WO2007007443A1

WO2007007443A1 - 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法

Info

Publication number: WO2007007443A1
Application number: PCT/JP2006/304971
Authority: WO
Inventors: Tomokazu Itai; Kiyoko Mori; Yo Yagura; Isao Koyama; Naoyuki Yamamoto
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-03-14
Publication date: 2007-01-18
Also published as: EP2239281A2; US20090215097A1; EP1903069B1; EP1903069A1; WO2007007392A1; EP1903069A4; EP2239281A3; US8158375B2

Description

明細書

新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法

技術分野

[0001] 本発明は、一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んでなるポリマーを用いた、例えば高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDU、超低比重リポ蛋白（VLDL)等のリポ蛋白中コレステロールの測定用試薬、キット及び測定方法、詳しくは、試料中の HDL、 LDL、 VLDL中のコレステロールの直接的な測定に於いて、当該ポリマーを含有させたリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬、キット及び該測定試薬を用いて特定のリポ蛋白中のコレステロール濃度を測定する方法、並びに一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び第 3モノマー単位からなるポリマ一に関する。

背景技術

[0002] 血清及び血漿中リポ蛋白中コレステロールの測定は、主に動脈硬化、心筋症、脂質異常解析等の診断に利用されており、臨床検査の分野に於いては重要な測定項目の 1つである。特に HDLコレステロ一ノレ（HDL— C)及び LDLコレステロ一ノレ（LD L-C)に於いては、動脈硬化学会に於いてもガイドラインが設定され、測定頻度が高い項目の 1つでもある。遠心分離操作等を行うことなぐ自動分析装置等を用いて実施できる HDL— Cの直接的測定方法としては、例えば、抗 j3リポ蛋白抗体を用いて HDL以外のリポ蛋白を保護し HDL— Cのみを検出する方法（特許文献 1)、シクロデキストリン誘導体等の糖ィ匕合物及び修飾した酵素を用いて同様に HDL— Cのみを検出する方法 (特許文献 2)、リポ蛋白を溶解しなレ、界面活性剤を使用する方法（特許文献 3)、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後に HDL— Cを特異的に検出する方法（特許文献 4)、カリタスアレン類を用いて HDL以外のリポ蛋白と複合体を形成させて保護し、 HDL— Cを検出する方法 (特許文献 5)などがある [0003] 一方、遠心分離操作等を行うことなぐ自動分析装置等を用いて実施できる LDL— Cの直接的測定法としては、ポリア二オンと両性界面活性剤で LDLを保護し、 LDL 以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去した後、 LDL— Cを測定する方法（特許文献 6)界面活性剤を用いて LDL以外のリポ蛋白のみ可溶化して消去した後、 LDL— Cを検出する方法（特許文献 7、特許文献 8)、カリタスアレン類を用いて LDL以外のリポ蛋白を保護し、 LDL— Cを検出する方法 (特許文献 9)などが挙げられる。

[0004] しかしながら、これらの試薬の測定精度は、脂質濃度が正常範囲である検体 (正脂検体）に於いては満足できるものの、例えば高トリグリセライド (TG)検体等の脂質異常検体に於いては、標準的測定法で、超遠心による分画と組み合わせた UCHM法 (U ItracentnfUgation-heparin— Mnし 1 -method)、 BQ¾ (Beta-Quantincation method)で

2

の測定値を比べると必ずしも精度の面で十分とはいえないのが現状である。

また、特許文献 10には、ポリエチレングリコールを主鎖に有するブロック共重合体及びこれを化粧料として使用することが開示されている。

[0005] 特許文献 1：特許第 3446486号公報

特許文献 2：特許第 2600065号公報

特許文献 3：特許第 2799835号公報

特許文献 4：特許第 3164829号公報

特許文献 5：国際公開 WO98/59068号公報

特許文献 6：特開 2000-60600号公報

特許文献 7：特許第 3193634号公報

特許文献 8：特許第 3058602号公報

特許文献 9：国際公開 WO98/59068号公報

特許文献 10：特開 2001-288233号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、ポリマーを含んで成る、リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用試薬、並びに新規なポリマーを提供することを課題とする。

課題を解決するための手段本発明は、

(l) (i)一般式 [ 1]

[0008] (式中、 kは 10〜250の整数を表す。 )で示される基を有するポリエチレングリコ

(ii)一般式 [2]

[2]

[0009] (式中、 R¹は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び

(iii)メタクリル酸 tert -ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸 2_ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルォロメチル）メチル、メタクリル酸 2，2，3,3,4，4，5，5 -ォクタフルォロペンチル、メタクリル酸へプタデカフルォロォクチルェチル、シクロへキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロへキシル、ビニルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、シクロへキシルビュルエーテル又はァリルベンゼン由来の第 3モノマー単位からなるポリマー（以下、「本発明のポリマー（a)」と略記する場合がある。 )、

[0010] (2) (iv)—般式 [1 ]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

[0011] (式中、 kは前記に同じ。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、 (V)—般式 [2]

[0012] (式中、 R¹は前記に同じ。 )で示されるモノマー単位、及び

(vi)—般式 [3]

[0013] 〔式中、 R²は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R³は一般式 [4]

― COOR⁴ [4]

[0014] (式中、 R⁴はアルキル基、ハロアルキル基又はボル二ル基を表す。）で示される基、ァノレキノレ基、アルコキシ基、ァラルキル基又はアルキル力ルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（以下、「本発明に係るポリマー」と略記する場合がある。 )

の共存下で測定を行うことを特徴とする、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定方法、

[0015] (3)生体由来試料を (1)コレステロールエステラーゼ（CHE)及びコレステロールォキシダーゼ（CO)、又は (2)CHE、コレステロールデヒドロゲナーゼ（CHD)及び NAD ( P)〔ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸)〕と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) H〔還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〕に基づレ、てコレステロールを測定するための試薬に、上記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬、

[0016] (4)生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、特定のリポ蛋白中のコレステロールと、（l)CHE及び C〇、又は (2)CHE、 CHD及び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づいてコレステロールを測定するための試薬に、上記 Gv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬、

[0017] (5) (1)上記（iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)CHE、（3)C〇、ペルォキシダーゼ（POD)、及びカップラー又は/及びデベロッパー、及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液と、（5)CHE、（6)CO及び (7)水性媒体を含んでなる第二試液とからなるものであって、 P〇D、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キク、

[0018] (6) (1)上記（iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)CHE、（3)C〇、（4)P OD、（5)カップラー、（6)デベロッパー及び (7)水性媒体を含んでなる第一試液と、 (8) 界面活性剤及び (9)水性媒体を含んでなる第二試液とからなる、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、及び

[0019] (7) (1)上記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)CHE、（3)C〇、（4)力タラーゼ（CAT)及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液と、（6)CAT阻害剤、（7)水性媒体及び要すれば (8)界面活性剤とを含んでなる第二試液とからなるものであって、 POD、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット、の発明である。発明の効果

[0020] リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、上記 (iv)—般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、（V)—般式 [2]で示されるモノマー単位及び (vi)—般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んでなるポリマ一（以下、「本発明に係るポリマー」と略記する場合がある。）、特に上記 (i)一般式 [1] で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、 Gi)—般式 [2]で示されるモノマー及び Gii)第 3モノマーからなるポリマー（以下、「本発明のポリマー（a)」と略記する場合がある。）を共存させることにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。また、反応を先行させた当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。これにより、測定対象となる目的のリポ蛋白以外のリポ蛋白を分離分別することなぐ目的のリポ蛋白中のコレステロールを測定することが可能となる。更に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質異常検体の測定値に於いても標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れたリポ蛋白中コレステロール測定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。

発明を実施するための最良の形態

[0021] 1.本発明に係るポリマー

1 - 1.ポリマー

一般式 [1]に於いて、 kは通常 10〜250、好ましくは 20〜200、より好ましくは 40〜 150の整数である。

[0022] 一般式 [2]及び [3]に於いて、 R¹及び R²で示される炭素数:!〜 3のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよぐ通常炭素数 1〜3、好ましくは炭素数 1のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。

[0023] 一般式 [3]に於いて、 R³で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数:!〜 15、好ましくは 3〜8のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、イソブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基、 n_ペンチル基、イソペンチル基、 sec-ペンチノレ基、 tert-ペンチル基、ネオペンチル基、 n-へキシル基、イソへキシル基、 sec-へキシノレ基、 tert-へキシル基、ネオへキシル基、 n -ヘプチル基、イソへプチル基、 sec-へプチル基、 tert-ヘプチル基、ネオへプチル基、 n-ォクチル基、イソォクチル基、 sec- ォクチル基、 tert -ォクチル基、ネオォクチル基、 n-ノニル基、イソノニル基、 sec-ノニル基、 tert-ノニル基、ネオノニル基、 n-デシル基、イソデシル基、 sec-デシル基、 tert -デシル基、ネオデシル基、 n -ゥンデシル基、イソゥンデシル基、 sec -ゥンデシル基、 t ert -ゥンデシル基、ネオゥンデシノレ基、 n -ドデシル基、イソドデシノレ基、 sec -ドデシノレ基、 tert-ドデシル基、ネオドデシル基、 n-トリデシル基、イソトリデシノレ基、 sec-トリデシル基、 tert-トリデシノレ基、ネオトリデシル基、 n -テトラデシル基、イソテトラデシノレ基、 sec -テトラデシル基、 tert -テトラデシル基、ネオテトラデシノレ基、 n-ペンタデシル基、イソペンタデシル基、 sec-ペンタデシル基、 tert-ペンタデシル基、ネオペンタデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シク口へキシルメチル基、シクロへプチル基、シクロォクチル基、シクロノニル基、シクロデシノレ基、シクロウンデシノレ基、シクロドデシル基、シクロトリデシノレ基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシル基等が挙げられ、中でも、シクロへキシル基又はシクロへキシルメチル基が好ましい。

[0024] R³で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数:!〜 10、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、 _n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、 n-ブトキシ基、イソブトキシ基、 se c-ブトキシ基、 tert-ブトキシ基、 n-ペンチルォキシ基、イソペンチルォキシ基、 sec-ぺンチルォキシ基、 tert-ペンチルォキシ基、ネオペンチルォキシ基、 n-へキシルォキシ基、イソへキシルォキシ基、 sec-へキシルォキシ基、 tert-へキシルォキシ基、ネオへキシルォキシ基、 n-ヘプチルォキシ基、イソへプチルォキシ基、 sec-へプチルォキシ基、 tert-ヘプチルォキシ基、ネオへプチルォキシ基、 n -ォクチルォキシ基、イソォクチルォキシ基、 sec -ォクチルォキシ基、 tert -ォクチルォキシ基、ネオォクチルォキシ基、 n-ノニルォキシ基、イソノニルォキシ基、 sec-ノニルォキシ基、 tert -ノニルォキシ基、ネオノニルォキシ基、 n-デシルォキシ基、イソデシルォキシ基、 sec-デシルォキシ基、 tert-デシルォキシ基、ネオデシルォキシ基、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基、シクロへプチルォキシ基、シクロォクチルォキシ基、シクロノニルォキシ基、シクロデシルォキシ基等が挙げられ、中でもシクロへキシルォキシ基が好ましい。

[0025] R³で示されるァラルキル基としては、通常炭素数 7〜： 12のものが挙げられ、具体的には、例えばべンジル基、フエニルプロピル基、フエニルブチル基、フエニルペンチル基、フエ二ルへキシル基等が挙げられ、中でもべンジル基が好ましい。

[0026] R³で示されるアルキル力ルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 2〜： 11、好ましくは 2〜7のものが挙げられ、具体的には、例えばメチルカルバモイル基、ェチルカルバモイル基、 n -プロピル力ルバモイル基、ィソプロピル力ルバモイル基、 n-ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、 s ec -ブチルカルバモイル基、 tert-ブチルカルバモイル基、 n-ペンチルカルバモイル基、イソペンチルカルバモイル基、 sec-ペンチルカルバモイル基、 tert-ペンチルカルバモイル基、ネオペンチルカルバモイル基、 n-へキシルカルバモイル基、イソへキシノレ力ルバモイル基、 sec-へキシルカルバモイル基、 tert-へキシルカルバモイル基、ネォへキシルカルバモイル基、 n-へプチルカルバモイル基、イソへプチルカルバモイル基、 sec-へプチルカルバモイル基、 tert-へプチルカルバモイル基、ネオへプチルカノレバモイル基、 n-ォクチルカルバモイル基、イソォクチルカルバモイル基、 sec-オタチルカルバモイル基、 tert-ォクチルカルバモイル基、ネオォクチルカルバモイル基、 n-ノニルカルバモイル基、イソノニルカルバモイル基、 _sec-ノニルカルバモイル基、 ter t -ノニルカルバモイル基、ネオノニルカルバモイル基、 n-デシルカルバモイル基、イソデシルカルバモイル基、 sec-デシルカルバモイル基、 tert-デシルカルバモイル基、ネオデシルカルバモイル基、シクロプロピル力ルバモイル基、シクロプチルカルバモイノレ基、シクロペンチルカルバモイル基、シクロへキシルカルバモイル基、シクロへキシルメチルカルバモイル基、シクロへプチルカルバモイル基、シクロォクチルカルバモイノレ基、シクロノ二ルカルバモイル基、シクロデシルカルバモイル基等が挙げられ、中でもシクロへキシルカルバモイル基が好ましい。

[0027] 一般式 [4]に於いて、 R⁴で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数:!〜 15、好ましくは 3〜： 12のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n-プロピル基、イソプロピル基、 n-ブチル基、イソブチル基、 sec-ブチル基、 tert-ブチル基、 n_ペンチル基、イソペンチル基、 sec-ペンチノレ基、 tert-ペンチル基、ネオペンチル基、 n-へキシル基、イソへキシル基、 sec-へキシル基、 tert-へキシル基、ネオへキシル基、 3-メチルペンチル基、 2-メチルペンチノレ基、 1，2-ジメチルブチル基、 n-ヘプチル基、イソへプチル基、 sec-ヘプチル基、 ter t-ヘプチル基、ネオへプチル基、 n-ォクチル基、イソォクチル基、 sec-ォクチル基、 te rt-ォクチル基、ネオォクチル基、 2-ェチルへキシル基、ノニル基、デシル基、ゥンデシノレ基、ドデシル基、トリデシノレ基、テトラデシノレ基、ペンタデシル基、シクロプロピノレ基、シクロペンチル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへプチル基、シクロォクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、シクロドデシル基、シクロウンデシル基、シクロトリデシノレ基、シクロテトラデシル基、シクロペンタデシノレ基等が挙げられ、中でも、例えば tert-ブチル基、シクロへキシル基、 2_ェチルへキシル基、 n-ドデシノレ基等が好ましい。

[0028] R⁴で示されるハロアルキル基としては、炭素数 1〜12のアルキル基中の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子 (例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常炭素数:!〜 12、好ましくは 1〜： 10のものが挙げられ、具体的には、例えばフルォロメチノレ基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ョードメチル基、トリフルォロメチル基、トリクロロメチノレ基、トリブロモメチル基、 2-フルォロェチル基、 2-クロ口ェチル基、 2-ブロモェチル基、 3_フルォロプロピル基、 3_クロ口プロピル基、 3-ブロモプロピル基、トリフノレォロプロピル基、トリクロ口プロピル基、トリブロモプロピル基、ジ（トリフルォロメチル）メチノレ基、ジ（トリクロロメチル）メチル基、ジ（トリブロモメチル）メチル基、ヘプタフルォロプロピル基、ヘプタクロロプロピル基、 4-フルォロブチル基、 4-クロロブチル基、 4 -ブロモブチル基、ノナフルォロブチル基、ノナクロロブチル基、ノナブロモブチル基、 5- フルォロペンチル基、 5-クロ口ペンチル基、 5-ブロモペンチル基、 2,2,3,3，4，4，5,5 -ォクタフルォロペンチル基（_CH (CF ) H)、 2,2,3

2 2 4 ，3，4,4,5,5-オタタクロロペンチル基（

-CH (CC1 ) H)、 2,2,3，3，4，4,5,5—オタタブロモペンチノレ基（一CH (CBr ) H)、ノ

2 2 4 2 2 4 一フルォロペンチル基、パークロロペンチル基、パーブロモペンチル基、 6-フルォロへキシル基、 6-クロ口へキシル基、 6-ブロモへキシル基、パーフルォ口へキシル基、パークロロへキシノレ基、パーブロモへキシノレ基、パーフノレオ口へプチノレ基、パーク口口へプチル基、パーブロモヘプチル基、パーフルォロォクチル基、パークロロォクチル基、パーブロモォクチル基、パーフルォロノ二ル基、パークロロノニル基、パーブ口モノニル基、ヘプタデカフルォロォクチルェチル基（一 (CH ) (CF ) CF基）、ヘプタ

2 2 2 7 3

デカクロロォクチルェチル基（一 (CH ) (CC1 ) CC1基）、ヘプタデカブロモォクチル

2 2 2 7 3

ェチル基（― (CH ) (CBr ) CBr基）、パーフルォロデシル基、パークロロデシル基、

2 2 2 7 3

パーブロモデシル基、パーフルォロウンデシル基、パークロロゥンデシル基、パーブ口モウンデシル基、パーフルォロドデシル基、パーク口ロドデシル基、パーブ口モドデシル基等が挙げられ、中でも、例えばジ（トリフルォロメチル)メチル基、 2,2,3，3，4,4,5, 5-ォクタフルォロペンチル基、ヘプタデカフルォロォクチルェチル基等が好ましレ、。一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメントとしては、例えば一般式 [5]

[0030] (式中、 R⁵は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R⁶はシァノ基又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250 の整数を表す。）で示されるもの等が挙げられる。

[0031] 一般式 [5]に於いて、 R⁵及び R⁶で示される炭素数 1〜3のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよぐ通常炭素数 1〜3、好ましくは炭素数 1のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n -プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。

[0032] R⁵及び R⁶は、中でも、何れか一方がシァノ基であるのが好ましい。

[0033] Eで示される炭素数 1〜6のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよぐ通常炭素数:!〜 6、好ましくは炭素数 1〜4、より好ましくは炭素数 2のものが挙げられ、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、へキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばェチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、ェチルエチレン基、 1-メチルトリメチレン基、 2-メチルトリメチレン基、 1-メチルテトラメチレン基、 2-メチルテトラメチレン基、 1-メチルペンタメチレン基、 2-メチルペンタメチレン基、 3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも、エチレン基が好ましい。

[0034] kfま通常 10〜250、好ましく fま 20〜200、より好ましく ίま 40〜： 150の整数である。

[0035] 一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（本発明に係るポリマー）としては、例えば一般式 [6]

■CO- Ej- Ei-COO— (CH₂CH₂0)_k- [6]

(式中、 R⁷は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R⁸はシァノ基又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 nは 50〜900 の整数を表し、 pは 50〜900の整数を表し、 mは:!〜 10の整数を表し、〜、 R⁵、

R⁶、 E及び kは前記に同じ。）で示されるもの等が挙げられる。

1

[0037] 一般式 [6]に於いて、 R⁷及び R⁸で示される炭素数 1〜3のアルキル基としては、直鎖状或いは分枝状でもよぐ通常炭素数 1〜3、好ましくは炭素数 1のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、ェチル基、 n -プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。

[0038] R⁷及び R⁸は、中でも、何れか一方がシァノ基であるのが好ましい。

[0039] Eで示される炭素数 1〜6のアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよぐ通

2

常炭素数:!〜 6、好ましくは 1〜4、より好ましくは 2のものが挙げられ、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、へキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばェチリデン基、プロピレン基、イソプ口ピリデン基、ェチルエチレン基、 1-メチルトリメチレン基、 2-メチルトリメチレン基、 1- メチルテトラメチレン基、 2-メチルテトラメチレン基、 1-メチルペンタメチレン基、 2-メチルペンタメチレン基、 3-メチルペンタメチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも、エチレン基が好ましい。

[0040] n及び pは、夫々独立して通常 20〜： 1000、好ましくは 50〜900、より好ましくは 75 〜600の整数である。

[0041] mは、通常:!〜 10、好ましくは 2〜6の整数である。

[0042] 本発明に係るポリマーの重合平均分子量は、通常 10，000〜120,000、好ましくは 30, 000〜100，000である。

[0043] また、本発明に係るポリマーに於ける一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメントの含有量は、通常:!〜 70重量％、好ましくは 10〜50重量％である。

[0044] 更に、本発明に係るポリマーに於ける一般式 [2]及び [3]で示されるモノマー単位の含有量は、夫々通常 20〜85重量％、好ましくは 50〜85重量％である。

[0045] 1一 2.製造法

一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマー（本発明に係るポリマー）は、例えば一般式 [10]

R' R⁵

CO-E₂-C-N=N-C-E₁-COO— (CH₂CH₂0)_k [10]

R⁸ R⁶

[0046] (式中、 R⁵〜R⁸、 E、 E及び kは前記に同じ。 )で示されるモノマー単位を有するァゾ

1 2

基含有ポリエチレングリコールセグメントの共存下に、一般式 [_n] H R¹

c= c [i i]

^H COOH

[0047] (式中、 R¹は前記に同じ。）で示される化合物及び一般式 [12]

H R²

C = C [12]

H R³

[0048] (式中、 R²及び R³は前記に同じ。）で示される化合物を共重合することにより得られる

[0049] 一般式 [11]で示される化合物の具体例としては、例えばアクリル酸、メタクリル酸等が挙げられる。

[0050] 一般式 [12]で示される化合物の具体例としては、例えばメタクリル酸 tert -ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸 2 -ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ヘプタデカフルォロォクチルェチル、メタクリノレ酸 2，2 ，3，3,4,4,5，5-ォクタフルォロペンチル等のメタクリル酸エステル類、例えばアクリル酸シクロへキシル等のアクリル酸エステル類等の _α， β -不飽和カルボン酸エステル類、例えばシクロへキシルメタクリルアミド等の α , β -不飽和カルボン酸アミド類、例えばシクロへキシルビニルエーテル等のビニルエーテル類、例えばビエルシクロへキシル、ァリルシクロへキシノレ等の _α , β -不飽和脂肪族炭化水素類、例えばァリルベンゼン等の _α , 0 -不飽和芳香族炭化水素類等が挙げられる。

[0051] 一般式 [10]で示されるモノマー単位を有するァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントは、市販品を用いても常法により適宜合成したものを用いてもよい。市販品を使用する場合の具体例としては、例えば VPE— 0201、 VPE— 0401、 VPE— 0601 等の高分子ァゾ重合開始剤 (和光純薬工業 (株)製)等が挙げられる。

[0052] また、常法により適宜合成したものを使用する場合の具体例としては、例えば特開平 4-372675号公報等に記載の製造法に従って容易に製造することができる。即ち、例えば一般式 [13]

HO— (CH₂CH₂0)_k - OH [ 13]

[0053] (式中、 kは前記に同じ。）で示されるポリエチレングリコールと、例えば一般式 [14]

R⁷ R⁵

XOC-E₂-C-N=N-C-E₁-COX [14]

R⁸ R⁵

[0054] (式中、 Xはハロゲン原子を表し、 R⁵〜、 E及び Eは前記に同じ。 )で示されるァゾ

1 2

基含有二塩基酸ジハライドとを適当な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下で反応させることにより得ることができる。

[0055] また、一般式 [10]で示されるモノマー単位を有するァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントは、例えば特開平 6-93100号公報、特開平 6-322089号公報等に記載の製造法に従って製造したものを用いてもよい。即ち、例えば上記一般式 [ 13]で示されるポリエチレングリコールと、一般式 [ 15]

R⁷ R⁵

HOOC-E₂-C-N = N-C-E₁-COOH [15]

R⁸ R⁵

[0056] (式中、 R⁵〜R⁸、 E及び Eは前記に同じ。）で示されるァゾ基含有二塩基酸とを適当

1 2

な溶媒中、要すれば塩基性触媒の存在下、脱水剤を用いて反応させることによってあ得ること力 sでさる。

[0057] 一般式 [14]に於いて、 Xで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

[0058] 上記製造法は、何れも塩基性触媒の存在下で行うのが好ましぐ使用する塩基性触媒の具体例としては、例えばトリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、 Ν,Ν-ジメチルァニリン、ピぺリジン、ピリジン、 4-ジメチルァミノピリジン、 1,5-ジァザビシクロ [4. 3.0]ノナ- 5-ェン、 1,8-ジァザビシクロ [5.4.0]ゥンデ力- 7-ェン、トリ- η-ブチルァミン、 Ν -メチルモルホリン等の有機アミン類、例えば水素化ナトリウム等の金属水素化物類、例えば n-ブチルリチウム、 tert-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類等が挙げられる。

[0059] 塩基性触媒の使用量としては特に限定されるものではないが、一般式 [14]で示されるァゾ基含有二塩基酸ジハライド、 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸或いは脱水剤に対して通常 0.5〜5倍モル、好ましくは 0.5〜1.5倍モルの範囲から適宜選択される。

[0060] また、当該ポリエチレングリコールと一般式 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸とを反応させる方法に於いて使用される脱水剤の具体例としては、脱水縮合剤として用いられるものであれば特に限定されないが、例えば濃硫酸、五酸化二リン、無水塩化亜鉛等の無機脱水剤類、例えばジシクロへキシルカルポジイミド、ジイソプロピル力ノレボジイミド、 1-ェチル -3-(3 -ジメチルァミノプロピルカルボジイミド)塩酸塩等のカルボジイミド類、ポリリン酸、無水酢酸、カルボニルジイミダゾール、 p -トルエンスルホニルクロライド等が挙げられる。

[0061] 脱水剤の使用量としては特に限定されるものではないが、少ないと反応が遅くなり、且つ到達分子量も小さくなり、多すぎると短時間で高分子量になるが分子量の制御が困難となり、且つ、経済的でないため、相当するァゾ基含有二塩基酸に対して通常 1〜5倍モル、好ましくは 2〜3倍モルの範囲から適宜選択される。

[0062] 反応溶媒としては、どちらの方法に於いても例えばジェチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ジメトキシェタン等のエーテル類、例えば四塩化炭素、クロ口ホルム、塩化メチレン、ジクロロェタン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素類、例えば n-へキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素類、例えば酢酸ェチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のエステル類、ァセト二トリル、 Ν,Ν-ジメチルホルムアミド、 Ν，Ν_ジメチルァセトアミド等が挙げられる。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。

[0063] 一般式 [13]で示されるポリエチレングリコールと、一般式 [14]で示されるァゾ基含有二塩基酸ジハライド或いは一般式 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸との使用割合は特に限定されず必要に応じて適宜決定されるが、高分子量のァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントを得るには両者をほぼ等モル量用いることが好ましい。 [0064] 反応温度は、特に限定されないが、あまり高いとァゾ基が分解し、低すぎると反応速度が遅くなり製造に時間を要し、且つ高分子量のァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントが得られ難くなるため、通常一 10〜60°Cの範囲から適宜選択される。また、反応温度は低温から段階的に温度を上昇させる方法をとつてもよい。

[0065] 反応時間は製造方法により異なるが、通常:!〜 60時間の範囲から適宜選択される。

[0066] 目的物の単離は、使用した原料、塩基性触媒、脱水剤、溶媒等の種類や量並びに反応液の状態等に応じて適宜行えばよぐ例えば粘稠な反応液の場合には、反応液を適当な溶媒で希釈した後、濾過或いは水洗等の操作により副生する第四級アンモ二ゥム塩等の不純物を除いた後、溶媒を除去することにより目的のァゾ基含有ポリェチレングリコールセグメントを得ることができる。また、得られた該ァゾ基含有ポリェチレンダリコールセグメントは精製及び/又は単離することなぐそのまま重合反応に付してもよい。

[0067] 尚、原料として用いられる、上記一般式 [13]で示されるポリエチレングリコール、一般式 [14]で示されるァゾ基含有二塩基酸ジハライド又は一般式 [15]で示されるァゾ基含有二塩基酸は、市販品を用いても或いは常法により適宜製造したものを用いてもよい。

[0068] 本発明に係るポリマー、即ち、一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマ一単位を構成成分として含んで成るポリマーは、例えば親水性有機溶媒中、一般式 [10]で示されるァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメント、一般式 [11]で示される化合物及び一般式 [12]で示される化合物を、得られるポリマーの主たる構成単位である一般式 [1]で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、一般式 [2 ]で示されるモノマー単位及び一般式 [3]で示されるモノマー単位の組成比が目的とする組成となるように夫々の使用量を選択設定して重合反応させ、得られる溶液から、不溶性有機溶剤を沈殿剤として用いて晶析、単離することにより得られる。

[0069] 重合溶媒としては、例えばアセトン、メチルェチルケトン等のケトン類、例えばメタノール、エタノール、 n -プロパノール、イソプロパノール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、 1,4-ジォキサン等の環状エーテル類、例えば N-メチルピロリドン、 Ν，Ν' -ジメチルァセトアミド、ジメチルスルホキシド等の親水性有機溶媒が挙げられる。これらは単独で用いても 2種類以上適宜組み合わせて用いてもよい。また、反応に影響が出なレ、範囲であれば、含水溶媒であってもよレ、。

[0070] 上記重合反応の方法としては、例えば懸濁重合、溶液重合、バルタ重合、乳化重合等が挙げられる。この際ァゾ基含有ポリエチレングリコールセグメントと通常のラジカル重合開始剤（例えばァゾビスイソプチロニトリル、 2，2， -ァゾビスイソ酪酸ジメチル等）を併用してもよい。

[0071] この共重合反応を行う際、必要に応じて連鎖移動剤（例えばラウリルメルカブタン、ォクチルメルカプタン、ブチルメルカプタン、 2-メルカプトエタノール、チォグリコーノレ酸ブチル等）を添加し、分子量の調節を行ってもよい。

[0072] 重合反応時の濃度としては、当該ァゾ基含有ポリシロキサンセグメント、一般式 [2] 及び一般式 [3]で示される化合物の合計が通常 5〜100重量％ (無溶媒）、好ましくは 5〜80重量％、より好ましくは 10〜70重量％、更に好ましくは 20〜50重量％の範囲となるよう適宜選択される。

[0073] 重合反応は、不活性ガス雰囲気下で行うことが望ましい。不活性ガスとしては、例えば窒素ガス、アルゴンガス等が挙げられる。

[0074] 重合温度は、高すぎると反応の制御が困難になり、低すぎると反応速度が遅くなり反応に時間を要するため、通常 30〜： 120°C、好ましくは 60〜： 100°Cである。また、重合反応の進行に合わせて重合温度を変化させ、反応の制御を行ってもよい。

[0075] 重合時間は、通常 3〜24時間、好ましくは 5〜： 15時間である。

[0076] 沈殿剤として用いる有機溶媒としては、生成したポリマーが不溶物として析出するものであれば特に限定されないが、例えばへキサン、酢酸ェチル、ジェチルエーテル等が挙げられる。これらは単独で用いても 2種類以上適宜組み合わせて用いてもよレ、。更に、溶媒の使用量は、少なすぎると、得られる共重合体に含まれる残存重合溶媒の量や未反応の残存モノマーの量が多くなるため、通常重合溶媒の 2倍容量以上、好ましくは 3〜20倍容量、より好ましくは 5〜： 10倍容量である。

尚、反応後の後処理等はこの分野に於いて通常行われる後処理法に準じてこれを行えばよい。 [0077] 1 - 3.ポリマーの性質

このようにして得られた本発明に係るポリマーは、例えば塗料用樹脂組成物、被覆用樹脂組成物等の樹脂組成物、例えば頭髪化粧料用基材 (例えばセット剤、トリートメント剤等）、基礎化粧料用基材等の化粧料用基材等として、或いは、離型剤、コーティング剤、表面改質剤、医療材料等としての用途が期待されているが、中でも、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用添加剤として有用である。

[0078] 例えば本発明に係るポリマーは、当該ポリマーを構成するモノマー単位の組成比を適宜選択することにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害することができる。この性質を利用することにより、後述するように、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することが可能となる。

尚、本発明に於いて「阻害」とは、保護された特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を、遅延ないしは一時的に停止させることを意味する。

[0079] このような目的に使用可能なポリマーの好ましい具体例としては、例えば下記 (i)〜( iii)のみからなるポリマー（本発明のポリマー（a) )が挙げられる。

(i)一般式 [ 1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

[0080] (式中、 kは前記に同じ。 )で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、

(ii)一般式 [2]

(式中、 R¹は前記に同じ。）で示されるモノマー単位、及び

(iii)メタクリル酸 tert-ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸 2-ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルォロメチル）メチル、メタクリル酸 2，2，3,3,4，4，5，5-ォクタフルォロペンチル、メタクリル酸へプタデカフルォロォクチルェチル、シクロへキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロへキシル、ビニルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、シクロへキシルビュルエーテル及びァリルベンゼンから選ばれる第 3モノマー単位 [0082] (1) HDL保護ポリマー

例えば、 HDLを保護し、 HDL中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式 [2]で示されるモノマー単位（モノマー A)と一般式 [3]で示されるモノマ一単位（モノマー B)との組成比力通常 2≤モノマー BZモノマー A、好ましくは 2≤ モノマー B/モノマー A≤ 3であって、一般式 [2]で示されるモノマー単位と一般式 [ 3]で示されるモノマー単位の合計 (AB)と一般式 [1]で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG)との組成比は、通常 1≤ABZPEG≤10、好ましくは 2≤ABZP EG≤ 5であるポリマーが好ましい。

[0083] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位がァクリル酸又はメタクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一般式 [7]

[0084] (式中、 ITは炭素数 6〜 12のアルキル基、アルコキシ基、炭素数 4〜： 16のアルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、アルキル力ルバモイル基、ァラルキル基又はボルニルォキシカルボ二ル基を表す。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましい。

[0085] 一般式 [7]に於いて、 R⁹で示される炭素数 6〜： 12のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³ で示されるアルキル基中の炭素数 6〜： 12のものの例示と同様のものが挙げられ、中でも、例えばシクロへキシル基、シクロへキシルメチル基等が好ましい。

[0086] R⁹で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数:!〜 10、好ましくは 1〜6のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³で示されるアルコキシ基の例示と同様のものが挙げられ、中でも、シクロへキシルォキシ基が好ましい。

[0087] R⁹で示される炭素数 4〜： 16のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば n-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、 n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、 sec-ブトキシカルボニル基、 tert-ブトキシカルボニル基、ネオブトキシカルボニル基、 n-ペンチルォキシカルボニル基、イソペンチルォキシカルボニル基、 sec-ペンチルォキシカルボニル基、 tert-ペンチルォキシカルボニル基、ネオペンチルォキシカルボニル基、 n-へキシルォキシカルボニル基、イソへキシルォキシカルボニル基、 sec-へキシルォキシカルボニル基、 tert-へキシルォキシカルボニル基、ネオへキシルォキシカルボニル基、 n -ヘプチルォキシカルボニル基、イソへプチルォキシカルボニル基、 sec- ヘプチルォキシカルボニル基、 tert-ヘプチルォキシカルボニル基、ネオへプチルォキシカルボニル基、 n-ォクチルォキシカルボニル基、イソォクチルォキシカルボニル基、 sec -ォクチルォキシカルボニル基、 tert-ォクチルォキシカルボニル基、ネオオタチルォキシカルボニル基、 2-ェチルへキシルォキシカルボニル基、 n-ノニルォキシ力ルボニル基、イソノニルォキシカルボニル基、 sec-ノニルォキシカルボニル基、 tert -ノニルォキシカルボニル基、ネオノニルォキシカルボニル基、 n-デシルォキシカルボ二ル基、イソデシルォキシカルボニル基、 sec-デシルォキシカルボニル基、 tert-デシルォキシカルボニル基、ネオデシルォキシカルボニル基、 n-ゥンデシルォキシカルボ二ル基、イソゥンデシルォキシカルボニル基、 sec-ゥンデシルォキシカルボニル基、 tert -ゥンデシルォキシカルボニル基、ネオゥンデシルォキシカルボニル基、 n-ドデシルォキシカルボニル基、イソドデシルォキシカルボニル基、 sec-ドデシルォキシカルボニル基、 tert-ドデシルォキシカルボニル基、ネオドデシルォキシカルボニル基、 n-トリデシルォキシカルボニル基、イソトリデシルォキシカルボニル基、 sec-トリデシルォキシカルボニル基、 tert-トリデシルォキシカルボニル基、ネオトリデシルォキシカルボ二ル基、 n-テトラデシルォキシカルボニル基、イソテトラデシルォキシカルボニル基、 sec -テトラデシルォキシカルボニル基、 tert-テトラデシルォキシカルボニル基、ネオテトラデシルォキシカルボニル基、 n -ペンタデシルォキシカルボニル基、イソペンタデシルォキシカルボニル基、 sec-ペンタデシルォキシカルボニル基、 tert-ペンタデシルォキシカルボニル基、ネオペンタデシルォキシカルボニル基、シクロへキシルォキシカルボニル基、シクロへキシルメトキシカルボニル基、シクロへプチルォキシカルボ二ル基、シクロォクチルォキシカルボニル基、シクロノニルォキシカルボニル基、シクロデシルォキシカルボニル基、シクロウンデシルォキシカルボニル基、シクロドデシルォキシカルボニル基、シクロトリデシルォキシカルボニル基、シクロテトラデシルォキシカノレボニル基、シクロペンタデシルォキシカルボニル基等が挙げられ、中でも、例えば t ert -ブトキシカルボニル基、シクロへキシルォキシカルボニル基、 2-ェチルへキシノレォキシカルボニル基、ドデシルォキシカルボニル基等が好ましレ、。

R⁹で示されるハロアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 2〜： 13のアルコキシカルボニル基の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子 (例えばフッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子等が挙げられ、中でもフッ素原子が好ましい。）で置換されたものが挙げられ、通常炭素数 2〜 13、好ましくは 2〜： 11のものが挙げられ、具体的には、例えばフルォロメトキシカルボニル基、クロロメトキシカルボニル基、ブロモメトキシカルボニル基、ョードメトキシカルボニル基、トリフルォロメトキシカルボニル基、トリクロロメトキシカルボニル基、トリブロモメトキシカルボニル基、 2-フルォロエトキシカルボニル基、 2-クロ口エトキシカルボ二ノレ基、 2-ブロモエトキシカルボニル基、 3-フルォロプロポキシカルボニル基、 3-クロ口プロポキシカルボニル基、 3-ブロモプロポキシカルボニル基、トリフルォロプロポキシカルボニル基、トリクロ口プロポキシカルボニル基、トリブロモプロポキシカルボニル基、ジ（トリフルォロメチル）メトキシカルボニル基、ジ（トリクロロメチル）メトキシカルボ二ノレ基、ジ（トリブロモメチル）メトキシカルボニル基、ヘプタフルォロプロポキシカルボ二ノレ基、ヘプタクロロプロポキシカルボニル基、 4-フルォロブトキシカルボニル基、 4-クロロブトキシカルボニル基、 4-ブロモブトキシカルボニル基、ノナフルォロブトキシカルボニル基、ノナクロロブトキシカルボニル基、ノナブロモブトキシカルボニル基、 5-フルォロペンチルォキシカルボニル基、 5_クロ口ペンチルォキシカルボニル基、 5-ブロモペンチルォキシカルボニル基、 2,2,3,3，4，4,5,5 -ォクタフルォロペンチルォキシカルボニル基（_ C〇OCH (CF ) H)、 2，2，3,3,4,4，5，5 -オタタクロロペンチルォキシカルボ

2 2 4

ニル基（_ C〇OCH (CC1 ) H)、 2,2,3，3，4，4,5,5-オタタブロモペンチルォキシカル

2 2 4

ボニル基（_ C〇OCH (CBr ) H)、パーフルォロペンチルォキシカルボニル基、パ

2 2 4

一クロ口ペンチルォキシカルボニル基、パーブロモペンチルォキシカルボニル基、 6- フルォ口へキシルォキシカルボニル基、 6-クロ口へキシルォキシカルボニル基、 6-ブロモへキシルォキシカルボニル基、パーフルォ口へキシルォキシカルボニル基、パークロ口へキシルォキシカルボニル基、パーブロモへキシルォキシカルボニル基、パーフルォ口へプチルォキシカルボニル基、パークロロへプチルォキシカルボニル基、パ一ブロモヘプチルォキシカルボニル基、パーフルォロォクチルォキシカルボニル基、パークロロォクチルォキシカルボニル基、パーブロモォクチルォキシカルボニル基、パーフルォロノニルォキシカルボニル基、パークロロノニルォキシカルボニル基、 Λ ーブロモノニルォキシカルボニル基、ヘプタデカフルォロォクチルェトキシカルボ二ル基（_ CO〇(CH ) (CF ) CF基）、ヘプタデカクロロォクチルェトキシカルボニル

2 2 2 7 3

基（_ CO〇(CH ) (CC1 ) CC1基）、ヘプタデカブロモォクチルェトキシカルボニル

2 2 2 7 3

基（_ CO〇(CH ) (CBr ) CBr基）、パーフルォロデシルォキシカルボニル基、パー

2 2 2 7 3

クロ口デシルォキシカルボニル基、パーブロモデシルォキシカルボニル基、パーフルォロウンデシルォキシカルボニル基、パークロロゥンデシルォキシカルボニル基、 Λ ーブロモウンデシルォキシカルボニル基、パーフルォロドデシルォキシカルボニル基、パーク口ロドデシルォキシカルボニル基、パーブ口モドデシルォキシカルボニル基等が挙げられ、中でも、例えばジ（トリフルォロメチル)メトキシカルボニル基、 2,2,3,3， 4,4,5,5-ォクタフルォロペンチルォキシカルボニル基、ヘプタデカフルォロォクチルエトキシカルボニル基が好ましレ、。

[0089] R⁹で示されるアルキル力ルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 2〜： 11、好ましくは 2〜7のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³で示されるアルキル力ルバモイル基の例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロへキシルカルバモイル基が好ましレ、。

[0090] R⁹で示されるァラルキル基としては、通常炭素数 7〜： 12のものが挙げられ、具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³で示されるァラルキル基の例示と同様なものが挙げられ、中でもべンジル基が好ましい。

[0091] 一般式 [7]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 t ert -ブチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸 2-ェチルへキシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸シクロへキシル、アクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸ジ（トリフルォロメチル）メチル、メタクリル酸ヘプタデカフルォロォクチルェチル、メタクリル酸 2, 2, 3，3，4,4,5,5-ォクタフルォロペンチル、シクロへキシルメタクリルアミド、シクロへキシルビエルエーテル、ビニルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、ァリルベンゼン等由来のものが挙げられる。

[0092] (2) LDL保護ポリマー

例えば、 LDLを保護し、 LDL中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (A)と一般式 [3]で示されるモノマー単位 (B )との組成比力通常 B/A≤l、好ましくは 0. 5≤B/A≤1であって、一般式 [2]で示されるモノマー単位と一般式 [3]で示されるモノマー単位から成るコポリマー (AB) と一般式 [1]で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG)との組成比は、通常 1 ≤AB/PEG≤10,好ましくは 2≤AB/PEG≤5であるポリマーが好ましい。

[0093] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位がメタクリル酸又はアクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一般式 [8]

[0094] (式中、 R^1Qが炭素数 1〜8のアルコキシカルボ二ル基を表し、 R²は前記に同じ。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましい。

[0095] 一般式 [8]に於いて、 R^1Qで示される炭素数 1〜8のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 1〜8のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、 n-プロポキシ力ルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、が挙げられ、中でも、例えば tert-ブトキシカルボニル基、シクロへキシルォキシカルボニル基等が好ましレ、。

[0096] R^1Qで示される炭素数 6〜： 12のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³で示されるアルキル基中の炭素数 6〜12のものの例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロへキシル基が好ましい。

[0097] R^1Qで示されるアルキル力ルバモイル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ通常炭素数 2〜： 1 1、好ましくは 2〜7のものが挙げられ、例えば上記一般式 [3]に於ける R³で示されるアルキル力ルバモイル基の例示と同様のものが挙げられ、中でもシクロへキシルカルバモイル基が好ましレ、。

[0098] 一般式 [8]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 t ert -ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、シクロへキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロへキシル、ビュルシクロへキシル等由来のものが挙げられ、中でも、例えばビュルシクロへキシル、メタクリル酸 tert-ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、シクロへキシノレメタクリルアミド等がより好ましレヽ。

[0099] (3) HDL ' LDL保護ポリマー

例えば、 LDLと HDLとを保護し、 HDL中のコレステロール及び LDL中のコレステロールの反応を阻害するポリマーとしては、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (A) と一般式 [3]で示されるモノマー単位（B)との組成比力通常 1 < BZAく 2であって、一般式 [2]で示されるモノマー単位と一般式 [3]で示されるモノマー単位から成るコポリマー (AB)と一般式 [ 1 ]で示されるポリエチレングリコールセグメント（PEG)との組成比（AB/C)は、通常1≤八8/〇≤10、好ましくは 2≤AB/C≤5であるポリマ一が好ましい。

[0100] また、このようなポリマーとしては、例えば一般式 [2]で示されるモノマー単位力 Sメタクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位が、一般式 [9]

,2

I

•CH₂一 C [9]

11

C I OOR^{1 1}

[0101] (式中、 R¹¹は炭素数 1〜6のアルキル基を表し、 R²は前記に同じ。）で示されるものを構成成分として含んで成るポリマーが好ましレ、。

[0102] 一般式 [9]に於いて、 R¹¹で示される炭素数 1〜6のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよぐ具体的には、例えば上記一般式 [3]に於ける R³ で示されるアルキル基中の炭素数 1〜6のものの例示と同様なものが挙げられ、中でも、例えば tert-ブチル基、シクロへキシル基等が好ましい。

[0103] 一般式 [9]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えばメタクリル酸 t ert-ブチル、メタクリル酸シクロへキシル等由来のものが挙げられ、中でもメタクリル酸シクロへキシノレ由来のものが好ましい。

[0104] 2.本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法

本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定法は、上記した如き本発明に係るポリマー（以下、単に「ポリマー」と略記する場合がある。）の存在下で、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定すればよい。

[0105] このような生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法としては、原理的には、生体由来試料中のコレステロールを CHEと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次レ、で (a)COを反応させて生成する過酸化水素を測定するか、或いは (b)CHD及び NAD (P)を反応させて生成する NAD (P) Hを測定する方法が挙げられる。

[0106] より具体的には、酵素反応を利用する、（1)例えば生体由来試料中のコレステロ一ルエステルを CHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、 COによって酸化して、コレステ一 4—ェン一 3—オンと過酸化水素とにし、 PODの存在下、生成した過酸化水素で被酸化性呈色試薬 (例えばカップラーとデベロッパーとの組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する酸化呈色法、（2)例えば生体由来試料中のコレステロールを CHEによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、初めから存在する遊離コレステロールと共に CHDの存在下、 NAD (P)と反応させて、生成する NAD (P) Hを 340nmで測定する紫外部測定法等が挙げられる。

[0107] 即ち、本発明の測定法は、これらの方法を行うに際して、反応系に、本発明に係るポリマーを存在（共存）させればょレ、。

[0108] 尚、本発明の方法は、本発明に係るのポリマーを使用する以外は上記した如き方法に準じて実施すれば良ぐまた、上記した如き方法において使用される試薬類も使用可能である。

[0109] 本発明の測定法は、より具体的には以下の 2つの方法に大別される。

[0110] (1)本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法 (直接法）生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応によって生成される前記生成物を測定する。

[0111] (2)本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法 (消去法）

先ず、生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させて、当該試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、その結果として当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させてこれらを消去（消費）し、しかる後、特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応によって生成される前記生成物を測定する。

[0112] 2- 1.直接法

上記した如き直接法としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。

[0113] 直接法 (1)

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素に PODと被酸化性呈色試薬 (例えば力ップラーとデベロッパーとの組合せ、酸ィヒによってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて酸化色素を生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロ一ル量を算出する。

[0114] 直接法 (2)

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NA D (P)を作用させて NAD (P) Hを生じさせ、次いで吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。

[0115] 上記直接法 (1)及び直接法 (2)において、吸光度を測定する時期は、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（〇 Dnb)である。尚、当該吸光度を測定する時期は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0116] また、上記直接法 (1)及び直接法 (2)において、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（LDL—コレステロール及び V LDL—コレステロールの量）を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることにより、 LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量（HDL—コレステロール及び VLDL—コレステロールの量）を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL及び LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量 (VLDL—コレステロールの量）を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。

[0117] 2- 2.消去法

上記した如き消去法としては、以下のように更に 2つに大別される。

[0118] 消去法 (1) :生体由来試料と本発明に係るポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定する方法。

[0119] 消去法 (2) :本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応に関与しなレ、別の反応に導レ、て消去（消費）する方法。

[0120] (1)消去法 (1)

上記した如き消去法 (1)としては、例えば以下の如き方法が挙げられる。 [0121] 消去法 (l)-a

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素に PODと被酸化性呈色試薬 (例えば力ップラーとデベロッパーとの組合せ、酸ィ匕によってそれ自体が発色する発色剤等）を作用させて酸化色素を生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。

[0122] 消去法 (l)-b

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NA D (P)を作用させて NAD (P) Hを生じさせ、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。

[0123] 上記消去法 (l)-a及び (l)-bにおいて、相異なる二つの時点とは、（i)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODn b)と、（ii)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（〇Dt)、の二つの時点である。尚、これら二つの時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0124] また、上記消去法 (l)_a及び消去法 (l)-bにおいて、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL コレステロールの量を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることにより、 LDL コレステロールの量を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL コレステロール及び LDL コレステロールの量を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。

[0125] 上記消去法 (l)-a及び消去法 (l)-bにおいては、（i)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後、好ましくは本発明に係るポリマーによって反応が阻害されないリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODnb)の後に、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を復活（復帰 )或いは促進し得る物質を反応系に共存させるのが好ましい。これにより阻害されていた特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が復活（復帰）或いは促進されるので、より短時間に目的とする特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定を完了（終了）すること力 Sできる。

[0126] また、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODnb)の後に、反応系の pHを変化させることによつても、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或いは促進し得る。

[0127] (2)消去法 (2)

本発明の消去法 (2)を実施するには、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬の存在下、当該試薬と本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールとを反応させて、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを、本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白中のコレステロールの反応に関与しない別の反応に導いて消去（消費）した後、本発明に係るポリマ一により保護された特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を実施すればよい。

[0128] 例えば、このような本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬としては、（i)生体由来試料中のコレステロールを CHEと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、次レ、で COを反応させて生成する過酸化水素を消去するための過酸化水素消去試薬、（ii)生体由来試料中のコレステロールを CHEと反応させて遊離コレステロールと脂肪酸に分解し、 CH D及び NAD (P)を反応させて生成する NAD (P) Hを消去するための NAD (P) H消去試薬等が挙げられる。

[0129] 過酸化水素消去試薬としては、例えば CHE、 CO、 POD及びカップラーとの組合せ、 CHE、 CO、 POD及びデベロッパーとの組合せ、 CHE、 CO、 P〇D、カップラー及びデベロッパーの組合せ、 CHE、 CO及び CAT等が挙げられ、 NAD (P) H消去試薬としては、 CHE、 CHD及び NAD (P)の組合せが挙げられる。

[0130] このような本発明に係るポリマーにより保護されたリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬を用いる、本発明の消去法 (₂)は、例えば以下のように実施することができる。

[0131] 消去法 (2)-a

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHEと COを作用させて過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素に PODとカップラー（又はデベロッパー )、又は CATを作用させて、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去（消費）し、次いでデベロッパー（又はカップラー）、又は CAT阻害剤及び被酸化性呈色試薬を作用させて酸化色素を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する

[0132] 消去法 (2)-b

本発明に係るポリマーの存在下（共存下）、生体由来試料に CHE、 CHD及び NA D (P) (或いは CHE、 C〇、 P〇D及びカップラー又は/及びデベロッパー）を作用させて NAD (P) H (或いは過酸化水素）を生じさせる反応系に導レ、て、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去（消費）した後、次いで、 CO、 P〇D、被酸化性呈色試薬及び CHD阻害剤（或いは CHD、 NAD (P)及び CO阻害剤）を作用させて酸化色素（或いは NAD (P) H)を生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量、即ち、生体由来試料と本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する。

[0133] 上記消去法 (2)-a及び (2)-bにおいては、一つの時点、即ち、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（ODb)のみの吸光度の測定によっても生体由来試料中の特定リポ蛋白中のコレステロール量を測定し得るが、より測定精度を上げるために、上記消去法 ( l)-a及び (l)-bと同様の相異なる二つの時点、即ち、 G)生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（ODbl)と、（Π)本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点（〇Db)での吸光度を測定するのが好ましい。尚、これら二つの時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0134] また、上記消去法 (2)-a及び消去法 (2)-bにおいて、本発明に係るポリマーを適宜選択して用いることにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを特異的に測定することができる。例えば (1)前述した如き HDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL 一コレステロールの量を、（2)前述した如き LDLを保護するポリマーを用いることにより、 LDL—コレステロールの量を、また、（3)前述した如き HDL及び LDLを保護するポリマーを用いることにより、 HDL—コレステロール及び LDL—コレステロールの量を、それぞれ求めることができる。尚、これら本発明に係るポリマーの具体例、好ましい態様は前述した通りである。

[0135] 上記消去法 (2)-a及び消去法 (2)-bにおいては、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）された後、好ましくは生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前（〇Dbl)に、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰）或いは促進し得る物質を反応系に共存させるのが好ましい。これにより阻害されてレ、た特定のリポ蛋白の反応が復活 (復帰）或いは促進されるので、より短時間に測定を完了（終了）することができる。

[0136] また、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（〇Dbl)の後に、反応系の pHを変ィ匕させることによつても、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或レ、は促進し得る。

[0137] 2- 3.具体的な測定法

(1)直接法〔直接法 (1)及び (2)〕

本発明の直接法〔直接法 (1)及び ( 〕は、 1液法でも 2液法でも或いはそれ以上の試液を用いる方法の何れでもよぐ 2液以上の試液を用いる方法においては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。尚、 1 液法の場合には、本発明に係るポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液に含まれることは言うまでもない。

[0138] 以下に本発明の直接法〔直接法 (1)及び (2)〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。

[0139] 1液法で行う場合は、例えば以下の如くである。

[0140] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD及び被酸化性呈色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる試液とを混合した後に吸光度（ODnb)を測定し、この吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればよい。

[0141] 2液法で行う場合は、例えば以下の如くである。

[0142] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー及び (2)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（〇Dbl)を測定し、次いで、当該混合液と、 (3) CHE、 (4)CO〔又は (4)CHD〕及び (5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（〇Dnb)を測定し、この吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればよレ、。尚、第二試液に COを含有させる場合には、 POD及びカップラー、デベロッパーを、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液に CHDを含有させる場合には、 NAD (P)を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。

[0143] 上記において、〇Dnbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0144] また、上記の 1液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40 °C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。

[0145] 上記の 2液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C 、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6 〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常 15〜40°C、好ましくは 25 〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5 、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればょレ、。

[0146] (2)消去法 (1)〔消去法 (l)-a及び (l)-b〕

本発明の消去法 (1)〔消去法 (l)-a及び (l)-b〕は、 1液法でも 2液法でも或いはそれ以上の試液を用レ、る方法の何れでもよレ、。 2液以上の試液を用レ、る方法にぉレ、ては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよぐまた、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を使用する場合には、当該物質を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で添加する試液中（例えば 2液法の場合には第二試液）に含有させればよレ、。尚、 1液法の場合には、本発明に係るポリマー及びコレステロール測定用の試薬類の全てが当該試液に含まれることは言うまでもない。

[0147] 以下に本発明の消去法 (1)〔消去法 (l)-a及び (l)_b〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。

[0148] 1液法で行う場合は、例えば以下の如くである。

[0149] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー、（2)CHE、（3)CO、 POD及び被酸化性呈色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる試液とを混合し、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明に係るポリマ一によつて反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点で吸光度（〇Dnb)を測定し、次いで、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（ODt)を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればよい。

[0150] 2液法で行う場合は、例えば以下の如くである。

[0151] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー及び (2)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（〇Dbl)を測定し、次いで、当該混合液と、 (3) CHE、 (4)CO〔又は (4)CHD〕及び (5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ使用する本発明に係るポリマ一によつて反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点で吸光度（ODnb)を測定し、次いで、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（ODt)を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール)量を算出すればよい。尚、第二試液に COを含有させる場合には、 POD及びカップラー、デべロッパーを、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、第二試液に CHDを含有させる場合には、 NAD (P)を第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。

[0152] また、例えば以下のようにしても 2液法で本発明を実施することができる。

[0153] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー、（2)CHE、（3)CO、 P〇D及び被酸化性呈色試薬〔又は (3)CHD及び NAD (P)〕及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（〇Dnb)を測定し、次いで、当該混合液と、（4)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質及び (5)水性媒体を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ODt)を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール量）を算出すればよい。

[0154] 上記において、〇Dnbと ODtを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0155] また、上記の 1液法において、生体由来試料と試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40 °C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。

[0156] 上記の 2液法において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C 、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6 〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常 15〜40°C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、ょり好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればょレ、。

[0157] (3)消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕

本発明の消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕は、通常 2液法又はそれ以上の試液を用いる方法で行われる。 2液以上の試液を用いる方法においては、本発明に係るポリマーを、生体由来試料と直接混合させる試薬中に含有させればよい。また、上記消去法 (2)_aにおいては、 P〇Dとカップラー、 PODとデベロッパー、又は CATを、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよぐ上記消去法 (2)_bにおいては、 PODとカップラー又は/及びデベロッパー、又は NAD (P )を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよレ、。特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を使用する場合には、当該物質を、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールが実質的に消去（消費）された後の時点で添加する試液中（例えば 2液法の場合には第二試液）に含有させればよい。

[0158] 以下に本発明の消去法 (2)〔消去法 (2)-a及び (2)-b〕の具体例を示すが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。

[0159] 例えば以下のようにして、消去法 (2)-aを実施することができる。

[0160] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー、（2)CHE、（3)CO、（4)PODとカップラー

(又はデベロッパー）〔或いは (4)CAT〕、及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（ODbl)を測定し、次いで、当該混合液と、（6)デべロッパー（又はカップラー）〔或いは (6)CAT阻害剤〕、（7)水性媒体及び要すれば (8) 特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ODb)を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）量を算出すればよい。尚、第一試液に CATを含有させる場合には、 P OD、カップラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。また、 CHE、 CO、 PODは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。

[0161] 例えば以下のようにして、消去法 (2)_bを実施することができる。

[0162] 生体由来試料と、（1)本発明に係るポリマー、（2)CHE、（3)CO、 P〇D、及びカップラ一又は Z及びデベロッパー〔或いは (3)CHD及び NAD (P)〕、及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し、その後、要すれば吸光度（〇Dbl)を測定し、次いで、当該混合液と、（6)CHD、 NAD (P)及び CO阻害剤〔或いは (6)CO、 P〇D、被酸化性呈色試薬及び CHD阻害剤〕及び (7)水性媒体、要すれば (8)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（〇Db)を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量）を算出すればよい。

[0163] 上記において、 ODbを測定する時点は、測定方法の違いや、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）を検討し、適宜設定すればよい。

[0164] また、上記において、生体由来試料と第一試液との反応条件としては、使用する本発明に係るポリマーの種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、一概には言えないが、反応温度としては、通常 15〜40°C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等）等を検討し、適宜設定すればよい。また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6 〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から適宜設定すればよい。また、生体由来試料と第一試液との混合液と第二試液との反応条件についても同様であり、反応温度としては、通常 15〜40°C、好ましくは 25〜40°C、より好ましくは 30°C〜40°Cの範囲、反応時間は:!〜 20分、好ましくは 2〜15分、より好ましくは 3〜10分の範囲から、また、反応時の pHについても同様に、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、ょり好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近の範囲から例えば各リポ蛋白分画に対する反応性 (反応曲線等)等を検討し、適宜設定すればょレ、。

[0165] (4)リポ蛋白中のコレステロール量の算出

上記した如き本発明の方法において、得られた吸光度に基づいて生体由来試料中のリポ蛋白中のコレステロール量を算出するには、例えば以下の如くして行えばよレ、。

[0166] 直接法〔直接法 (1)及び (2)〕

(l)〇Dnbを、例えば予め、濃度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODnbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する

[0167] (2)〇Dnbから ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて求めた値)〕を差し引いた吸光度（〇Dtv)を求め、得られた ODtvを、例えば予め、濃度既知の、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマ一との接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と〇Dtvとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。

[0168] 消去法 (1)〔直接法 (l)-a及び (l)_b〕

(l)〇Dtから ODnb〔又は ODnbに由来する値（例えば ODnbに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（〇Dcb)を求め、得られた ODcbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマーとの接触によつて反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。

[0169] (2)〇Dnbから ODbl〔又は ODblに由来する値（例えば ODblに液量補正係数を掛けて求めた値）〕を差し引いた吸光度（ODcnb)と、 ODtから ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて求めた値)〕を差し弓 I V、た吸光度（ODct) を求め、更に ODctから ODcnbを差し引いた吸光度（ODcb)を求める。得られた〇Dc bを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。

[0170] 消去法 (2)〔直接法 (2)-a及び (2)-b〕

(l)〇Dbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害される特定のリポ中のコレステロール)を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。

[0171] (2)〇Dbから ODbl〔又は ODblに由来する値 (例えば ODblに液量補正係数を掛けて求めた値)〕を差し引いた吸光度（ODcb)を求め、得られた ODcbを、例えば予め、濃度既知の特定のリポ蛋白中のコレステロール (本発明に係るポリマーとの接触によつて反応が阻害される特定のリポ蛋白中のコレステロール）を含有する標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして求めた、当該リポ蛋白中のコレステロール濃度と ODcbとの関係を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量 (生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によつて反応が阻害された特定のリポ蛋白中のコレステロール）の値を算出する。

[0172] 2-4.各構成要件の態様及び使用濃度

以下に本発明における各構成要件の好ましい態様、具体例及びその使用濃度等について説明する。

[0173] (1)本発明に係るポリマー

本発明のポリマーの好ましい態様、具体例は前述した通りである。

[0174] また、本発明に係るポリマーの使用濃度としては、特定のリポ蛋白中のコレステロ一ルの反応を阻害させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させ得る濃度であればよぐ生体由来試料と直接混合させる試液中の濃度として、通常 0.001%〜10% (W/V)、好ましくは0.05%〜2% (W/V)でぁる。尚、これら本発明のポリマーは単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。

[0175] (2) CO

本発明において用いられる COとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属、シユードモナス属等の微生物に由来するもの、牛瞎臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。 COの使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.03〜330u/ml、好ましくは 0.07〜130u/ml、より好ましくは 0.13〜65uZmlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常 0.02〜250u /ml,好ましくは 0.05〜100u/ml、より好ましくは 0.1〜50uZmlである。

尚、一液法の場合は、上記最終の反応液中の濃度範囲から適宜選択される。（以下、同様。 )

[0176] (3) CHE

本発明において用いられる CHEとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、キャンディダ属、シユードモナス属等の微生物に由来するもの、牛瞎臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。 CHEの使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.03〜330uZml、好ましくは 0.07〜130uZml、より好ましくは 0.13〜65uZmlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常 0.02〜2 50u/ml、好ましくは 0.05〜100u/ml、より好ましくは 0.1〜50uZmlである。

[0177] (4) POD

本発明において用いられる PODとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、西洋ヮサビ、大豆、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられる。 P〇Dの使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.1〜1000u/ml、好ましくは 0.25〜400u/ml、より好ましくは 0.5〜200u/mlであり、又は、最終の反応液中の濃度として、通常 0.1〜250u/ml、好ましくは 0.25〜100u/ml、より好ましくは 0 .5〜50u mlでめ。

[0178] (5)被酸化性呈色試薬

本発明において用いられる被酸化性呈色試薬としては、 PODの存在下、過酸化水素と反応して呈色するものであればよぐ例えば 4-ァミノアンチピリン (以下、 4 AA と略記する。）等のカップラー及び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッパーとの組合せ、即ち、例えば 4 AAとフエノール系化合物、ナフトール系化合物若しくはァニリン系化合物の組合せ、 3_メチル _2_ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとァニリン系化合物の組合せ等や、例えば 2, 2'-アジノビス (3-ェチルベンゾチアゾリン- 6 -スルホン酸)、トリフエニルメタン系ロイコ色素、ジフエニルァミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、 0 -フエ二レンジァミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色する発色剤等が挙げられる。

[0179] デベロッパーとしてのフヱノール系化合物の具体例としては、例えばフヱノール、 P- クロロフヱノール、 2，4 -ジクロロフヱノール等が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例えば 1-ナフトール、 1-ナフトール- 2-スルホン酸、 1-ナフトール- 2-カルボン酸等が挙げられ、また、ァニリン系化合物の具体例としては、例えば Ν,Ν-ジェチノレァニリン、 Ν-ェチル -N_( i3 -ヒドロキシェチル) -m-トルィジン、 N-ェチル -N-(2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル)- 3,5-ジメトキシァニリン（DA〇S)、 N-ェチル _N- (2-ヒドロキシ- 3_スルホプロピル) -3，5 -ジメトキシ -4-フルォロア二リン（FDAOS)、 N_(2_ヒドロキシ -3-スルホプロピル) -3，5-ジメトキシァニリン（HDAOS)、 N-ェチル _N_(2-ヒドロキシ- 3_スルホプロピル) -m -トルィジン（TO〇S)、 N-ェチル -N-(3_メチルフエニル) - Ν'-サクシニル-エチレンジァミン（EMSE)、 Ν- (3-スルホプルピル)- 3-メトキシ -5-メチルァ二リン（HMMPS)等が挙げられる。

[0180] カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラーの種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異なる力例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.01〜400mM、好ましくは 0.1〜40 mM、より好ましくは 0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.01〜10 0mM、好ましくは 0.1〜10mMの範囲である。また、カップラーとして 4— AAを使用する場合の使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.01〜 200mM、好ましくは 0.1〜40mM、より好ましくは 0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜5mMである。

[0181] また、デベロッパーの使用量としては、用いるデベロッパーの種類や組み合わせるカップラーの種類等により異なるため一概には言えないが、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.01〜200mM、好ましくは 0.1〜40mM、より好ましくは 0. 2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.01〜50mM、好ましくは 0.1〜 5mMである。

[0182] トリフエニルメタン系ロイコ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス (p-ジェチルァミノフエニル) -2-スルホフェニルメタン、ビス (P-ジェチルァミノフエ二ル)- 3, 4-ジスルホプロポキシフエニルメタン 'ジナトリウム塩等が挙げられ、ジフヱ二ルァミン誘導体の具体例としては、例えばビス〔4 -ジ (2-ブトキシェチル)ァミノ- 2-メチルフエニル〕ァミン、 N，N-ビス (4-ジェチルァミノ- 2-メチルフエ二ル)- N'-p-トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば 10- (カルボキシメチルァミノカルボニル) -3,7-ビス (ジメチルァミノ)フエノチアジン*ナトリウム塩、 10-〔3- (メトキシカルボニルアミノメチル)フエニルメチルァミノカルボニル〕 -3,7-ビス (ジメチルァミノ)フエノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具体例としては、例えばべンジジン、 0_トリジン、 0-ジァニシジン、 3, 3，-ジァミノべンジジン、 3,3'，5，5，-テトラァミノべンジジン等が挙げられ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例えば 2-(4-カルボキシフヱ二ル)- 3-N -メチルカルバモイル -4， 5-ビス (4 -ジェチルァミノフエニル)イミダゾール、 2_(3-メトキシ- 4 -ジェチルァミノフエニル) 3-N-メチルカルバモイル- 4,5-ビス (2-メチル -4-ジェチルァミノフエニル)イミダゾール等が挙げられる。

[0183] これら発色剤の使用量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲である。

[0184] (6) CAT

本発明において用いられる CATとしては、通常この分野で使用されているもの、例えば、牛肝臓等の動物臓器に由来するもの、クロ口プラスト等の植物に由来するもの、ミクロコッカス属、ロドシユードモナス属等の微生物に由来するもの等が挙げられる。 CATの使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 10〜5 0000u/m 好ましくは 100〜5000u/ml、より好ましくは 50〜2000u/mlである。

[0185] (7) CHD

本発明において用いられる CHDは、通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア属に由来するもの等が挙げられる。 CHDの使用量としては、例えば 2 液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.1〜150u/ml、好ましくは 0.3〜100u /ml、より好ましくは 0.5〜60u/mlであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.1〜1 00u/ml、好ましくは 0.5〜50u/mlである。

[0186] (8) NAD (P)

本発明において用いられる NAD (P)は、通常この分野で使用されているもの、例えば、酵母に由来するもの等が挙げられる。 NAD (P)の使用量としては、例えば 2液法に於ける第一試液中の濃度として、通常 0.2〜70mM、好ましくは 0.5〜50mM、より好ましくは l〜20mMであり、最終の反応液中の濃度として、通常 0.2〜50mM、好ましくは:!〜 10mMである。 [0187] (9) CAT阻害剤

本発明において用いられる CAT阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えば NaN、 3-ァミノ- 1，2，4-トリァゾール等が挙げられる。これら CAT阻害剤

3

の使用量としては、用いる CAT阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.01〜10% (W/V)、好ましくは 0.02〜5% (W/V)、より好ましくは 0.03〜3% (W/V)である。

[0188] (10) CO阻害剤

本発明において用いられる CO阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えば Ag +イオン、 Zn2 +イオン、ダルタチオン等が挙げられる。これら CO阻害剤の使用量としては、用いる C〇阻害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例えば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.00002〜40% (W/V)、好ましくは 0.0002〜4% (W/V)、より好ましくは 0.002〜0.4% (W/V)である。

[0189] (l l) CHD阻害剤

本発明において用いられる CHD阻害剤としては、通常この分野で使用されているもの、例えば Ag +イオン、 Zn2 +イオン等が挙げられる。これら CHD阻害剤の使用量としては、用いる CHD阻害剤の種類により異なるため一概には言えなレ、が、例えば 2液法に於ける第二試液中の濃度として、通常 0.00001〜70% (W/V)、好ましくは 0.0001〜7% (W/V)、より好ましくは 0.001〜0.7% (W/V)である。

[0190] (12)水性媒体

本発明において用いられる水性媒体としては、水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝剤としては、 pH5〜l lの範囲で緩衝作用を有し、コレステロール測定反応を阻害しないものであればよぐ例えばトリスヒドロキシメチルァミノメタン、グッドの緩衝剤（PIPES、 BES、 TES、 HEPES等）、リン酸塩、ホウ酸塩、イミダゾール等、通常この分野で用いられるものが挙げられ、その使用濃度としては、通常 lmM〜2M 、好ましくは 10mM〜lMの範囲であり、また、 pHは、通常 5〜11、好ましくは 5〜10、より好ましくは 5.5〜8.5、更に好ましくは 6〜8、特に好ましくは 7付近である。

[0191] また、生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールが実質的に消去（消費）され、且つ使用する本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点（〇Dbl)の後に、反応系の pHを変化させることによって、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除、言い換えれば、本発明に係るポリマーによって阻害されている特定のリポ蛋白の反応を復活 (復帰)或いは促進させる場合には、生体由来試料と直接混合させる本発明に係るポリマーを含む試液 (例えば第一試液）の pHを、本発明に係るポリマーによつて反応が阻害されなレ、リポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）中のコレステロールの反応が実質的に終了した後の時点で添加する試液 (例えば第二試液）の pHよりも、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る程度高ぐまたは低くすればよい。具体的には、使用する本発明に係るポリマーの種類や濃度等によって異なるため一概には言えないが、これら試液間での pHの差は、通常 0.5〜3、好ましくは:!〜 3である。

[0192] (13)特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質

本発明において用いられる、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質としては、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応を復活 (復帰）或いは促進し得る性質を有するものであればよい。

[0193] このような性質を有する物質としては、例えば、上記した如き性質を有するものであつて、自体公知の総コレステロール測定方法 (試薬）で使用される非イオン性界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界面活性剤が使用できる。

[0194] 非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル〔ポリォキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシェチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシェチレン高級アルコールエーテル等〕、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテル〔ポリォキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンノユルフェニルエーテル等〕、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル〔ポリエチレングリコールモノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート、ポリエチレングリコールモノォレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔

トリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等〕、ソルビタン脂肪酸エステル〔ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノォレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキォレエート等〕、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル〔テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット等〕、ポリオキシエチレンアルキルアミン〔ポリオキシェチレンラウリルァミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等〕、グリセリン脂肪酸エステル〔ステアリン酸モノダリセライド、ォレイン酸モノグリセライド等〕等が挙げられる。

[0195] 陰イオン性界面活性剤としては、例えばコール酸およびその誘導体〔コール酸、デォキシコール酸、ポリオキシエチレンアルキルフエノールエーテル硫酸塩、ラウロイノレサルコシン等〕等が挙げられる。

[0196] 両性界面活性剤としては、例えばアルキルべタイン誘導体〔ラウリルべタイン、ステァリルべタイン、ラウリルジメチルアンモニゥムベタイン、ココナットべタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルべタイン、ラウリン酸アミドプロピルべタイン等〕、イミダゾリニゥムべタイン誘導体〔2-ラウリル- N-カルボキシメチル -N-ヒドロキシェチルイミダゾリ二ゥムべタイン、 2-ゥンデシル -N-カルボキシメチル -N-ヒドロキシェチルイミダゾリ二ゥムべタイン等の 2_アルキル -N -カルボキシメチル -N-ヒドロキシェチルイミダゾリニゥムベタイン； 2-アルキル -N-カルボキシェチル -N -ヒドロキシェチルイミダゾリニゥムベタイン等〕、スルホベタイン誘導体〔N -ォクチル -N，N -ジメチル- 3_アンモニォ -1-プロパンスルホン酸、 N -デシル _N,N-ジメチル -3-アンモニォ _1_プロパンスルホン酸、 N -ドデシル- N，N_ジメチル- 3_アンモニォ -1-プロパンスルホン酸、 N-テトラデシル- N，N_ジメチル- 3-アンモニォ -1-プロパンスルホン酸、 N-へキサデシル -Ν,Ν-ジメチル -3-アンモニォ -1-プロパンスルホン酸等〕等のベタイン誘導体；例えばアルキルグリシン、アルキルビス (アミノエチル)グリシン、ジォクチルポリアミノェチルグリシン、 N-アルキルポリアミノエチルダリシン、 β -ァラニン誘導体等のアミノカルボン酸誘導体;例えばビス (2-ゥンデシル -Ν-ヒドロキシェチルイミダゾリン)クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾリン誘導体等のイミダゾリン誘導体；例えばラウリルジメチルァミンオキサイド等のアミンォキサイド誘導体等が挙げられる。

[0197] 上記した如き界面活性剤の中でも、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤が好ましい。

[0198] 上記した如き界面活性剤の使用濃度としては、本発明に係るポリマーによって反応が阻害されたリポ蛋白（生体由来試料と本発明に係るポリマーとの接触によって反応が阻害された特定のリポ蛋白）中のコレステロールの反応を復活 (復帰）或いは促進し得る濃度であればよぐ使用する本発明のポリマーの種類やその使用濃度、界面活性剤の種類等により異なる為一概には言えないが、 2液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量比等により異なるが、第二試液中の濃度としては、通常 0.01〜2 0% (W/V)、好ましくは 0·05〜5% (W/V)である。

尚、これら界面活性剤は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせて用いてあよい。

[0199] (14)その他の試薬類

本発明においては、上記した如き試薬類 (構成要件)以外にも、通常この分野で用レ、られてレ、る試薬類が使用可能である。

[0200] このような試薬類としては、例えばァスコルビン酸、溶血、ビリルビン等の共存物質の影響回避（例えばァスコルビン酸ォキシダーゼ、銅イオン等の金属イオン、フエロシアンィ匕カリウム等）、高トリグリセライド検体等による乳びの影響回避剤（例えば界面活性剤、 NaCl、 KC1等の塩類、例えば LPL等の酵素等）及び反応促進剤（例えば界面活性剤、金属イオン等）、酵素等の安定ィ匕剤（例えば牛アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質、例えばグルタミン酸等の各種アミノ酸類、例えばブドウ糖等の各種糖類等）、各種塩類 (例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム等）、抗酸化性物質 (例えばマンニトール等）、キレート剤（例えば EDTA等）、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム等）、吸着防止剤〔例えば PMPC、 PMB82、 PMB82_ 1M、 PMB37、 PMC 91、 PMC 82、 PMBz82等の特開 2003-344413号公報記載の MPCポリマー〕等が挙げ

18

られる。

尚、上記した如きその他の試薬類の使用濃度は、自体公知の方法に従い適宜選択すればよい。

[0201] (15)生体由来試料

本発明が適用される生体由来試料としては、例えば血清、血漿等の生体由来試料、及びこれらを水、生理食塩水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。

[0202] 3.本発明のリポ蛋白中のコレステロールの測定用試薬及びキット

本発明の試薬及びキットは、上記した如き本発明の測定法を実施するために使用されるものであり、本発明に係るポリマーを用いる以外は、上記した如き生体由来試料中のコレステロールを測定する方法に使用される試薬類 (構成要件）を、通常この分野で使用される濃度範囲で含有するように調製されたものでよぐ構成要件の好ましい態様や使用濃度等は、前述した通りである。

[0203] より具体的には、本発明の試薬及びキットは、例えば以下の如き試薬類 (構成要件 )を主成分として含むものであり、これら以外にその他の試薬類を含有していてもよい

[0204] (1)直接法用試薬'キット

上記した如き本発明の直接法用の試薬'キットとしては、例えば以下の如き試薬類（構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。

[0205] 直接法 (1)用試薬'キット (一液法）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CO

•POD

•被酸化性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）

•水性媒体 [0206] 直接法 (1)用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•水性媒体

(第二試液）

•CHE

•CO

•水性媒体

尚、上記の場合には、 P〇D、カップラー及びデベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。

[0207] 直接法 (2)用試薬'キット (一液法）

，本発明に係るポリマー

•CHE

•CHD

•NAD (P)

•水性媒体

[0208] 直接法 (2)用試薬'キット (2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

，水性媒体

(第二試液）

•CHE

•CHD

•水性媒体

尚、上記の場合には、 NAD (P)は、第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させる。

[0209] (2)消去法 (1)用試薬'キット

上記した如き本発明の消去法 (1)用の試薬'キットとしては、例えば以下の如き試薬類 (構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。

[0210] 消去法 (l)-a用試薬'キット（一液法）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CO

•POD

•被酸化性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）

•水性媒体

[0211] 消去法 (l)-b用試薬'キット (一液法）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CHD

•NAD (P)

•水性媒体

[0212] 消去法 (l)-a用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•水性媒体

(第二試液）

•CHE

•CO

•水性媒体

[0213] 消去法 (l)_a用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE •CO

•POD

•カップラー

•ァベロッノ ~

•水性媒体

(第二試液）

•特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質 (例えば界面活性剤）

•水性媒体

[0214] 消去法 (l)_b用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•水性媒体

(第二試液）

•CHE

•CHD

•水性媒体

[0215] 消去法 (l)-b用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CHD

•NAD (P)

•水性媒体

(第二試液）

•水性媒体

[0216] (3)消去法 (2)用試薬'キット

上記した如き本発明の消去法 (2)用の試薬 ·キットとしては、例えば以下の如き試薬類 (構成要件）を主成分として含むものが挙げられる。

[0217] 消去法 (2)_a用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CO

•POD

'カップラー又はデベロッパー

•水性媒体

(第二試液）

•デベロッパー又はカップラー

•水性媒体

，要すれば、特定のリポ蛋白に対する本発明に係るポリマーの保護を解除し得る物質 (例えば界面活性剤）

上記の場合には、 CHE、 C〇、 PODは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。

[0218] 消去法 (2)-a用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CO

•CAT

•水性媒体

(第二試液） •CAT阻害剤

•水性媒体

上記の場合には、 P〇D、カップラー、デベロッパーは、それぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含有させ、また、 CHE、 C〇は第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。

[0219] 消去法 (2)- b用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CO

•POD

'カップラー又は/及びデベロッパー

•水性媒体

(第二試液）

•CHD

•NAD (P)

•CO阻害剤

•水性媒体

上記の場合には、 CHEは第一試薬と第二試薬の両方に含有させても良い。

[0220] 消去法 (2)-b用試薬'キット（2液法）

(第一試液）

•本発明に係るポリマー

•CHE

•CHD •NAD (P)

•水性媒体

(第二試液）

•CO

•POD

•CHD阻害剤

•被酸化性呈色試薬 (カップラー及びデベロッパー）

•水性媒体

[0221] また、当該キットには、必要に応じて、測定対象となるリポ蛋白中のコレステロ一ノレ標準品等が組み合わされていてもよい。当該標準品は、例えばヒトゃ動物等の血清等を用いて調製された標準血清やこれらに由来する測定対象となるリポ蛋白分画を含有するもの等を使用することができる。尚、ここで、測定対象となるリポ蛋白質とは、例えば利用する測定法が本発明の直接法の場合には、本発明に係るポリマーによつて保護されるリポ蛋白以外のリポ蛋白（本発明に係るポリマーによって反応が阻害される特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白）を意味し、利用する測定法が本発明の消去法の場合には、本発明に係るポリマーによって保護されるリポ蛋白（本発明に係るポリマーによって反応が阻害される特定のリポ蛋白）を意味する。

[0222] 更に、前述した如き本発明の測定法での使用のための説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴 ·原理 ·操作手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット（リーフレット）等を意味する。

[0223] 以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。

実施例

[0224] 以下に表記される「ィ匕合物 (1)〜(16)」とは、下記表 1に示される化合物のことを意味する。

[0225] [表 1]

[0226] 実施例 1.本発明のポリマーの製造方法

実施例 1 1.

メタクリル酸 (和光純薬工業 (株)社製） 23g〔以下、「モノマー A」と略記する。〕とメタクリル酸シクロへキシル (和光純薬工業 (株)社製） 23g〔以下、「モノマー B」と略記する。〕とをイソプロパノール 180g中に溶解し、重合開始剤（ァゾ基含有ポリエチレングリコール）（以下、「PEG」と略記する。 ) (商品名： VPE-0201 ,和光純薬工業 (株)社製 ) 15gを添加した後、アルゴンガス置換下、 78°Cで 6時間攪拌した。反応終了後、得られた反応液をへキサン 500mLに投入し、上澄みを除去した。残渣を減圧乾燥することにより、本発明に係るポリマーを得た。

得られたポリマーは、 H-NMRスペクトル分析により、ポリメタクリル酸セグメント (0.88 pprr！〜 1.96ppm)及びポリエチレングリコールセグメント (3.58ppm)を有していること、 IR スペクトル分析により、カルボニル基（_C=0) (1725cm— の存在を確認した。その結果を表 2に示す。

[0227] 実施例 1 2 24. 本発明のポリマーに於けるモノマー A及びモノマー Bとして、表 2に示す各種モノマ一を所定の割合で用いる以外は、実施例 1 1と同様の操作を行い、本発明に係るポリマーを得た。その結果を表 2に併せて示す。

[表 2]

モノマ一重量比組成比物性亍一タ

実施例

A B PEG A B B/A NMRスペクトル IRXベクトル

0B3~1.99ppm(P A),

1-1 (3) 10 20 10 0.5 1 11cm"¹(-C=0)

3.56ppm(PEG)

0.908~2.02ppm(PMA),

1-2 1724cm"¹(-C=0) π) (7) 10 20 10 0.5 3.60ppm(PEG)

0£8~1.90ppm(P A),

1-3 (2) (7) 10 20 10 0.5 1724cm"¹(-C=0)

3.59ppm(PEG)

0£4~2.10ppm(P A),

1-4 (" (7) 10 40 20 0.5 1726cm"¹(-C=0)

3.48ppm(PEG)

0B3~1.98ppm(P A),

1-5 (" (7) 10 18 12 0.7 1 24cnT¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

0.94~1.90ppm(P A),

1-6 (" (7) 10 17 13 0.8 1725crrT¹(-C=0)

3.60ppm(PEG)

0B9~1.95ppm(P A),

1-7 (" (7) 10 16 14 0.9 1726cm"¹(-C=0)

3.55ppm(PEG)

0£8~1.90ppm(P A),

1-8 (" (7) 10 15 15 1.0 1725cm"¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

0.78~2.00ppm(P A),

1-9 (" (7) 10 14 16 1.1 1726cm"¹(-C=0)

3.59ppm(PEG)

0£2~2.00ppm(P A),

1-10 (1) (7) 10 13 17 1.3 1 26cnT¹(-C=0)

3.56ppm(PEG)

C 〜l.Wppm(P A),

1-11 (" (7) 10 12 18 1.5 1724crrT¹(-C=0)

3.57ppm(PEG)

0B3~2.16ppm(P A),

1-12 (" (7) 10 11 19 1.7 1723cm"¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

030~2.08ppm(P A),

1-13 (" (4) 10 10 20 2.0 1729cm"¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

0.90~1.99ppm(P A),

1-14 (" (5) 10 10 20 2.0 1726cm"¹(-C=0)

3.60ppm(PEG)

0.78~2.03ppm(P A),

1-15 (" (6) 10 10 20 2.0 1723cm"¹(-C=0)

3.59ppm(PEG)

0B4~2.12ppm(P A),

1-16 (" (7) 10 10 20 2.0 1724crrT¹(-C=0)

3.60ppm(PEG)

0B0~2.00ppm(P A),

1-17 (" (7) 10 10 30 3.0 1725cm-，(-C=0)

3.60ppm(PEG)

0.78-1.98ppm(P A),

1-18 (" (7) 10 20 40 2.0 1726cm"¹(-C=0)

3.53ppm(PEG)

0£0~2.01ppm(P A),

1-19 (" (8) 10 20 40 2.0 1729cm"¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

0.78~1.90ppm(P A),

1-20 (" (9) 10 10 20 2.0 1730cm"¹(-C=O)

3.58ppm(PEG)

0£0~1.90ppm(P A),

1-21 (1) (10) 10 10 20 2.0 1 32cnT¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

0B8~1.98ppm(P A), 1 25cm"¹(-C=0),

1-22 (1) (11) 10 10 20 2.0 3.57ppm(PEG) 1033cm"¹, 1525cm"¹ (-CONH)

0.90-2.12ppm(P A),

1-23 (" (12) 10 10 20 2.0 1 27cm"¹(-C=0)

3.54ppm(PEG)

0£9~2.00ppm(P A),

1-24 (1) (13) 10 10 20 2.0 1726cm"¹(-C=0)

3.58ppm(PEG)

PMA:ポリメタクリル酸、 PEG:ポリエチレングリコール [0229] 実施例 1一 25〜：!一 47

本発明に於けるモノマー A及びモノマー Bとして、表 3に示す各種モノマーを所定の割合で用いる以外は、実施例 1 1と同様の操作を行い、本発明のポリマーを得た

。その結果を表 3に示す。

[0230] [表 3]

施例 2— 1 本発明のポリマーを含有するコレステロール測定用試薬と、超遠心法で分画した各種リポ蛋白との反応曲線を測定し、本発明のポリマーの各リポ蛋白中のコレステロ一ルの反応性への影響にっレ、て確認した。

〔試料〕

自体公知の超遠心法によりヒト血清より分画して得た、 HDL分画（コレステロール： 2 00mg/dL)、 LDL分画（コレステロール： 300mg/dL)及び VLDL分画（コレステロール： 1 OOmg/dL)をそれぞれ試料とした。

〔試薬〕

下記の組成の試薬を使用した。

• MOPS緩衝液 (pH7. 0) 25mM

-塩化ナトリウム 0. 40%

• コレステロ一ノレォキシダゼ丄 u/mL

• レステロ一ノレ：！：ステラ^" ゼ丄 u/mL

• HMMPS 0. 5mM

. 4 一アミノアンチピリン ImM

•ペルォキシダーゼ 1. 5u/mL

.本発明のポリマー 0. 10%

尚、本発明のポリマーとしては、実施例 1 _ 1〜1—47で合成したポリマーを使用した。また、対照として、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いた。

〔測定条件〕

日立 7170形自動分析装置（(株）日立製作所製)を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。

•測定方法： 1ポイントエンド [15]_[0]

•試料量：2.0 し

•試液量：180 /i L

•測定波長： 700/600nm

•測定温度： 37°C

〔結果〕

図 1に、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タィムコースを、図 2に、実施例 1—1で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 3に、実施例 1—3で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 4に、実施例 1 8 で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 5に、実施例 1— 11で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、図 6に、実施例 1— 16で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースを、また、図 7に、実施例 1— 22 で得られたポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースをそれぞれ示す。

尚、各図中、 _ · _は HDL分画試料（コレステロール： 200mg/dL)について得られた結果を、 _♦—は LDL分画試料（コレステロール： 300mg/dL)について得られた結果を、—國—は VLDL分画試料（コレステロール： 100mg/dL)について得られた結果を、また、 _△—は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。

[0233] 図 1〜図 4の結果から、実施例 1 _ 1、 1 _ 3及び 1 _8で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、 LDL中のコレステロールの反応が阻害されていること力図 1及び図 5の結果から、実施例 1 11で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合、 LDL及び HDL中のコレステロールの反応が阻害されていること力また、図 1及び図 6〜7の結果から、実施例 1— 16及び 1— 22で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用レ、た場合、 HDL中のコレステロールの反応が阻害されてレ、ること力それぞれ判る。

[0234] 尚、図示はしていないが、実施例 1— 2、 1 4〜：!一 7、 1 36〜：!一 38、 1 40及び 1—45〜1—47で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、 LDL中のコレステロールの反応が阻害されること力 S、実施例 1 9-1 - 12で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用レ、た場合には、 LDL及び HDL中のコレステロールの反応が阻害されること力 S、また、実施例1 _ 1₃〜1 _ 15、 1 - 17-21, 1

—23〜： 1— 26、 1— 27〜： 1— 35、 1— 39及び 1—41〜： 1—44で得られた本発明のポリマーを含有する試薬を用いた場合には、 HDL中のコレステロールの反応が阻害されること力それぞれ確認された。

[0235] 以上の結果と表 2及び 3から、本発明のポリマーのうち、一般式 [2]で示されるモノマー単位 (A)と一般式 [3]で示されるモノマー単位（B)との組成比力 B/A≤lであるポリマー（実施例 1—1〜： 1— 8、 1— 36〜： 1— 38、 1—40及び 1—45〜： 1—47) は、 LDLを保護し、 LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有することが、本発明のポリマーのうち、これらの組成比力 1く B/Aく 2であるポリマー（実施例 1 —9〜： 1— 12)は、 LDLと HDLとを保護し、 HDL中のコレステロール及び LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を、また、これらの組成比力 S、 2≤BZAであるポリマー（実施例 1— 13〜： 1— 35、 1— 39及び 1—41〜： 1—44)は、 HDLを保護し、 HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有することが示唆される。

[0236] 更に、本発明のポリマーが有するこれらの性質を適宜選択することによって、例えば本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを直接測定することや、本発明のポリマーによって保護された特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去法によって消去した後に、本発明のポリマ一によつて保護された特定のリポ蛋白質中のコレステロールを測定することが可能となること力 S示唆される。

[0237] 実施例 3— 1 消去法による HDL—コレステロールの測定

HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例 1— 22のポリマー）を用いて、消去法により試料中の HDL—コレステロールを測定し、基準的測定法である UCHM法での測定値と比較した。

〔試料〕

人血清 20検体

尚、各人血清中のトリダリセライド (TG)値は、 Lタイプヮコー TG-M (和光純薬工業（株)製）によって測定した。

〔UCHM法〕

Recommendations on Lipoprotein Measurement Prom the Working roup on Lipop rotein Measurement (NIH Publication No.95-3044 September 1995 page63 - 124)に記載の方法に従い測定した。

〔本発明による HDL -コレステロールの測定〕

(試薬）

以下の試薬を用い、本発明の消去法により各試料中の HDL -コレステロールを測定した。

•第一試液

• MOPS緩衝液、 pH7. 0 0. 025M

•塩化ナトリウム 0. 30%

■ コレステロ一ノレエステラーゼ 2U/mL

• コレステロ一/レオキシダーゼ 2U/mL

'力タラーゼ 1 k U/mし

'本発明のポリマー（実施例 1— 2 2 ) 0. 25%

■ HMMPS 0. 5 mM

'第二 S式液

■ MOPS緩衝液、 pH7. 0 0. 025M

■ ぺノレォキシダーゼ 6U/mL

• 4ーァミノアンチピリン 4mM

•アジ化ナトリウム 0. 10%

• ノニオン性界面活性剤 2. 00%

(測定条件）

ォリンパス AU— 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。

尚、キヤリブレーターとしてマルチキヤリブレーターリピッド（和光純薬工業 (株)製）を用いた。

'条件：2ポイントエンド法（測光ポイント 10— 27)

•試料：2 し

•試薬 1 : 180 μし

•試薬 2 : 60 /i L

•測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm

[0238] 〔結果〕

測定結果及び各試料中の TG値を表 4に、また、本発明の方法と UCHM法との相関図を図 8にそれぞれ示す。

尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。

相関式: y= 1.03x_ 1.3444 ;相関係数： R² = 0.9742

[0239] [表 4]

[0240] 表 4と図 8の結果から明らかなように、本発明の消去法による HDL—コレステロール測定法 (試薬）は、基準的測定法である UCHM法と良好な相関を示すことが判る。特に、高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法による HDL—コレステロ一ル測定法 (試薬)で得られた値は、 UCHM法の値力解離することなぐその測定値は両者で一致してレ、ること力 S半 IJる。

[0241] 実施例 3_ 2 消去法による LDL_コレステロールの測定

LDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例 1—8のポリマー）を用いて、消去法により試料中の LDL—コレステロールを測定し、基準的測定法である BQ法での測定値と比較した。

〔試料〕

人血清 20検体

尚、各人血清中のトリダリセライド (TG)値は、 Lタイプヮコー TG-M (和光純薬工業（株)製）によって測定した。〔BQ法〕

Recommendations on Lipoprotein Measurement From the Working Group on Lipop rotein Measurement (NIH Publication No.95-3044 September 1995 page 1—62) (こ己載の方法に従い測定した。

〔本発明による LDL -コレステロールの測定〕

(試薬）

以下の試薬を用レ、、本発明の消去法により各試料中の LDL -コレステロールを測定した。

•第一試液

(測定条件）

ォリンパス AU— 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製）を用レ、、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。

'条件：2ポイントエンド法（測光ポイント 10— 27)

，試料：2 し

•曾式 1 : 180 し

•試薬 2 : 60 μ L

•測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm

〔結果〕測定結果及び各試料中の TG値を表 5に、また、本発明の方法と BQ法との相関図を図 9にそれぞれ示す。

尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。

相関式: y=0.987x_ 1.1931；相関係数： R² = 0.9862

[表 5]

表 5と図 9の結果から明らかなように、本発明の消去法による LDL—コレステロール測定法 (試薬）は、基準的測定法である BQ法と良好な相関を示すことが判る。特に、高トリグリセライド検体においても、本発明の消去法による LDL—コレステロール測定法 (試薬)で得られた値は、 BQ法の値力解離することなぐその測定値は両者で一致していることが判る。

尚、上記第 1試液に更に PMB37 0.25%を添カ卩して同様の操作を行った場合でも BQ 測定値と良好な相関を示す LDL—コレステロール値が得られ、このような試薬は本発明の測定法に影響がないことが判った。実施例 3— 3 直接法による VLDL—コレステロールの測定

LDL及び HDL中のコレステロールの反応を阻害する性質を有する、本発明のポリマー（実施例 1— 1 1のポリマー）を用いて、直接法により試料中の VLDL—コレステロールを測定し、基準的測定法である超遠心法での測定値と比較した。

〔試料〕

人血清 20検体

〔超遠心法〕

( 1 )超遠心分離法による VLDL分画の採取

「新生化学実験講座、第 4卷脂質 I 197ページ (東京化学同人編)」に記載された方法により、 VLDL分画を採取した。即ち、血清試料 (4mL)に比重 d=l .006の塩化ナトリウム溶液を 2mL重層し、 16°C、 20,000卬 mで 30分間遠心して上層にあるキロミクロンを分離除去して残った下層に、さらに比重 d=l .006の塩ィ匕ナトリウム溶液を 2mL 重層し、 16°C、 40,000卬 mで 18時間遠心した後の上層部を採取して VLDL分画とし

(2) VLDL—コレステロールの測定

上記（1 )の操作により得た VLDL分画に生理食塩水を加えて元の血清量 4mLにしたものを試料として、その中に含まれているコレステロール濃度を総コレステロール測定試薬 (Lタイプヮコー CHO ' H :和光純薬工業 (株)製)を用いて、日立自動分析装置 7170S形自動分析装置（(株）日立製作所製)を用い、下記の測定条件で測定した。

'条件：2ポイントエンド法（測光ポイント 16— 34)

'試料：2 x L

•試薬 1 : 180 x L

•試薬 2 ■. Q0 μ L •測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm

〔本発明による VLDL コレステロールの測定〕

(試薬）

以下の試薬を用い、本発明の直接法により各試料中の VLDL コレステロールを測定した。

•第一試液

(測定条件）

ォリンパス AU 640自動分析装置 (ォリンパス (株)製）を用い、測定パラメータを以下のように設定して測定を行った。

'条件：2ポイントエンド法（測光ポイント 10— 27)

'試料：3 x L

•曾式 1 : 180 し

•試薬 2 : 60 μ L

•測定波長：主波長 600nm、副波長 700nm

〔結果〕

測定結果及び各試料中の TG値を表 6に、また、本発明の方法と UCHM法との相関図を図 10にそれぞれ示す。

尚、相関式及び相関係数は以下の通りであった。

相関式: y = 1.0065x 1.1194；相関係数： R² = 0.9909 [0247] [表 6]

[0248] 表 6と図 10の結果から明らかなように、本発明の消去法による VLDL—コレステロール測定法 (試薬）は、基準的測定法である超遠心法と良好な相関を示すことが判る。高トリグリセライド検体においても、本発明の直接法による VLDL—コレステロール測定法 (試薬)で得られた値は、超遠心法の値から解離することなぐその測定値は両者で一致していることが判る。

産業上の利用可能性

[0249] リポ蛋白中のコレステロールの直接的測定法に於いて、本発明のポリマーを共存させることにより、特定のリポ蛋白を保護し、当該特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応を阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を先行させて、当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。また、反応を先行させた当該特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することにより、特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することができる。これにより、測定対象となる目的のリポ蛋白以外のリポ蛋白を分離分別することなぐ目的のリポ蛋白中のコレステロールを測定することが可能となる。更に、本発明によれば、これまで問題となっていた脂質異常検体の測定値に於いても標準的測定法での測定値と一致する測定精度に優れたリポ蛋白中コレステロール測定方法及び測定試薬を提供することが可能となる。図面の簡単な説明

園 1]実施例 2—1で得られた、本発明のポリマーを含有しない試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

園 2]実施例 2— 1で得られた、実施例 1— 1のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

[図 3]実施例 2— 1で得られた、実施例 1 3のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

園 4]実施例 2—1で得られた、実施例 1—8のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

[図 5]実施例 2— 1で得られた、実施例 1一 11のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

園 6]実施例 2 _ 1で得られた、実施例 1 _ 16のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

[図 7]実施例 2_ 1で得られた、実施例 1 _ 22のポリマーを含有する試薬を用いて得られた各リポ蛋白の反応タイムコースである。

園 8]実施例 3_ 1で得られた、本発明の方法による HDL—コレステロール測定値と UCHM法による HDL—コレステロール測定値との相関図である。

園 9]実施例 3_ 2で得られた、本発明の方法による LDL—コレステロール測定値と B Q法による LDL コレステロール測定値との相関図である。

園 10]実施例 3— 3で得られた、本発明の方法による VLDL コレステロール測定値と超遠心法による VLDL コレステロール測定値との相関図である。

符号の説明図 1〜7中、 ·一は HDL分画試料（コレステロール： 200mg/dL)について得られた結果を、 ♦一は LDL分画試料（コレステロール： 300mg/dL)について得られた結果を、ー國一は VLDL分画試料（コレステロール： 100mg/dL)について得られた結果を、また、—△—は生理食塩水を試料として得られた結果をそれぞれ示す。

Claims

請求の範囲

[1] (i)一般式 [1]

(式中、 kは 10〜250の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコール

(ii)一般式 [2]

[2]

(式中、 R¹は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び

(iii)メタクリル酸 tert -ブチル、メタクリル酸シクロへキシル、メタクリル酸 2_ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルォロメチル）メチル、メタクリル酸 2，2，3,3,4，4，5，5 -ォクタフルォロペンチル、メタクリル酸へプタデカフルォロォクチルェチル、シクロへキシルメタクリルアミド、アクリル酸シクロへキシル、ビニルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、シクロへキシルビュルエーテル又はァリルベンゼン由来の第 3モノマー単位からなるポリマー。

[2] ポリエチレングリコールセグメントが、一般式 [5]

C一 Ef COO— (CH₂CH₂0)_k- [5]

R⁶

(式中、 R⁵は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R⁶はシァノ基又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250 の整数を表す。）で示されるものである、請求項 1に記載のポリマー。

[3] 重合平均分子量が 10， 000〜120, 000である、請求項 1に記載のポリマー。

[4] 一般式 [5]で示されるポリエチレングリコールセグメントを 1〜70重量％含有する、請求項 2に記載のポリマー。

[5] 一般式 [2]で示されるモノマー単位を 20〜85重量％含有する、請求項 1に記載のポリマー

[6] 第 3モノマー単位を 20〜85重量％含有する、請求項 1に記載のポリマー。

[7] 一般式 [2]で示されるモノマー単位がメタクリル酸由来のものであり、第 3モノマー単位がメタクリル酸シクロへキシル由来のものである、請求項 1に記載のポリマー。

[8] (iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(式中、 kは 10〜250の整数を表す。）で示される基を有するポリエチレングリコールセグメント、

(V)—般式 [2]

(式中、 Rは水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表す。）で示されるモノマー単位、及び

(vi)—般式 [3]

〔式中、 R²は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R³は一般式 [4] — COOR" [41

(式中、 R⁴はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、ァラルキル基又はアルキル力ルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位を構成成分として含んで成るポリマーの共存下で測定を行うことを特徴とする、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定法。

ポリエチレングリコールセグメントが、一般式 [5Ί

R⁵

C一 Ef COO— (CH₂CH₂0)_k [5]

R⁶ (式中、 R⁵は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、はシァノ基又は炭素数:!〜 3のアルキル基を表し、 Eは炭素数 1〜6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250 の整数を表す。）で示されるものである、請求項 8に記載の測定法。

ポリマーが、一C RRII般式 [6]

R¹ 2

CO- E CH₂— C- C- E i-COO— (CH₂CH₂0)_k- [6]

3

COOH R⁶

P

m

(式中、 R⁵及び R⁷は夫々独立して水素原子又は炭素数:!〜 3のアルキル基を表し、 R 6及び R⁸は夫々独立してシァノ基又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 E及び Eは

1 2 夫々独立して炭素数:!〜 6のアルキレン基を表し、 kは 10〜250の整数を表し、 nは 5 0〜900の整数を表し、 pは 50〜900の整数を表し、 mは:!〜 10の整数を表し、 ¹〜 R³は前記に同じ。）で示されるものである、請求項 8に記載の測定法。

[11] 一般式 [3]で示されるモノマー単位力メタクリル酸 tert -ブチル、メタクリノレ酸シクロへキシル、メタクリル酸 2-ェチルへキシル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ボルニル、メタクリル酸ジ（トリフルォロメチル）メチル、メタクリノレ酸 2，2，3,3,4,4，5，5-ォクタフルォロペンチル、メタクリル酸ヘプタデカフルォロォクチルェチル、シクロへキシルメタクリノレアミド、アクリル酸シクロへキシル、ビュルシクロへキシル、ァリルシクロへキシル、シク口へキシルビニルエーテル又はァリルベンゼン由来のものである、請求項 8に記載の測定法。

[12] ポリマーの重合平均分子量が 10, 000-120, 000である、請求項 8に記載の測定法。

[13] 一般式 [5]で示されるポリエチレングリコールセグメントが:!〜 70重量％である、請求項 9に記載の測定法。

[14] 一般式 [2]で示されるモノマー単位が 20〜85重量％である、請求項 8に記載の測定法。

[15] 一般式 [3]で示されるモノマー単位が 20〜85重量％である、請求項 8に記載の測定法。

[16] 一般式 [2]で示されるモノマー単位がメタクリル酸由来のものであり、一般式 [3]で示されるモノマー単位力 Sメタクリル酸シクロへキシノレ由来のものである、請求項 8に記載の測定法。

[17] (a)当該ポリマーの共存下、生体由来試料を (1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ、又は (2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)と反応させ、

(b)生成する過酸化水素量又は NAD (P) H量に基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定することを特徴とする、請求項 8に記載の測定法。

[18] 生体試料と当該ポリマーとを接触させた後、相異なる二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール量を算出する、請求項 8に記載の測定法。

[19] 相異なる二つの時点が、（1)生体由来試料と当該ポリマーとを接触させ、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つ特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に開始される前の時点と、（2)特定のリポ蛋白中のコレステロールの反応が実質的に終了した時点である、請求項 18に記載の測定法。

[20] (a)当該ポリマー共存下、生体由来試料と特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬とを接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、

(b)次いで、（1)特定のリポ蛋白中のコレステロールと、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼとの反応によって生成する過酸化水素量、又は (2)特定のリポ蛋白中のコレステロールと、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)との反応によって生成する NAD (P) H量に基づいて生体試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する、請求項 8に記載の測定法。

[21] 特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬が、コレステロ一ノレエステラーセ、コレステロ一ノレォキシターゼ、ぺノレォキシターセとカップラー又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項 20に記載の測定法。

[22] リポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リポ蛋白（ VLDL)である、請求項 8、 17、 18及び 20の何れかに記載の測定法。

[23] 生体由来試料を (1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ、又は (2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づレ、てコレステロールを測定するための試薬に、下記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んで成るポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。

(iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(V)—般式 [2]

(vi)—般式 [3]

〔式中、 R²は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R³は一般式 [4] — COOR" [4]

(式中、 R⁴はアルキル基、ハロアルキル基又はボルナニル基を表す。）で示される基、アルキル基、アルコキシ基、ァラルキル基又はアルキル力ルバモイル基を表す。〕で示されるモノマー単位

生体由来試料を特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬と接触させて、特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、特定のリポ蛋白中のコレステロールと、（1)コレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼ、又は (2)コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ及び NAD (P)と反応させ、生成する過酸化水素又は NAD (P) Hに基づレ、てコレステロールを測定するための試薬に、下記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んで成るポリマーを含有させた、生体由来試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。

(iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(V)—般式 [2]

(vi)—般式 [3]

〔式中、 R²は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R³は一般式 [4] — COOR⁴ [4]

[25] 特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去するための試薬が、コレステロールエステラーゼ、コレステロールォキシダーゼ、ペルォキシダーゼとカップラー又はデベロッパー、或いはカタラーゼである、請求項 24記載の試薬。

[26] リポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リポ蛋白（ VLDL)である、請求項 23又は 24に記載の測定用試薬。

[27] (1)下記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（3)コレステロールォキシダーゼ、ペルォキシダーゼ、及びカップラー又は/及びデベロッパー、及び (4)水性媒体を含んでなる第一試液と、（5)コレステロールエステラーゼ、（6)コレステロールォキシダーゼ及び (7)水性媒体を含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルォキシダーゼ、カップラー、デベロッパーがそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロ一ノレ測定用キット。

(iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(V)—般式 [2]

(vi)—般式 [3]

(1)下記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（3)コレステロールォキシダーゼ、（4)ペルォキシダーゼ、 (5)カップラー、 (6)デベロッパー及び (7冰性媒体を含んでなる第一試液と、（8)界面活性剤及び (9冰性媒体を含んでなる第二試液とからなる、特定のリポ蛋白中のコレステロール測定用キット。

(iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(V)—般式 [2]

(vi)—般式 [3]

(1)下記 (iv)〜(vi)を構成成分として含んでなるポリマー、（2)コレステロールエステラーゼ、（₃)コレステロールォキシダーゼ、（4)カタラーゼ及び (5)水性媒体を含んでなる第一試液と、（6)カタラーゼ阻害剤、（7)水性媒体及び要すれば (8)界面活性剤とを含んでなる第二試液とからなるものであって、ペルォキシダーゼ、カップラー、デベロッパ一がそれぞれ第一試液と第二試液の少なくとも一方に含まれている、特定のリポ蛋白中のコレステロールの測定用キット。 (iv)—般式 [1]

—— (CH₂CH₂0)k― [ 1 ]

(V)—般式 [2]

(vi)—般式 [3]

〔式中、 R²は水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R³は一般式 [4] ― COOR⁴ [4]

リポ蛋白が高比重リポ蛋白（HDL)、低比重リポ蛋白（LDL)又は超低比重リポ蛋白（ VLDL)である、請求項 27〜29の何れかに記載のキット。