CN111936861B - 对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂 - Google Patents

对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂 Download PDF

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Abstract

本发明旨在提供用于以更高的精度测定脂蛋白质的吸收能力的方法及试剂。通过将试样中的脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合，通过调制吸收该标记甾醇的脂蛋白质而测定脂蛋白质的标记甾醇的吸收能力，由此解决所述的课题。

Description

对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法及试剂
【技术领域】
本发明涉及对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法。另外，本发明涉及脂蛋白质的吸收能力测定用试剂。再者，本发明涉及在脂蛋白质的吸收能力的测定中使用的试样稀释用试剂及清洗用试剂。
【背景技术】
已知脂质的代谢异常与各种疾病相关，血中的脂质浓度成为疾病的指标。但是，在有脂质浓度不反映疾病的存在或疾病风险等的情况中。从而，不仅是脂质浓度等的量的指标，关注关注于脂蛋白质的功能的质的指标。
例如，有即使血中的高密度脂蛋白质胆甾醇(HDL-C)浓度高，心血管疾病(CVD)风险也不降低的情况，指出HDL-C浓度不完全地反映CVD风险的可能性。关注高密度脂蛋白质(HDL)的功能，报告了从由HDL的末梢组织的胆甾醇的排出功能是对于CVD风险的负的预后因子。
作为研究HDL的功能的方法，例如，在专利文献1中记载了对脂蛋白质的胆甾醇吸收能力进行测定的方法，其包括：通过将试样中的脂蛋白质、附加有标签的胆甾醇和与脂蛋白质特异性地结合的抗体混合，形成含吸收附加有标签的胆甾醇的脂蛋白质和上述的抗体的复合体的工序，通过将此复合体、与上述的标签特异性地结合的捕获体和标记物质结合，对复合体进行标记的工序，和检测从与复合体结合的标记物质发生的信号的工序。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：美国专利申请公开第2017/0315112号说明书
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
在检测目标物质的测定系中，可发生各种非特异性的反应或粒子的凝集。本发明旨在抑制测定系中的非特异反应或粒子凝集。
【用于解决课题的手段】
本发明提供对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法，其包括：通过将试样中的脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合，调制吸收该标记甾醇的脂蛋白质的工序，和基于被该脂蛋白质吸收的标记甾醇的标记而测定对标记甾醇的吸收能力的工序。
本发明提供对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法，其包括：通过将试样中的脂蛋白质、标记甾醇和不具有环状结构的表面活性剂混合，调制吸收该标记甾醇的脂蛋白质的工序，和基于被脂蛋白质吸收的标记甾醇的标记而测定对标记甾醇的吸收能力的工序。
本发明提供标记甾醇和含不具有环状结构的表面活性剂的脂蛋白质的吸收能力测定用试剂。
本发明提供含不具有环状结构的表面活性剂的在脂蛋白质的吸收能力的测定中使用的试样稀释用试剂。
本发明提供含不具有环状结构的表面活性剂的在脂蛋白质的吸收能力的测定中使用的清洗用试剂。
【发明的效果】
根据本发明，在脂蛋白质的吸收能力的测定中，非特异反应或粒子凝集被抑制。
【附图的简单的说明】
【图1A】图1A是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1B】图1B是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1C】图1C是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图1D】图1D是显示本实施方式涉及的试剂盒的外观的一例的图。
【图2】图2是显示磁性粒子的回收效率的坐标图。
【图3】图3是显示使用含各种表面活性剂的反应缓冲液而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图4】图4是显示使用含各种表面活性剂的反应缓冲液而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图5】图5是显示使用含不具有环状结构的表面活性剂的反应缓冲液而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图6】图6是显示使用含不具有环状结构的表面活性剂的反应缓冲液而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图7】图7是显示使用含各种表面活性剂的试样稀释用试剂而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图8】图8是显示使用含不具有环状结构的表面活性剂的试样稀释用试剂而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【图9】图9是显示使用含不具有环状结构的表面活性剂及环糊精的试样稀释用试剂而测定HDL的胆甾醇吸收能力的结果的坐标图。
【具体实施方式】
[1.对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法1]
在本实施方式的测定脂蛋白质的吸收能力的方法(以下，也称为“测定方法”)中，首先，将试样中的脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合。由此混合，在不具有环状结构的表面活性剂的存在下脂蛋白质和标记甾醇相接触，该标记甾醇被脂蛋白质吸收。
在本实施方式中，如后述的实施例所示，通过在不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行上述的混合，与使用具有环状结构的表面活性剂时相比，促进由脂蛋白质的吸收反应。所以，本实施方式的测定方法使以更高的精度测定脂蛋白质的吸收能力变得可能。另外，不具有环状结构的表面活性剂还发挥封闭剂的作用。因此，在本实施方式中，也可不使用牛血清白蛋白(BSA)等的免疫学测定中作为封闭剂一般使用的动物来源蛋白质。动物来源蛋白质有批间的品质不稳定的情况。另外，动物来源蛋白质有与表面活性剂相比，与试样中的成分或添加到测定系的抗体或标记甾醇非特异性地结合的倾向。由于不具有环状结构的表面活性剂是合成品，品质大致一定，对测定的影响与动物来源蛋白质相比轻微。
(不具有环状结构的表面活性剂)
不具有环状结构的表面活性剂是指作为非环式化合物的表面活性剂。不具有环状结构的表面活性剂可从非离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及两性表面活性剂适宜选择，优选为非离子性表面活性剂。
不具有环状结构的非离子性表面活性剂不特别限定，可举出例如，聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧基亚烷基二烷基醚、聚氧基亚烷基烯基醚、聚氧乙烯分歧烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚、聚氧基亚烷基醚、聚乙二醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、聚丙烯二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯椰脂肪酸甘油基、聚氧乙烯固化蓖麻子油、聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯三异硬脂酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基胺、聚氧乙烯烷基丙二胺、脂肪酸二乙醇酰胺、聚氧乙烯脂肪酸单乙醇酰胺等。不具有环状结构的非离子性表面活性剂可单独使用，也可将2种以上组合使用。
在上述的非离子性表面活性剂之中，也优选聚氧乙烯烷基醚及聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。作为聚氧乙烯烷基醚，可举出例如，聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鲸蜡基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯山萮基醚等。在本实施方式中，特别优选聚氧乙烯月桂基醚。聚氧乙烯月桂基醚有市售，可举出例如，日油株式会社的非离子K-230及非离子K-220、花王株式会社的Emulgen123P及Emulgen130K等。
在本实施方式中，作为聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物，优选嵌段共聚物，更优选环氧乙烷和环氧丙烷的三嵌段共聚物。作为这样的嵌段共聚物的非离子性表面活性剂，特别优选下述的式(I)所表示的化合物。
【化1】
(式中，x、y及z相同或不同，是1以上的整数，
聚丙烯氧化物部分的分子量是2750以下)
式(I)所表示的化合物也称为聚丙烯二醇环氧乙烷加成物、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、或者Pluronic(商标)型非离子表面活性剂。
在式(I)中，聚丙烯氧化物部分(以下，也称为“PPO”)的分子量是指-(O-CH(CH3)-CH2)y-所表示的部分的分子量，是指从分子结构式算出的分子量。在本实施方式中，PPO的分子量优选为900以上2750以下，更优选为950以上2750以下，特别更优选为950以上2250以下。由于Pluronic型非离子表面活性剂中的PPO是比较高疏水性的，PPO的分子量越大，表面活性剂的疏水性也变得越大。因此，PPO的分子量比2750高的Pluronic型非离子表面活性剂有作用于脂蛋白质而抑制标记甾醇的吸收的担忧。
式(I)所表示的化合物的平均分子量优选为1000～13000。在式(I)中，x及z的和优选为2～240。另外，在式(I)中，y优选为15～47，更优选为16～47，特别更优选为16～39。在本说明书中，“平均分子量”是由凝胶渗透层析法(GPC)测定的重量平均分子量。
Pluronic型非离子表面活性剂有市售，可举出例如，BASF公司的Pluronic的系列、日油株式会社的Pronon的系列、旭电化工业株式会社的Adeka Pluronic的系列等。Pluronic的系列由将PPO的分子量设在纵轴，将环氧乙烷(EO)含量(％)设在横轴的Pluronic格(参照例如Pitto-Barry A.及Barry N.P.E.,Poly.Chem.,2014,vol.5,p.3291-3297)分类。Pluronic格不仅从学术文献，还从各种制造业者提供。在本实施方式中，也可基于Pluronic格而选择式(I)所表示的化合物。
作为式(I)所表示的Pluronic型非离子表面活性剂，可举出例如，Pluronic L31(PPO的分子量：950、EO含有率：10％)、Pluronic L35(PPO的分子量：950、EO含有率：50％)、Pluronic F38(PPO的分子量：950、EO含有率：80％)、Pluronic L42(PPO的分子量：1200、EO含有率：20％)、Pluronic L43(PPO的分子量：1200、EO含有率：30％)、Pluronic L44(PPO的分子量：1200、EO含有率：40％)、Pluronic L61(PPO的分子量：1750、EO含有率：10％)、Pluronic L62(PPO的分子量：1750、EO含有率：20％)、Pluronic L63(PPO的分子量：1750、EO含有率：30％)、Pluronic L64(PPO的分子量：1750、EO含有率：40％)、Pluronic P65(PPO的分子量：1750、EO含有率：50％)、Pluronic F68(PPO的分子量：1750、EO含有率：80％)、Pluronic L72(PPO的分子量：2050、EO含有率：20％)、Pluronic P75(PPO的分子量：2050、EO含有率：50％)、Pluronic F77(PPO的分子量：2050、EO含有率：70％)、Pluronic L81(PPO的分子量：2250、EO含有率：10％)、Pluronic P84(PPO的分子量：2250、EO含有率：40％)、Pluronic P85(PPO的分子量：2250、EO含有率：50％)、Pluronic F87(PPO的分子量：2250、EO含有率：70％)、Pluronic F88(PPO的分子量：2250、EO含有率：80％)、Pluronic L92(PPO的分子量：2750、EO含有率：20％)、Pluronic P94(PPO的分子量：2750、EO含有率：40％)、Pluronic F98(PPO的分子量：2750、EO含有率：80％)等。
或者，环氧乙烷和环氧丙烷的三嵌段共聚物也可为下述的式(II)所表示的化合物。此化合物也称为反向Pluronic型非离子表面活性剂。
【化2】
(式中，p、q及r相同或不同，是1以上的整数，
聚丙烯氧化物部分的分子量是2750以下)
在式(II)中，聚丙烯氧化物部分的分子量是指-(O-CH(CH3)-CH2)p-及-(O-CH(CH3)-CH2)r-所表示的部分的分子量的合计，是指从分子结构式算出的分子量。在本实施方式中，PPO的分子量优选为900以上2750以下，更优选为950以上2250以下。式(II)所表示的Pluronic型非离子表面活性剂有市售，可举出例如，BASF公司的Pluronic 10R5(PPO的分子量：950、EO含有率：50％)等。
式(II)所表示的化合物的平均分子量优选为1000～13000。在式(II)中，q优选为2～240。另外，在式(II)中，p及r的和优选为15～47，更优选为16～47，特别更优选为16～39。在本说明书中，“平均分子量”是由GPC测定的重量平均分子量。
(含脂蛋白质的试样)
在本实施方式中，试样只要是含哺乳动物的脂蛋白质、优选人的脂蛋白质，就不特别限定。作为这样的试样，可举出例如，血液、血清、血浆等的血液试样、稀释这些试样。
在本实施方式中，脂蛋白质可为HDL、低密度脂蛋白质(LDL)、中间密度脂蛋白质(IDL)、超低密度脂蛋白质(VLDL)、或者乳糜微粒(CM)。HDL是具有1.063g/mL以上的密度的脂蛋白质。LDL是具有1.019g/mL以上且不足1.063g/mL的密度的脂蛋白质。IDL是具有1.006g/mL以上且不足1.019g/mL的密度的脂蛋白质。VLDL是具有0.95g/mL以上且不足1.006g/mL的密度的脂蛋白质。CM是具有0.95g/mL不足的密度的脂蛋白质。在它们之中，本实施方式的测定方法也适宜于HDL的吸收能力的测定。
在本实施方式中，也可由超离心分离法或聚乙二醇(PEG)沉淀法等的公知的方法分离血液试样而取得含指定的脂蛋白质的级分。也可以这样得到的含指定的脂蛋白质的级分作为试样使用。
已知脂蛋白质酯化而吸收胆甾醇。作为标记甾醇，在使用后述的标记胆甾醇时，也可将对于由脂蛋白质的胆甾醇的酯化反应必要的脂肪酸或含其的组合物(例如脂质体)添加到试样中。
在本实施方式中，也可对含脂蛋白质的试样进行稀释。例如，为了调整脂蛋白质浓度，可以将含上述的血液试样或指定的脂蛋白质的级分用水性介质稀释而得到的液作为试样使用。作为这样的水性介质，可举出例如，水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)及Tris-HCl等的缓冲液等。
在本实施方式中，也可将含脂蛋白质的试样在不具有环状结构的表面活性剂的存在下稀释。例如，也可用将不具有环状结构的表面活性剂溶解于上述的水性介质的溶液稀释含脂蛋白质的试样。通过将这样稀释的试样和标记甾醇混合，脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下接触。
作为脂蛋白质的主要的构成成分的ApoAI的浓度成为试样中的脂蛋白质浓度的指标。在本实施方式中，也可取试样的一部分，将其中所含的ApoAI的浓度由公知的免疫学测定法(例如免疫透射比浊法)测定。通过基于得到的ApoAI的浓度而稀释试样，可调整试样中的脂蛋白质浓度。
在本实施方式中，也可将含脂蛋白质的试样在环状寡糖的存在下稀释。例如，也可用将环状寡糖溶解于上述的水性介质的溶液稀释含脂蛋白质的试样。作为环状寡糖，可举出例如，环糊精、甲基-β-环糊精、羟基丙基环糊精等。在本实施方式的测定方法中，环状寡糖包括来源于试样的胆甾醇而作为封闭剂发挥功能。
在本实施方式中，也可将含脂蛋白质的试样在与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分的存在下稀释。例如，也可用将该成分溶解于上述的水性介质的溶液稀释含脂蛋白质的试样。作为与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分，可举出例如，杯芳烃等。杯芳烃与LDL、VLDL及CM结合，但不与HDL结合。在对由HDL的吸收能力进行测定时，通过将杯芳烃添加到试样中，可掩盖来源于试样的LDL、VLDL及CM。
在本实施方式中，也可将含脂蛋白质的试样在用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂的存在下稀释。例如，也可用将该封闭剂溶解于上述的水性介质的溶液稀释含脂蛋白质的试样。由封闭剂的添加抑制例如，向后述的固相或捕获体的标记甾醇的非特异性吸附。封闭剂只要是可抑制标记甾醇被标记胆甾醇以外的物质吸附的成分即可。作为优选的封闭剂，可举出例如，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。此聚合物可为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的均聚物，也可为与其他单体的共聚物。作为其他单体，优选作为疏水性基具有碳原子数1～20的烷基的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物有市售。例如，可举出日油株式会社的Lipidure(商标)的系列，在它们之中，也特别优选Lipidure-BL203。
(标记甾醇)
标记甾醇是具有标记物质的甾醇。以下，将具有标记甾醇的标记物质也称为“第1标记”。在标记甾醇中使用的甾醇只要是被脂蛋白质吸收，就不特别限定。作为这样的甾醇，可举出例如，胆甾醇及其衍生物。作为胆甾醇衍生物，可举出例如，胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆烯-3β-醇等。
在本实施方式中，标记甾醇优选具有标记物质的胆甾醇(以下，也称为“标记胆甾醇”)。在标记胆甾醇中的胆甾醇部分可为具有天然存在的胆甾醇的结构，或者，也可为具有从与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链除1个以上的亚甲基和/或甲基的胆甾醇(也称为去甲胆固醇)的结构。
由于脂蛋白质酯化而吸收胆甾醇，优选使用由脂蛋白质酯化的标记胆甾醇。在本实施方式中，在标记胆甾醇与试样接触时，由该试样中所含的生物体来源的卵磷脂-胆甾醇酰基转移酶(LCAT)酯化。确认由脂蛋白质的标记胆甾醇的酯化的方法本身在现有技术中公知，可由本领域技术人员常规进行。
第1标记只要是能检测被脂蛋白质吸收的标记甾醇的标记物质，就不特别限定。第1标记例如，可为其本身成为检测对象的标签，也可为发生能检测的信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)。
作为第1标记的标签只要是不抑制由脂蛋白质的甾醇的吸收，并且，存在或得到可与该标签特异性地结合的物质，就不特别限定。在以下中，将作为第1标记附加标签的甾醇也称为“附加有标签的甾醇”。同样地，将作为第1标记附加标签的胆甾醇也称为“附加有标签的胆甾醇”。附加有标签的胆甾醇本身在现有技术领域中公知，记载在例如US 2017/0315112 A1(US 2017/0315112 A1由参照整合到本说明书中)。
作为附加有标签的胆甾醇，可举出例如，下述的式(III)所表示的附加有标签的胆甾醇。
【化3】
(式中，R1是也可具有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，
X及Y相同或不同，由-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-表示，其中，R2各自独立地是连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，
L由-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-表示，其中，R3是氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，
TAG是标签，
a及c相同或不同，是0～6的整数，
b是0或1，
d及e相同或不同，是0～12的整数，
f是0～24的整数。)
在式(III)中，a、b及c是均0之时，此式所表示的附加有标签的胆甾醇不具有接头，标签和胆甾醇部分直接键合。在式(III)中，a、b及c之任一者不是0之时，此式所表示的附加有标签的胆甾醇在标签和胆甾醇部分之间具有接头(-[X]a-[L]b-[Y]c-)。认为由接头而露出到脂蛋白质的外表面的标签和捕获体变得容易进一步结合。接下来，对于式(III)的各取代基进行说明。
R1也可以碳原子数1～6的亚烷基作为主链，在任何位置具有甲基。R1相当于与天然存在的胆甾醇的C17位结合的烷基链。在本实施方式中，R1在碳原子数是1～5的情况中，优选在天然存在的胆甾醇中的C20的位置具有甲基。R1在碳原子数是6的情况中，优选为与天然存在的胆甾醇的C20位～C27位的烷基链相同的结构。
[X]a相当于R1和L、[Y]c或标签的连接部分。[Y]c相当于R1、[X]a或L和标签的连接部分。X及Y对应于结合胆甾醇部分和接头的反应及结合接头和标签的反应的种类确定。
关于R2，连键是指其间不经其他原子直接键合。R2是碳原子数1～10的亚烷基之时，作为这样的亚烷基，可举出例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、亚戊基、新亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、2-乙基亚己基、亚壬基及亚癸基等的基。在它们之中，也优选碳原子数1～4的亚烷基。R2是具有取代基的亚烷基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。
R2是亚芳基或杂亚芳基之时，这样的基是也可含选自N、S、O及P的1个以上的杂原子的碳原子数6～12的芳香环即可。例如，可举出亚苯基、亚萘基、亚联苯基、亚呋喃基、亚吡咯基、亚苯硫基、亚三唑基、亚噁二唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基等的基。R2是具有取代基的亚芳基或杂亚芳基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。
R2是环亚烷基或杂环亚烷基之时，这样的基是也可含选自N、S、O及P的1个以上的杂原子的碳原子数3～8的非芳香环即可。例如，可举出环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基、环亚庚基、环亚辛基、亚吡咯烷基、亚哌啶基、亚吗啉基等的基。R2是具有取代基的环亚烷基或杂环亚烷基之时，在上述的碳原子数中，不含取代基的碳原子数。
作为R2中的取代基，例如，羟基、氰基、烷氧基、＝O、＝S、-NO2、-SH、卤素、卤烷基、杂烷基、羧基烷基、胺、酰胺、及硫醚等的基举。R2也可有多个取代基。其中，卤素表示氟、氯、溴、或者碘。烷氧基表示-O-烷基，此烷基是碳原子数1～5、优选为碳原子数1或2的直链状或支链状的饱和脂肪族烃基。
优选为a及c一同是1，X及Y相同或不同，是-(C＝O)-NH-、或者-NH-(C＝O)-。
L相当于间隔物，具有向接头赋予指定的长度的聚合物结构。此聚合物结构部分优选为不抑制由脂蛋白质的胆甾醇的吸收，并且，接头部分难被脂蛋白质吸收的性质。作为这样的聚合物，可举出聚乙二醇(PEG)等的亲水性聚合物。在优选的实施方式中，L是-(CH2)d-[O-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-O]f-(CH2)d-所表示的结构。其中，d及e相同或不同，是0～12的整数、优选2～6的整数、更优选一同为2。f是0～24的整数、优选2～11的整数、更优选为4～11的整数。
标签可为天然来源的物质及合成的物质之任一者，可举出例如，化合物、肽、蛋白质、核酸及它们的组合等。化合物只要是存在或得到可与其特异性地结合的物质，就可为在现有技术中公知的标记化合物，可举出例如，染料化合物等。
在现有技术领域中，已知胆甾醇通过被酯化而脂溶性增大，促进由脂蛋白质的吸收。附加在胆甾醇的标签也可为脂溶性或疏水性的物质。
作为标签和可与该标签特异性地结合的物质的组合，可举出例如，识别抗原和该抗原的抗体、半抗原和抗半抗原抗体、肽或蛋白质和识别它们的适体、配体及其受体、寡核苷酸及具有其互补链的寡核苷酸、生物素和亲和素(或者链霉亲和素)、组氨酸标签(含6～10残基的组氨酸的肽)和镍、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽等。作为标签的抗原，可为在现有技术中公知的肽标签及蛋白标签，可举出例如，FLAG(注册商标)、凝血素(HA)、Myc蛋白质、绿色荧光蛋白质(GFP)等。作为标签的半抗原，可举出例如，2,4-二硝基苯酚等。
附加有标签的甾醇，作为标签，可举出例如，附加下述的式所表示的结构的甾醇：
下述的式(IV)所表示的结构：
【化4】
或者
下述的式(V)所表示的结构：
【化5】
式(IV)所表示的结构是硼二吡咯亚甲基(BODIPY(注册商标))骨架，式(V)所表示的结构表示生物素的一部分。由于作为标签附加了式(IV)或(V)所表示的结构的甾醇一般可得到对于这些标签的捕获体，从而优选。另外，作为标签附加2,4-二硝基苯基(DNP)基的甾醇，也由于抗DNP抗体有市售，从而优选。
作为不具有接头的附加有标签的胆甾醇，可举出例如，下述的式(VI)所表示的荧光标记胆甾醇(23-(二吡咯亚甲基硼二氟)-24-去甲胆固醇、CAS No：878557-19-8)。
【化6】
此荧光标记胆甾醇由Avanti Polar Lipids公司以TopFluor Cholesterol这样的商品名销售。式(VI)所表示的荧光标记胆甾醇是标签(具有BODIPY骨架结构的荧光部分)直接键合于胆甾醇的C23位。作为与具有上述的BODIPY骨架结构的荧光部分特异性地结合的捕获体，抗BODIPY抗体(BODIPY FL Rabbit IgG Fraction、A-5770、Lifetechnologies公司)有市售。
作为标签经接头结合的附加有标签的胆甾醇，可举出下述的式(VII)所表示的生物素附加胆甾醇。
【化7】
(式中，n是0～24的整数、优选2～11的整数、更优选为4～11的整数。)
在此附加有标签的胆甾醇中，标签(式(IV)所表示的生物素部分)经接头(聚乙二醇)而与胆甾醇部分结合。作为与生物素部分特异性地结合的捕获体，亲和素或链霉亲和素是适宜的。另外，结合了辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等的标记物质的亲和素或链霉亲和素也有市售。
另外，作为标签经接头结合的附加有标签的胆甾醇，可举出下述的式(VIII)所表示的DNP附加胆甾醇。
【化8】
在此附加有标签的胆甾醇中，DNP经接头(-(C＝O)-NH-CH2-CH2-NH-)而与胆甾醇部分结合。作为与DNP特异性地结合的捕获体，抗DNP抗体是适宜的。另外，结合了HRP、ALP等的标记物质的抗DNP抗体也有市售。
甾醇部分和标签的结合样式不特别限定，可使甾醇部分和标签结合，也可使甾醇部分和标签经接头而结合。连键段不特别限定，例如，利用官能团的交联是简便且优选的。官能团不特别限定，氨基、羧基及巯基优选可利用市售的交联剂。
胆甾醇由于与C17位结合的烷基链上无官能团，优选在标签的附加中使用该烷基链中具有官能团的胆甾醇衍生物。作为这样的胆甾醇衍生物，可举出例如，胆汁酸的前体、类固醇的前体等。具体而言，优选3β-羟基-Δ5-胆烯酸、24-氨基-5-胆烯-3β-醇等。标签的官能团因标签的种类而不同。例如，在标签中使用肽或蛋白质时，可利用氨基、羧基及巯基(SH基)，在标签中使用生物素时，可利用侧链的羧基。接头优选两端具有官能团的聚合物化合物。再者，在以生物素作为标签附加时，也可使用市售的生物素标记试剂。此试剂含使末端具有氨基等的官能团的各种各样的长度的间隔物臂(PEG等)结合的生物素。
作为第1标记的信号发生物质，可举出例如，荧光物质、显色物质、发光物质、放射性同位素等。这些中，特别优选荧光物质。荧光物质优选含具有有极性结构的荧光团。在现有技术领域中，含具有有极性结构的荧光团的荧光物质本身是公知的。
被信号发生物质标记的甾醇可通过将该物质用公知的方法附加到甾醇来制造。再者，在甾醇中，附加信号发生物质的位置不特别限定，可对应于使用的信号发生物质的种类适宜确定。甾醇和信号发生物质的结合样式不特别限定，优选两者经共价键而直接键合。
作为含荧光物质的甾醇，可举出例如，含具有上述的式(IV)所表示的BODIPY骨架结构的荧光团的荧光标记甾醇等。在本实施方式中，也可使用市售的荧光标记甾醇。例如，作为含具有BODIPY骨架结构的荧光团的甾醇，可举出上述的式(VI)所表示的荧光标记胆甾醇。式(VI)所表示的荧光标记胆甾醇由470～490nm的激发波长发生525～550nm的波长的荧光信号。
(吸收标记甾醇的脂蛋白质的调制)
在本实施方式中，试样中的脂蛋白质和标记甾醇的混合例如，可通过将含脂蛋白质的试样、含标记甾醇的溶液和含不具有环状结构的表面活性剂的溶液混合来进行。混合的顺序不特别限定。将这些混合之后，脂蛋白质开始吸收标记甾醇。由此，可调制吸收标记甾醇的脂蛋白质。或者，也可预先调制含不具有环状结构的表面活性剂及标记甾醇的溶液(以下，也称为“反应缓冲液”)，将此反应缓冲液和含脂蛋白质的试样混合。在试样用含不具有环状结构的表面活性剂的水性介质稀释时，也可将被稀释的试样和含标记甾醇的溶液或反应缓冲液混合。即使在试样被含不具有环状结构的表面活性剂的水性介质稀释时，在脂蛋白质和标记甾醇的接触中，也使用含不具有环状结构的表面活性剂的溶液或上述反应缓冲液即可。
在本实施方式中，试样中的脂蛋白质和标记甾醇的混合也可在上述的环状寡糖及不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。另外，试样中的脂蛋白质和标记甾醇的接触也可在上述的与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分及不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。例如，也可向含标记甾醇的溶液或反应缓冲液添加环状寡糖和/或与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分。
在本实施方式中，试样中的脂蛋白质和标记甾醇的混合也可在用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂的存在下进行。例如，也可向含标记甾醇的溶液或反应缓冲液添加该封闭剂。作为封闭剂，优选上述的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。
标记甾醇的添加量不特别限定，也可以标记甾醇不枯渴的方式略过量地添加。例如，可将标记甾醇以终浓度成为0.1μM以上30μM以下，优选1μM以上10μM以下的方式添加。
不具有环状结构的表面活性剂的添加量可对应于表面活性剂的种类适宜设定。在使用式(I)所表示的化合物时，例如，可以终浓度成为0.001％(v/v)以上0.5％(v/v)以下，优选0.01％(v/v)以上0.1％(v/v)以下的方式添加。在使用聚氧乙烯月桂基醚时，例如，可以终浓度成为0.001％(v/v)以上0.5％(v/v)以下，优选0.01％(v/v)以上0.1％(v/v)以下的方式添加。
在混合中的温度及时间的条件不特别限定。例如，也可将试样和标记甾醇的混合液于20～48℃、优选25～42℃，温育1分钟～24小时、优选10分钟～2小时。温育之间、混合液可静置，也可搅拌或振荡。
(脂蛋白质和第1捕获体的复合体的形成)
本实施方式的测定方法优选还包括将脂蛋白质和与该脂蛋白质结合的第1捕获体混合的工序。由此混合，脂蛋白质和第1捕获体相接触，形成了脂蛋白质和第1捕获体的复合体。第1捕获体只要是可与脂蛋白质的表面的一部分特异性地结合的物质，就不特别限定。作为第1捕获体，优选与脂蛋白质特异性地结合的抗体，更优选可与作为脂蛋白质的构成成分的载脂蛋白特异性地结合的抗体。作为这样的抗体，可举出例如，抗ApoAI抗体、抗ApoAII抗体等。在它们之中，也特别优选抗ApoAI抗体。也可使用市售的抗脂蛋白质抗体及抗ApoAI抗体。
抗脂蛋白质抗体及抗ApoAI抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。抗体的来源不特别限定，也可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马、骆驼等之任一者的哺乳动物的抗体。另外，抗体的同种型可为IgG、IgM、IgE、IgA等之任一者，优选为IgG。在本实施方式中，作为第1捕获体，可使用抗体的片段及其衍生物，可举出例如，Fab片段、F(ab')2片段等。
脂蛋白质和第1捕获体的接触可在脂蛋白质和标记甾醇的接触之前、脂蛋白质和标记甾醇的接触的同时、或者脂蛋白质和标记甾醇的接触之后进行。脂蛋白质和第1捕获体的接触例如，可通过将含脂蛋白质的试样、含标记甾醇的溶液和含第1捕获体的溶液，在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合进行。将含脂蛋白质的试样、标记甾醇和第1捕获体混合的顺序不特别限定。将这些在不具有环状结构的表面活性剂的存在下可同时混合，也可依次混合。第1捕获体的添加量不特别限定，可对应于第1捕获体的种类等而由本领域技术人员适宜设定。
在优选的实施方式中，脂蛋白质和标记甾醇的接触之后，进行该脂蛋白质和第1捕获体的接触。由此，形成了吸收标记甾醇的脂蛋白质和第1捕获体的复合体。例如，首先，将含脂蛋白质的试样和含标记甾醇的溶液在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合而调制吸收标记甾醇的脂蛋白质。进而，将含第1捕获体的溶液混合。此时，在脂蛋白质吸收标记甾醇之后，形成了该脂蛋白质和第1捕获体的复合体。
在作为第1捕获体，使用抗ApoAI抗体时，也可在抗ApoAI抗体和吸收标记甾醇的脂蛋白质接触之前，将该脂蛋白质用氧化剂处理。可由氧化剂的作用改善抗ApoAI抗体和脂蛋白质的反应性。作为这样的氧化剂，可举出例如，过氧化氢、过氧化亚硝酸、二氧化氯、次氯酸等。
在脂蛋白质和第1捕获体的接触中的温度及时间的条件不特别限定。例如，也可将上述的混合液于20～48℃、优选25～42℃，温育1分钟～24小时、优选10分钟～2小时。温育之间、混合液可静置，也可搅拌或振荡。
在本实施方式中，也可使脂蛋白质和第1捕获体的复合体在固相上形成。例如，也可将含脂蛋白质的试样、标记甾醇溶液、含第1捕获体的溶液和固相在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合。另外，也可将含脂蛋白质的试样、标记甾醇溶液和含第1捕获体的溶液在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合之后，将得到的混合液和固相混合。或者，也可将第1捕获体预先固定化于固相上而使用。例如，通过向含脂蛋白质的试样和标记甾醇溶液的混合液添加固定化抗脂蛋白质抗体的固相，在固相上形成复合体。在使用固相时的温度及时间的条件不特别限定。例如，也可为与上述的脂蛋白质和第1捕获体的接触同样的条件。
作为固相，优选能捕获复合体中的第1捕获体的固相。固相的种类不特别限定，可举出例如，物理吸附抗体的材质的固相、固定化与抗体特异性地结合的分子的固相等。作为与抗体特异性地结合的分子，可举出蛋白A或G、特异性地识别抗体的抗体(即第二抗体)等。另外，也可使用介于抗体和固相之间的物质的组合而结合两者。作为这样的物质的组合，可举出生物素和亲和素(或者链霉亲和素)、半抗原和抗半抗原抗体等的组合。例如，在预先生物素修饰第1捕获体时，可由固定化有亲和素或链霉亲和素的固相捕获第1捕获体。
固相的原料可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬、钴及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可组合这些中的2种以上而使用。固相的形状不特别限定，可举出例如，粒子、微平板、微管、试管等。在它们之中，也优选微平板及粒子，特别优选96孔微平板及磁性粒子。
(清洗工序)
在本实施方式中，也可在上述的接触工序和后述的测定工序之间，进行除去未反应的游离成分的清洗工序。此清洗工序含B/F分离及复合体的清洗。未反应的游离成分是指不构成含吸收标记甾醇的脂蛋白质的复合体的成分。例如，可举出未被脂蛋白质吸收的游离的标记甾醇、未与脂蛋白质结合的游离的第1捕获体等。B/F分离的手段不特别限定，例如，通过由超离心分离法等回收仅复合体，可对复合体和未反应的游离成分进行分离。在使复合体在固相上形成时，当固相是粒子时，通过由离心分离或磁分离回收粒子，除去上清，可对复合体和未反应的游离成分进行分离。当固相是微平板或微管等的容器时，通过除去含未反应的游离成分的液，可对复合体和未反应的游离成分进行分离。
在除去未反应的游离成分之后，可将回收的复合体用适合的水性介质清洗。作为这样的水性介质，可举出例如，水、生理盐水、PBS及Tris-HCl等的缓冲液等。在本实施方式中，优选将上述的清洗工序在不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。例如，也可向上述的水性介质溶解不具有环状结构的表面活性剂而调制清洗液，将回收的复合体用该清洗液清洗。在使用固相时，也可将捕获复合体的固相用清洗液清洗。具体而言，向回收的复合体或捕获复合体的固相添加清洗液而再次进行B/F分离。
(吸收能的测定)
在本实施方式的测定方法中，上述的调制工序之后，对由脂蛋白质的对标记甾醇的吸收能力进行测定。吸收能力的测定通过检测来源于被脂蛋白质吸收的标记甾醇的信号来进行。由于此信号反映被脂蛋白质吸收的标记甾醇的量，该信号的检测结果成为脂蛋白质的吸收能力的指标。从而，本实施方式的测定方法也可称为基于来源于被脂蛋白质吸收的标记甾醇的信号而评价脂蛋白质的吸收能力的方法。
在本说明书中，“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及，将信号的强度如“信号不发生”、“弱”、“强”等一样以多个阶段半定量检测。
来源于被脂蛋白质吸收的标记甾醇的信号也可为从标记甾醇直接发生的信号。这样的信号可例如，在作为第1标记而使用具有信号发生物质的标记甾醇时进行检测。即，通过检测从被脂蛋白质吸收的标记甾醇中的第1标记发生的信号，可对吸收能力进行测定。例如，在使用荧光标记甾醇时，对荧光强度进行测定即可。对荧光强度进行测定的方法本身在现有技术领域中公知。例如，可使用分光荧光光度计及荧光板读取器等的公知的测定装置而测定从复合体发生的荧光强度。激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光标记胆甾醇的种类适宜确定。例如，在使用上述的式(VI)的荧光标记胆甾醇时，激发波长从470～490nm的范围确定，荧光波长从525～550nm的范围确定即可。
(标记甾醇和第2捕获体的复合体的形成)
来源于被脂蛋白质吸收的标记甾醇的信号也可为在检测被脂蛋白质吸收的标记甾醇之时发生的信号。为了检测被脂蛋白质吸收的标记甾醇，在本实施方式中，也可使标记甾醇和与该标记甾醇结合的第2捕获体接触而使复合体形成。此时，标记甾醇优选附加有标签的甾醇，更优选附加有标签的胆甾醇。另外，第2捕获体优选与标签特异性地结合的物质。
被脂蛋白质吸收的附加有标签的胆甾醇的检测原理如以下。通常，当胆甾醇被脂蛋白质吸收时，从该脂蛋白质粒子的表层向中心部移动。在附加有标签的胆甾醇中，认为被脂蛋白质吸收的是胆甾醇部分，标签露出到脂蛋白质的外表面。其中，“脂蛋白质的外表面”是指脂蛋白质粒子的外侧的面。“露出到外表面”是指存在于脂蛋白质的外表面上，及从脂蛋白质的外表面突出这两方。在本实施方式中，使此露出到外表面的标签和与该标签特异性地结合的第2捕获体接触，形成复合体。进而，通过检测此复合体中的第2捕获体，检测被脂蛋白质吸收的胆甾醇。
与标签特异性地结合的物质可对应于标签的种类适宜确定。例如，可参照上述的标签和可与该标签特异性地结合的物质的组合而从抗体、配体受体、寡核苷酸、生物素、亲和素(或者链霉亲和素)、组氨酸标签或镍、GST或谷胱甘肽等选择。在它们之中，也优选与标签特异性地结合的抗体。这样的抗体可为市售的抗体，也可为由现有技术中公知的方法制作的抗体。抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。抗体的来源及同种型不特别限定，与对于抗HDL抗体所述的同样。另外，可使用抗体的片段及其衍生物，可举出例如，Fab片段、F(ab')2片段等。
在本实施方式中，优选在形成吸收标记甾醇的脂蛋白质和第1捕获体的复合体之后，进行该标记甾醇和第2捕获体的接触。特别是，优选在固相上形成吸收标记甾醇的脂蛋白质和第1捕获体的复合体之后，进行该标记甾醇和第2捕获体的接触。由此，形成了第1捕获体、吸收标记甾醇的脂蛋白质和第2捕获体的复合体。在此复合体中，吸收标记甾醇的脂蛋白质处于被第1捕获体及第2捕获体夹的状态。在本实施方式中，将第1捕获体、吸收标记甾醇的脂蛋白质和第2捕获体的复合体也称为“夹心复合体”。
在标记甾醇和第2捕获体的接触中的温度及时间的条件不特别限定。例如，也可将含脂蛋白质和第1捕获体的复合体的溶液和含第2捕获体的溶液的混合物于4～60℃、优选25～42℃，温育1秒钟～24小时、优选10分钟～2小时。温育之间、混合物可静置，也可搅拌或振荡。
(第2标记)
第2捕获体优选被第2标记标记。在第2捕获体被第2标记标记时，通过检测来源于标记甾醇和第2捕获体的复合体中的第2标记的信号，可对吸收能力进行测定。
第2标记可为信号发生物质，可使用催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质。作为信号发生物质，可举出例如，荧光物质、放射性同位素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，可举出例如酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(注册商标)、花青苷系染料等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素，可举出125I、14C、32P等。在它们之中，也优选酶，特别优选碱性磷酸酶及过氧化物酶。
在本实施方式中，由第2标记的第2捕获体的标记可通过使第2捕获体直接或间接结合第2标记来进行。例如，可使用市售的标记试剂盒等而使第2标记与第2捕获体直接键合。另外，也可通过使用将可与第2捕获体特异性地结合的抗体用第2标记标记而得到的第二抗体，将第2标记与第2捕获体间接结合。在本实施方式中，可使用结合了第2标记的第2捕获体，也可使用第2捕获体和具有第2标记的第二抗体。
在本实施方式中，也可在进行信号的检测之前，进行除去未反应的游离成分的清洗工序。作为未反应的游离成分，可举出例如，未与标签结合的游离的第2捕获体、未与第2捕获体结合的游离的第2标记等。对于清洗的具体性的方法及清洗液，与上述的清洗工序同样。
(来源于第2标记的信号的检测)
检测来源于第2标记的信号的方法本身在现有技术领域中公知。在本实施方式中，可对应于来源于第2标记的信号的种类，选择适合的测定方法。例如，在第2标记是酶时，可通过使用公知的装置测定通过酶和针对该酶的底物反应而发生的光、色等的信号来进行。作为这样的测定装置，可举出分光光度计、发光计等。
酶的底物可对应于该酶的种类而从公知的底物适宜选择。例如，在作为酶，使用过氧化物酶时，作为底物，可举出LUMINOR及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色底物。另外，在作为酶，使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。
在第2标记是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置测定作为信号的放射线。另外，在第2标记是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光物质的种类适宜确定。
在优选的实施方式中，提供测定脂蛋白质的吸收能力的方法，其包括以下的工序：
通过在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合试样中的脂蛋白质和附加有标签的甾醇，调制吸收该附加有标签的甾醇的脂蛋白质的工序；
在不具有环状结构的表面活性剂的存在下在固相上形成吸收该附加有标签的胆甾醇的脂蛋白质和与脂蛋白质特异性地结合的第1捕获体的复合体的工序；
通过用含不具有环状结构的表面活性剂的水性介质清洗该固相，除去未反应成分的工序；
清洗后，通过将固相上的复合体和与标签特异性地结合的第2捕获体混合，在固相上形成含吸收附加有标签的胆甾醇的脂蛋白质、第1捕获体和第2捕获体的夹心复合体的工序；及
通过对该夹心复合体进行测定，测定对标记甾醇的吸收能力的工序。
在优选的实施方式中，提供测定脂蛋白质的吸收能力的方法，其包括以下的工序：
通过将不具有环状结构的表面活性剂(第1表面活性剂)、试样中的脂蛋白质和附加有标签的甾醇混合，调制吸收该附加有标签的甾醇的脂蛋白质的工序；
通过将吸收该附加有标签的胆甾醇的脂蛋白质、不具有环状结构的表面活性剂(第2表面活性剂)和与脂蛋白质特异性地结合的第1捕获体混合，在固相上形成复合体的工序；
通过用含不具有环状结构的表面活性剂(第3表面活性剂)的水性介质清洗该固相，除去未反应成分的工序；
清洗后，通过将固相上的复合体和与标签特异性地结合的第2捕获体混合，在固相上形成含吸收附加有标签的胆甾醇的脂蛋白质、第1捕获体和第2捕获体的夹心复合体的工序；及
通过对该夹心复合体进行测定，测定对标记甾醇的吸收能力的工序。
在此实施方式中，第1～第3表面活性剂之中，可为至少2个表面活性剂是同种，也可为第1～第3表面活性剂是各自别种的表面活性剂。
在优选的实施方式中，在吸收标记甾醇的脂蛋白质的调制工序中，基本上不含具有环状结构的表面活性剂。另外，在含脂蛋白质的试样的稀释工序中，基本上不含具有环状结构的表面活性剂。另外，在除去未反应的游离成分的清洗工序中，基本上不含具有环状结构的表面活性剂。即，在本实施方式的测定方法中，在任何工序中，也优选不使用具有环状结构的表面活性剂。在本实施方式中，即使在微量混入来源于使用的试样或试剂的具有环状结构的表面活性剂时，也不影响吸收能力的测定结果时，看作基本上不含具有环状结构的表面活性剂。
(脂质异常症的判断方法)
在进一步的实施方式中，也可将在上述的测定方法中得到的脂蛋白质的吸收能力的结果在受试者是脂质异常症与否的判断中利用。即，提供辅助脂质异常症的判断的方法，其包括以下的工序：
通过将从受试者得到的试样中的脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合，调制吸收标记甾醇的脂蛋白质的工序，
基于被上述脂蛋白质吸收的标记甾醇而测定上述脂蛋白质对标记甾醇的吸收能力的工序，及
基于测定结果而取得关于上述的受试者的脂质异常的信息的工序。
通过由本实施方式的测定方法蓄积从健康者及脂质异常症患者的试样得到的信号测定值的数据，可确定关于脂蛋白质的吸收能力的阈值或基准范围。进而，通过对其阈值或基准范围和使用受试者的试样时的信号测定值进行比较，可取得关于该受试者的脂质异常的信息、即，受试者的脂蛋白质的吸收能力在正常或基准的范围内与否的信息。可基于此信息而辅助受试者是脂质异常症与否的判断。
[2.对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法2]
在本实施方式的测定方法中，混合试样中的脂蛋白质、标记甾醇和不具有环状结构的表面活性剂。由此混合调制吸收该标记甾醇的脂蛋白质。
脂蛋白质、标记甾醇、及不具有环状结构的表面活性剂的混合顺序不特别限定。在一实施方式中，在混合工序中，首先将脂蛋白质和不具有环状结构的表面活性剂混合，其后添加标记甾醇。在对含脂蛋白质的试样进行稀释时，可使用含不具有环状结构的表面活性剂的试样稀释用试剂，也可在稀释的前和/或后将不具有环状结构的表面活性剂添加到试样中。
在别的实施方式中，在混合工序中，将脂蛋白质和含标记甾醇及不具有环状结构的表面活性剂的试剂混合。在别的实施方式中，在混合工序中，首先将脂蛋白质和标记甾醇混合，其后添加表面活性剂。
在别的实施方式中，混合工序包括将脂蛋白质和不具有环状结构的表面活性剂混合的第1工序，及向此混合液进一步混合含标记甾醇及不具有环状结构的表面活性剂的试剂的第2工序。在第1工序中使用的不具有环状结构的表面活性剂和第2工序中使用的不具有环状结构的表面活性剂可为同种，也可为别种。
本实施方式的测定方法的其他事项与在[1.对脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法1]中所述的同样。
[3.脂蛋白质的吸收能力测定用试剂]
在本发明的范围中，也含在上述的测定方法中使用的试剂。即，提供标记甾醇和含不具有环状结构的表面活性剂的脂蛋白质的吸收能力测定用试剂(以下，也称为“测定用试剂”)。标记甾醇及不具有环状结构的表面活性剂的详细如上所述。本实施方式的测定用试剂可作为上述的反应缓冲液使用。
不具有环状结构的表面活性剂优选从非离子性表面活性剂选择。作为这样的非离子性表面活性剂，优选聚氧乙烯月桂基醚及聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。作为聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物，优选嵌段共聚物，更优选环氧乙烷和环氧丙烷的三嵌段共聚物。作为这样的嵌段共聚物的非离子性表面活性剂，特别优选上述的式(I)所表示的化合物。
标记甾醇优选上述的附加有标签的甾醇、或具有上述的信号发生物质的甾醇。作为附加有标签的甾醇，可举出上述的式(III)所表示的附加有标签的胆甾醇。在它们之中，也优选上述的式(VI)、(VII)及(VIII)所表示的附加有标签的胆甾醇。作为具有信号发生物质的甾醇，可举出荧光标记甾醇。作为荧光标记甾醇，可举出例如，上述的式(VI)所表示的荧光标记胆甾醇。
本实施方式的测定用试剂优选处于向适合的水性介质溶解标记甾醇及不具有环状结构的表面活性剂的溶液的形态。这样的水性介质只要是不抑制由脂蛋白质的吸收反应，就不特别限定。作为这样的水性介质，可举出例如，水、生理盐水、PBS及Tris-HCl等的缓冲液等。
在测定用试剂中的不具有环状结构的表面活性剂的浓度在将测定用试剂和含脂蛋白质的试样混合之时，可使该表面活性剂的终浓度在0.001％(v/v)以上0.5％(v/v)以下，优选为0.01％(v/v)以上0.1％(v/v)以下的浓度即可。从而，在测定用试剂中的不具有环状结构的表面活性剂的浓度可从测定用试剂和试样的混合比确定。在本实施方式中，在测定用试剂中的不具有环状结构的表面活性剂的浓度例如是0.002％(v/v)以上10％(v/v)以下，优选为0.005％(v/v)以上5％(v/v)以下。
在测定用试剂中的标记甾醇的浓度在将测定用试剂和含脂蛋白质的试样混合之时，可使该标记甾醇的终浓度在0.1μM以上30μM以下，优选为1μM以上10μM以下的浓度即可。从而，在测定用试剂中的标记甾醇的浓度可从测定用试剂和试样的混合比确定。在本实施方式中，在测定用试剂中的标记甾醇的浓度例如是0.2μM以上600μM以下，优选为2μM以上200μM以下。
本实施方式的测定用试剂也可含环状寡糖。作为环状寡糖，可举出例如，环糊精、甲基-β-环糊精、羟基丙基环糊精等。在测定用试剂中的环状寡糖的浓度不特别限定，例如0.2mM以上20mM以下，优选为1mM以上10mM以下。
本实施方式的测定用试剂也可含与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分。作为这样的成分，可举出例如，杯芳烃等。在测定用试剂中的该成分的浓度不特别限定，在使用杯芳烃时，例如0.1μM以上0.1mM以下，优选为1μM以上5μM以下。
本实施方式的测定用试剂也可含用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂。作为这样的封闭剂，可举出例如，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。此聚合物的详细如上所述。作为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物，优选日油株式会社的Lipidure(商标)的系列，特别优选LipidureBL-203。在测定用试剂中的该封闭剂的浓度不特别限定，在使用2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物时，例如0.01％(w/w)以上5％(w/w)以下，优选为0.05％(w/w)以上2％(w/w)以下。
在优选的实施方式中，测定用试剂基本上不含具有环状结构的表面活性剂。在本实施方式中，即使在微量混入来源于测定用试剂的调制中使用的原料等的具有环状结构的表面活性剂时，也不影响吸收能力的测定结果时，看作基本上不含具有环状结构的表面活性剂。
在本发明的范围中，也含标记甾醇和不具有环状结构的表面活性剂用于制造脂蛋白质的吸收能力测定用试剂的用途。即，本发明还涉及标记甾醇及不具有环状结构的表面活性剂用于制造脂蛋白质的吸收能力测定用试剂的用途。
[4.试样稀释用试剂及清洗用试剂]
在本发明的范围中，也含在测定脂蛋白质的吸收能力中使用的试样稀释用试剂及清洗用试剂。即，提供含不具有环状结构的表面活性剂的试样稀释用试剂及清洗用试剂。不具有环状结构的表面活性剂的详细如上所述。
试样稀释用试剂在本实施方式的测定方法中，可在稀释含脂蛋白质的试样时使用。试样稀释用试剂由于含不具有环状结构的表面活性剂，通过将用此试剂稀释的试样和标记甾醇混合，脂蛋白质和标记甾醇可在不具有环状结构的表面活性剂的存在下接触。
在本实施方式的测定方法中，清洗用试剂可在除去未反应的游离成分的清洗工序中使用。通过使用含不具有环状结构的表面活性剂的清洗用试剂，可如后述的实施例所示，改善作为固相的磁性粒子的回收效率。
试样稀释用试剂及清洗用试剂优选处于向适合的水性介质溶解不具有环状结构的表面活性剂的溶液的形态。这样的水性介质只要是不抑制由脂蛋白质的吸收反应，就不特别限定。作为这样的水性介质，可举出例如，水、生理盐水、PBS及Tris-HCl等的缓冲液等。
不具有环状结构的表面活性剂优选从非离子性表面活性剂选择。作为这样的非离子性表面活性剂，优选聚氧乙烯月桂基醚及聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。作为聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物，优选嵌段共聚物，更优选环氧乙烷和环氧丙烷的三嵌段共聚物。作为这样的嵌段共聚物的非离子性表面活性剂，特别优选上述的式(I)所表示的化合物。在试样稀释用试剂及清洗用试剂中的不具有环状结构的表面活性剂的浓度不特别限定，例如0.002％(v/v)以上10％(v/v)以下，优选为0.005％(v/v)以上5％(v/v)以下。
试样稀释用试剂也可含环状寡糖。作为环状寡糖，可举出例如，环糊精、甲基-β-环糊精、羟基丙基环糊精等。在各试剂中的环状寡糖的浓度不特别限定，例如0.2mM以上20mM以下，优选为1mM以上10mM以下。
试样稀释用试剂也可含与和测定对象的脂蛋白质不同的脂蛋白质结合的成分。作为这样的成分，可举出例如，杯芳烃等。在各试剂中的该成分的浓度不特别限定，在使用杯芳烃时，例如1μM以上1mM以下，优选为10μM以上50μM以下。
试样稀释用试剂及清洗用试剂也可含用于防止标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂。作为这样的封闭剂，可举出例如，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。此聚合物的详细如上所述。作为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物，优选日油株式会社的Lipidure(商标)的系列，特别优选LipidureBL-203。在各试剂中的该封闭剂的浓度不特别限定，在使用2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物时，例如0.01％(w/w)以上5％(w/w)以下，优选为0.05％(w/w)以上2％(w/w)以下。
在优选的实施方式中，试样稀释用试剂及清洗用试剂基本上不含具有环状结构的表面活性剂。在本实施方式中，即使在微量混入来源于试样稀释用试剂及清洗用试剂的调制中使用的原料等的具有环状结构的表面活性剂时，也不影响吸收能力的测定结果时，看作基本上不含具有环状结构的表面活性剂。
在本发明的范围中，也含不具有环状结构的表面活性剂用于制造试样稀释用试剂或清洗用试剂的用途。即，本发明还涉及不具有环状结构的表面活性剂用于制造在测定脂蛋白质的吸收能力中使用的试样稀释用试剂或清洗用试剂的用途。
[5.脂蛋白质的吸收能力测定用试剂盒]
在本发明的范围中，也含在上述的测定方法中使用的试剂盒。此试剂盒含上述的测定用试剂、试样稀释用试剂及清洗用试剂。即，提供脂蛋白质的吸收能力测定用试剂盒(以下，也称为“试剂盒”)，其具备：标记甾醇和含不具有环状结构的表面活性剂的脂蛋白质的吸收能力测定用试剂、含不具有环状结构的表面活性剂的试样稀释用试剂、及含不具有环状结构的表面活性剂的清洗用试剂。各试剂及这些中所含的各成分的详细如上所述。脂蛋白质的吸收能力测定用试剂中所含的不具有环状结构的表面活性剂、试样稀释用试剂中所含的不具有环状结构的表面活性剂、及清洗用试剂中所含的不具有环状结构的表面活性剂之中，可为至少2个表面活性剂是同种，也可为上述3个表面活性剂是各自别种的表面活性剂。
收容上述的试剂的容器也可收容在箱而提供于使用者。此箱可为将上述的试剂全部同装的，也可为收容一部分的试剂。在此箱中，也可同装记载各试剂的使用方法等的附带文书。
在图1A显示本实施方式的试剂盒的一例。图中，10表示试剂盒，11表示收容测定用试剂的第1容器，12表示收容试样稀释用试剂的第2容器，13表示收容清洗用试剂的第3容器，14表示捆包箱，15表示附带文书。
本实施方式的试剂盒也可还具备含第1捕获体的试剂和含第2捕获体的试剂。第2捕获体也可被第2标记标记。在图1B显示进一步的实施方式的试剂盒的一例。图中，20表示试剂盒，21表示收容测定用试剂的第1容器，22表示收容试样稀释用试剂的第2容器，23表示收容清洗用试剂的第3容器，24表示收容含第1捕获体的试剂的第4容器，25表示收容含第2捕获体的试剂的第5容器，26表示捆包箱，27表示附带文书。
本实施方式的试剂盒也可还具备用于使第1捕获体固定化的固相。固相可收容在箱，也可与收容试剂的箱不同地包装。在图1C显示还具备固相的试剂盒的一例。再者，固相的详细如上所述。图中，30表示试剂盒，31表示收容测定用试剂的第1容器，32表示收容试样稀释用试剂的第2容器，33表示收容清洗用试剂的第3容器，34表示收容含第1捕获体的试剂的第4容器，35表示收容含第2捕获体的试剂的第5容器，36表示作为固相的96孔微平板，37表示捆包箱，38表示附带文书。固相也可为磁性粒子。此时，图中的36也可为收容磁性粒子的第6容器。
在第2捕获体被作为第2标记的酶标记时，本实施方式的试剂盒也可还具备该酶的底物。在图1D显示还具备酶的底物的试剂盒的一例。再者，底物的详细如上所述。图中，40表示试剂盒，41表示收容测定用试剂的第1容器，42表示收容试样稀释用试剂的第2容器，43表示收容清洗用试剂的第3容器，44表示收容含第1捕获体的试剂的第4容器，45表示收容含被酶标记的第2捕获体的试剂的第5容器，36表示收容酶的底物的第6容器，47表示捆包箱，48表示附带文书。
接下来，将本发明由实施例详细地说明，但本发明不限定于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：磁性粒子的回收效率的探讨】
在作为固相使用磁性粒子的ELISA法中，在B/F分离之后，一般使用含表面活性剂的清洗液而清洗磁性粒子。但是，在脂蛋白质的胆甾醇吸收能力的测定中，有表面活性剂作用于脂蛋白质而影响测定结果的担忧。从而，使用不含表面活性剂的清洗液、或者含Pluronic型非离子性表面活性剂的清洗液而进行磁性粒子的清洗。
向微管放入30μL的1％HISCL磁性粒子(Sysmex株式会社)，用PBS或0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS清洗。清洗后，对磁性粒子进行集磁而除上清，对可回收的磁性粒子的重量进行测定。在图2显示用各清洗液清洗之后的磁性粒子的回收效率。
如图2所示，当用作为不含表面活性剂的清洗液的PBS清洗磁性粒子时，回收效率降低。从而得知，当使用不含表面活性剂的清洗液时，发生磁性粒子吸附到反应容器而磁性粒子的回收效率降低这样的别的问题。与此相比，通过用含0.1％(v/v)Pluronic F68的清洗液清洗磁性粒子，大幅地改善回收效率。
【实施例2：表面活性剂对胆甾醇吸收反应的影响的探讨】
为了探讨表面活性剂对脂蛋白质的胆甾醇吸收能力的影响，使用含各种表面活性剂的反应缓冲液而测定胆甾醇吸收能力。作为表面活性剂，使用Pluronic F68(Thermo公司)、Pluronic L31(BASF公司)、Pluronic L35(BASF公司)、Pluronic 10R5(BASF公司)、Triton X-100(Sigma-Aldrich公司)、脱氧胆酸(和光纯药工业株式会社)、NP-40(Calbiochem公司)、Tween20(Sigma-Aldrich公司)及CHAPS(同仁化学研究所)。
(1)生物体试样
将与健康者的血清(0.1mL)等量的22％聚乙二醇4000(和光纯药工业株式会社)混合而得到悬浮液。将得到的悬浮液于室温静置20分钟之后，以3000rpm于室温离心分离15分钟。以得到的上清作为HDL级分回收。
(2)在表面活性剂的存在下的HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
(2.1)反应缓冲液的调制
将表1中所示的成分混合而调制反应缓冲液。在表1中，各成分的量的单位全部是“μL”。表中，表面活性剂是指Pluronic F68、Pluronic L31、Pluronic L35、Pluronic 10R5、Triton X-100、脱氧胆酸、NP-40、Tween20及CHAPS之任一者1个。在实施例2中，将反应缓冲液和试样混合之时的各成分的终浓度如下。各表面活性剂是0.1％(v/v)、甘油是2％(v/v)、Lipidure(商标)BL203是0.1％(v/v)、甲基-β-环糊精是1mM、脂质体是0.5％(v/v)、DNP附加胆甾醇是7.5μM。对于一部分的表面活性剂，以终浓度成为0.001％(v/v)、0.003％(v/v)、0.01％(v/v)或0.03％(v/v)的方式调制反应缓冲液。表1的脂质体的组成是2mM二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、2mM胆甾醇及4mM氢加成大豆磷脂酰胆碱。向水溶解Phosphate bufferedsaline tablet(Sigma-Aldrich公司)而调制PBS。DNP附加胆甾醇参照US 2017/0315112 A1而调制。
【表1】
成分 无表面活性剂 有表面活性剂
PBS 953 941
50％甘油 48 48
表面活性剂 0 12
Lipidure(商标)-BL203 1.2 1.2
20mM甲基-β-环糊精 60 60
脂质体 6 6
0.75mM DNP附加胆甾醇 12 12
合计 1080 1080
(2.2)测定用试样的调制
(i)生物体试样的稀释
将HDL-C试剂·KL“Kokusai”(Sysmex株式会社)中附带的分级分离液用PBS稀释为1.85％而调制试样稀释用试剂。在此试样稀释用试剂中，含来源于HDL-C试剂·KL“Kokusai”中附带的分级分离液的非离子K-230、杯芳烃及环糊精。从上述的HDL级分取一部分，使用ApoAI测定用试剂盒(N-测定TIA ApoAI-H、NITTOBO MEDICAL株式会社)而测定ApoAI浓度。浓度测定的具体性的操作根据附带在该试剂盒的手册进行。测定后，将HDL级分用试样稀释用试剂稀释而调制ApoAI浓度是1,000ng/mL的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照受试体(ApoAI浓度0ng/mL)，使用试样稀释用试剂。
(ii)HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
向含表面活性剂的反应缓冲液(1080μL)及不含表面活性剂的反应缓冲液(1080μL)各自添加含有HDL级分的稀释液(120μL)而混合，在冰上静置1小时。从得到的混合物各取500μL而移到1.5mL low-binding管，于42℃、以1,000rpm振荡20分钟。由此，使HDL和DNP附加胆甾醇在表面活性剂的存在下接触而促进由HDL的DNP附加胆甾醇的吸收反应。其后，将管于室温静置5分钟，得到测定用试样。对于对照受试体，也同样地处理。
(3)由HDL的胆甾醇吸收能力的测定
(3.1)测定用板的准备(固定化于抗ApoAI抗体的固相)
向作为固相的96孔微平板(荧光测定用黑色板H、住友Bakelite株式会社制)的各孔添加各200μL的50mM Tris-HCl(pH 7.5)而清洗。将此清洗操作合计进行2次。向各孔添加各100μL的用50mM Tris-HCl(pH 7.5)稀释为10μg/mL的浓度的抗ApoAI抗体(clone 8E10)的溶液，于4℃一晚静置。除去抗体溶液，向各孔添加各200μL的138mM NaCl水溶液而清洗。将此清洗操作合计进行3次。向各孔添加各200μL的2％BSA/PBS，于25℃、以600rpm振荡1小时。
(3.2)在固相上的HDL和抗ApoAI抗体的复合体的形成
从固定化抗ApoAI抗体的板除去BSA溶液，将各100μL各测定用试样添加到孔中。将板于42℃、以1,000rpm振荡20分钟而使HDL和抗ApoAI抗体的复合体形成。从各孔除测定用试样，添加各200μL含138mM NaCl及0.1％Pluronic F68的线清洗液而清洗孔。将此清洗操作合计进行3次。在实施例1中，调制2个捕获这样复合体的板。
(3.3)被HDL吸收的附加有标签的胆甾醇的检测
将抗DNP抗体(委托北山LABES株式会社制作)使用ALP Labeling Kit-SH(Dojindo)而进行ALP标记而调制ALP标记抗DNP抗体。将得到的ALP标记抗DNP抗体用HISCLR3缓冲液(Sysmex株式会社)以1:500稀释。在上述的2个板之中的1个中，将各100μL的ALP标记抗DNP抗体的稀释液添加到各孔中。将板于25℃、以600rpm振荡1小时。从各孔除抗体溶液，添加各200μL含138mM NaCl及0.1％Pluronic F68的线清洗液而清洗孔。将此清洗操作合计进行3次。向各孔添加各100μL的ALP的底物溶液。将作为HISCL发光底物(Sysmex株式会社)的R4试剂和R5试剂以1:2的比例混合而调制该底物溶液。将板于25℃、以600rpm振荡30分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200 Pro、TECAN公司制)测定。测定结果示于图3～6。再者，图3及图4中的“PF68”是指Pluronic F68。
(3.4)被捕获的复合体的量的测定
在调制的2个板之中的其余的1个中，将各100μL以1:8000稀释的ALP标记抗ApoAI抗体(clone PIA5)的溶液添加到各孔中。将板于25℃、以600rpm振荡1小时。从各孔除抗体溶液，添加各200μL含138mM NaCl及0.1％Pluronic F68的线清洗液而清洗孔。将此清洗操作合计进行3次。向各孔添加各100μL的ALP的底物溶液。将板于25℃、以600rpm振荡30分钟之后，将发光量用酶标仪(Infinite(注册商标)F200 Pro、TECAN公司制)测定。测定结果未图示，在受试体间，在被捕获的复合体的量上确认不到大的差异。
(4)结果
如图3及4所示，在使用含Triton X-100、脱氧胆酸、NP-40、Tween20或CHAPS的反应缓冲液时，显示胆甾醇吸收能力的信号(黑色条)大大减少。这些表面活性剂是在免疫测定中一般使用的具有环状结构的表面活性剂在绝大部分的表面活性剂中降低至与背景(灰色条)同水平。这被认为是，表面活性剂作用于脂蛋白质及标记胆甾醇而吸收反应被抑制，或者，被吸收的胆甾醇漏出。
一方面，如图3～5所示，在使用含作为不具有环状结构的表面活性剂的PluronicF68、Pluronic L31、Pluronic L35、Pluronic 10R5的反应缓冲液时，得到了显示与使用不含表面活性剂的反应缓冲液时同等的吸收能力的信号。另外，图6显示，在使用含PluronicF68的反应缓冲液时，与使用不含表面活性剂的反应缓冲液时比较而显示吸收能力的信号增强。再者，在图3～6中的“无表面活性剂”表示使用不含表面活性剂的反应缓冲液。此反应缓冲液不含表面活性剂，在被稀释的试样中，含作为不具有环状结构的表面活性剂的非离子K-230。此非离子K-230来源于试样稀释用试剂。从而，在“无表面活性剂”中，HDL和附加有标签的胆甾醇的混合在不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。
以上显示，通过在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合脂蛋白质和标记胆甾醇，可良好地检测显示由脂蛋白质的胆甾醇吸收能力的信号。
【实施例3：表面活性剂对试样稀释用试剂的适用】
在实施例2中，在使用不含表面活性剂的反应缓冲液时，也可良好地检测显示由HDL的胆甾醇吸收能力的信号。其中，在实施例2中，用于对含脂蛋白质的试样进行稀释的试剂中含不具有环状结构的非离子性表面活性剂的非离子K-230。从而，为了探讨表面活性剂对试样的稀释的影响，使用含各种表面活性剂的试样稀释用试剂而测定胆甾醇吸收能力。作为不具有环状结构的表面活性剂，使用非离子K-230(日油株式会社制)、Pluronic L31、Pluronic L61及Pluronic P84(均BASF公司制)。作为具有环状结构的表面活性剂，使用Triton X-100(Sigma-Aldrich制)及Tween20(Sigma-Aldrich公司制)。吸收能力的测定由作为固相使用磁性粒子的ELISA法进行。
(1)生物体试样
从HDL-胆甾醇值高的5个临床受试体(血清)的混合物与实施例2同样地调制HDL级分。
(2)在表面活性剂的存在下的HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
(2.1)试样稀释用试剂的调制
作为试样稀释用试剂，调制含0.01％(v/v)或0.1％(v/v)非离子K-230、0.1％(v/v)Pluronic L31、0.01％(v/v)或0.1％(v/v)Pluronic L61、0.01％(v/v)Pluronic P84、0.1％(v/v)Tween20、或者0.1％(v/v)Triton X-100的PBS。
(2.2)测定用试样的调制
(i)生物体试样的稀释
从上述的HDL级分取一部分，与实施例2同样地，对ApoAI浓度进行测定。测定后，将HDL级分用各试样稀释用试剂稀释而调制ApoAI浓度是450ng/mL的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照试样(ApoAI浓度0ng/mL)，使用试样稀释用试剂。
(ii)HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
与实施例2同样地，调制含0.1％(v/v)Pluronic F68及7.5μM DNP附加胆甾醇的反应缓冲液。向比色杯添加反应缓冲液(60μL)及含有HDL级分的稀释液(10μL)而混合，在冰上静置30分钟。将比色杯于42℃静置1分钟，得到测定用试样。对于对照试样，也同样地处理。
(3)由HDL的胆甾醇吸收能力的测定
(3.1)在磁性粒子上的HDL和抗ApoAI抗体的复合体的形成
将抗ApoA1抗体(clone 8E10)用2-巯基乙基胺盐酸盐(NACALAI TESQUE)还原，用Biotin-PEAC5-maleimide(Dojindo)标记而调制生物素化ApoAI抗体。向含反应缓冲液及含有HDL级分的稀释液的比色杯添加30μL的2.5ng/μL生物素化ApoAI抗体而于42℃反应12分钟。反应后，向比色杯添加30μL的HISCL磁性粒子(Sysmex株式会社)而于42℃反应10分钟。由于在HISCL磁性粒子的表面固定了亲和素，复合体中的生物素化抗ApoAI抗体与磁性粒子的表面结合。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而清洗磁性粒子。将此清洗操作合计进行3次。进而，对磁性粒子进行集磁而除去上清。
(3.2)被HDL吸收的附加有标签的胆甾醇的检测
向具有吸收DNP附加胆甾醇的HDL的磁性粒子添加100μL的与实施例2相同的ALP标记抗DNP抗体的稀释液而于42℃反应10分钟。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而清洗磁性粒子。将此清洗操作合计进行3次。向别的比色杯移磁性粒子，对磁性粒子进行集磁而除去上清。向含磁性粒子的比色杯添加HISCL R4试剂(50μL)及R5试剂(100μL)，于42℃反应5分钟。反应后，对发光量进行测定。算出从含HDL级分的试样得到的测定值(信号)和从对照试样得到的测定值(噪声)的比(S/N)。结果示于图7。
(4)结果
如图7所示，在使用含Tween20或Triton X-100的试样稀释用试剂时，在信号和噪声之间基本上无差异，S/N是约1。因此，无法评价HDL的胆甾醇吸收能力。一方面，在使用含非离子K-230、Pluronic L31、Pluronic L61或Pluronic P84的试样稀释用试剂时，与使用含Tween20或Triton X-100的试样稀释用试剂时相比，S/N变大。从而显示，通过将不具有环状结构的表面活性剂添加到试样稀释用试剂中，可改善吸收能力测定的S/N。
【实施例4：与手动方法的比较】
探讨由作为试样稀释用试剂使用BSA溶液的微平板的吸收能力的测定法(以下，称为“手动方法”)和由使用含表面活性剂的试样稀释用试剂的磁性粒子的测定法的相关性。
(1)生物体试样
作为生物体试样，使用预先由手动方法测定胆甾醇吸收能力的2种HDL级分。一个是在手动方法中示高的信号的HDL级分(以下，称为“高值受试体”)，另一个是在手动方法中示低的信号的HDL级分(以下，称为“低值受试体”)。
(2)由使用磁性粒子的ELISA法的胆甾醇吸收能力的测定
(2.1)试样稀释用试剂的调制
向PBS溶解表2中所示的成分而调制试样稀释用试剂A～G。表中，“HP-γ-CD”是指羟基丙基-γ-环糊精(日本食品加工株式会社)。
【表2】
(2.2)测定用试样的调制
(i)生物体试样的稀释
从上述的高值受试体及低值受试体各自取一部分，与实施例2同样地，对ApoAI浓度进行测定。测定后，将高值受试体及低值受试体用各试样稀释用试剂稀释而调制ApoAI浓度是450ng/mL的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照试样(ApoAI浓度0ng/mL)，使用试样稀释用试剂。
(ii)HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
与实施例2同样地，调制含0.1％(v/v)Pluronic F68及7.5μM DNP附加胆甾醇的反应缓冲液。与实施例3同样地，将反应缓冲液及含有HDL级分的稀释液混合而得到测定用试样。对于对照试样，也同样地处理。
(2.3)由HDL的胆甾醇吸收能力的测定
(i)在磁性粒子上的HDL和抗ApoAI抗体的复合体的形成
与实施例3同样地，向含反应缓冲液及含有HDL级分的稀释液的比色杯添加生物素化ApoAI抗体而于42℃反应12分钟。反应后，向比色杯添加30μL的HISCL磁性粒子(Sysmex株式会社)而于42℃反应10分钟。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而清洗磁性粒子。将此清洗操作合计进行3次。进而，对磁性粒子进行集磁而除去上清。
(ii)被HDL吸收的附加有标签的胆甾醇的检测
与实施例3同样地，向具有吸收DNP附加胆甾醇的HDL的磁性粒子添加ALP标记抗DNP抗体的稀释液而于42℃反应10分钟。对反应液中的磁性粒子进行集磁而除去上清，添加0.1％(v/v)Pluronic F68/PBS而清洗磁性粒子。将此清洗操作合计进行3次。向别的比色杯移磁性粒子，对磁性粒子进行集磁而除去上清。与实施例3同样地，向含磁性粒子的比色杯添加HISCL R4试剂及R5试剂而使反应。反应后，对发光量进行测定。算出将高值受试体的测定值设为100％之时的低值受试体的测定值的比例(相对信号强度)。结果示于图8及9。
(3)由手动方法的胆甾醇吸收能力的测定
(3.1)测定用试样的调制
(i)生物体试样的稀释
在手动方法中，作为试样稀释用试剂，使用2％BSA/PBS。将上述的高值受试体及低值受试体的各自用2％BSA/PBS稀释而调制ApoAI浓度是450ng/mL的含有HDL级分的稀释液。另外，作为不含HDL级分的对照受试体(ApoAI浓度0ng/mL)，使用2％BSA/PBS。
(ii)HDL和附加有标签的胆甾醇的混合
作为反应缓冲液，除了代替DNP附加胆甾醇而使用BODIPY附加胆甾醇(TopFluorCholesterol、AvantiPolar Lipids公司)以外，与实施例2同样地，调制含0.1％(v/v)Pluronic F68及7.5μM BODIPY附加胆甾醇的反应缓冲液。与实施例2同样地，将反应缓冲液和含有HDL级分的稀释液混合而得到测定用试样。对于对照受试体，也同样地处理。
(3.2)由HDL的胆甾醇吸收能力的测定
(i)在板上的HDL和抗ApoAI抗体的复合体的形成
与实施例2同样地，准备使抗ApoAI抗体固定化的96孔微平板。与实施例2同样地，将各测定用试样添加到孔中而在板上形成HDL和抗ApoAI抗体的复合体。再者，孔的清洗使用含138mM NaCl及0.1％Pluronic F68的线清洗液而与实施例2同样地进行。
(3.3)被HDL吸收的附加有标签的胆甾醇的检测
向清洗的各孔添加各100μL的10mM环糊精/PBS，将板于25℃、以600rpm振荡15分钟。将板设置于荧光板读取器(Infinite(注册商标)200Pro、TECAN公司制)，对荧光强度进行测定(激发光485nm/荧光535nm)。从高值受试体及低值受试体的测定值算出相对信号强度。结果示于图8及9。
(4)结果
如图8所示，手动方法与高值受试体的胆甾醇吸收能力相比，低值受试体胆甾醇吸收能力低。在由使用含非离子K-230及Pluronic P84的试样稀释用试剂的磁性粒子的测定法中，也得到了与手动方法同样的结果。另外得知，如图9所示，通过使用还含环糊精的试样稀释用试剂，与手动方法的相关性进一步改善。
【符号的说明】
10、20、30、40：试剂盒
11、21、31、41：第1容器
12、22、32、42：第2容器
13、23、33、43：第3容器
24、34、44：第4容器
25、35、45：第5容器
36：固相
46：第6容器
14、26、37、47：捆包箱
15、27、38、48：附带文书

Claims (29)

1.测定人脂蛋白质的吸收能力的方法，其包括：
通过将含人脂蛋白质的试样中的人脂蛋白质和标记甾醇在不具有环状结构的表面活性剂的存在下混合，调制吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质的工序，及
基于吸收到所述人脂蛋白质的标记甾醇的标记而测定对所述标记甾醇的吸收能力的工序。
2.权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子性表面活性剂。
3.权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物。
4.权利要求3所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇环氧乙烷加成物是嵌段共聚合型。
5.权利要求4所述的方法，其中所述嵌段共聚合型的表面活性剂是：
下述的式(I)所表示的化合物：
式中，
x、y及z相同或不同，是1以上的整数，
聚丙烯氧化物部分的分子量是2750以下，或者
下述的式(II)所表示的化合物：
式中，
p、q及r相同或不同，是1以上的整数，
聚丙烯氧化物部分的分子量是2750以下。
6.权利要求1所述的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯月桂基醚。
7.权利要求1所述的方法，其中所述人脂蛋白质是高密度人脂蛋白质。
8.权利要求1所述的方法，其中所述标记甾醇是标记胆甾醇。
9.权利要求8所述的方法，其中所述标记胆甾醇是下述的式(III)所表示的附加有标签的胆甾醇：
式中，
R1是任选具有甲基的碳原子数1～6的亚烷基，
X及Y相同或不同，由-R2-NH-、-NH-R2-、-R2-(C＝O)-NH-、-(C＝O)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝O)-、-NH-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-、-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝O)-O-、-(C＝O)-O-R2-、-R2-O-(C＝O)-、-O-(C＝O)-R2-、-R2-(C＝S)-NH-、-(C＝S)-NH-R2-、-R2-NH-(C＝S)-、-NH-(C＝S)-R2-、-R2-O-、-O-R2-、-R2-S-、或者-S-R2-表示，其中，R2各自独立地是连键、任选有取代基的碳原子数1～10的亚烷基、任选有取代基的碳原子数6～12的亚芳基或杂亚芳基、或者，任选有取代基的碳原子数3～8的环亚烷基或杂环亚烷基，
L由-(CH2)d-[R3-(CH2)e]f-、或者-[(CH2)e-R3]f-(CH2)d-表示，其中，R3是氧原子、硫原子、-NH-、-NH-(C＝O)-或-(C＝O)-NH-，
TAG是标签，
a及c相同或不同，是0～6的整数，
b是0或1，
d及e相同或不同，是0～12的整数，
f是0～24的整数。
10.权利要求9所述的方法，其中所述附加有标签的胆甾醇的结构为，作为标签附加有：
下述的式(IV)所表示的结构：
或者
下述的式(V)所表示的结构：
或者
2,4-二硝基苯基。
11.权利要求10所述的方法，其中所述附加有标签的胆甾醇由下述的式表示：下述的式(VI)：
或者下述的式(VII)：
式中，n是0～24的整数，或者
下述的式(VIII)：
12.权利要求1所述的方法，其中所述测定工序包括将吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质和与所述人脂蛋白质结合的第1捕获体混合，形成含吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质和所述第1捕获体的复合体的工序。
13.权利要求12所述的方法，其中所述第1捕获体是与所述人脂蛋白质特异性地结合的抗体。
14.权利要求12所述的方法，其中所述第1捕获体固定化于固相，所述人脂蛋白质固定于固相上。
15.权利要求14所述的方法，其中固定化于所述固相的人脂蛋白质是吸收所述标记甾醇的所述人脂蛋白质。
16.权利要求1所述的方法，其中所述测定工序通过检测来源于吸收到所述人脂蛋白质的所述标记甾醇的信号来进行。
17.权利要求1所述的方法，其中所述测定工序包括将吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质、与所述人脂蛋白质结合的第1捕获体和与所述标记甾醇结合的第2捕获体混合，形成含吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质、所述第1捕获体和第2捕获体的复合体的工序。
18.权利要求17所述的方法，其中所述测定工序通过检测所述第2捕获体来进行。
19.权利要求18所述的方法，其中
所述第2捕获体被第2标记所标记，
所述测定工序是检测来源于所述第2标记的信号的工序。
20.权利要求19所述的方法，其中
所述第2标记是酶，
所述信号是从所述酶和底物的反应产物发生的化学发光信号。
21.权利要求1所述的方法，其中所述调制工序在抑制所述标记甾醇的非特异性吸附的封闭剂的存在下进行。
22.权利要求21所述的方法，其中所述封闭剂是2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱系聚合物。
23.权利要求1所述的方法，其中所述试样是在所述调制工序之前被含不具有环状结构的表面活性剂的水性介质稀释的试样。
24.权利要求23所述的方法，其中所述稀释在环状寡糖和/或与和测定对象的人脂蛋白质不同的人脂蛋白质结合的成分的存在下进行。
25.权利要求24所述的方法，其中
所述环状寡糖是环糊精、甲基-β-环糊精或羟基丙基环糊精，
所述与和测定对象的人脂蛋白质不同的人脂蛋白质结合的成分是杯芳烃。
26.权利要求1所述的方法，其中在所述调制工序和所述测定工序之间还含除去未反应的游离成分的清洗工序。
27.权利要求26所述的方法，其中所述清洗工序在不具有环状结构的表面活性剂的存在下进行。
28.对人脂蛋白质的吸收能力进行测定的方法，其包括：
通过将含人脂蛋白质的试样中的人脂蛋白质、标记甾醇和不具有环状结构的表面活性剂混合，调制吸收所述标记甾醇的人脂蛋白质的工序，及
基于吸收到所述人脂蛋白质的标记甾醇的标记而测定对所述标记甾醇的吸收能力的工序。
29.人脂蛋白质的吸收能力测定用试剂，其含标记甾醇和不具有环状结构的表面活性剂。
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