CN105784616A - 基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法 - Google Patents
基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，该方法包括：向双金属纳米团簇溶液中加入可能含有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的待测样品、柠檬酸钠、双氧水和TMB，经混合反应后，通过观测所形成的混合反应体系在可见光波段的吸光值，实现对待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的检测；所述双金属纳米团簇为DNA‑Ag/Pt纳米团簇。本发明基于DNA‑Ag/Pt纳米团簇溶液模拟过氧化物酶比色检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸，其检测的线性范围为5.0‑500nM，灵敏度可达到2.0nM，具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于血清等生物样品中半胱氨酸或乙酰半胱氨酸药品的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于双金属纳米团簇形成的检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，特别涉及一种利用单链核酸制备双金属纳米团簇并将之应用于半胱氨酸或乙酰半胱氨酸检测的方法，属于纳米科技领域。
背景技术
酶是一类具有催化功能的蛋白质或核酸，可以在适宜的环境中催化化学反应。但是，酶属于生物催化剂，所需要催化的条件比较严格，而且需要较高成本，限制了它们的应用。因此，开发一种具有类似催化活性的模拟酶尤为重要。
纳米模拟酶是一类非蛋白结构，但与天然酶有相似催化性能的人工合成催化剂，除了具有催化稳定性高、制备容易、价格低廉、生产规模化等优点，还能在室温下保存稳定，易于修饰和标记各类功能分子或是蛋白抗体的优点，引起了研究人员的广泛关注。自从2007年中国科学院生物物理研究所高利增等报道四氧化三铁纳米颗粒具有过氧化物酶样模拟活性以来，大量的纳米材料被报道具有过氧化物酶活性。在单金属纳米材料中引入第二种金属会对催化剂的整体的催化活性以及选择性发生变化，因此双金属纳米材料也逐渐成为人们关注的焦点。纳米模拟酶与外界特定分子的选择性作用，可诱导其催化活性的选择性和灵敏的变化。基于纳米模拟酶的特性，开发纳米模拟酶传感方法具有很高的应用前景。
半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的检测对于临床诊断和药物质量控制具有重要的价值。因此，如何提供一种将纳米模拟酶应用于半胱氨酸和乙酰半胱氨酸的检测，已经成为业界研发人员的重要研究方向。
发明内容
针对上述现有技术中的不足，本发明的主要目的在于提供一种基于双金属纳米团簇形成的检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其能方便快速、低成本、高灵敏、高稳定性的实现半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的比色检测。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法包括：向双金属纳米团簇溶液中加入可能含有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的待测样品、柠檬酸钠、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，经混合反应后，通过观测所形成的混合反应体系在可见光波段的吸光值，实现对待测样品中的半胱氨酸的检测；所述双金属纳米团簇为DNA-Ag/Pt纳米团簇。
进一步的，该方法包括：
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液或乙酰半胱氨酸溶液并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，建立半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和待测样品并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线比对，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇粒径在3.0nm～6.0nm。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇的Ag与Pt的质量比为1：10～1:30。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的浓度为0.1μM～2.0μM。
作为优选方案之一，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为3.0～4.5。
作为优选方案之一，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为1.0mM～4.0mM。
作为优选方案之一，所述双氧水的浓度为0.5M～2.0M。
作为优选方案之一，所述混合反应是在温度20℃～45℃的条件下进行。
在一较为优选的实施方案中，所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法包括如下步骤：
(1)提供10μL浓度为0.1μM～2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液；
(2)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL一系列不同浓度的标准半胱氨酸或乙酰半胱氨酸溶液，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL待测样品，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，再测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
进一步的，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的制备方法包括：将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min，之后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
在一实施方案中，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的制备方法包括：将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min，之后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
其中，采用的典型单链核酸的序列为：5’-CCCCCTAACTCCCCC-3’，但不限于此。
与现有技术相比，本发明的优点至少在于：本发明基于DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液模拟过氧化物酶比色检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸，其检测的线性范围为5.0-500nM，灵敏度可达到2.0nM，具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于血清等生物样品中半胱氨酸或乙酰半胱氨酸药品的检测。
附图说明
图1是本发明实施例1中半胱氨酸抑制DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液(DNA-Ag/Pt NCs)过氧化物模拟酶催化活性的原理图；
图2是本发明实施例1中制得的半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线图；
图3是本发明实施例1中对于不同氨基酸的选择性测试谱图；
图4是本发明实施例1中对多种氨基酸检测的选择性分析对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
本发明实施例的一个方面提供了一种基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法包括：向双金属纳米团簇溶液中加入可能含有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的待测样品、柠檬酸钠、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，经混合反应后，通过观测所形成的混合反应体系在可见光波段的吸光值，实现对待测样品中的半胱氨酸的检测；所述双金属纳米团簇为DNA-Ag/Pt纳米团簇。
进一步的，该方法包括：
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液或乙酰半胱氨酸溶液并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，建立半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和待测样品并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线比对，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇粒径在3.0nm～6.0nm。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇的Ag与Pt的质量比为1：10～1:30。
作为优选方案之一，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的浓度为0.1μM～2.0μM。
作为优选方案之一，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为3.0～4.5。
作为优选方案之一，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为1.0mM～4.0mM。
作为优选方案之一，所述双氧水的浓度为0.5M～2.0M。
作为优选方案之一，所述混合反应是在温度20℃～45℃的条件下进行。
在一较为优选的实施方案中，所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)提供10μL浓度为0.1μM～2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液；
(2)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL一系列不同浓度的标准半胱氨酸或乙酰半胱氨酸溶液，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL待测样品，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，再测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
具体的，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的制备方法为(参考文献hemical communications2014,50(86),13103-6.)：
将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
以下实施例1-2中，所涉及的原料，如硝酸银、四氯铂酸钾、ssDNA及其它试剂均可通过市售途径获取，但本领域技术人员亦可采用业界已知的其它合适试剂进行替代。
实施例1
(1)根据已报道的参考文献合成DNA-Ag/Pt NCs，具体步骤如下：将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
(2)取10μL步骤(1)最终所获混合溶液，并分别依次加入30μL pH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM TMB溶液和100μL一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液混合均匀，在20℃～45℃条件下反应25min后，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线，如图3所示，检测灵敏度可达到2.0nM，检测线性范围为5.0-500nM。
(3)血清中半胱氨酸的检测：将血清用超纯水稀释1000倍，经0.22μm微孔过滤膜过滤。参照上述步骤(1)-(2)的操作，以简单处理后血清溶液代替半胱氨酸溶液，即可完成血清中半胱氨酸的检测。
另外，参照步骤(1)-(3)的操作及基本相同的反应条件，还对其它多种氨基酸进行了比对性的检测，其最终检测结果可参阅图4(其中半胱氨酸、乙酰半胱氨酸和谷胱甘肽浓度为500nM，其它氨基酸和浓度为10μM)。
实施例2
(1)根据已报道的参考文献合成DNA-Ag/Pt NCs，具体步骤如下：将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
(2)取10μL步骤(1)最终所获混合溶液，并分别依次加入30μL pH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM TMB溶液和100μL一系列不同浓度的标准乙酰半胱氨酸溶液混合均匀，在20℃～45℃条件下反应25min后，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得乙酰半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线。
(3)药片中乙酰半胱氨酸的检测：称量1.0g左右乙酰半胱氨酸药片，瓷研钵中破碎、细磨；加入10mL水，超声波中振荡20分钟；6000转下离心5分钟，经0.22μm微孔过滤膜过滤后用超纯水稀释1000倍。参照上述步骤(1)-(2)的操作，即可完成药片中乙酰半胱氨酸的检测。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于包括：向双金属纳米团簇溶液中加入可能含有半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的待测样品、柠檬酸钠、双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，经混合反应后，通过观测所形成的混合反应体系在可见光波段的吸光值，实现对待测样品中的半胱氨酸的检测；所述双金属纳米团簇为DNA-Ag/Pt纳米团簇。
2.根据权利要求1所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于包括：
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和一系列不同浓度的标准半胱氨酸溶液或乙酰半胱氨酸溶液并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，建立半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
向DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入柠檬酸钠缓冲溶液、双氧水、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和待测样品并混合反应，测定所获混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线比对，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
3.根据权利要求2所述的所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇粒径在3.0nm～6.0nm；和/或，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇内Ag与Pt的质量比为1：10～1:30。
4.根据权利要求2所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的浓度为0.1μM～2.0μM。
5.根据权利要求2所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为3.0～4.5。
6.根据权利要求2所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为1.0mM～4.0mM。
7.根据权利要求2所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述双氧水的浓度为0.5M～2.0M。
8.根据权利要求2所述的所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述混合反应是在温度20℃～45℃的条件下进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的基于双金属纳米团簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)提供10μL浓度为0.1μM～2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液；
(2)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL一系列不同浓度的标准半胱氨酸或乙酰半胱氨酸溶液，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，分别测定所获的各混合反应体系在可见光波段的吸光值，由此建立半胱氨酸浓度-吸光值标准曲线；
(3)向步骤(1)所获的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液中加入30μLpH值为3.0～4.5的柠檬酸钠缓冲溶液、20μL浓度为0.5M～2.0M的双氧水和40μL浓度为1.0mM～4.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液和100μL待测样品，均匀混合，形成混合反应体系，充分反应后，再测定该混合反应体系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测样品中的半胱氨酸或乙酰半胱氨酸浓度。
10.根据权利要求9所述的基于双金属纳米簇检测半胱氨酸或乙酰半胱氨酸的方法，其特征在于，所述DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液的制备方法包括：将体积比为30：5：12的浓度为2.0μM的单链核酸溶液、浓度为150μM的硝酸银溶液和浓度为125μM的四氯铂酸钾溶液均匀混合后，4℃下避光反应30min，之后加入浓度为5.0mM的硼氢化钠溶液，所述单链核酸溶液与硼氢化钠溶液的体积比为30：4，37℃下振荡3h，得到浓度为2.0μM的DNA-Ag/Pt纳米团簇溶液。
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