CN1693879A - 一种酶生化反应测定同型半胱氨酸的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明一种酶生化反应测定生物样本中同型半胱氨酸的方法。同型半胱氨酸经L－蛋氨酸γ－裂解酶去氨转化为α－丁酮酸、氨和硫化氢。硫化氢和荧光化合物DMPD 2HCl在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670nm处的蓝色产物－亚甲蓝。通过测定亚甲蓝在670nm处的吸光率来定量生物样本中的同型半胱氨酸浓度。本法可线性测定生物样本中同型半胱氨酸浓度范围(3－1000μM)。本发明还涉及用于进行上述方法的试剂盒。本试剂盒应用液体双试剂，测试同型半胱氨酸所需样本量少，仅需25微升血清或血浆即可；此外，测定时反应时间短，操作简单，适用于大量检测。本试剂盒比所有其它同型半胱氨酸分析试剂盒所需费用都低。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样本中测定同型半胱氨酸含量的技术方案以及有此方案制造的试剂。特别是涉及一种用酶生化反应测定同型半胱氨酸的方法。
背景技术
Tan(2000)报导了一种用酶生化反应测定同型半胱氨酸的方法。同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)经同型半胱氨酸α，γ-裂解酶(homocysteine α-γ-lyase，rHCYase)去氨转化为α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氢(H2S)。硫化氢和荧光素N，N-二丁基亚苯基二胺(N，N-Dibutylphenylene diamine，DBPDA)形成色素酚噻嗪氯化物类化合物[3，7-bis(dibutyl amino)phenothiazine-5-ium chloride]，后者可在660nm处定量测定并且其吸光率和样本中HCY的含量成正比。
[λmax(最大吸光度波长)=660nm]
Tan Y，Tang L，Sun X，Zhang N，Han Q，Xu M，Baranov E，Tan XZ，Tan XY，Rashidi B，An Z，Perry AW，Hoffman RM.总同型半胱氨酸测定法。临床化学杂志2000；46：1686-88。[Tan Y，Tang L，Sun X，Zhang N，Han Q，Xu M，Baranov E，Tan XZ，Tan XY，Rashidi B，An Z，Perry AW，Hoffman RM.Total-homocysteine enzymatic assay.Clinical Chemistry2000；46：1686-88.]
该法已获美国专利：5,985,540、5,998,191、6,066,467、6,140,102、6,448,446、6,468,762，日本专利3,337,693和中国专利98807531.8。但是，不光只有rHCYase才能使HCY去氨产生H2S；此外，测定硫化氢的生化方法也不限于上述一种。
L-蛋氨酸γ-裂解酶(L-Methionine Gamma-Lyase，rMETase)的经典反应：
Tanaka(1980)发现当rMETase底物是HCY时，和rHCYase一样将HCY去氨转化为α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氢(H2S)。并且，rMETase活性是以L-蛋氨酸为底物时的1.75倍。
Tanaka，等，细菌L-蛋氨酸γ-裂解酶选择性测定L-蛋氨酸和L-半胱氨酸，以及其抗肿瘤特性。应用生化杂志。2，439-444，1980。[Tanaka，H.，et al.，Selective Determination ofL-Methionine and L-Cysteine with Bacterial L-Methionine Gamma-Lyase and AntitumorActivity of the Enzyme.J.Applied Biochem.2，439-444，1980]
但是，迄今为至此法还未有人应用于HCY测定。
Chen(1976)使硫化氢和荧光化合物N，N-双甲基-p-亚苯基二胺双盐酸(N，N-Dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride，DMPD 2HCl)在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670nm处的蓝色产物-亚甲蓝(Methylene blue)。通过定量测定亚甲蓝在670nm处的吸光率可计算硫化氢的含量。
(λMax=670nm)
Chen JS，Mortenson LE.含硫醇铁-硫蛋白样本中测定对酸不稳定的硫化物时亚甲蓝形成的抑制因素。分析生化。1977年5月1；79(1-2)：157-65。[Chen JS，Mortenson LE.Inhibitionof methylene blue formation during determination of the acid-labile sulfide ofiron-sulfur protein samples containing dithionite.Anal Biochem.1977 May 1；79(1-2)：157-65.]
但是，迄今为至此法还未有人应用于HCY测定。
HCY测定第一步必须将血清样本中胱氨酸，蛋白结合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物还原为游离的同型半胱氨酸。以往包括Tan氏法均使用Dithiothreitol(DTT)还原含二硫键(-S-S-)的化合物成还原态(-SH)化合物。
*R1为任何含硫醇基团
Prot为蛋白质
-SS-为二硫键
Schonberg(1935)报导用氨丁三醇(2-羧基乙基)磷化氢[Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]还原含二硫键(-S-S-)的化合物成还原态(-SH)化合物。
Schonberg，A.化学，柏林。1935，68，163-164。[Schonberg，A.Chem，Ber.1935，68，163-164。]
TCEP比DTT稳定性强，但却罕见用于HCY测定。
发明内容
本发明酶生化反应测定同型半胱氨酸的原理和Tan氏法一样，都是借助HCY裂解产生H2S，通过间接测定H2S的产量来定量生物样本中的HCY浓度。但是，本发明血清样本还原反应、所用的HCY裂解酶和测定H2S的方法和Tan氏法不同。用TCEP还原血清样本中胱氨酸，蛋白结合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物为游离的同型半胱氨酸，HCY经rMETase去氨转化为α-丁酮酸、氨和硫化氢。硫化氢和荧光化合物DMPD 2HCl在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670nm处的蓝色产物-亚甲蓝。通过测定亚甲蓝在670nm处的吸光率来定量生物样本中的HCY浓度。
*R1为任何含硫醇基团
(λMax＝670nm)
以本发明的酶生化反应测定同型半胱氨酸的方法配制了测定HCY的试剂盒。
具体实施方式
1.HCY测定
1)还原和酶转化：
在0.25ml反应液(50mM Tris-HCl pH 7.5，含20μM磷酸吡哆醛pyridoxal phosphate简称PLP，0.05％ Triton X-100，1mM TCEP和0.1U/ml rMETase)中加入0.025ml 0-1000μM L-同型胱氨酸，置于37℃水浴30分钟。
2)测定硫化氢：
加入0.025ml显色液(1N HCl含20mM DMPD 2HCl和30mM FeCl3)，混匀后室温静止10分钟。以蒸馏水作为参比，670nm处读取吸光度。
3)结果：
L-同型半胱氨酸线性范围3-1000μM
2.同型半胱氨酸(HCY)生化试剂盒
产品名称：同型半胱氨酸(HCY)生化试剂盒
型号：生化试剂
产品代码：DC-HCY
规格：试剂I 25ml，试剂II 2.5ml，HCY标准品1瓶，HCY正常血清对照1瓶，HCY升高血清对照1瓶。100测试/盒。
检测介质：血清或血浆
适用于体外诊断
用途
同型半胱氨酸(HCY)生化试剂盒用于测定血浆或血清标本中的同型半胱氨酸总量(tHCY)用来判断动脉粥样硬化所致心血管疾病危险性。
概述
同型半胱氨酸(高半胱氨酸)是含硫氨基酸，在细胞内蛋氨酸脱甲基化生成，同型半胱氨酸经甲基化生成蛋氨酸，此过程需活性维生素B12及四氢叶酸作为辅助因子参与。同型半胱氨酸也可以经转硫通路生成半胱氨酸，此过程需胱硫酶合成酶参与，磷酸吡哆醛(活性维生素B6)为其辅助因子。当同型半胱氨酸代谢受阻，同型半胱氨酸就在细胞内积聚，并进入血液循环。还原形同型半胱氨酸在血中仅占1％，大部分以氧化型存在，其中80-90％与蛋白结合，5-10％与同型半胱氨酸自身结合(HCY-SS-HCY)，另外5-10％与半胱氨酸等结合形成混合型同型半胱氨酸二硫化物(CY-SS-HCY)。通常测定血中总同型半胱氨酸含量(tHCY)。
McCully于1969年最先将极度同型半胱氨酸血症(tHCY浓度100-450umol/L)动脉粥样硬化疾病相联系，极度同型半胱氨酸是由于参与同型半胱氨酸代谢的转甲基或转硫作用的酶缺陷所致，常见的有胱硫酶合成酶及亚甲基四氢叶酸还原酶缺陷，极度同型半胱氨酸血症病人有早发性动脉粥样硬化，动静脉栓塞及智力障碍。
近年来，人们开始注意同型半胱氨酸与心血管疾病的联系。大量的事实表明轻微到中度同型半胱氨酸血症(tHCY浓度≥12umol/L，但≤100umol/L)是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的独立的致病因素。1997年人群调查表明，人群tHCY浓度偏高的地区，心血管疾病所致的死亡率增加。1998年对血浆tHCY浓度不同的人研究发现tHCY≥15umol/L较之于tHCY≤10umol/L人群危险系数增加到1.4。1998年对21520位年龄在35-64之间没有缺血性心肌病(IHD)的人群研究，IHD死亡率差异比(odds ratio)由1(tHCY＜10.25umol/L)增致1.43(tHCY介于10.25与12.32umol/L)、1.46(tHCY介于12.33与15.16umol/L)及2.90(tHCY浓度＞15.16umol/L)每增加5umol/L tHCY，缺血性心肌病危险性增加33％，且与血中胆固醇增加0.5nmol/L危险性相当。同时发现冠状动脉粥样硬化心脏病人同时伴有tHCY升高，死亡率增加。慢性肾病病人，排泄HCY功能障碍，血中tHCY增加，引起动脉粥样硬化，心血管疾病死亡率增加。
同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血因子功能，增加血栓形成倾向。同型半胱氨酸可使小动脉血管易于栓塞及促进血管平滑肌细胞增殖参与粥样硬化形成。同型半胱氨酸活化形式(Homocystein thiolactone)可促使血小板聚集，并可与载脂蛋白B形成致密的复合物易于被血管壁巨噬细胞吞噬，引起血管壁脂肪堆积。同型半胱氨酸能增强其它心血管疾病危险因素如胆固醇、高血压及吸烟对心血管的损害。通过上述机制，同型半胱氨酸促进动脉粥样硬化及血栓形成，使心血管疾病发病率及死亡率增加，血中同型半胱氨酸浓度升高(tHCY浓度≥12umol/L)是冠心病、中风、外周血管粥样硬化及动静脉栓塞的危险因子，血中同型半胱氨酸升高使心血管疾病发病率及死亡率增加，因此测定血中tHCY浓度在临床意义上十分重要。
原理
还原：
标本中胱氨酸，蛋白结合的的同型半胱氨酸及混合型二硫化物在加入氨丁三醇(2-羧基乙基)磷化氢[Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP]后，还原为游离的同型半胱氨酸。
*R1为任何含硫醇基团
酶转化：
经基因重组蛋白rMETase去氨作用，同型半胱氨酸转化为α-丁酮酸(α-ketobutyrate)、氨(NH4)和硫化氢(H2S)
测定硫化氢：
硫化氢和合成的荧光化合物N，N-双甲基-p-亚苯基二胺双盐酸(N，N-Dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride，DMPD 2HCl)反应形成最高吸光率在670nm的蓝色产物-亚甲蓝(Methylene blue)。其吸光值与总HCY浓度成正比。
(λMax＝670nm)
试剂盒组成
每个同型半胱氨酸(HCY)生化试剂盒(100测试)含有：
1.试剂I 反应液 1瓶25ml
2.试剂II 显色剂 1瓶2.5ml
3.HCY标准品 1瓶冻干品
4.HCY正常血清对照 1瓶冻干品
5.HCY升高血清对照 1瓶冻干品
6.检验证明
7.1份使用说明。
试剂配制
本试剂盒为液体双试剂，可直接上机使用。HCY标准品、HCY正常或升高血清对照需要溶于1ml蒸馏水中方可使用。如果受限于分析仪比色杯容积限制，可以依比例(详见试验参数)调整试剂I、样本/标准品/血清对照及试剂II使用量。
试剂的稳定与贮存期
试剂I和试剂II避光保存2-8℃一年。冻干的HCY标准品、HCY正常或升高血清对照2-8℃或冷冻保存一年。溶化后的HCY标准品、HCY正常或升高血清对照-20℃保存半年。
样本处理
a.因红细胞可合成同型半胱氨酸，所以标本需在半小时内离心使血浆或血清与红细胞分离.在离心分离前，标本应置于冰上。加NaF于血液样品中也可阻止Hcy在采样后2小时内的显著升高。
b.用于科研，建议使用EDTA处理血浆，血清标本通常正常范围比血浆标本高5-10％。EDTA处理血浆需立刻离心或立即置于冰中。离心前EDTA处理血浆可在冰中保持6小时。
c.食物的摄入可影响同型半胱氨酸的检测水平，蛋白含量丰富的食物可导致测定值的升高，因此采样前应注意不要摄入太多蛋白。
d.常规血样应特别注意上述事项。
e.融化的标本使用前需充分混匀。反复的冻溶并不影响血浆Hcy的浓度。
f.血浆样品中的Hcy在室温可稳定4天，在2-8℃可保存几周，在-20℃可保存数月。
试验参数与操作步骤
温度 37℃
测试方法 终点法
启动反应 0.025ml样本/标准品/血清对照+0.25ml试剂I(或依比例混匀)
孵育时间 30分钟
终止反应 加0.025ml试剂II(或依比例混匀)
延迟时间 10分钟
空白参照 水
测试 读吸光值A670
测试仪 Shimadzu UV-160
计算
HCY(μmol/L)＝(Ax/Ac)×Ec
其中：Ax＝样本吸光值A670
Ac＝标准品吸光值A670
Ec＝HCY标准品浓度(μmol/L)
注意事项
1.试剂和样品用量可因仪器不同，按比例增减。
2.测试中HCY正常或升高血清对照应作为阴性和阳性参照。
参考值
正常参考范围5-15μmol/L tHCY。但切记各实验室需要根据自身实验条件自行订定正常人血清tHCY范围。
试剂性能
线性范围-3-1000μmol/L L-HCY
精密度-CV12％
特异性-血清、0.075mmol/L L-蛋氨酸、150mmol/L L-半胱氨酸、0.75mmol/L L-胱硫醚、5.0mmol/L腺苷、50mmol/L谷胱甘肽、200mg/dL血红蛋白、400mg/dL甘油三酯对本法无干扰。
仪器
全自动、半自动生化分析仪或可见光分光光度计
参考文献
参阅实申参考资料。
Claims (2)
1.一种用酶生化反应测定生物样本中同型半胱氨酸的方法，其特征是同型半胱氨酸经L-蛋氨酸γ-裂解酶去氨转化为α-丁酮酸、氨和硫化氢，硫化氢和荧光化合物DMPD 2HCl在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670nm处的蓝色产物-亚甲蓝，通过测定亚甲蓝在670nm处的吸光率来定量生物样本中的同型半胱氨酸浓度。
2.一种按权利要求1制造的测定生物样本中同型半胱氨酸含量的产品，其特征是同型半胱氨酸经L-蛋氨酸γ-裂解酶去氨转化为α-丁酮酸、氨和硫化氢，硫化氢和荧光化合物DMPD2HCl在Fe3+和酸性条件下反应形成最高吸光率在670nm处的蓝色产物-亚甲蓝，通过测定亚甲蓝在670nm处的吸光率来定量生物样本中的同型半胱氨酸浓度(3-1000μM)。
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