CN1148891A - 低密度脂蛋白中或极低密度脂蛋白中的胆甾醇的定量法 - Google Patents

低密度脂蛋白中或极低密度脂蛋白中的胆甾醇的定量法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及低密度脂蛋白(LDL)中的胆甾醇或极低密度脂蛋白(VLDL)中的胆甾醇的定量法，其特征在于在糖化合物和/或蛋白增溶剂的存在下测定试样中LDL中的胆甾醇含量或VLDL中的胆甾醇含量。

Description

低密度脂蛋白中或极低密度脂 蛋白中的胆甾醇的定量法
本发明涉及在临床诊断领域中在脂质代谢方面具有重要意义的低密度脂蛋白(LDL)或极低密度脂蛋白(VLDL)中的胆甾醇(以下称为LDL胆甾醇和VLDL胆甾醇)的定量法。
LDL具有向末稍细胞供应胆甾醇的作用，是引起以冠状动脉硬化症为首的各种动脉硬化症的直接因素，LDL在血中的含量已知可作为动脉硬化性疾病的指标。另外，富含甘油三酸酯(TG)的VLDL也与动脉硬化有关，这一点正引起人们注意。作为现有的LDL胆甾醇的定量法，有超离心法、电泳法、换算法等，而作为VLDL胆甾醇的定量法，有超离心法、电泳法等。超离心法可作为基本的定量法使用，它是使用一种分离用超离心机，根据比重的差别来分离LDL或VLDL，进而测定其中胆甾醇的含量(Adr.Lipid Res.，第6卷，第1页，1968年)。然而该方法在定量性、简便性、经济性等方面存在缺点。在使用电泳法的情况下，以乙酸纤维素膜或琼脂胶等作为支持体进行分离，通过酶反应来定量胆甾醇(临床检查，第29卷，1344页，1985年)。该方法在简便性、经济性等方面存在问题。在换算法的情况下是根据以下的计算式来算出LDL胆甾醇含量(Clin.Chem.，第18卷，499页，1972年)。
(LDL胆甾醇量)＝(总胆甾醇量)－(HDL胆甾醇量)－(甘油三酸酯)/5
然而，该方法由于受到血清中的TG含量和高脂血症的类型等的限制，因此在简便性、正确性、多个试样处理等方面存在问题。如上所述，现有的LDL胆甾醇或VLDL胆甾醇的定量法不适合于进行多个试样处理、迅速测定以及在临床检查领域中广泛地使用的自动分析装置中使用。而且，按照现有的定量法容易产生诸如用定量移液管量取分离出来的LDL时那样的人为误差。然而，即使不将血清试样分离成LDL或VLDL而是将其直接地添加到一种含有胆甾醇酯酶和胆甾醇氧化酶的试剂中，与用于定量总胆甾醇的体系也没有差别，不能特异地定量LDL胆甾醇或VLDL胆甾醇。
本发明者们发现，使用存在糖化合物和/或蛋白增溶剂的胆甾醇测定试剂体系，对以超离心法分离出的高密度脂蛋白(HDL)、LDL、VLDL和乳糜微粒(CM)的各种脂蛋白进行测定时，由于糖化合物和/或蛋白增溶剂的组合，可使得与各种脂蛋白的反应性产生差异，其结果是使HDL中的胆甾醇、LDL胆甾醇、VLDL胆甾醇、CM中的胆甾醇的反应性产生差异，至此便完成了本发明。
本发明涉及LDL胆甾醇或VLDL胆甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶剂的存在下测定试样中的LDL胆甾醇量或VLDL胆甾醇量。在进行上述测定时，为了进一步提高其特异性，还可以同时添加二价的金属原子盐。
另外，根据本发明，提供了一种以糖化合物和/或蛋白增溶剂作为成分的用于LDL或VLDL中胆甾醇的定量试剂，或者由糖化合物与蛋白增溶剂组合而成的用于LDL或VLDL中胆甾醇的定量试剂。
作为糖化合物，优选使用葡萄糖衍生物，作为葡萄糖衍生物，例如可以举出通式(I)和通式(II)表示的化合物，其中，
通式(I)为：
Figure A9619020600071
〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氢原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷酰基、SO3M2(式中，M2表示氢原子或金属原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麦芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氢原子、金属原子或SO3M3(式中，M3表示氢原子或金属原子)；m表示6-8〕
通式(II)为：
〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氢或SO3M4(式中，M4表示氢原子或金属原子)；R9表示氢原子、OM5(式中，M5表示氢原子或金属原子)或OSO3M6(式中，M6表示氢原子或金属原子)；R10表示氢原子、金属原子或SO3M7(式中，M7表示氢原子或金属原子)；n表示4-8000的整数〕。
作为蛋白增溶剂，优选使用由通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，
通式(III)为：
R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12    (III)
〔式中，a和b表示0-200的整数；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或链烯基；X表示单键或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整数；R21表示烷基或键烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氢原子、金属原子、烷基或链烯基)但是a和b不能同时为0，不过两种成分可以任意的比例存在〕
通式(IV)为：
(式中，R13、R14、R15、R16、R17和R18相同或不同，表示烷酰基)
通式V为：
R19-Y-SO3M1    (V)
〔式中，R19表示烷基、链烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示单键、
Figure A9619020600092
-O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或链烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整数)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整数)、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或链烯基)或者它们的混合物；M1表示氢或金属原子〕。
以下对通式(I)-通式(V)表示的化合物分别称为化合物(I)-化合物(V)。
在通式(I)-通式(V)中的各基团的定义中，作为烷基和烷酰基的烷基部分是直链或支链状含1-22个碳原子的烷基，例如可以举出：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、癸基、十五烷基、二十烷基、二十二烷基等；作为链烯基，指直链或支链含碳原子2-22的链烯基，例如可以举出：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、癸烯基、十五碳烯基、二十碳烯基、二十二碳烯基等。所说芳基表示苯基或萘基；作为金属原子，可以举出锂、钠、钾等。
作为取代烷基和取代烷酰基的取代基，例如可以举出：羟基、羧基、磺基等。作为取代芳基的取代基，例如可以举出烷基等，所说烷基表示与上述烷基具有同样的定义。
作为糖化合物，优选使用化合物(I)或化合物(II)中的环糊精衍生物，特别优选甲基化的环糊精。例如可以举出：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、三甲基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、羧甲基-β-环糊精、糖基-β-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、部分(パ-シヤリ)-甲基-β-环糊精、α-环糊精硫酸酯、β-环糊精硫酸酯等。
作为蛋白增溶剂，优选使用化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)等表面活性剂，特别优选非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂。作为非离子型表面活性剂，例如可以举出：聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯十八烷基醚、聚氧乙烯十八碳烯基醚、聚氧乙烯二十二烷基醚、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯月桂酰胺、聚氧乙烯硬脂酰胺、蔗糖脂肪酸酯等；作为阴离子型表面活性剂，例如可以举出：十十烷基苯磺酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸钠、高级醇硫酸酯钠等。
作为二价金属原子盐，可以举出：0.01-20mM的镁盐、钙盐、锰盐、镍盐、钴盐等，优选使用0.01-20mM的镁盐。
本发明的特征在于使糖化合物和/或蛋白增溶剂与胆甾醇测定试剂体系共存，而胆甾醇测定试剂体系本身可根据下述的反应原理，按照一般方法配制。其中，作为色素源和测定波长没有限定。
              色素＋5H2O(λmax＝555nm)EMSE：N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺
                            NAD(P)H＋H+(λmax＝340nm)
例如，作为色素源，一般使用4-氨基安替比林与苯酚、4-氯苯酚、间甲酚、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等苯酚类的组合，除此之外，还可以使用4-氨基安替比林与已知可作为Trinder’s试剂(同仁化学研究所第19版总合目录，1994年)使用的下列化合物组合使用，所说化合物有：N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间甲苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-磺丙基间甲苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基间甲苯胺、N，N-二磺丙基-3，5-二甲氧基茉胺、N-乙基-N-磺丙基间甲苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)间茴香胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺等苯胺类或者N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺等。另外，作为高灵敏度的色素源，也可以使用特公昭60-33479中所示的10-(N-甲基氨基甲酰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪(MCDP)、在特公开4-27839中所示的双〔3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基〕胺(BCMA)、特开昭62-296中所示的色素源等，另外，4-氨基安替比林或者上述的Trinder’s试剂也可以组合使用。作为色素源的浓度，优选为0.01-10mg/ml，这要受溶解度关系的限制。
作为胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶，可以举出通常市售的，由一些对胆甾醇酯具有水解能力的微生物或动物得来的胆甾醇酯酶或脂蛋白脂肪酶、由一些能将胆甾醇氧化而生成过氧化氢的微生物得来的胆甾醇氧化酶、由微生物或动物得来的胆甾醇脱氢酶等，但是，为了进一步提高这些酶的特异性和稳定性，可以使用通过以聚乙二醇为主成分的基团、水溶性的低聚糖残基、磺丙基等对上述的酶进行化学修饰而获得的酶。另外，按照基因工程的操作从这些酶中提取基因并将其导入别的微生物中而产生的酶或对这些酶进行化学修饰而获得的修饰体，或者将这些基因改变而产生的酶，或对这些酶进行化学修饰而获得的修饰体等也适合使用。
作为用于修饰所说酶的试剂(化学修饰剂)，例如可以举出：在聚乙二醇上键合一种能够与氨基键合的基团而生成的化合物{例如在聚乙二醇上键合一种能够与N-羟基琥珀酰亚氨基等氨基键合的基团而生成的Sunbright VFM 4101〔日本油脂(株)制〕等}、具有聚乙二醇结构和酸酐结构的Sunbright AKM系列、同样的ADM系列、同样的ACM系列〔每一种皆为日本油脂(株)制：化学工学论文集，第20卷，第3号，459页，1994年〕、在聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物上键合一种能够与氨基键合的基团而生成的化合物、聚乙二醇单甲基丙烯基单甲醚与马来酸酐的共聚物等。另外，作为聚氨酯化学修饰剂的聚氨酯P4000activated.(ベ-リニガ-マンハイム社制Enzyme modification set能书)、作为葡聚糖化学修饰剂的葡聚糖T40，TCT-activated(同)、1，3-丙烷磺内酯等也可以使用。
下面例示出使上述化学修饰剂与酶反应的方法，但本发明不受这些例子的制约。首先，将所说的酶溶解于pH8以上的磷酸缓冲液等缓冲液中，在0-50℃下添加例如0.01-500倍摩尔量的Sunbright，搅拌5分钟-24小时。可以将该反应液直接使用或者根据需要通过限外过滤膜除去低分子物质后使用。胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶和胆甾醇脱氢酶的用量优选为0.1-100μ/ml。
本发明的方法可以适用于血液、尿等含有LDL或VLDL的体液。
下面举例说明本发明的定量法。
方法1
在实施本发明时，首先配制糖化合物溶液和/或蛋白增溶剂溶液。糖化合物溶液的配制是将糖化合物溶解于适当的缓冲液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，使其在反应时的浓度例如为100mM以下，优选为3-80mM。可以预先使糖化合物共存于胆甾醇测定试剂中。蛋白增溶剂溶液的配制是将蛋白增溶剂溶解于适当的缓冲液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，使其与胆甾醇测定试剂共存，使其在反应时的浓度例如在50g/l以下，优选在0.1-20g/l以下。所说试剂由与糖化合物溶液和/或胆甾醇测定试剂共存的蛋白增溶剂溶液来调制(在不使用蛋白增溶剂溶液的情况下，使糖化合物预先共存于胆甾醇测定试剂中)，在20-50℃，优选在30-40℃保温约5分钟。然后将试样直接地加入，或者根据需要用水或食盐水稀释后再加入上述的试剂中，使其反应5-30分钟。反应结束后，以340-900nm，例如，在单波长的情况下，以555nm；在双波长的情况下，以主波长600nm，副波长700nm来测定该反应液的吸光度，据此算出胆甾醇含量(在双波长的情况下，由按该两波长所获吸光度的差值算出)。
使用按超离心法由血清分离出的HDL、LDL、VLDL和CM的各部分为样品，用上述试剂测定其中的胆甾醇含量。其结果，通过糖化合物与蛋白增溶剂的组合，使得HDL胆甾醇、LDL胆甾醇、VLDL胆甾醇、CM胆甾醇的反应性发生差异，由此可以确认，通过糖化合物与蛋白增溶剂的组合，可使其与各种脂蛋白的反应性产生差异。
当使糖化合物50mM与蛋白增溶剂聚氧乙烯单月桂酸酯5g/l组合并共存于胆甾醇测定试剂(未修饰)中时，各种脂蛋白反应性的差异示于表1中。
表1
糖化合物 HDL LDL VLDL CM
α-环糊精 + +  + + +
β-环糊精 + +  + + +
γ-环糊精 + +  + + +  +
二甲基-β-环糊精 - +  +  + +  +  + +  +  +
三甲基-β-环糊精 - +  +  + + +
羟乙基-β-环糊精 - +  + + +
2-羟丙基-α-环糊精 + +  + +  + +  +
2-羟丙基-β-环糊精 - +  + +  + +  +
羧甲基-β-环糊精 + +  + +  + +  +
葡糖基-β-环糊精 + +  + +  + +  +
麦芽糖基-α-环糊精 + +  + +  + +  +
麦芽糖基-β-环糊精 + +  + + +
部分甲基-β-环糊精 + +  + + +
α-环糊精硫酸酯 + +  + + +
β-环糊精硫酸酯 + +  + + +
-、+、++、+++分别表示反应性强度，其顺序为-＜+＜++＜+++。
当使糖化合物三甲基-β-环糊精5mM与蛋白增溶剂5g/l组合并共存于胆甾醇测定试剂(未修饰)中时，各种脂蛋白反应性的差异示于表2中。
表2
蛋白增溶剂 HDL LDL VLDL CM
聚氧乙烯二十烷基醚 - +  +  + +  +  + +  +  +
聚氧乙烯十六烷基醚 + +  + + +
聚氧乙烯十八烷基醚 + +  + + +
聚氧乙烯十八碳烯基醚 + +  + + +
聚氧乙烯二十二烷基醚 + +  + + +
聚氧乙烯单月桂酸酯 - +  +  + + +
聚氧乙烯单硬脂酸酯 - +  + + +
聚氧乙烯单油酸酯 - +  + + +
聚氧乙烯月桂酰胺 - +  + + +
聚氧乙烯硬脂酰胺 - +  + + +
蔗糖脂肪酸酯 + +  + +  + +
十二烷基苯磺酸钠 - +  + + +
正十二烷基苯磺酸钠 - +  + +  + +  +
十二烷基硫酸钠 - +  + +  + +  +
高级醇硫酸酯钠 + +  + + +
-、+、++、+++分别表示反应强度，其顺序为-＜+＜++＜+++。
方法2
糖化合物溶液的配制是将糖化合物溶解于适当的缓冲液中，例如溶解于50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，使其在反应时的浓度例如在100mM以下，优选为3-80mM。蛋白增溶剂溶液的配制是将蛋白增溶剂溶解于适当的缓冲液中，例如溶解于50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，使其在反应时的浓度例如在50g/l以下，优选为0.1-20g/l。将试样直接地加入，或者根据需要用水或生理食盐水稀释后的试样加入预先加热至20-50℃，优选30-40℃，例如37℃的糖化合物溶液和/或蛋白增溶剂溶液中，例如在37℃下加热5分钟，5分钟后测定所获得溶液在555nm处的吸光度(E1)。然后添加入预先加热至20-50℃，优选30-40℃，例如37℃的胆甾醇测定试剂，搅拌，5分钟后在相同波长处测这吸光度〔E2(浓度补正后的值)〕。使用含有已知浓度胆甾醇的标准液进行同样的操作，根据对(E2-E1)值的比较算出胆甾醇的含量。
下面根据实施例说明本发明的方案。
用于实施本发明的最佳方案
实施例1
用于直接定量LDL胆甾醇的本方法与琼脂糖电泳法(临床检查，第29卷，1344页，1985年)的比较。
本方法的试剂组成
第一试剂
三甲基-β-环糊精               5mM
聚氧乙烯单月桂酸酯             5g/l
EMSE                           1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)              30mM
第二试剂
胆甾醇酯酶(未修饰)             1.0U/ml
胆甾醇氧化酶(未修饰)                  5.0U/ml
过氧化物酶                            25U/ml
4-氯基安替比林                        2.2mM
Tris缓冲液(pH7.0)                     30mM
按照本方法，首先将血清样品50μl添加到预先加热至37℃的第一试剂2.25ml中，在37℃下加热5分钟，5分钟后测定所获溶液在555nm处的吸光度(E1)。然后加入预先加热至37℃的第二试剂0.75ml，5分钟后测定在相同波长处的吸光度〔E2(浓度补正后的值)〕。使用一种胆甾醇浓度为200mg/dl的标准液进行同样的操作，通过比较(E2-E1)的数值算出LDL胆甾醇的含量。
按照琼脂糖电泳法，对电泳后在支持体上的脂蛋白部分进行胆甾醇的酶染色，用光密度计(クリニスキヤン株式会社研究所)定量测定LDL胆甾醇的含量。
所获结果示于表3中。
表3
   样品      LDL胆甾醇浓度(mg/dl)
 本发明的方法   电泳法
    12345678910     628577148122156150133133140     558172138116151139121123129
如表3所示，显示出按本发明方法获得的结果与按电泳法获得的结果具有良好的相关性。
实施例2
除了将第一试剂中所用的糖化合物与蛋白增溶剂组合改变之外，其余按与实施例1的本发明方法同样的步骤进行，对血清样品的20个试样进行测定，获得了与琼脂糖电泳法相关的相关系数。
第一试剂的组成
A.三甲基-β-环糊精                   5mM
聚氧乙烯单月桂酸酯                   5g/l
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                    30mM
B.三甲基-β-环糊精                   5mM
十二烷基苯磺酸钠                     5g/l
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                    30mM
C.二甲基-β-环糊精                   5mM
聚氧乙烯单月桂酸酯                   5g/l
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                    30mM
D.二甲基-β-环糊精                   5mM
十二烷基苯磺酸钠                     5g/l
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                    30mM
按照本方法，使用日立7070自动分析装置分别进行测定。测定条件如下所示。
样品量：  4μl
第一试剂：300μl
第二试剂：100μl
测定波长  主波长：600nm；副波长：700nm所获结果示于表4中。表4
第一试剂 相关系数
A. 0.9324
B. 0.8227
C. 0.8523
D. 0.7876
如表4所示，显示出按本发明方法获得的结果与按电泳法获得的结果有良好的相关性。
实施例3
除了向实施例2的B和D中添加金属原子盐之外，其余按照与实施例2同样的步骤进行，对血清样品的20个试样进行测定，获得了与琼脂糖电泳法相关的相关系数。
第一试剂的组成
E.三甲基-β-环糊精                   5mM
十二烷基苯磺酸钠                     5g/l
MgCl2·6H2O                        6mg/ml
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                    30mM
F.二甲基-β-环糊精                   5mM
十二烷基苯磺酸钠                     5g/l
MgCl2·6H2O                        6mg/l
EMSE                                 1.1mM
Tris缓冲液(PH7.0)                    30mM
结果示于表5中。
表5
第一试剂 相关系数
E. 0.9302
F. 0.9298
如表5所示，显示出按本发明方法获得的结果与按电泳法所获结果具有良好的相关性。
实施例4
对用于直接定量VLDL胆甾醇的本方法与琼脂糖电泳法(临床检查，第29卷，1344页，1985年)，通过进行与实施例1同样的操作来作比较。
本方法的试剂组成
第一试剂
2-羟丙基-β-环糊精                 5mM
聚氧乙烯十二烷基醚                 5g/l
EMSE                               1.1mM
Tris缓冲液(pH7.0)                  30mM
第二试剂
修饰的胆甾醇酯酶                   1.0U/ml
修饰的胆甾醇氧化酶                 5.0U/ml
过氧化物酶                         25U/ml
4-氨基安替比林                     2.2mM
Tris缓冲液(pH7.0)                  30mM
应说明，所说修饰的胆甾醇酯酶和修饰的胆甾醇氧化酶的制备是将胆甾醇酯酶或胆甾醇氧化酶溶解于20mM的磷酸缓冲液(pH8)中(10mg/ml)，在5℃下冷却后，向其中加20倍摩尔量的Sunbright4001(日本油脂)，使其溶解，在5℃下反应4小时，用聚乙二醇进行修饰，所获反应液即可直接使用(聚乙二醇部分的分子量6000)。
结果示于表6中。
表6
   样品      LDL胆甾醇浓度(mg/dl)
 本发明的方法   电泳法
    12345678     2429171912254644     1922152315234939
    910     3331     2734
如表6所示，显示出按本发明方法获得的结果与按电泳法获得的结果具有良好的相关性。
产业上利用的可能性
按照本发明，可以提供一种不需要烦杂的分级分离操作的简便而且适用于自动分析装置的LDL胆甾醇或VLDL胆甾醇的定量法。

Claims (21)

1.低密度脂蛋白(LDL)或极低密度脂蛋白(VLDL)中的胆甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶剂的存在下测定试样中的LDL或VLDL中的胆甾醇含量。
2.LDL中的胆甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶剂的存在下测定试样中的LDL中的胆甾醇含量。
3.VLDL中的胆甾醇的定量法，其特征在于，在糖化合物和/或蛋白增溶剂的存在下测定试样中的VLDL中的胆甾醇含量。
4.如权利要求1-3所述的定量法，其中所说的糖化合物是葡萄糖衍生物。
5.如权利要求4所述的定量法，其中所说的糖化合物是由下列通式(I)或通式(II)表示的化合物，所说通式(I)为：
Figure A9619020600021
〔式中，R1、R2和R3可以相同或不同，表示氢原子、取代或非取代烷基、取代或非取代烷酰基、SO3M2(式中，M2表示氢原子或金属原子)、-(葡糖基)p-H(式中，p表示1或2)或-(麦芽糖基)q-H(式中，q表示1或2)；R4和R5可以相同或不同，表示氢原子、金属原子或SO3M3(式中，M3表示氢原子或金属原子)；m表示6-8〕
〔以下称为化合物(I)，对于其他通式编号的化合物同样类推〕；
所说通式(II)为：
Figure A9619020600031
〔式中，R6、R7和R8可以相同或不同，表示氢或SO3M4(式中，M4表示氢原子或金属原子)；R9表示氢原子、OM5(式中，M5表示氢原子或金属原子)或OSO3M6(式中，M6表示氢原子或金属原子)；R10表示氢原子、金属原子或SO3M7(式中，M7表示氢原子或金属原子)；n表示4-8000的整数〕。
6.如权利要求5所述的定量法，其中所说的糖化合物是环糊精衍生物。
7.如权利要求1-6所述的定量法，其中所说的蛋白增溶剂为通式(III)、(IV)或(V)表示的化合物，其中，
通式(III)为：
R11(C2H4O)a-(C3H6O)bR12      (III)
〔式中，a和b表0-200的整数；R11表示R20-X-O-(式中，R20表示烷基或链烯基；X表示单键或CO)，或者H-(CH2CH2O)c-N(R21)-(式中，c表示1-200的整数；R21表示烷基或键烯基)；R12表示C2H4COOR22、C3H6COOR23、C2H4CH(COOR24)2或C2H4CH(COOR25)(COOR26)(式中，R22、R23、R24、R25及R26相同或不同，表示氢原子、金属原子、烷基或链烯基)但是a和b不能同时为0，不过两种成分可以任意的比例存在〕
通式(IV)为：
Figure A9619020600032
(式中，R13、R14、R15、R16和R18相同或不同，表示烷酰基)
通式V为：
R19-Y-SO3M1            (V)
〔式中，R19表示烷基、链烯基或者取代的或非取代的芳基；Y表示单键、
Figure A9619020600041
-O-、-CH(R27)-(式中，R27表示烷基或链烯基)、-CH2CH(OH)(CH2)d-(式中，d表示1-22的整数)、-CH＝CH(CH2)e-(式中，e表示1-22的整数)、-OCOCH(CH2COOR28)-(式中，R28表示烷基或链烯基)或者它们的混合物；M1表示氢原子或金属原子〕。
8.如权利要求7所述的定量法，其中所说的蛋白增溶剂为非离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的定量法，其中，在测定胆甾醇含量时存在二价金属原子盐。
10.如权利要求1-9中任一项所述的定量法，其中，使胆甾醇酯水解酶和胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶在试样中发生反应，通过定量分析由于这种反应而生成的过氧化氢或还原型辅酶来测定胆甾醇的含量，在该测定方法中所用的胆甾醇酯水解酶、胆甾醇氧化酶或胆甾醇脱氢酶是经化学修饰或未修饰的胆甾醇酯酶、经化学修饰或未修饰的胆甾醇氧化酶或经化学修饰或未修饰的胆甾醇脱氢酶。
11.一种用于LDL或VLDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂以糖化合物和/或蛋白增溶剂作为成分。
12.一种用于LDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂以糖化合物和/或蛋白增溶剂作为成分。
13.一种用于VLDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂以糖化合物和/或蛋白增溶剂作为成分。
14.一种用于LDL或VLDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂由糖化合物与蛋白增溶剂组成。
15.一种用于LDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂由糖化合物与蛋白增溶剂组成。
16.一种用于VLDL中的胆甾醇的定量试剂，该试剂由糖化合物与蛋白增溶剂组成。
17.如权利要求11-16中任一项所述的定量试剂，其中所说的糖化合物是葡萄糖衍生物。
18.如权利要求17所述的定量试剂，其中所说的糖化合物是化合物(I)或化合物(II)。
19.如权利要求18所述的定量试剂，其中所说的糖化合物是环糊精衍生物。
20.如权利要求11-19中任一项所述的定量试剂，其中所说的蛋白增溶剂是化合物(III)、化合物(IV)或化合物(V)。
21.如权利要求20所述的定量试剂，其中所说的蛋白增溶剂是非离子型表面活性剂或阴离子型表面活性剂。
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