JP2001124780A - リポ蛋白質コレステロールの測定方法 - Google Patents
リポ蛋白質コレステロールの測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】血清および血漿等のリポ蛋白質を含有する試料
において、界面活性作用を有する血液成分の影響を受け
ず、かつ光学的な測定を妨害する要因を生成しない、高
精度で汎用性の高いリポ蛋白質コレステロールの測定方
法および測定試薬を提供すること。 【解決手段】リポ蛋白質を含む試料に酵素を作用させ、
酵素反応で消費されるあるいは生成される化合物を定量
するリポ蛋白質コレステロールの測定方法において、特
定の高分子化合物と第１界面活性剤を用いＨＤＬコレス
テロールを選択的に反応させるかまたはＬＤＬコレステ
ロール以外のコレステロールを反応させる第１行程、次
いで第２界面活性剤を用いてＬＤＬコレステロールを選
択的に反応させる第２行程からなり、ＨＤＬコレステロ
ールおよび／またはＬＤＬコレステロールを定量するこ
とを含むリポ蛋白質コレステロールの測定方法および測
定試薬セット。
において、界面活性作用を有する血液成分の影響を受け
ず、かつ光学的な測定を妨害する要因を生成しない、高
精度で汎用性の高いリポ蛋白質コレステロールの測定方
法および測定試薬を提供すること。 【解決手段】リポ蛋白質を含む試料に酵素を作用させ、
酵素反応で消費されるあるいは生成される化合物を定量
するリポ蛋白質コレステロールの測定方法において、特
定の高分子化合物と第１界面活性剤を用いＨＤＬコレス
テロールを選択的に反応させるかまたはＬＤＬコレステ
ロール以外のコレステロールを反応させる第１行程、次
いで第２界面活性剤を用いてＬＤＬコレステロールを選
択的に反応させる第２行程からなり、ＨＤＬコレステロ
ールおよび／またはＬＤＬコレステロールを定量するこ
とを含むリポ蛋白質コレステロールの測定方法および測
定試薬セット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、主として臨床検査
の分野での使用を目的とし、リポ蛋白質を含有する試料
中の特定のリポ蛋白質分画コレステロールを定量する方
法およびリポ蛋白質を含有する試料中の特定のリポ蛋白
質分画コレステロールを定量する試薬に関する。
の分野での使用を目的とし、リポ蛋白質を含有する試料
中の特定のリポ蛋白質分画コレステロールを定量する方
法およびリポ蛋白質を含有する試料中の特定のリポ蛋白
質分画コレステロールを定量する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、血中コレステロールは血液中の
リポ蛋白質に含まれるものであり、動脈硬化症や心筋梗
塞に関連性が深い診断的指標として重要視されている。
また、リポ蛋白質はアポリポ蛋白質と脂質の複合体であ
り、比重によって高密度リポ蛋白質(以下、「ＨＤＬ」
という。)、低密度リポ蛋白質(以下、「ＬＤＬ」とい
う。)、超低密度リポ蛋白質(以下、「ＶＬＤＬ」とい
う。)およびカイロミクロン(以下、「ＣＭ」という。)
の４種類に大別される。
リポ蛋白質に含まれるものであり、動脈硬化症や心筋梗
塞に関連性が深い診断的指標として重要視されている。
また、リポ蛋白質はアポリポ蛋白質と脂質の複合体であ
り、比重によって高密度リポ蛋白質(以下、「ＨＤＬ」
という。)、低密度リポ蛋白質(以下、「ＬＤＬ」とい
う。)、超低密度リポ蛋白質(以下、「ＶＬＤＬ」とい
う。)およびカイロミクロン(以下、「ＣＭ」という。)
の４種類に大別される。
【０００３】古くから臨床検査において実施されてきた
血中総コレステロールの測定は、血中の全てのリポ蛋白
質に含まれるコレステロールを測定するもので、上記疾
患の危険度を予測するものとして重要とされてきた。し
かし、近年の臨床的研究においては、ＬＤＬに含まれる
コレステロールが上記疾患のより正確なリスクファクタ
ーとされ、逆にＨＤＬに含まれるコレステロールは負の
リスクファクターすなわちＨＤＬコレステロール量と上
記疾患の発生頻度の間には負の相関が成り立つため、動
脈硬化に関連する疾患の診断には、ＨＤＬあるいはＬＤ
Ｌに含まれるコレステロールを個別に測定することがよ
り重要であるとされている（動脈硬化２５（１・２）：
１−３４，１９９７）。
血中総コレステロールの測定は、血中の全てのリポ蛋白
質に含まれるコレステロールを測定するもので、上記疾
患の危険度を予測するものとして重要とされてきた。し
かし、近年の臨床的研究においては、ＬＤＬに含まれる
コレステロールが上記疾患のより正確なリスクファクタ
ーとされ、逆にＨＤＬに含まれるコレステロールは負の
リスクファクターすなわちＨＤＬコレステロール量と上
記疾患の発生頻度の間には負の相関が成り立つため、動
脈硬化に関連する疾患の診断には、ＨＤＬあるいはＬＤ
Ｌに含まれるコレステロールを個別に測定することがよ
り重要であるとされている（動脈硬化２５（１・２）：
１−３４，１９９７）。
【０００４】これらリポ蛋白質の分析法としては、比重
の差を利用した超遠心法の他に電気泳動により分離した
リポ蛋白質を脂質染色等により検出する方法や、ＨＰＬ
Ｃにより分離した後にコレステロールを含むピークを酵
素試薬により発色検出する反応液体クロマトグラフィー
法、または免疫化学的方法等があるが、いずれも操作が
煩雑であったり多数の検体を迅速に測定できない等の問
題があり、日常的な検査にはほとんど用いられていなか
った。
の差を利用した超遠心法の他に電気泳動により分離した
リポ蛋白質を脂質染色等により検出する方法や、ＨＰＬ
Ｃにより分離した後にコレステロールを含むピークを酵
素試薬により発色検出する反応液体クロマトグラフィー
法、または免疫化学的方法等があるが、いずれも操作が
煩雑であったり多数の検体を迅速に測定できない等の問
題があり、日常的な検査にはほとんど用いられていなか
った。
【０００５】過去、日常的な臨床検査においては、硫酸
化デキストランやリンタングステン酸等のリポ蛋白質沈
殿剤を用いてＨＤＬコレステロールを測定する方法が用
いられてきた。これらは、先ず血清等の検体にリポ蛋白
質沈殿剤と２価の金属イオンを加えてＨＤＬ以外のリポ
蛋白質を凝集させ、これを遠心分離により取り除き上清
中に残存するＨＤＬ中のコレステロールを測定する。さ
らに血中総コレステロール値と中性脂肪値を測定し、経
験的に導かれたＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式にこれらの値
をあてはめてＬＤＬコレステロール値を算出するもので
ある。
化デキストランやリンタングステン酸等のリポ蛋白質沈
殿剤を用いてＨＤＬコレステロールを測定する方法が用
いられてきた。これらは、先ず血清等の検体にリポ蛋白
質沈殿剤と２価の金属イオンを加えてＨＤＬ以外のリポ
蛋白質を凝集させ、これを遠心分離により取り除き上清
中に残存するＨＤＬ中のコレステロールを測定する。さ
らに血中総コレステロール値と中性脂肪値を測定し、経
験的に導かれたＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式にこれらの値
をあてはめてＬＤＬコレステロール値を算出するもので
ある。
【０００６】この方法は、超遠心法等に比較して簡便で
はあるものの、沈殿剤を加えて遠心分離する操作を含む
ため、比較的多量の検体量を要し、短時間で多数の検体
を処理することが困難であった。さらに、Ｆｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄの式は、ＶＬＤＬ中のコレステロール量と中性
脂肪量の比率がほぼ一定であるという経験則から導かれ
たものであるため、リポ蛋白質代謝あるいは脂質代謝に
異常をきたす疾患では大きな誤差を生じるという問題が
あった。
はあるものの、沈殿剤を加えて遠心分離する操作を含む
ため、比較的多量の検体量を要し、短時間で多数の検体
を処理することが困難であった。さらに、Ｆｒｉｅｄｅ
ｗａｌｄの式は、ＶＬＤＬ中のコレステロール量と中性
脂肪量の比率がほぼ一定であるという経験則から導かれ
たものであるため、リポ蛋白質代謝あるいは脂質代謝に
異常をきたす疾患では大きな誤差を生じるという問題が
あった。
【０００７】このような状況の中、血漿あるいは血清中
のリポ蛋白質コレステロールの定量を、遠心分離等の前
処理を行う事なく自動分析装置で直接的に実施できる方
法が開発されている。
のリポ蛋白質コレステロールの定量を、遠心分離等の前
処理を行う事なく自動分析装置で直接的に実施できる方
法が開発されている。
【０００８】それらの中で、ＨＤＬコレステロールを直
接測定するための手法としては、前述の沈澱法を応用し
てＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させて酵素が作用しな
い状態にしておきＨＤＬコレステロールを選択的に反応
させる方法（特開平８−１３１１９７号公報、特開平６
−２４２１１０号公報、特開平１１−５６３９５号公
報、特開平９−９６６３７号公報、特開平９−２８５２
９８号公報）、および界面活性剤等の沈澱剤以外の物質
を用いてリポ蛋白質コレステロールの酵素反応をコント
ロールする方法（特開昭６３−１２６４９８号公報、特
開昭６２−６９９９９号公報、特開平９−２９９号公
報）の２つに大別できるが、これらはいずれも汎用性
や、正確性などにおいて十分に満足のいくものではなか
った。
接測定するための手法としては、前述の沈澱法を応用し
てＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させて酵素が作用しな
い状態にしておきＨＤＬコレステロールを選択的に反応
させる方法（特開平８−１３１１９７号公報、特開平６
−２４２１１０号公報、特開平１１−５６３９５号公
報、特開平９−９６６３７号公報、特開平９−２８５２
９８号公報）、および界面活性剤等の沈澱剤以外の物質
を用いてリポ蛋白質コレステロールの酵素反応をコント
ロールする方法（特開昭６３−１２６４９８号公報、特
開昭６２−６９９９９号公報、特開平９−２９９号公
報）の２つに大別できるが、これらはいずれも汎用性
や、正確性などにおいて十分に満足のいくものではなか
った。
【０００９】その他に、リポ蛋白質凝集剤と界面活性剤
を組み合わせた方法として、ＨＤＬに優先的に作用する
界面活性剤とリポ蛋白質コレステロールの酵素反応を抑
制する物質の共存下でＨＤＬを優先的に反応させ検出す
る方法（特開平１１−５６３９５号公報）、リポ蛋白質
コレステロールの反応性をコントロールする糖化合物と
界面活性剤の共存下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステ
ロールを反応消去してＨＤＬコレステロールを定量する
方法（特開平７−３０１６３６号公報）等が開示されて
いる。
を組み合わせた方法として、ＨＤＬに優先的に作用する
界面活性剤とリポ蛋白質コレステロールの酵素反応を抑
制する物質の共存下でＨＤＬを優先的に反応させ検出す
る方法（特開平１１−５６３９５号公報）、リポ蛋白質
コレステロールの反応性をコントロールする糖化合物と
界面活性剤の共存下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステ
ロールを反応消去してＨＤＬコレステロールを定量する
方法（特開平７−３０１６３６号公報）等が開示されて
いる。
【００１０】一方、ＬＤＬコレステロールの直接測定試
薬に関してもＨＤＬコレステロールの直接測定試薬と同
じような手法による測定方法が開示されており、リポ蛋
白質凝集剤等を用いたＬＤＬコレステロール測定方法と
しては、特開平６−２１３８９９号公報、特開平７−２
８０８１２号公報、ＷＯ９６／２８７３４号公報、特開
平１０−３１１８３３号公報、特開平１１−３０６１７
号公報等がある。また、界面活性剤を用いたＬＤＬコレ
ステロール測定方法としては、特開昭５８−１６５８０
０号公報、特開平１０−８４９９７号公報、特開平１０
−３８８８８号公報などが開示されている。さらに、Ｌ
ＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬコレス
テロールを選択的に反応させ検出する方法（特開平１０
−８０３００号公報）も開示されている。
薬に関してもＨＤＬコレステロールの直接測定試薬と同
じような手法による測定方法が開示されており、リポ蛋
白質凝集剤等を用いたＬＤＬコレステロール測定方法と
しては、特開平６−２１３８９９号公報、特開平７−２
８０８１２号公報、ＷＯ９６／２８７３４号公報、特開
平１０−３１１８３３号公報、特開平１１−３０６１７
号公報等がある。また、界面活性剤を用いたＬＤＬコレ
ステロール測定方法としては、特開昭５８−１６５８０
０号公報、特開平１０−８４９９７号公報、特開平１０
−３８８８８号公報などが開示されている。さらに、Ｌ
ＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬコレス
テロールを選択的に反応させ検出する方法（特開平１０
−８０３００号公報）も開示されている。
【００１１】これらのリポ蛋白質コレステロールの選択
的測定法は多くが界面活性剤あるいはリポ蛋白質の凝集
剤を組み合わせてリポ蛋白質コレステロールの反応選択
性をコントロールするものであるが、血液中には界面活
性作用を有する成分が存在するため、界面活性剤の効果
が血液成分の影響を受けやすいという問題がある。例え
ば、リポ蛋白質中に含まれるリン脂質であるレシチンは
強い界面活性作用を持ち、コレステロールエステルの加
水分解過程では界面活性作用を有する高級脂肪酸が生成
する。血中のコレステロールは大部分が高級脂肪酸との
エステル体として存在し、コレステロールの測定にはこ
のエステル型コレステロールの加水分解過程が必須であ
るため、高級脂肪酸の生成は避けられない。さらに、エ
ステル型コレステロールの加水分解に用いるコレステロ
ールエステラーゼは哺乳動物の膵臓から得られるコレス
テロールエステラーゼを除いて大部分が中性脂肪を加水
分解する活性を併せ持っており、血中の中性脂肪の加水
分解によっても高級脂肪酸が生成する。
的測定法は多くが界面活性剤あるいはリポ蛋白質の凝集
剤を組み合わせてリポ蛋白質コレステロールの反応選択
性をコントロールするものであるが、血液中には界面活
性作用を有する成分が存在するため、界面活性剤の効果
が血液成分の影響を受けやすいという問題がある。例え
ば、リポ蛋白質中に含まれるリン脂質であるレシチンは
強い界面活性作用を持ち、コレステロールエステルの加
水分解過程では界面活性作用を有する高級脂肪酸が生成
する。血中のコレステロールは大部分が高級脂肪酸との
エステル体として存在し、コレステロールの測定にはこ
のエステル型コレステロールの加水分解過程が必須であ
るため、高級脂肪酸の生成は避けられない。さらに、エ
ステル型コレステロールの加水分解に用いるコレステロ
ールエステラーゼは哺乳動物の膵臓から得られるコレス
テロールエステラーゼを除いて大部分が中性脂肪を加水
分解する活性を併せ持っており、血中の中性脂肪の加水
分解によっても高級脂肪酸が生成する。
【００１２】界面活性剤の作用は、その濃度あるいは他
の界面活性作用を持つ物質の共存等により大きく変化す
るが、血液中には界面活性剤を吸着する作用を有する血
清アルブミンが存在し、血清を添加した試薬中の遊離の
界面活性剤濃度が変動する可能性がある。従って、血清
アルブミン濃度、コレステロール濃度、中性脂肪濃度等
に異常をきたした血清では、特定リポ蛋白のコレステロ
ールが選択的に酵素反応するように設計された界面活性
剤の効果を維持することが困難になり、目的とするリポ
蛋白質コレステロールの測定精度が低下する傾向があ
る。
の界面活性作用を持つ物質の共存等により大きく変化す
るが、血液中には界面活性剤を吸着する作用を有する血
清アルブミンが存在し、血清を添加した試薬中の遊離の
界面活性剤濃度が変動する可能性がある。従って、血清
アルブミン濃度、コレステロール濃度、中性脂肪濃度等
に異常をきたした血清では、特定リポ蛋白のコレステロ
ールが選択的に酵素反応するように設計された界面活性
剤の効果を維持することが困難になり、目的とするリポ
蛋白質コレステロールの測定精度が低下する傾向があ
る。
【００１３】リポ蛋白質の凝集剤には血液成分の影響を
受けるという問題は少ないものの、一方で特開平６−２
１３８９９号公報で開示されているように、リポ蛋白質
を添加した試薬の濁度を上昇させるという問題がある。
現在のコレステロール測定法のほとんどがコレステロー
ルの酸化還元反応によって生成した過酸化水素あるいは
還元型補酵素を光学的な方法で定量する手法をとってお
り、リポ蛋白質の凝集により試薬試料混合液の濁度が上
昇することで測定誤差が生じている。さらに、リポ蛋白
質の凝集塊は自動分析装置の廃液ラインを詰まらせる危
険性をも併せ持っている。従って、特定のリポ蛋白質コ
レステロールを正確に測定するためには特開平６−２４
２１１０号公報で開示されているようなリポ蛋白質凝集
塊の溶解工程や、特開平８−１３１１９５号公報で開示
されているような反応速度を測定する工程が必要とな
る。
受けるという問題は少ないものの、一方で特開平６−２
１３８９９号公報で開示されているように、リポ蛋白質
を添加した試薬の濁度を上昇させるという問題がある。
現在のコレステロール測定法のほとんどがコレステロー
ルの酸化還元反応によって生成した過酸化水素あるいは
還元型補酵素を光学的な方法で定量する手法をとってお
り、リポ蛋白質の凝集により試薬試料混合液の濁度が上
昇することで測定誤差が生じている。さらに、リポ蛋白
質の凝集塊は自動分析装置の廃液ラインを詰まらせる危
険性をも併せ持っている。従って、特定のリポ蛋白質コ
レステロールを正確に測定するためには特開平６−２４
２１１０号公報で開示されているようなリポ蛋白質凝集
塊の溶解工程や、特開平８−１３１１９５号公報で開示
されているような反応速度を測定する工程が必要とな
る。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる状況に
鑑みてなされたものであり、界面活性作用を有する血液
成分の影響を受けず、かつ光学的な測定を妨害する要因
を生成しない、高精度で汎用性の高いリポ蛋白質コレス
テロールの測定方法および測定試薬に関する。
鑑みてなされたものであり、界面活性作用を有する血液
成分の影響を受けず、かつ光学的な測定を妨害する要因
を生成しない、高精度で汎用性の高いリポ蛋白質コレス
テロールの測定方法および測定試薬に関する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の高分子化合
物と界面活性剤を用いることにより、リポ蛋白質の凝集
により反応液の濁度を上昇させることなく、精度よく簡
便にリポ蛋白質コレステロールを測定できることを見出
し本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の高分子化合
物と界面活性剤を用いることにより、リポ蛋白質の凝集
により反応液の濁度を上昇させることなく、精度よく簡
便にリポ蛋白質コレステロールを測定できることを見出
し本発明を完成するに至った。
【００１６】すなわち本発明は次の事項に関する。 ［１］リポ蛋白質を含む試料に酵素を作用させ、酵素反
応で消費されるあるいは生成される化合物を定量するリ
ポ蛋白質コレステロールの測定方法において、（１）式
（ａ）
応で消費されるあるいは生成される化合物を定量するリ
ポ蛋白質コレステロールの測定方法において、（１）式
（ａ）
【化５】 および式（ｂ）
【化６】 の繰り返し単位[式中、Ｒ1は炭素数４〜３０のアルキル
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ 3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物の共
存下において、リポ蛋白質を含有する試料に酵素と第１
界面活性剤を加えることにより、ＨＤＬコレステロール
のみ選択的に酵素反応させるかまたはＬＤＬコレステロ
ール以外のコレステロールを選択的に酵素反応させる第
１工程、次いで（２）第２界面活性剤を加えることによ
り、ＬＤＬコレステロールのみ選択的に酵素反応させる
第２工程、（３）（１）の工程、あるいは（１）および
（２）の工程において、酵素との反応により消費される
化合物または生成される化合物を測定することにより、
ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロ
ールを定量することを含むリポ蛋白質コレステロールの
測定方法。 ［２］前記高分子化合物の分子量が５，０００〜５０
０，０００ダルトンである上記［１］に記載のリポ蛋白
質コレステロールの測定方法。 ［３］前記高分子化合物の濃度が０.００１〜１％の範
囲である上記［１］または［２］に記載のリポ蛋白質コ
レステロールの測定方法。 ［４］前記高分子化合物が、炭素数６〜３２の１−オレ
フィンとマレイン酸、アクリル酸またはメタクリル酸の
共重合体、およびそれらの酸アミドからなる群より選ば
れる１種以上の化合物である上記［１］ないし［３］の
いずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。 ［５］ｐＨが５〜９の範囲でコレステロールとコレステ
ロール測定用酵素を反応させる上記［１］ないし［４］
のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ 3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物の共
存下において、リポ蛋白質を含有する試料に酵素と第１
界面活性剤を加えることにより、ＨＤＬコレステロール
のみ選択的に酵素反応させるかまたはＬＤＬコレステロ
ール以外のコレステロールを選択的に酵素反応させる第
１工程、次いで（２）第２界面活性剤を加えることによ
り、ＬＤＬコレステロールのみ選択的に酵素反応させる
第２工程、（３）（１）の工程、あるいは（１）および
（２）の工程において、酵素との反応により消費される
化合物または生成される化合物を測定することにより、
ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロ
ールを定量することを含むリポ蛋白質コレステロールの
測定方法。 ［２］前記高分子化合物の分子量が５，０００〜５０
０，０００ダルトンである上記［１］に記載のリポ蛋白
質コレステロールの測定方法。 ［３］前記高分子化合物の濃度が０.００１〜１％の範
囲である上記［１］または［２］に記載のリポ蛋白質コ
レステロールの測定方法。 ［４］前記高分子化合物が、炭素数６〜３２の１−オレ
フィンとマレイン酸、アクリル酸またはメタクリル酸の
共重合体、およびそれらの酸アミドからなる群より選ば
れる１種以上の化合物である上記［１］ないし［３］の
いずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。 ［５］ｐＨが５〜９の範囲でコレステロールとコレステ
ロール測定用酵素を反応させる上記［１］ないし［４］
のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。
【００１７】［６］第１界面活性剤が、胆汁酸誘導体お
よび／または両性界面活性剤である上記［１］ないし
［５］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの
測定方法。 ［７］第２界面活性剤を前記高分子と第１界面活性剤の
共存下において用いることにより、第１界面活性剤によ
り抑制されていたＬＤＬコレステロールの酵素反応を選
択的に酵素反応可能にすることを特徴とする上記［１］
ないし［６］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロ
ールの測定方法。 ［８］第２界面活性剤が、ポリオキシエチレン鎖を有す
るノニオン性界面活性剤の少なくとも１種である上記
［１］ないし［７］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレ
ステロールの測定方法。 ［９］第２界面活性剤のＨＬＢが、８．５以上１２．６
未満である上記［８］に 記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法。［１０］
酵素として、コレステロールエステラーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナー
ゼを用いる上記［１］ないし［９］のいずれかに記載の
リポ蛋白質コレステロールの測定方法。 ［１１］コレステロール測定用酵素、式（ａ）
よび／または両性界面活性剤である上記［１］ないし
［５］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの
測定方法。 ［７］第２界面活性剤を前記高分子と第１界面活性剤の
共存下において用いることにより、第１界面活性剤によ
り抑制されていたＬＤＬコレステロールの酵素反応を選
択的に酵素反応可能にすることを特徴とする上記［１］
ないし［６］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロ
ールの測定方法。 ［８］第２界面活性剤が、ポリオキシエチレン鎖を有す
るノニオン性界面活性剤の少なくとも１種である上記
［１］ないし［７］のいずれかに記載のリポ蛋白質コレ
ステロールの測定方法。 ［９］第２界面活性剤のＨＬＢが、８．５以上１２．６
未満である上記［８］に 記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法。［１０］
酵素として、コレステロールエステラーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナー
ゼを用いる上記［１］ないし［９］のいずれかに記載の
リポ蛋白質コレステロールの測定方法。 ［１１］コレステロール測定用酵素、式（ａ）
【化７】 および式（ｂ）
【化８】 の繰り返し単位[式中、Ｒ1は炭素数４〜３０のアルキル
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物、第
１界面活性剤および第２界面活性剤からなり、上記
［１］ないし［１０］のいずれかに記載のリポ蛋白質コ
レステロールの測定方法を用いることを特徴とするリポ
蛋白質コレステロールの測定試薬。 ［１２］ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコ
レステロールを定量することを特徴とする上記［１１］
に記載のリポ蛋白質コレステロールの測定試薬。
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物、第
１界面活性剤および第２界面活性剤からなり、上記
［１］ないし［１０］のいずれかに記載のリポ蛋白質コ
レステロールの測定方法を用いることを特徴とするリポ
蛋白質コレステロールの測定試薬。 ［１２］ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコ
レステロールを定量することを特徴とする上記［１１］
に記載のリポ蛋白質コレステロールの測定試薬。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明は、上記式(ａ)および式
(ｂ)の繰り返し単位を有する高分子化合物が、光学的測
定を妨害するリポ蛋白質の凝集塊を形成することなく、
ＬＤＬコレステロールとコレステロール測定用酵素との
反応を選択的に抑制し、かつその反応抑制効果が高級脂
肪酸等の界面活性作用を有する血中成分の影響を受けな
いという特徴を有する新しい知見に基づいている。類似
の作用を示す化合物については既に多数開示されてお
り、例えば、特開平６−２１３８９９号公報において開
示されている水溶性櫛型ポリマーはＬＤＬに選択的に作
用するがＬＤＬ凝集物を形成して反応液の濁度を上昇さ
せる点で、本発明の高分子化合物と異なる。また、特開
平９−１２１８９５号公報で開示されているアクリル酸
／メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー
は、ＬＤＬの他にＶＬＤＬにも作用してその酵素反応を
阻害する点で、本発明の高分子化合物と異なっている。
さらにヘパリン、硫酸化デキストラン、リンタングステ
ン酸等のリポ蛋白質凝集剤は、２価金属イオンの共存下
でのみＬＤＬおよびＶＬＤＬの凝集活性と酵素反応阻害
活性が発現するという点において本発明の高分子化合物
とは明確に異なるものである。
(ｂ)の繰り返し単位を有する高分子化合物が、光学的測
定を妨害するリポ蛋白質の凝集塊を形成することなく、
ＬＤＬコレステロールとコレステロール測定用酵素との
反応を選択的に抑制し、かつその反応抑制効果が高級脂
肪酸等の界面活性作用を有する血中成分の影響を受けな
いという特徴を有する新しい知見に基づいている。類似
の作用を示す化合物については既に多数開示されてお
り、例えば、特開平６−２１３８９９号公報において開
示されている水溶性櫛型ポリマーはＬＤＬに選択的に作
用するがＬＤＬ凝集物を形成して反応液の濁度を上昇さ
せる点で、本発明の高分子化合物と異なる。また、特開
平９−１２１８９５号公報で開示されているアクリル酸
／メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー
は、ＬＤＬの他にＶＬＤＬにも作用してその酵素反応を
阻害する点で、本発明の高分子化合物と異なっている。
さらにヘパリン、硫酸化デキストラン、リンタングステ
ン酸等のリポ蛋白質凝集剤は、２価金属イオンの共存下
でのみＬＤＬおよびＶＬＤＬの凝集活性と酵素反応阻害
活性が発現するという点において本発明の高分子化合物
とは明確に異なるものである。
【００１９】本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単
位を有する高分子化合物は、高級アルキル基を有するモ
ノマー単位とアニオン性基を有するモノマー単位から構
成される高分子化合物である。式（ａ）においてＲ1は
炭素数が４以上のアルキル基が好ましく、ブチル、シク
ロヘキシル、オクチル、ドデシル、テトラデシル、ヘキ
サデシル基等が例示できるが、これらの中でも効果の点
から特にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル基が好
ましい。アルキル基が無いものあるいはその炭素数が３
以下のものはＬＤＬコレステロールの反応を抑制する効
果が低いため好ましくない。また側鎖ＹとしてはＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2ＯＨ、ＣＯＮＨＮＨ2、
ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣ2Ｈ4ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣ2Ｈ4
ＳＯ3Ｈ、ＣＯＯＣ2Ｈ2ＰＯ(ＯＨ)2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2Ｓ
Ｏ3Ｈ、ＣＨ2ＯＣ6Ｈ6ＳＯ3Ｈ等が挙げられるが、これ
らの中でもＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2Ｏ
Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2が好ましい。
位を有する高分子化合物は、高級アルキル基を有するモ
ノマー単位とアニオン性基を有するモノマー単位から構
成される高分子化合物である。式（ａ）においてＲ1は
炭素数が４以上のアルキル基が好ましく、ブチル、シク
ロヘキシル、オクチル、ドデシル、テトラデシル、ヘキ
サデシル基等が例示できるが、これらの中でも効果の点
から特にドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル基が好
ましい。アルキル基が無いものあるいはその炭素数が３
以下のものはＬＤＬコレステロールの反応を抑制する効
果が低いため好ましくない。また側鎖ＹとしてはＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2ＯＨ、ＣＯＮＨＮＨ2、
ＣＨ2ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣ2Ｈ4ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣ2Ｈ4
ＳＯ3Ｈ、ＣＯＯＣ2Ｈ2ＰＯ(ＯＨ)2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2Ｓ
Ｏ3Ｈ、ＣＨ2ＯＣ6Ｈ6ＳＯ3Ｈ等が挙げられるが、これ
らの中でもＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＣ2Ｈ2Ｏ
Ｈ、ＣＯＮＨＮＨ2が好ましい。
【００２０】（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有す
る高分子化合物としては、たとえば、炭素数６〜３２の
１−オレフィンと、アクリル酸、メタクリル酸またはマ
レイン酸の共重合体もしくはそれらの酸アミドまたはエ
ステル類などが挙げられ、これらの中でも特にポリ（１
−エイコセン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−ノナデ
セン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−オクタデセン−
ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−
マレイン酸）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−マレイ
ン酸）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−マレイン
酸）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−マレイン酸）、
ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１
−ドデセン−ｃｏ−マレイン酸）、およびそれらの酸ア
ミド、ポリ（１−エイコセン−ｃｏ−アクリル酸エステ
ル）、ポリ（１−ノナデセン−ｃｏ−アクリル酸エステ
ル）、ポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−アクリル酸エス
テル）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−アクリル酸エ
ステル）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−アクリル酸
エステル）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−アクリル
酸エステル）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−アクリ
ル酸エステル）、ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−アクリ
ル酸エステル）、ポリ（１−ドデセン−ｃｏ−アクリル
酸エステル）ポリ（１−エイコセン−ｃｏ−メタクリレ
ート）、ポリ（１−ノナデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ドデセン−ｃｏ−メタクリレート）が
好ましい。
る高分子化合物としては、たとえば、炭素数６〜３２の
１−オレフィンと、アクリル酸、メタクリル酸またはマ
レイン酸の共重合体もしくはそれらの酸アミドまたはエ
ステル類などが挙げられ、これらの中でも特にポリ（１
−エイコセン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−ノナデ
セン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−オクタデセン−
ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−
マレイン酸）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−マレイ
ン酸）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−マレイン
酸）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−マレイン酸）、
ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（１
−ドデセン−ｃｏ−マレイン酸）、およびそれらの酸ア
ミド、ポリ（１−エイコセン−ｃｏ−アクリル酸エステ
ル）、ポリ（１−ノナデセン−ｃｏ−アクリル酸エステ
ル）、ポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−アクリル酸エス
テル）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−アクリル酸エ
ステル）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−アクリル酸
エステル）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−アクリル
酸エステル）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−アクリ
ル酸エステル）、ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−アクリ
ル酸エステル）、ポリ（１−ドデセン−ｃｏ−アクリル
酸エステル）ポリ（１−エイコセン−ｃｏ−メタクリレ
ート）、ポリ（１−ノナデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ヘプタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ヘキサデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ペンタデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−テトラデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−トリデセン−ｃｏ−メタクリレー
ト）、ポリ（１−ドデセン−ｃｏ−メタクリレート）が
好ましい。
【００２１】上記（ａ）と（ｂ）の比率は１：９９〜９
９：１であり、好ましくは１０：９０〜９０：１０、よ
り好ましくは２０：８０〜８０：２０である。また、本
発明の高分子化合物は、繰り返し単位（ａ）と（ｂ）以
外にさらに他の繰り返し単位を含んでいても構わない。
９：１であり、好ましくは１０：９０〜９０：１０、よ
り好ましくは２０：８０〜８０：２０である。また、本
発明の高分子化合物は、繰り返し単位（ａ）と（ｂ）以
外にさらに他の繰り返し単位を含んでいても構わない。
【００２２】液体クロマトグラフィーで測定した上記
（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合
物の質量平均分子量は５，０００〜５００，０００ダル
トンが好ましく、より好ましくは１０，０００〜１０
０，０００ダルトンである。質量平均分子量が５，００
０ダルトン未満だと高分子化合物の効果が小さいため好
ましくなく、５００，０００ダルトンを超えると製造工
程上粘度の問題を生じるため好ましくない。
（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合
物の質量平均分子量は５，０００〜５００，０００ダル
トンが好ましく、より好ましくは１０，０００〜１０
０，０００ダルトンである。質量平均分子量が５，００
０ダルトン未満だと高分子化合物の効果が小さいため好
ましくなく、５００，０００ダルトンを超えると製造工
程上粘度の問題を生じるため好ましくない。
【００２３】本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単
位を有する高分子化合物は、ＬＤＬコレステロールの酵
素反応を選択的に抑制する特徴を持つため、ＬＤＬコレ
ステロールの酵素反応を抑制する化合物の共存下でＬＤ
Ｌ以外のリポ蛋白質のコレステロールを一部あるいは全
部消去した後に、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素
反応させ定量する原理に基づいたＬＤＬコレステロール
の測定方法に用いると、その特徴がより効果的に発揮さ
れるが、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質の反応を抑制する物質
の共存下でＨＤＬを選択的に酵素反応させる原理に基づ
いたＨＤＬコレステロールの測定方法にも応用できる。
すなわち、本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物を添加することにより、ＨＤＬコ
レステロールが反応する際に生成する界面活性作用を有
する成分等によって、ＬＤＬコレステロールの反応を抑
制している界面活性剤等の抑制効果が低下しＬＤＬコレ
ステロールが反応することを防止できるため、精度の高
いＨＤＬコレステロールの定量を行うことができるとい
う特徴を有する。
位を有する高分子化合物は、ＬＤＬコレステロールの酵
素反応を選択的に抑制する特徴を持つため、ＬＤＬコレ
ステロールの酵素反応を抑制する化合物の共存下でＬＤ
Ｌ以外のリポ蛋白質のコレステロールを一部あるいは全
部消去した後に、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素
反応させ定量する原理に基づいたＬＤＬコレステロール
の測定方法に用いると、その特徴がより効果的に発揮さ
れるが、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質の反応を抑制する物質
の共存下でＨＤＬを選択的に酵素反応させる原理に基づ
いたＨＤＬコレステロールの測定方法にも応用できる。
すなわち、本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物を添加することにより、ＨＤＬコ
レステロールが反応する際に生成する界面活性作用を有
する成分等によって、ＬＤＬコレステロールの反応を抑
制している界面活性剤等の抑制効果が低下しＬＤＬコレ
ステロールが反応することを防止できるため、精度の高
いＨＤＬコレステロールの定量を行うことができるとい
う特徴を有する。
【００２４】リポ蛋白質を含む試料に上記（ａ）および
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物を接触させ
る時の高分子化合物の濃度は、リポ蛋白質を含む試料中
のＬＤＬ含有量に依存するが、リポ蛋白質を含む試料が
血清あるいは血漿の場合には０.００１〜１質量百分率
（以下、質量百分率を「％」という。）がよく、好まし
くは０.０１〜０.３％の範囲である。高分子化合物の濃
度が０.００１％未満の場合は添加効果が充分得られな
いため好ましくなく、１％を超えると酵素の活性に影響
する場合があるため好ましくない。
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物を接触させ
る時の高分子化合物の濃度は、リポ蛋白質を含む試料中
のＬＤＬ含有量に依存するが、リポ蛋白質を含む試料が
血清あるいは血漿の場合には０.００１〜１質量百分率
（以下、質量百分率を「％」という。）がよく、好まし
くは０.０１〜０.３％の範囲である。高分子化合物の濃
度が０.００１％未満の場合は添加効果が充分得られな
いため好ましくなく、１％を超えると酵素の活性に影響
する場合があるため好ましくない。
【００２５】上記（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を
有する高分子化合物はその効果の発現に際し、２価金属
イオンの共存を必要としない。従って２価金属イオンを
添加する必要はないが、特に制限するものではなく、添
加して用いても構わない。
有する高分子化合物はその効果の発現に際し、２価金属
イオンの共存を必要としない。従って２価金属イオンを
添加する必要はないが、特に制限するものではなく、添
加して用いても構わない。
【００２６】また本発明は、コレステロール測定用酵素
と界面活性剤との組み合わせにより第１工程において、
リポ蛋白質を含有する試料に高分子化合物、コレステロ
ール測定用酵素および第１界面活性剤を加えることによ
りＨＤＬコレステロールを酵素と反応させ、次いで、第
２工程で前記高分子化合物と第一界面活性剤存在下にさ
らに第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレス
テロールを選択的に酵素と反応させ、消費される化合物
または生成される化合物を測定することにより、ＨＤＬ
コレステロールとＬＤＬコレステロールを精密かつ迅速
に測定することができる。
と界面活性剤との組み合わせにより第１工程において、
リポ蛋白質を含有する試料に高分子化合物、コレステロ
ール測定用酵素および第１界面活性剤を加えることによ
りＨＤＬコレステロールを酵素と反応させ、次いで、第
２工程で前記高分子化合物と第一界面活性剤存在下にさ
らに第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレス
テロールを選択的に酵素と反応させ、消費される化合物
または生成される化合物を測定することにより、ＨＤＬ
コレステロールとＬＤＬコレステロールを精密かつ迅速
に測定することができる。
【００２７】また、本発明はコレステロール測定用酵素
と界面活性剤との組み合わせによっては、第１工程でＬ
ＤＬ以外のリポ蛋白質を全て酵素と反応させることがで
き、次いで、第２工程でさらに第２界面活性剤を加える
ことにより、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素と反
応させ、消費される化合物または生成される化合物を測
定することにより、ＬＤＬコレステロールを精密かつ迅
速に測定することができる。
と界面活性剤との組み合わせによっては、第１工程でＬ
ＤＬ以外のリポ蛋白質を全て酵素と反応させることがで
き、次いで、第２工程でさらに第２界面活性剤を加える
ことにより、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素と反
応させ、消費される化合物または生成される化合物を測
定することにより、ＬＤＬコレステロールを精密かつ迅
速に測定することができる。
【００２８】本発明において用いる第１界面活性剤は、
第一工程において、酵素との協同作用によってＨＤＬ以
外のリポ蛋白質に含まれるコレステロールの酵素反応を
抑制するか、またはＬＤＬに含まれるコレステロールの
酵素反応を抑制する界面活性剤であって、第二工程にお
いては第２界面活性剤と協同的に作用してＬＤＬコレス
テロールの酵素反応を促進する機能を有するものであれ
ばいずれのものを用いてもよい。
第一工程において、酵素との協同作用によってＨＤＬ以
外のリポ蛋白質に含まれるコレステロールの酵素反応を
抑制するか、またはＬＤＬに含まれるコレステロールの
酵素反応を抑制する界面活性剤であって、第二工程にお
いては第２界面活性剤と協同的に作用してＬＤＬコレス
テロールの酵素反応を促進する機能を有するものであれ
ばいずれのものを用いてもよい。
【００２９】例えば、胆汁酸誘導体として胆汁酸および
その塩、両性界面活性剤としてラウリルカルボキラウリ
ルカルボキヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイ
ン、Ｎ―ＴｅｔｒａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎａｔｅ(ＳＢ３−１４)，Ｎ―ＨｅｘａｄｅｃｙＬ
−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１
−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ−１６）、
Ｎ―ＯｃｔｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍ
ｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ
（ＳＢ３−８）、Ｎ―ＯｃｔａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａ
ｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ３−１８）、Ｎ―Ｄｅｃ
ｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ
−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ３−１
０）、Ｎ―ＤｏｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ
−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏ
ｎａｔｅ(ＳＢ−１２）、または、胆汁酸誘導体であり
かつ両性界面活性剤である３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄ
ｏｐｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]ｐｒ
ｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）もしくは
３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐ
ａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳＯ）等があげら
れ、これらのなかでも胆汁酸、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳ
Ｏ、ＳＢ３−１４等が好ましく用いられる。
その塩、両性界面活性剤としてラウリルカルボキラウリ
ルカルボキヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイ
ン、Ｎ―ＴｅｔｒａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈ
ｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎａｔｅ(ＳＢ３−１４)，Ｎ―ＨｅｘａｄｅｃｙＬ
−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１
−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ−１６）、
Ｎ―ＯｃｔｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍ
ｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ
（ＳＢ３−８）、Ｎ―ＯｃｔａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄ
ｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａ
ｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ３−１８）、Ｎ―Ｄｅｃ
ｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｍｏｎｉｏ
−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢ３−１
０）、Ｎ―ＤｏｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ
−３−ａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏ
ｎａｔｅ(ＳＢ−１２）、または、胆汁酸誘導体であり
かつ両性界面活性剤である３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄ
ｏｐｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]ｐｒ
ｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）もしくは
３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐ
ａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳＯ）等があげら
れ、これらのなかでも胆汁酸、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳ
Ｏ、ＳＢ３−１４等が好ましく用いられる。
【００３０】例えば第一工程において、第１界面活性剤
と酵素との協同作用によってＨＤＬ以外のリポ蛋白質に
含まれるコレステロールの酵素反応を抑制する場合の例
として、コール酸ナトリウムとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
属由来のコレステロールエステラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ属由来のコレステロールオキシダーゼの組み合
わせが挙げられ、また、第一工程において、第１界面活
性剤と酵素との協同作用によってＬＤＬに含まれるコレ
ステロールの酵素反応を抑制する場合の例として、コー
ル酸ナトリウムと膵臓由来のコレステロールエステラー
ゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のコレステロール
オキシダーゼの組み合わせが挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではない。
と酵素との協同作用によってＨＤＬ以外のリポ蛋白質に
含まれるコレステロールの酵素反応を抑制する場合の例
として、コール酸ナトリウムとＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
属由来のコレステロールエステラーゼ、Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ属由来のコレステロールオキシダーゼの組み合
わせが挙げられ、また、第一工程において、第１界面活
性剤と酵素との協同作用によってＬＤＬに含まれるコレ
ステロールの酵素反応を抑制する場合の例として、コー
ル酸ナトリウムと膵臓由来のコレステロールエステラー
ゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属由来のコレステロール
オキシダーゼの組み合わせが挙げられるが、特にこれら
に限定されるものではない。
【００３１】また、用いる第１界面活性剤の濃度は選択
した界面活性剤に応じて決められる。例えば、胆汁酸、
ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯまたはＳＢ３−１４の場合
は、０.０１〜１％、好ましくは０.０３〜０.５％であ
る。
した界面活性剤に応じて決められる。例えば、胆汁酸、
ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯまたはＳＢ３−１４の場合
は、０.０１〜１％、好ましくは０.０３〜０.５％であ
る。
【００３２】本発明において、ＬＤＬコレステロールを
測定する場合に添加する第２界面活性剤は、第１工程で
ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬ以外のコレステロー
ルが反応した後の試料に対して、本発明の高分子化合物
と第１界面活性剤の共存下で添加使用される。
測定する場合に添加する第２界面活性剤は、第１工程で
ＨＤＬコレステロールまたはＬＤＬ以外のコレステロー
ルが反応した後の試料に対して、本発明の高分子化合物
と第１界面活性剤の共存下で添加使用される。
【００３３】すなわち、本発明のＬＤＬコレステロール
の測定は、第１工程でＨＤＬコレステロールのみ反応さ
せてその他のリポ蛋白質が全て残存する場合には、第２
工程においてＬＤＬコレステロールの酵素反応を促進し
かつＬＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステロ
ールの酵素反応を抑制する機能を有する第２界面活性剤
を添加してＬＤＬコレステロールを反応させて行われ
る。
の測定は、第１工程でＨＤＬコレステロールのみ反応さ
せてその他のリポ蛋白質が全て残存する場合には、第２
工程においてＬＤＬコレステロールの酵素反応を促進し
かつＬＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステロ
ールの酵素反応を抑制する機能を有する第２界面活性剤
を添加してＬＤＬコレステロールを反応させて行われ
る。
【００３４】または第１工程でＬＤＬコレステロール以
外のリポ蛋白質コレステロールを反応させＬＤＬコレス
テロールだけが残存する場合には、第２工程において高
分子化合物と第１界面活性剤の共存下でＬＤＬコレステ
ロールの酵素反応を促進する第２界面活性剤を添加して
ＬＤＬコレステロールを反応させて実施される。
外のリポ蛋白質コレステロールを反応させＬＤＬコレス
テロールだけが残存する場合には、第２工程において高
分子化合物と第１界面活性剤の共存下でＬＤＬコレステ
ロールの酵素反応を促進する第２界面活性剤を添加して
ＬＤＬコレステロールを反応させて実施される。
【００３５】本発明において用いる第２界面活性剤とし
ては、本発明の目的に適合するものであれば特に制限は
ない。本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有
する高分子化合物の存在下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コ
レステロールの酵素反応を抑制する第１界面活性剤とし
て、例えば胆汁酸誘導体あるいは両性界面活性剤を用
い、第１工程でＨＤＬコレステロールのみを反応させた
場合において、第２工程でＬＤＬコレステロールのみの
酵素反応を促進しかつＬＤＬコレステロール以外のリポ
蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面活
性剤としては、ＨＬＢ値が８．５以上１２．６未満、好
ましくはＨＬＢ値が９以上１１未満、さらに好ましくは
ＨＬＢ値が９．５以上１０．７未満のポリオキシエチレ
ン鎖を有するノニオン性界面活性剤が用いられる。これ
によりＬＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステ
ロールの反応抑制効果は維持されるがＬＤＬコレステロ
ールに対する反応抑制が選択的に解除され、ＬＤＬコレ
ステロールの反応が促進される。しかしこの場合ＨＬＢ
値が８．５未満かあるいは１２．６を超える場合は、Ｌ
ＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステロールの
反応も促進されるため好ましくない。本発明において用
いる第２界面活性剤は、単独で添加しても良いが、数種
を混合しＨＬＢ値を調整して添加してもよい。
ては、本発明の目的に適合するものであれば特に制限は
ない。本発明の（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有
する高分子化合物の存在下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コ
レステロールの酵素反応を抑制する第１界面活性剤とし
て、例えば胆汁酸誘導体あるいは両性界面活性剤を用
い、第１工程でＨＤＬコレステロールのみを反応させた
場合において、第２工程でＬＤＬコレステロールのみの
酵素反応を促進しかつＬＤＬコレステロール以外のリポ
蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面活
性剤としては、ＨＬＢ値が８．５以上１２．６未満、好
ましくはＨＬＢ値が９以上１１未満、さらに好ましくは
ＨＬＢ値が９．５以上１０．７未満のポリオキシエチレ
ン鎖を有するノニオン性界面活性剤が用いられる。これ
によりＬＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステ
ロールの反応抑制効果は維持されるがＬＤＬコレステロ
ールに対する反応抑制が選択的に解除され、ＬＤＬコレ
ステロールの反応が促進される。しかしこの場合ＨＬＢ
値が８．５未満かあるいは１２．６を超える場合は、Ｌ
ＤＬコレステロール以外のリポ蛋白質コレステロールの
反応も促進されるため好ましくない。本発明において用
いる第２界面活性剤は、単独で添加しても良いが、数種
を混合しＨＬＢ値を調整して添加してもよい。
【００３６】また、第１工程でＬＤＬコレステロール以
外のリポ蛋白質レステロールを反応させた場合、すなわ
ち残存するリポ蛋白質コレステロールがＬＤＬコレステ
ロールのみの場合には、第１界面活性剤の共存下でＬＤ
Ｌコレステロールを反応させるため、やはりＨＬＢ値が
８．５以上１２．６未満、好ましくはＨＬＢ値が９以上
１１未満、さらに好ましくはＨＬＢ値が９．５以上１
０．７未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニオン性
界面活性剤を用いることが好ましい。この場合、さらに
酵素反応を短時間に確実に完結させる目的で複数の界面
活性剤を添加することもできる。例えば酵素反応を早め
るための他の界面活性剤として上記のＨＬＢ値が８．５
以上１２．６未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニ
オン性界面活性剤と同様にポリオキシエチレン鎖を有
し、上記界面活性剤よりＨＬＢのより大きな界面活性剤
であるノニデットＰ−４０（ＨＬＢ１３）やトリトンＸ
−１００（ＨＬＢ１３．５）等が例示できる。
外のリポ蛋白質レステロールを反応させた場合、すなわ
ち残存するリポ蛋白質コレステロールがＬＤＬコレステ
ロールのみの場合には、第１界面活性剤の共存下でＬＤ
Ｌコレステロールを反応させるため、やはりＨＬＢ値が
８．５以上１２．６未満、好ましくはＨＬＢ値が９以上
１１未満、さらに好ましくはＨＬＢ値が９．５以上１
０．７未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニオン性
界面活性剤を用いることが好ましい。この場合、さらに
酵素反応を短時間に確実に完結させる目的で複数の界面
活性剤を添加することもできる。例えば酵素反応を早め
るための他の界面活性剤として上記のＨＬＢ値が８．５
以上１２．６未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニ
オン性界面活性剤と同様にポリオキシエチレン鎖を有
し、上記界面活性剤よりＨＬＢのより大きな界面活性剤
であるノニデットＰ−４０（ＨＬＢ１３）やトリトンＸ
−１００（ＨＬＢ１３．５）等が例示できる。
【００３７】ポリオキシエチレン鎖を有する界面活性剤
は、特開平９−２９９号公報においてＨＤＬ以外のリポ
蛋白質分画中のコレステロールに対する酵素の作用を抑
制する界面活性剤として開示されており、また特開平１
０−３８８８８号公報ではＨＬＢ値が１１以上１３未満
のポリアルキレンオキサイド誘導体が全てのリポ蛋白質
に作用し、ＨＬＢ値が１３以上１５未満のポリアルキレ
ンオキサイド誘導体がＬＤＬ以外のリポ蛋白質に作用す
ることが開示されているが、これらの界面活性剤のリポ
蛋白選択性に対する効果は、本発明の（ａ）および
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物、コール酸
等の第１界面活性剤と第２界面活性剤との併用による効
果とは全く異なるものである。
は、特開平９−２９９号公報においてＨＤＬ以外のリポ
蛋白質分画中のコレステロールに対する酵素の作用を抑
制する界面活性剤として開示されており、また特開平１
０−３８８８８号公報ではＨＬＢ値が１１以上１３未満
のポリアルキレンオキサイド誘導体が全てのリポ蛋白質
に作用し、ＨＬＢ値が１３以上１５未満のポリアルキレ
ンオキサイド誘導体がＬＤＬ以外のリポ蛋白質に作用す
ることが開示されているが、これらの界面活性剤のリポ
蛋白選択性に対する効果は、本発明の（ａ）および
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物、コール酸
等の第１界面活性剤と第２界面活性剤との併用による効
果とは全く異なるものである。
【００３８】ＨＬＢ値が８．５以上１２．６未満のポリ
オキシエチレン鎖を有するノニオン性界面活性剤とし
て、単独組成のものとしては(ポリオキシエチレン)５−
ノニルフェニルエーテル、(ポリオキシエチレン)４−ラ
ウリルエーテル、(ポリオキシエチレン)８−オレイルエ
ーテル、(ポリオキシエチレン)６−ラウリルエーテル、
(ポリオキシエチレン)１０−セチルエーテル、(ポリオ
キシエチレン)６−ノニルフェニルエーテル、(ポリオキ
シエチレン)８−ラウリルエーテル、(ポリオキシエチレ
ン)９−ノニルフェニルエーテル等が挙げられ、また数
種類の界面活性剤を混合してＨＬＢ値を調整したものと
しては、(ポリオキシエチレン)２―ステアリルエーテル
と(ポリオキシエチレン)９―ラウリルエーテルの混合物
等が例示される。
オキシエチレン鎖を有するノニオン性界面活性剤とし
て、単独組成のものとしては(ポリオキシエチレン)５−
ノニルフェニルエーテル、(ポリオキシエチレン)４−ラ
ウリルエーテル、(ポリオキシエチレン)８−オレイルエ
ーテル、(ポリオキシエチレン)６−ラウリルエーテル、
(ポリオキシエチレン)１０−セチルエーテル、(ポリオ
キシエチレン)６−ノニルフェニルエーテル、(ポリオキ
シエチレン)８−ラウリルエーテル、(ポリオキシエチレ
ン)９−ノニルフェニルエーテル等が挙げられ、また数
種類の界面活性剤を混合してＨＬＢ値を調整したものと
しては、(ポリオキシエチレン)２―ステアリルエーテル
と(ポリオキシエチレン)９―ラウリルエーテルの混合物
等が例示される。
【００３９】なお、ノニオン性界面活性剤のＨＬＢ値
は、例えば「新・界面活性剤入門」（藤本武彦著、昭和
４８年、三洋化成工業株式会社発行）等の周知の方法で
算出することができる。
は、例えば「新・界面活性剤入門」（藤本武彦著、昭和
４８年、三洋化成工業株式会社発行）等の周知の方法で
算出することができる。
【００４０】ＬＤＬコレステロールを反応させるために
使用する第２界面活性剤はコレステロール測定用酵素を
失活させない濃度範囲内において用いられる。第２界面
活性剤の添加濃度は選択した界面活性剤の種類に応じて
決められ、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル
の場合は０.０１〜１％、好ましくは０.１〜０.４％で
ある。
使用する第２界面活性剤はコレステロール測定用酵素を
失活させない濃度範囲内において用いられる。第２界面
活性剤の添加濃度は選択した界面活性剤の種類に応じて
決められ、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル
の場合は０.０１〜１％、好ましくは０.１〜０.４％で
ある。
【００４１】本発明に使用するコレステロール測定用酵
素としては、通常コレステロールを測定するために使用
されるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを使
用することができ、コレステロールエステラーゼとコレ
ステロールオキシダーゼ、またはコレステロールエステ
ラーゼとコレステロールデヒドロゲナーゼを組み合わせ
て用いる。特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の微生物
由来のコレステロールエステラーゼは中性脂肪を加水分
解する活性が高いので、本発明の高分子化合物を共存さ
せることによって大きな効果が得られる。
素としては、通常コレステロールを測定するために使用
されるコレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼを使
用することができ、コレステロールエステラーゼとコレ
ステロールオキシダーゼ、またはコレステロールエステ
ラーゼとコレステロールデヒドロゲナーゼを組み合わせ
て用いる。特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の微生物
由来のコレステロールエステラーゼは中性脂肪を加水分
解する活性が高いので、本発明の高分子化合物を共存さ
せることによって大きな効果が得られる。
【００４２】本発明では第１工程で第１界面活性剤とコ
レステロール測定用酵素との組み合わせにより、ＨＤＬ
コレステロールが反応する場合と、ＬＤＬ以外のリポ蛋
白質コレステロールが反応する場合がある。表１に界面
活性剤の種類とコレステロール測定用酵素との組み合わ
せによる第１工程でのリポ蛋白質コレステロールの反応
例を示す。
レステロール測定用酵素との組み合わせにより、ＨＤＬ
コレステロールが反応する場合と、ＬＤＬ以外のリポ蛋
白質コレステロールが反応する場合がある。表１に界面
活性剤の種類とコレステロール測定用酵素との組み合わ
せによる第１工程でのリポ蛋白質コレステロールの反応
例を示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】ＬＰ第１行程：第１工程で反応するリポ蛋
白質の種類／ＨＤＬ＝ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ以
外＝ＬＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロール、 Ａ：コレステロールエステラーゼの起源／Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ＝Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来、膵臓＝膵
臓由来、 Ｂ：コレステロールオキシダーゼの起源／他微生物＝微
生物由来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ＝Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属由来、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ＝Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ属由来、 Ｃ：第１界面活性剤種類／コール酸Ｎａ＝コール酸ナト
リウム、ＣＨＡＰＳ＝３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐ
ｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]ｐｒｏｐ
ａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ＳＢ３−１４＝Ｎ―Ｔｅｔ
ｒａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍ
ｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ
白質の種類／ＨＤＬ＝ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ以
外＝ＬＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロール、 Ａ：コレステロールエステラーゼの起源／Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ＝Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来、膵臓＝膵
臓由来、 Ｂ：コレステロールオキシダーゼの起源／他微生物＝微
生物由来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ＝Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ属由来、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ＝Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ属由来、 Ｃ：第１界面活性剤種類／コール酸Ｎａ＝コール酸ナト
リウム、ＣＨＡＰＳ＝３−[(３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐ
ｒｏｐｙｌ)ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ]ｐｒｏｐ
ａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ＳＢ３−１４＝Ｎ―Ｔｅｔ
ｒａｄｅｃｙＬ−Ｎ，Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍ
ｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ
【００４５】本発明において用いるコレステロール測定
用酵素の濃度は、試料中のコレステロールの濃度、反応
温度および反応時間等により設定する。例えば、リポ蛋
白質を含む試料が血清または血漿であり１０分間程度で
反応させる場合にはコレステロールエステラーゼの濃度
は０.１Ｕ/ｍｌ〜５０Ｕ/ｍｌ、コレステロールオキシ
ダーゼの濃度は０.１Ｕ/ｍｌ〜１０Ｕ/ｍｌが好まし
い。
用酵素の濃度は、試料中のコレステロールの濃度、反応
温度および反応時間等により設定する。例えば、リポ蛋
白質を含む試料が血清または血漿であり１０分間程度で
反応させる場合にはコレステロールエステラーゼの濃度
は０.１Ｕ/ｍｌ〜５０Ｕ/ｍｌ、コレステロールオキシ
ダーゼの濃度は０.１Ｕ/ｍｌ〜１０Ｕ/ｍｌが好まし
い。
【００４６】本発明においてリポ蛋白質を含む試料を測
定する際のｐＨは５〜９の範囲において測定するのが好
ましく、本発明の高分子化合物の効果をより高めるため
にはｐＨ６〜８の範囲がより好ましい。ｐＨが５未満ま
たは９を超えた場合は、本発明の高分子化合物の効果が
十分に発揮されにくいため好ましくない。
定する際のｐＨは５〜９の範囲において測定するのが好
ましく、本発明の高分子化合物の効果をより高めるため
にはｐＨ６〜８の範囲がより好ましい。ｐＨが５未満ま
たは９を超えた場合は、本発明の高分子化合物の効果が
十分に発揮されにくいため好ましくない。
【００４７】本発明において用いるｐＨ緩衝剤に特に制
限はなく、設定したｐＨに対応するｐＫａを持つ１〜２
００ｍＭのｐＨ緩衝剤により調節することができる。ｐ
Ｈ緩衝剤としてＮ−（２−２ヒドロキシエチル)ピペラ
ジン−Ｎ’−(２−エタンスルフォネート)（ＨＥＰＥ
Ｓ）、ピペラジンーＮ，Ｎ’−ビス(２−エタンスルフ
ォネート)（ＰＩＰＥＳ）、３−(Ｎ−モルフォリノ)プ
ロパンスルフォネート（ＭＯＰＳ）などが例示できる。
限はなく、設定したｐＨに対応するｐＫａを持つ１〜２
００ｍＭのｐＨ緩衝剤により調節することができる。ｐ
Ｈ緩衝剤としてＮ−（２−２ヒドロキシエチル)ピペラ
ジン−Ｎ’−(２−エタンスルフォネート)（ＨＥＰＥ
Ｓ）、ピペラジンーＮ，Ｎ’−ビス(２−エタンスルフ
ォネート)（ＰＩＰＥＳ）、３−(Ｎ−モルフォリノ)プ
ロパンスルフォネート（ＭＯＰＳ）などが例示できる。
【００４８】また本発明においては、（ａ）および
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物や酵素の活
性あるいは界面活性剤の作用に影響しないものであれば
任意の物質を共存させることができる。例えば、塩化ナ
トリウム、リン酸カリウム等の塩類、血清アルブミン等
の蛋白質、アスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダ
ーゼ、カタラーゼ等の酵素、コレステロールの酵素反応
生成物を定量するための色素原体等が挙げられる。
（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物や酵素の活
性あるいは界面活性剤の作用に影響しないものであれば
任意の物質を共存させることができる。例えば、塩化ナ
トリウム、リン酸カリウム等の塩類、血清アルブミン等
の蛋白質、アスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダ
ーゼ、カタラーゼ等の酵素、コレステロールの酵素反応
生成物を定量するための色素原体等が挙げられる。
【００４９】本発明において反応に要する時間は試料中
に含まれるコレステロール量、酵素濃度、反応温度、界
面活性剤濃度ならびに（ａ）および（ｂ）の繰り返し単
位を有する高分子化合物濃度等で決定される。また、本
発明により測定される特定のリポ蛋白質コレステロール
の濃度は、コレステロールが酵素反応により生成するあ
るいは消費される物質を定量する一般的な方法で知るこ
とができる。例えば、コレステロール測定用酵素として
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキ
シダーゼを用いた場合、コレステロールが反応して生成
した過酸化水素をパーオキシダーゼの共存下において４
−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロ
キシ−３−スルフォプロピル)−３−メチルアニリン
（以下、「ＴＯＯＳ」という。）、Ｎ−エチル−Ｎ−
(２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル)−３，５−ジ
メトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−(２
−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル)−３，５−ジメ
トキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）等のトリ
ンダー試薬の酸化縮合反応により生じる色素の濃度とし
て吸光度で測定することができる。
に含まれるコレステロール量、酵素濃度、反応温度、界
面活性剤濃度ならびに（ａ）および（ｂ）の繰り返し単
位を有する高分子化合物濃度等で決定される。また、本
発明により測定される特定のリポ蛋白質コレステロール
の濃度は、コレステロールが酵素反応により生成するあ
るいは消費される物質を定量する一般的な方法で知るこ
とができる。例えば、コレステロール測定用酵素として
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキ
シダーゼを用いた場合、コレステロールが反応して生成
した過酸化水素をパーオキシダーゼの共存下において４
−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロ
キシ−３−スルフォプロピル)−３−メチルアニリン
（以下、「ＴＯＯＳ」という。）、Ｎ−エチル−Ｎ−
(２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル)−３，５−ジ
メトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−(２
−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル)−３，５−ジメ
トキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）等のトリ
ンダー試薬の酸化縮合反応により生じる色素の濃度とし
て吸光度で測定することができる。
【００５０】本発明による特定のリポ蛋白質コレステロ
ールの検出は、コレステロール測定用酵素としてコレス
テロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲ
ナーゼを用いた場合、コレステロールが反応して生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、例えば３４０ｎｍの吸光度におけ
る紫外吸収で測定したり、ホルマザン色素を形成させて
比色定量することができる。
ールの検出は、コレステロール測定用酵素としてコレス
テロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲ
ナーゼを用いた場合、コレステロールが反応して生成し
たＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、例えば３４０ｎｍの吸光度におけ
る紫外吸収で測定したり、ホルマザン色素を形成させて
比色定量することができる。
【００５１】また、本発明による特定のリポ蛋白質コレ
ステロールの検出は、特定のリポ蛋白質コレステロール
が反応する際に消費される酸素を酸素電極によって測定
することによっても可能である。
ステロールの検出は、特定のリポ蛋白質コレステロール
が反応する際に消費される酸素を酸素電極によって測定
することによっても可能である。
【００５２】以下、本発明によるリポ蛋白質コレステロ
ールのより具体的な測定手法について述べる。本発明の
方法によりＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステ
ロールを定量する場合、血清等の試料に、例えばアスコ
ルビン酸オキシダーゼと４−アミノアンチピリン等から
なる第１試薬を添加して検体中のアスコルビン酸を消去
する。次いで第２試薬として、ＨＤＬコレステロールの
みを反応させる組み合わせの第１界面活性剤、コレステ
ロール測定用酵素、（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物、パーオキシダーゼおよびトリン
ダー試薬を添加することによりＨＤＬコレステロールの
みが反応する。生成した過酸化水素をパーオキシダーゼ
の作用で４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の酸
化縮合反応により生じる色素の濃度を吸光度測定するこ
とにより高精度にＨＤＬコレステロールの測定ができ
る。次いで高分子化合物存在下においてもＬＤＬコレス
テロールのみの酵素反応を促進しかつＬＤＬ以外のリポ
蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面活
性剤からなる第３試薬を添加し、ＬＤＬを選択的に酵素
と反応させ生成した過酸化水素を上記の検出系に導き高
精度にＬＤＬコレステロールの測定ができる。
ールのより具体的な測定手法について述べる。本発明の
方法によりＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステ
ロールを定量する場合、血清等の試料に、例えばアスコ
ルビン酸オキシダーゼと４−アミノアンチピリン等から
なる第１試薬を添加して検体中のアスコルビン酸を消去
する。次いで第２試薬として、ＨＤＬコレステロールの
みを反応させる組み合わせの第１界面活性剤、コレステ
ロール測定用酵素、（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物、パーオキシダーゼおよびトリン
ダー試薬を添加することによりＨＤＬコレステロールの
みが反応する。生成した過酸化水素をパーオキシダーゼ
の作用で４−アミノアンチピリンとトリンダー試薬の酸
化縮合反応により生じる色素の濃度を吸光度測定するこ
とにより高精度にＨＤＬコレステロールの測定ができ
る。次いで高分子化合物存在下においてもＬＤＬコレス
テロールのみの酵素反応を促進しかつＬＤＬ以外のリポ
蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面活
性剤からなる第３試薬を添加し、ＬＤＬを選択的に酵素
と反応させ生成した過酸化水素を上記の検出系に導き高
精度にＬＤＬコレステロールの測定ができる。
【００５３】また、ＨＤＬコレステロールを定量する必
要がなくＬＤＬコレステロールを定量する場合、上述の
アスコルビン酸の消去工程とＨＤＬコレステロールの反
応工程を同時に行い、さらにＨＤＬコレステロールの酵
素反応で生成する過酸化水素を同一工程内で消去する事
により２試薬系でＬＤＬコレステロールの測定を行う事
ができる。
要がなくＬＤＬコレステロールを定量する場合、上述の
アスコルビン酸の消去工程とＨＤＬコレステロールの反
応工程を同時に行い、さらにＨＤＬコレステロールの酵
素反応で生成する過酸化水素を同一工程内で消去する事
により２試薬系でＬＤＬコレステロールの測定を行う事
ができる。
【００５４】すなわち、血清等の試料に、例えばアスコ
ルビン酸オキシダーゼ、ＨＤＬコレステロールのみを反
応させる組み合わせの第１界面活性剤、コレステロール
測定用酵素、（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有す
る高分子化合物、カタラーゼおよびトリンダー試薬等か
らなる第１試薬を添加して試料中のアスコルビン酸を消
去すると共に、ＨＤＬコレステロールから生成する過酸
化水素をカタラーゼによって分解消去した後、次いでカ
タラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウム、ＬＤＬコレ
ステロールのみの酵素反応を促進しかつＬＤＬ以外のリ
ポ蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面
活性剤、パーオキシダーゼおよび色素原体の４−アミノ
アンチピリン等からなる第２試薬を添加して、ＨＤＬコ
レステロールを定量することなく高精度にＬＤＬコレス
テロールを測定する事ができる。
ルビン酸オキシダーゼ、ＨＤＬコレステロールのみを反
応させる組み合わせの第１界面活性剤、コレステロール
測定用酵素、（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位を有す
る高分子化合物、カタラーゼおよびトリンダー試薬等か
らなる第１試薬を添加して試料中のアスコルビン酸を消
去すると共に、ＨＤＬコレステロールから生成する過酸
化水素をカタラーゼによって分解消去した後、次いでカ
タラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウム、ＬＤＬコレ
ステロールのみの酵素反応を促進しかつＬＤＬ以外のリ
ポ蛋白質コレステロールの酵素反応を抑制する第２界面
活性剤、パーオキシダーゼおよび色素原体の４−アミノ
アンチピリン等からなる第２試薬を添加して、ＨＤＬコ
レステロールを定量することなく高精度にＬＤＬコレス
テロールを測定する事ができる。
【００５５】あるいは過酸化水素の消去にカタラーゼを
使用せず、４−アミノアンチピリン二量体に導くことに
よっても同一工程内でＨＤＬコレステロールの酵素反応
で生成する過酸化水素の消去を行うことができる。例え
ば上述の、カタラーゼを利用した過酸化水素消去法の第
１試薬としてのカタラーゼとトリンダー試薬の代わり
に、パーオキシダーゼと４−アミノアンチピリンを配合
し、ＨＤＬコレステロールから生成する過酸化水素を無
色の４−アミノアンチピリン二量体に導き、第２試薬に
は４−アミノアンチピリンの代わりにトリンダー試薬を
添加することでＨＤＬコレステロールを定量することな
く精度よくＬＤＬコレステロールを測定することができ
る。
使用せず、４−アミノアンチピリン二量体に導くことに
よっても同一工程内でＨＤＬコレステロールの酵素反応
で生成する過酸化水素の消去を行うことができる。例え
ば上述の、カタラーゼを利用した過酸化水素消去法の第
１試薬としてのカタラーゼとトリンダー試薬の代わり
に、パーオキシダーゼと４−アミノアンチピリンを配合
し、ＨＤＬコレステロールから生成する過酸化水素を無
色の４−アミノアンチピリン二量体に導き、第２試薬に
は４−アミノアンチピリンの代わりにトリンダー試薬を
添加することでＨＤＬコレステロールを定量することな
く精度よくＬＤＬコレステロールを測定することができ
る。
【００５６】あるいはまた、第１工程でコレステロール
測定用酵素と第１界面活性剤の組み合わせによりＬＤＬ
コレステロール以外のリポ蛋白質を反応させる系を選択
することもできる。この場合もＬＤＬコレステロール以
外のリポ蛋白質から生成する過酸化水素を、カタラーゼ
によって分解するかもしくは無色の４−アミノアンチピ
リン二量体に導く方法を利用して、精度よくＬＤＬコレ
ステロールを測定することができる。
測定用酵素と第１界面活性剤の組み合わせによりＬＤＬ
コレステロール以外のリポ蛋白質を反応させる系を選択
することもできる。この場合もＬＤＬコレステロール以
外のリポ蛋白質から生成する過酸化水素を、カタラーゼ
によって分解するかもしくは無色の４−アミノアンチピ
リン二量体に導く方法を利用して、精度よくＬＤＬコレ
ステロールを測定することができる。
【００５７】また、ＬＤＬコレステロールを定量する必
要がなく、ＨＤＬコレステロールを定量したい場合、例
えば前述のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステ
ロールを定量する場合において、第１工程と第２工程を
行ってＨＤＬコレステロールのみを測定してもよい。
要がなく、ＨＤＬコレステロールを定量したい場合、例
えば前述のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステ
ロールを定量する場合において、第１工程と第２工程を
行ってＨＤＬコレステロールのみを測定してもよい。
【００５８】
【本発明の効果】このように本発明は、特定の高分子と
複数の界面活性剤を組み合わせて用いることでリポ蛋白
質の反応性を制御する点に特徴を有するものであり、反
応液の濁度を上昇させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせ
ず、またＬＤＬコレステロールを反応させる工程で新た
に別の酵素を加える必要もなく、コレステロール測定に
用いられる通常の酵素を用いてＨＤＬコレステロール量
および／またはＬＤＬコレステロール量を精度良く定量
することができるため、臨床検査などの分野に有用であ
る。
複数の界面活性剤を組み合わせて用いることでリポ蛋白
質の反応性を制御する点に特徴を有するものであり、反
応液の濁度を上昇させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせ
ず、またＬＤＬコレステロールを反応させる工程で新た
に別の酵素を加える必要もなく、コレステロール測定に
用いられる通常の酵素を用いてＨＤＬコレステロール量
および／またはＬＤＬコレステロール量を精度良く定量
することができるため、臨床検査などの分野に有用であ
る。
【００５９】
【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定される
ものではない。
するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定される
ものではない。
【００６０】（製造例）直鎖の１−オレフィンと無水マ
レイン酸の共重合体０.１ｇを１００ｍｌの１Ｎ水酸化
ナトリウム溶液に懸濁して７０℃で２時間加熱した後、
１Ｎ塩酸でｐＨ７.０に中和して透析膜で１２時間脱塩
することにより上記（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物を得た。
レイン酸の共重合体０.１ｇを１００ｍｌの１Ｎ水酸化
ナトリウム溶液に懸濁して７０℃で２時間加熱した後、
１Ｎ塩酸でｐＨ７.０に中和して透析膜で１２時間脱塩
することにより上記（ａ）および（ｂ）の繰り返し単位
を有する高分子化合物を得た。
【００６１】（実施例１）本発明における上記（ａ）お
よび（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物の違い
によるコレステロールの反応抑制効果を第１界面活性剤
共存下で比較した。
よび（ｂ）の繰り返し単位を有する高分子化合物の違い
によるコレステロールの反応抑制効果を第１界面活性剤
共存下で比較した。
【００６２】[試薬組成] １）コレステロール測定用酵素溶液（Ｉ） ０．１％コール酸ナトリウム、１Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラー
ゼ、１Ｕ/ｍｌＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物由来の
コレステロールオキシダーゼ、３Ｕ/ｍｌパーオキシダ
ーゼ、１ｍＭ４−アミノアンチピリン、１ｍＭＴＯＯ
Ｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのＭＯＰＳ
ｐＨ７.０ ２）コレステロール測定用酵素溶液（ＩＩ） ０．１％コール酸ナトリウム、１Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、１Ｕ/ｍｌＳｔｒｅｐｔｍ
ｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、
３Ｕ/ｍｌパーオキシダーゼ、１ｍＭ４−アミノアンチ
ピリン、１ｍＭＴＯＯＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウ
ム、３０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７.０
ｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラー
ゼ、１Ｕ/ｍｌＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物由来の
コレステロールオキシダーゼ、３Ｕ/ｍｌパーオキシダ
ーゼ、１ｍＭ４−アミノアンチピリン、１ｍＭＴＯＯ
Ｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのＭＯＰＳ
ｐＨ７.０ ２）コレステロール測定用酵素溶液（ＩＩ） ０．１％コール酸ナトリウム、１Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、１Ｕ/ｍｌＳｔｒｅｐｔｍ
ｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、
３Ｕ/ｍｌパーオキシダーゼ、１ｍＭ４−アミノアンチ
ピリン、１ｍＭＴＯＯＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウ
ム、３０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７.０
【００６３】[測定方法]超遠心法により分離したリポ蛋
白質分画を、コレステロール測定用酵素溶液（Ｉ）また
はコレステロール測定用酵素溶液（ＩＩ）１００容に対
して１容の割合で加えて３７℃で１０分間反応させ、反
応したコレステロール量に比例する反応液の吸光度（主
波長５５０ｎｍ/副波長７００ｎｍ）を測定した。各リ
ポ蛋白質分画中のコレステロール濃度はＨＤＬ分画が約
１００ｍｇ/ｄｌ、ＶＬＤＬ分画が約５０ｍｇ/ｄｌ、Ｌ
ＤＬ分画が約２００ｍｇ/ｄｌである。
白質分画を、コレステロール測定用酵素溶液（Ｉ）また
はコレステロール測定用酵素溶液（ＩＩ）１００容に対
して１容の割合で加えて３７℃で１０分間反応させ、反
応したコレステロール量に比例する反応液の吸光度（主
波長５５０ｎｍ/副波長７００ｎｍ）を測定した。各リ
ポ蛋白質分画中のコレステロール濃度はＨＤＬ分画が約
１００ｍｇ/ｄｌ、ＶＬＤＬ分画が約５０ｍｇ/ｄｌ、Ｌ
ＤＬ分画が約２００ｍｇ/ｄｌである。
【００６４】次に、コレステロール測定用酵素溶液
（Ｉ）と（ＩＩ）に製造例と同様の方法で調製した高分
子化合物を添加し、無添加系と同様にしてリポ蛋白質分
画を反応させ、反応液の吸光度（主波長５５０ｎｍ/副
波長７００ｎｍ）を測定した。高分子化合物を添加しな
いコレステロール測定用酵素溶液で得られた吸光度を基
準にして、高分子化合物のリポ蛋白質コレステロールに
添加系の酵素反応抑制率を算出した。
（Ｉ）と（ＩＩ）に製造例と同様の方法で調製した高分
子化合物を添加し、無添加系と同様にしてリポ蛋白質分
画を反応させ、反応液の吸光度（主波長５５０ｎｍ/副
波長７００ｎｍ）を測定した。高分子化合物を添加しな
いコレステロール測定用酵素溶液で得られた吸光度を基
準にして、高分子化合物のリポ蛋白質コレステロールに
添加系の酵素反応抑制率を算出した。
【００６５】表２に高分子化合物のアルキル基（Ｒ1）
の炭素数（Ｃ１〜Ｃ２６）、側鎖Ｙ、質量平均分子量、
使用濃度および高分子化合物のコレステロール反応抑制
効果を示した。なお、ＸはＣＯＯＨあるいはそのナトリ
ウム塩である。また、リポ蛋白質コレステロールの反応
抑制効果は反応抑制率０〜５％を−、５〜３０％を＋、
３０〜８０％を＋＋、８０〜１００％を＋＋＋と評価し
た。
の炭素数（Ｃ１〜Ｃ２６）、側鎖Ｙ、質量平均分子量、
使用濃度および高分子化合物のコレステロール反応抑制
効果を示した。なお、ＸはＣＯＯＨあるいはそのナトリ
ウム塩である。また、リポ蛋白質コレステロールの反応
抑制効果は反応抑制率０〜５％を−、５〜３０％を＋、
３０〜８０％を＋＋、８０〜１００％を＋＋＋と評価し
た。
【００６６】
【表２】
【００６７】表２に示すように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ属微生物由来のコレステロールエステラーゼとＳｔｒ
ｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシ
ダーゼをコレステロール測定用酵素として使用した場
合、高分子化合物と第１界面活性剤の共存下において、
Ｒ1のアルキル基炭素数が４以上の化合物がＬＤＬコレ
ステロールとＶＬＤＬコレステロールの酵素反応を選択
的に抑制することがわかる。また、膵臓由来のコレステ
ロールエステラーゼとＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物
由来のコレステロールオキシダーゼをコレステロール測
定用酵素として使用した場合、高分子化合物と第１界面
活性剤の共存下において、Ｒ1のアルキル基炭素数が４
以上の化合物がＬＤＬコレステロールの酵素反応を選択
的に抑制することがわかる。
ｓ属微生物由来のコレステロールエステラーゼとＳｔｒ
ｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシ
ダーゼをコレステロール測定用酵素として使用した場
合、高分子化合物と第１界面活性剤の共存下において、
Ｒ1のアルキル基炭素数が４以上の化合物がＬＤＬコレ
ステロールとＶＬＤＬコレステロールの酵素反応を選択
的に抑制することがわかる。また、膵臓由来のコレステ
ロールエステラーゼとＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属微生物
由来のコレステロールオキシダーゼをコレステロール測
定用酵素として使用した場合、高分子化合物と第１界面
活性剤の共存下において、Ｒ1のアルキル基炭素数が４
以上の化合物がＬＤＬコレステロールの酵素反応を選択
的に抑制することがわかる。
【００６８】（実施例2）血清と混合した場合の濁度変
化を指標にして、本発明の第１界面活性剤と高分子化合
物を配合した試薬の光学特性をリンタングステン酸法と
比較した。試薬は、まず実施例1で用いたコレステロー
ル測定用酵素溶液（Ｉ）から色素原体であるＴＯＯＳを
除き、コレステロールが反応して過酸化水素が発生して
も色素を形成しないリポ蛋白質反応試薬（Ｉ）を調製し
た。さらに本発明の高分子として製造例と同様の方法で
調製したポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−マレイン酸）
を０.０５％添加してリポ蛋白質反応試薬（ＩＩ）を調
製した。比較対照用としてリンタングステン酸０.１％
および塩化マグネシウム１００ｍＭを添加したリポ蛋白
質凝集試薬を調製した。
化を指標にして、本発明の第１界面活性剤と高分子化合
物を配合した試薬の光学特性をリンタングステン酸法と
比較した。試薬は、まず実施例1で用いたコレステロー
ル測定用酵素溶液（Ｉ）から色素原体であるＴＯＯＳを
除き、コレステロールが反応して過酸化水素が発生して
も色素を形成しないリポ蛋白質反応試薬（Ｉ）を調製し
た。さらに本発明の高分子として製造例と同様の方法で
調製したポリ（１−オクタデセン−ｃｏ−マレイン酸）
を０.０５％添加してリポ蛋白質反応試薬（ＩＩ）を調
製した。比較対照用としてリンタングステン酸０.１％
および塩化マグネシウム１００ｍＭを添加したリポ蛋白
質凝集試薬を調製した。
【００６９】リポ蛋白反応試薬（Ｉ）、（ＩＩ）、リポ
蛋白質凝集試薬にそれぞれ血清を反応させ、血清添加前
後の反応液の吸光度差（主波長５５０ｎｍ/副波長７０
０ｎｍ）によって濁度変化を測定した結果を表３に示
す。
蛋白質凝集試薬にそれぞれ血清を反応させ、血清添加前
後の反応液の吸光度差（主波長５５０ｎｍ/副波長７０
０ｎｍ）によって濁度変化を測定した結果を表３に示
す。
【００７０】
【表３】 本発明で使用する界面活性剤を単独または高分子化合物
と共に配合した試薬を血清と混合しても濁度は上昇せ
ず、本発明方法によれば精度の高い光学測定が可能であ
ることがわかる。
と共に配合した試薬を血清と混合しても濁度は上昇せ
ず、本発明方法によれば精度の高い光学測定が可能であ
ることがわかる。
【００７１】（実施例３〜８および比較例１〜２）本発
明の高分子化合物、第１界面活性剤および第２界面活性
剤によるリポ蛋白質の選択性を実施例３〜８および比較
例１〜２に示す。
明の高分子化合物、第１界面活性剤および第２界面活性
剤によるリポ蛋白質の選択性を実施例３〜８および比較
例１〜２に示す。
【００７２】［試薬組成］ １）第１試薬 ０．０７％ コール酸ナトリウム、０．０５％ ポリ（１
−オクタデセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエ
ステラーゼ、２Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ、３Ｕ/ｍｌ
パーオキシダーゼ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、
１ｍＭ ＴＯＯＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ
ＭＯＰＳｐＨ７
−オクタデセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエ
ステラーゼ、２Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ、３Ｕ/ｍｌ
パーオキシダーゼ、１ｍＭ ４−アミノアンチピリン、
１ｍＭ ＴＯＯＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ
ＭＯＰＳｐＨ７
【００７３】２）第２試薬 １５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７に下
記（Ａ）〜（Ｈ）のポリオキシエチレン鎖を有するノニ
オン性界面活性剤を０.２％添加し８種類の第２試薬を
調製した。 （Ａ）実施例３：（ポリオキシエチレン）４−ラウリル
エーテル （ＨＬＢ値９.６／花王株式会社製エマルゲン１０４
Ｐ） （Ｂ）実施例４：（ポリオキシエチレン）８−オレイル
エーテル （ＨＬＢ値１０.０／花王株式会社製エマルゲン４０
８） （Ｃ）実施例５：（ポリオキシエチレン）１０−セチル
エーテル （ＨＬＢ値１０.７／花王株式会社製エマルゲン２１０
Ｐ） （Ｄ）実施例６：（ポリオキシエチレン）８−ラウリル
エーテル （ＨＬＢ値１２.１／花王株式会社製エマルゲン１０
８） （Ｅ）実施例７：（ポリオキシエチレン）３−ノニルフ
ェニルエーテル（ＨＬＢ＝７.８／花王株式会社製エマ
ルゲン９０３）と（ポリオキシエチレン）４−ラウリル
エーテル（ＨＬＢ値＝９.６／花王株式会社製エマルゲ
ン１０４Ｐ）を混合して調製したＨＬＢ≒８．５の界面
活性剤 （Ｆ）実施例８：（ポリオキシエチレン）９−ノニルフ
ェニルエーテル （ＨＬＢ＝１２．６／花王株式会社製エマルゲン９０
９） （Ｇ）比較例１：（ポリオキシエチレン）３−ノニルフ
ェニルエーテル （ＨＬＢ＝７.８／花王株式会社製エマルゲン９０３） （Ｈ）比較例２：（ポリオキシエチレン）１０−オクチ
ルフェニルエーテル （ＨＬＢ＝１３．１／花王株式会社製エマルゲン８１
０）
記（Ａ）〜（Ｈ）のポリオキシエチレン鎖を有するノニ
オン性界面活性剤を０.２％添加し８種類の第２試薬を
調製した。 （Ａ）実施例３：（ポリオキシエチレン）４−ラウリル
エーテル （ＨＬＢ値９.６／花王株式会社製エマルゲン１０４
Ｐ） （Ｂ）実施例４：（ポリオキシエチレン）８−オレイル
エーテル （ＨＬＢ値１０.０／花王株式会社製エマルゲン４０
８） （Ｃ）実施例５：（ポリオキシエチレン）１０−セチル
エーテル （ＨＬＢ値１０.７／花王株式会社製エマルゲン２１０
Ｐ） （Ｄ）実施例６：（ポリオキシエチレン）８−ラウリル
エーテル （ＨＬＢ値１２.１／花王株式会社製エマルゲン１０
８） （Ｅ）実施例７：（ポリオキシエチレン）３−ノニルフ
ェニルエーテル（ＨＬＢ＝７.８／花王株式会社製エマ
ルゲン９０３）と（ポリオキシエチレン）４−ラウリル
エーテル（ＨＬＢ値＝９.６／花王株式会社製エマルゲ
ン１０４Ｐ）を混合して調製したＨＬＢ≒８．５の界面
活性剤 （Ｆ）実施例８：（ポリオキシエチレン）９−ノニルフ
ェニルエーテル （ＨＬＢ＝１２．６／花王株式会社製エマルゲン９０
９） （Ｇ）比較例１：（ポリオキシエチレン）３−ノニルフ
ェニルエーテル （ＨＬＢ＝７.８／花王株式会社製エマルゲン９０３） （Ｈ）比較例２：（ポリオキシエチレン）１０−オクチ
ルフェニルエーテル （ＨＬＢ＝１３．１／花王株式会社製エマルゲン８１
０）
【００７４】［測定方法］血清をアスコルビン酸オキシ
ダーゼ（５Ｕ/ｍｌ）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム
水溶液で１０倍に希釈して３７℃で５分間加温した後
に、その０.１ｍｌを予め３７℃に加温した第１試薬０.
９ｍｌに混和して３７℃で５分間反応させ（第１工
程）、更に（Ａ）〜（Ｈ）の界面活性剤をそれぞれ添加
した第２試薬１ｍｌを追添して３７℃で５分間反応させ
（第２工程）、全反応工程の反応液の吸光度（主波長５
５０ｎｍ/副波長７００ｎｍ）を経時的に測定した。
（第２界面活性剤（Ａ）〜（Ｈ）はそれぞれ実施例３〜
８および比較例１〜２に使用。）別にコレステロール換
算で５０ｍｇ/ｄｌ相当のコレステロールパルミテート
を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液に懸濁し
て調製した標準液を適宜希釈した。希釈標準液０．１ｍ
ｌに血清と同様に第１試薬と第２試薬を反応させて、吸
光度変化量と標準液コレステロール濃度から検量線を作
成した。作成した検量線を基準として血清中のコレステ
ロール濃度を算出した。
ダーゼ（５Ｕ/ｍｌ）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム
水溶液で１０倍に希釈して３７℃で５分間加温した後
に、その０.１ｍｌを予め３７℃に加温した第１試薬０.
９ｍｌに混和して３７℃で５分間反応させ（第１工
程）、更に（Ａ）〜（Ｈ）の界面活性剤をそれぞれ添加
した第２試薬１ｍｌを追添して３７℃で５分間反応させ
（第２工程）、全反応工程の反応液の吸光度（主波長５
５０ｎｍ/副波長７００ｎｍ）を経時的に測定した。
（第２界面活性剤（Ａ）〜（Ｈ）はそれぞれ実施例３〜
８および比較例１〜２に使用。）別にコレステロール換
算で５０ｍｇ/ｄｌ相当のコレステロールパルミテート
を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００水溶液に懸濁し
て調製した標準液を適宜希釈した。希釈標準液０．１ｍ
ｌに血清と同様に第１試薬と第２試薬を反応させて、吸
光度変化量と標準液コレステロール濃度から検量線を作
成した。作成した検量線を基準として血清中のコレステ
ロール濃度を算出した。
【００７５】対照法として、反応液体クロマトグラフィ
ー法で同一の血清のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬ
コレステロールを定量した。Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工株
式会社登録商標）ＫＷ−８０４カラム（昭和電工株式会
社製）を用い１５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶
離液として血清中のリポ蛋白質を分離し、カラム出口に
溶出液とコレステロール検出液を混合させる反応コイル
を接続して、反応コイル中でカラム溶出液とコレステロ
ール検出液混合物を４５℃で３分間反応させた後に、５
５０ｎｍの吸光度を測定することによってリポ蛋白質各
分画のコレステロール量を測定した。
ー法で同一の血清のＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬ
コレステロールを定量した。Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工株
式会社登録商標）ＫＷ−８０４カラム（昭和電工株式会
社製）を用い１５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶
離液として血清中のリポ蛋白質を分離し、カラム出口に
溶出液とコレステロール検出液を混合させる反応コイル
を接続して、反応コイル中でカラム溶出液とコレステロ
ール検出液混合物を４５℃で３分間反応させた後に、５
５０ｎｍの吸光度を測定することによってリポ蛋白質各
分画のコレステロール量を測定した。
【００７６】なお、コレステロール検出液はＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラー
ゼ（１０Ｕ/ｍｌ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物
由来のコレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ/ｍｌ）、
パーオキシダーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２ｍＭ）およびＴＯＯＳ（２ｍＭ）を含む０．
５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液であり、溶出液と
１：１に混合するように反応コイルへの流入量を調節し
た。また、クロマトグラム中のピークは超遠心法によっ
て分離したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ分画を用いて同定
した。
ｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラー
ゼ（１０Ｕ/ｍｌ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物
由来のコレステロールオキシダーゼ（１０Ｕ/ｍｌ）、
パーオキシダーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２ｍＭ）およびＴＯＯＳ（２ｍＭ）を含む０．
５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液であり、溶出液と
１：１に混合するように反応コイルへの流入量を調節し
た。また、クロマトグラム中のピークは超遠心法によっ
て分離したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ分画を用いて同定
した。
【００７７】実施例３〜８および比較例１〜２につい
て、第１工程で反応した血清中のコレステロール濃度
（平均）と第２工程で反応した血清中のコレステロール
濃度、反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て定量した同一血清中のＨＤＬコレステロール濃度およ
びＬＤＬコレステロール濃度を表４にまとめて示す。
て、第１工程で反応した血清中のコレステロール濃度
（平均）と第２工程で反応した血清中のコレステロール
濃度、反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によっ
て定量した同一血清中のＨＤＬコレステロール濃度およ
びＬＤＬコレステロール濃度を表４にまとめて示す。
【００７８】
【表４】
【００７９】表４に示すように、第１工程で反応するコ
レステロールは、反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で測定したＨＤＬコレステロールと高い相関を示
し、また、第２界面活性剤としてＨＬＢ値が８．５以上
１２．６未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニオン
性界面活性剤を用いた場合には、第２工程で反応するコ
レステロールは反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で測定したＬＤＬコレステロールと高い相関を示し
た。
レステロールは、反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で測定したＨＤＬコレステロールと高い相関を示
し、また、第２界面活性剤としてＨＬＢ値が８．５以上
１２．６未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニオン
性界面活性剤を用いた場合には、第２工程で反応するコ
レステロールは反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で測定したＬＤＬコレステロールと高い相関を示し
た。
【００８０】（実施例９〜１５）本発明の測定例を実施
例９〜１５に示す。実施例９に、本発明によるＨＤＬコ
レステロールおよびＬＤＬコレステロールの測定例を、
実施例１０〜１４に本発明によりＨＤＬコレステロール
を測定せずＬＤＬコレステロールを測定した場合の測定
例を示し、実施例１５に本発明によりＬＤＬコレステロ
ールを測定せずＨＤＬコレステロールを測定した場合の
測定例を示した。
例９〜１５に示す。実施例９に、本発明によるＨＤＬコ
レステロールおよびＬＤＬコレステロールの測定例を、
実施例１０〜１４に本発明によりＨＤＬコレステロール
を測定せずＬＤＬコレステロールを測定した場合の測定
例を示し、実施例１５に本発明によりＬＤＬコレステロ
ールを測定せずＨＤＬコレステロールを測定した場合の
測定例を示した。
【００８１】日立７０７０型自動分析装置（株式会社日
立製作所製）を用いて、血清５０検体を被検試料として
本発明の方法によりリポ蛋白質コレステロールを測定し
た。反応条件としては、３７℃で各試薬添加後約５分反
応させた後、反応液の吸光度変化（５５０ｎｍ／７００
ｎｍ）を測定して、濃度既知のリポ蛋白質コレステロー
ルキャリブレーター（試料ブランク＝精製水）を用いて
血清中のＨＤＬコレステロール濃度またはＬＤＬコレス
テロール濃度を算出した。測定には、アルキル基
（Ｒ1）炭素数が１６で、（ａ）および（ｂ）の繰り返
し単位を有する高分子化合物として、ポリ（１−オクタ
デセン−ｃｏ−マレイン酸）を使用し、それぞれ以下の
組成の試薬を用いて測定を行った。
立製作所製）を用いて、血清５０検体を被検試料として
本発明の方法によりリポ蛋白質コレステロールを測定し
た。反応条件としては、３７℃で各試薬添加後約５分反
応させた後、反応液の吸光度変化（５５０ｎｍ／７００
ｎｍ）を測定して、濃度既知のリポ蛋白質コレステロー
ルキャリブレーター（試料ブランク＝精製水）を用いて
血清中のＨＤＬコレステロール濃度またはＬＤＬコレス
テロール濃度を算出した。測定には、アルキル基
（Ｒ1）炭素数が１６で、（ａ）および（ｂ）の繰り返
し単位を有する高分子化合物として、ポリ（１−オクタ
デセン−ｃｏ−マレイン酸）を使用し、それぞれ以下の
組成の試薬を用いて測定を行った。
【００８２】（実施例９） １）試薬１ ０.０７％ コール酸Ｎａ，５Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オ
キシダーゼ，３.０ｍｍ ４−アミノアンチピリン，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．０７％ コール酸Ｎａ，０．０５％ ポリ（１−オク
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）、２．４Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステ
ラーゼ、３．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生
物由来のコレステロールオキシダーゼ，５．７Ｕ/ｍｌ
パーオキシダーゼ，１.５ｍｍ ＴＯＯＳ，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ３）試薬３ ０．２７％ （ポリオキシエチレン）４−ラウリルエー
テル（花王株式会社製エマルゲン１０４Ｐ），１５０ｍ
ｍ ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７
キシダーゼ，３.０ｍｍ ４−アミノアンチピリン，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．０７％ コール酸Ｎａ，０．０５％ ポリ（１−オク
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）、２．４Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステ
ラーゼ、３．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生
物由来のコレステロールオキシダーゼ，５．７Ｕ/ｍｌ
パーオキシダーゼ，１.５ｍｍ ＴＯＯＳ，１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ３）試薬３ ０．２７％ （ポリオキシエチレン）４−ラウリルエー
テル（花王株式会社製エマルゲン１０４Ｐ），１５０ｍ
ｍ ＮａＣｌ，３０ｍｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８３】（実施例１０） １）試薬１ ０．０７％ コール酸Ｎａ、０．０３３％ ポリ（１−オ
クタデセン−ｃｏ−マレイン酸）、１．６Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、２．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ，２００Ｕ/ｍ
ｌ カタラーゼ、３Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オキシダー
ゼ、１ｍＭ ＴＯＯＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ
ＭＯＰＳｐＨ７ ２）試薬２ ０．０４Ｍ ＮａＮ3、０．２７％ エマルゲン１０４
Ｐ、３．８Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ、１．０ｍＭ ４
−アミノアンチピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７
クタデセン−ｃｏ−マレイン酸）、１．６Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、２．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ，２００Ｕ/ｍ
ｌ カタラーゼ、３Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オキシダー
ゼ、１ｍＭ ＴＯＯＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ
ＭＯＰＳｐＨ７ ２）試薬２ ０．０４Ｍ ＮａＮ3、０．２７％ エマルゲン１０４
Ｐ、３．８Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ、１．０ｍＭ ４
−アミノアンチピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８４】（実施例１１） １）試薬１ ０．０７％ コール酸Ｎａ、０．０３３％ ポリ（１−オ
クタデセン−ｃｏ−マレイン酸），１．６Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、２．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ、３．８Ｕ/ｍ
ｌ パーオキシダーゼ、２．４ｍＭ ４−アミノアンチピ
リン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、5Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸
オキシダーゼ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２７％ エマルゲン１０４Ｐ、１ｍＭ ＴＯＯＳ、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
クタデセン−ｃｏ−マレイン酸），１．６Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、２．０Ｕ/ｍｌＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微
生物由来のコレステロールオキシダーゼ、３．８Ｕ/ｍ
ｌ パーオキシダーゼ、２．４ｍＭ ４−アミノアンチピ
リン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、5Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸
オキシダーゼ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２７％ エマルゲン１０４Ｐ、１ｍＭ ＴＯＯＳ、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８５】（実施例１２） １）試薬１ ０．２％ ＳＢ３−１４、０．０７％ ポリ（１−オクタ
デセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、１Ｕ/ｍｌ Ｓｔｒｅｐｔｍ
ｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、
５Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ，３ｍＭ ４−アミノアン
チピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５Ｕ/ｍｌ アスコル
ビン酸オキシダーゼ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ エマルゲン１０４Ｐ，１ｍＭ ＴＯＯＳ，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
デセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、１Ｕ/ｍｌ Ｓｔｒｅｐｔｍ
ｙｃｅｓ属微生物由来のコレステロールオキシダーゼ、
５Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ，３ｍＭ ４−アミノアン
チピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５Ｕ/ｍｌ アスコル
ビン酸オキシダーゼ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ エマルゲン１０４Ｐ，１ｍＭ ＴＯＯＳ，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８６】（実施例１３） １）試薬１ ０．０５％コール酸Ｎａ、０．０５％ ポリ（１−オク
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）０．９Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラ
ーゼ、３．０Ｕ/ｍｌ微生物由来のコレステロールオキ
シダーゼ、１０Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ，３．０ｍＭ
４−アミノアンチピリン、１ｍＭ ＴＯＯＳ、５Ｕ/ｍ
ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ エマルゲン１０４Ｐ、２．４％ ノニデット
Ｐ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐ
Ｈ７
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）０．９Ｕ/ｍｌ Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエステラ
ーゼ、３．０Ｕ/ｍｌ微生物由来のコレステロールオキ
シダーゼ、１０Ｕ/ｍｌ パーオキシダーゼ，３．０ｍＭ
４−アミノアンチピリン、１ｍＭ ＴＯＯＳ、５Ｕ/ｍ
ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ エマルゲン１０４Ｐ、２．４％ ノニデット
Ｐ−４０、１５０ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐ
Ｈ７
【００８７】（実施例１４） １）試薬１ ０．０５％コール酸Ｎａ、０．０５％ ポリ（１−オク
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）、０．７５Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、３．０Ｕ/ｍｌ微生物由来のコレステロール
オキシダーゼ、２００Ｕ/ｍｌ カタラーゼ、１ｍＭ Ｔ
ＯＯＳ、５Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．０４Ｍ ＮａＮ3、０．２％ エマルゲン１０４Ｐ、
２．４％ ノニデットＰ−４０、１０Ｕ/ｍｌ パーオキ
シダーゼ，３．０ｍＭ ４−アミノアンチピリン，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
タデセン−ｃｏ−マレイン酸）、０．７５Ｕ/ｍｌ Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコレステロールエス
テラーゼ、３．０Ｕ/ｍｌ微生物由来のコレステロール
オキシダーゼ、２００Ｕ/ｍｌ カタラーゼ、１ｍＭ Ｔ
ＯＯＳ、５Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．０４Ｍ ＮａＮ3、０．２％ エマルゲン１０４Ｐ、
２．４％ ノニデットＰ−４０、１０Ｕ/ｍｌ パーオキ
シダーゼ，３．０ｍＭ ４−アミノアンチピリン，１５
０ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８８】（実施例１５） １）試薬１ ０．２％ ＣＨＡＰＳ、３Ｕ/ｍｌ アスコルビン酸オキ
シダーゼ、５Ｕ/ｍｌパーオキシダーゼ、２ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ ＣＨＡＰＳ、０．０３５％ ポリ（１−オクタ
デセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、２Ｕ/ｍｌ微生物由来のコ
レステロールオキシダーゼ、１ｍＭ ＴＯＯＳ，１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
シダーゼ、５Ｕ/ｍｌパーオキシダーゼ、２ｍＭ ４−ア
ミノアンチピリン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ Ｍ
ＯＰＳ ｐＨ７ ２）試薬２ ０．２％ ＣＨＡＰＳ、０．０３５％ ポリ（１−オクタ
デセン−ｃｏ−マレイン酸）、２Ｕ/ｍｌ膵臓由来のコ
レステロールエステラーゼ、２Ｕ/ｍｌ微生物由来のコ
レステロールオキシダーゼ、１ｍＭ ＴＯＯＳ，１５０
ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７
【００８９】実施例９〜１５の測定項目、供試検体量、
試薬添加量を表５にまとめて示す。表中のＨＤＬ＋ＬＤ
Ｌ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃは、それぞれ、ＨＤＬコレ
ステロールおよびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレス
テロール、ＬＤＬコレステロールを意味する。
試薬添加量を表５にまとめて示す。表中のＨＤＬ＋ＬＤ
Ｌ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃは、それぞれ、ＨＤＬコレ
ステロールおよびＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレス
テロール、ＬＤＬコレステロールを意味する。
【００９０】
【表５】
【００９１】対照法として、実施例３と同様に反応液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で同一血清試料のＨＤ
ＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールを定量し
た。結果を図１ないし８に示す。
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で同一血清試料のＨＤ
ＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールを定量し
た。結果を図１ないし８に示す。
【００９２】本発明によるＨＤＬコレステロールおよび
ＬＤＬコレステロール量は、反応液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によるＨＤＬコレステロールおよびＬＤ
Ｌコレステロール量とよい相関関係を示した。
ＬＤＬコレステロール量は、反応液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）によるＨＤＬコレステロールおよびＬＤ
Ｌコレステロール量とよい相関関係を示した。
【００９３】
【図１】本発明実施例９のＬＤＬコレステロールの測定
値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図２】本発明実施例９のＨＤＬコレステロールの測定
値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図３】本発明実施例１０のＬＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図４】本発明実施例１１のＬＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図５】本発明実施例１２のＬＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図６】本発明実施例１３のＬＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図７】本発明実施例１４のＬＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
【図８】本発明実施例１５のＨＤＬコレステロールの測
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
定値とＨＰＬＣ値との相関関係を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/28 Ｃ１２Ｑ 1/28 1/32 1/32 1/46 1/46 1/60 1/60 (72)発明者 佐藤 元 神奈川県川崎市川崎区扇町５番１号 昭和 電工株式会社総合研究所川崎研究室内 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 BB29 CA25 DA62 DA63 DA64 DA69 FA29 FB01 GC10 4B050 CC08 DD02 KK20 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ76 QR02 QR03 QR04 QR12 QR52 QS12 QX01
Claims (12)
- 【請求項１】 リポ蛋白質を含む試料に酵素を作用さ
せ、酵素反応で消費されるあるいは生成される化合物を
定量するリポ蛋白質コレステロールの測定方法におい
て、（１）式（ａ） 【化１】 および式（ｂ） 【化２】 の繰り返し単位[式中、Ｒ1は炭素数４〜３０のアルキル
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ 3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物の共
存下において、リポ蛋白質を含有する試料に酵素と第１
界面活性剤を加えることにより、ＨＤＬコレステロール
のみ選択的に酵素反応させるかまたはＬＤＬコレステロ
ール以外のコレステロールを選択的に酵素反応させる第
１工程、次いで（２）第２界面活性剤を加えることによ
り、ＬＤＬコレステロールのみ選択的に酵素反応させる
第２工程、（３）（１）の工程、あるいは（１）および
（２）の工程において、酵素との反応により消費される
化合物または生成される化合物を測定することにより、
ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロ
ールを定量することを含むリポ蛋白質コレステロールの
測定方法。 - 【請求項２】 前記高分子化合物の分子量が５，０００
〜５００，０００ダルトンである請求項１に記載のリポ
蛋白質コレステロールの測定方法。 - 【請求項３】 前記高分子化合物の濃度が０.００１〜
１％の範囲である請求項１または２に記載のリポ蛋白質
コレステロールの測定方法。 - 【請求項４】 前記高分子化合物が、炭素数６〜３２の
１−オレフィンとマレイン酸、アクリル酸またはメタク
リル酸の共重合体、およびそれらの酸アミドからなる群
より選ばれる１種以上の化合物である請求項１ないし３
のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。 - 【請求項５】 ｐＨが５〜９の範囲でコレステロールと
コレステロール測定用酵素を反応させる請求項１ないし
４のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定
方法。 - 【請求項６】 第１界面活性剤が、胆汁酸誘導体および
／または両性界面活性剤である請求項１ないし５のいず
れかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法。 - 【請求項７】 第２界面活性剤を前記高分子と第１界面
活性剤の共存下において用いることにより、第１界面活
性剤により抑制されていたＬＤＬコレステロールの酵素
反応を選択的に酵素反応可能にすることを特徴とする請
求項１ないし６のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステ
ロールの測定方法。 - 【請求項８】 第２界面活性剤が、ポリオキシエチレン
鎖を有するノニオン性界面活性剤の少なくとも１種であ
る請求項１ないし７のいずれかに記載のリポ蛋白質コレ
ステロールの測定方法。 - 【請求項９】 第２界面活性剤のＨＬＢが、８．５以上
１２．６未満である請求項８に記載のリポ蛋白質コレス
テロールの測定方法。 - 【請求項１０】 酵素として、コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼを用いる請求項１ないし９のいずれ
かに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法。 - 【請求項１１】 コレステロール測定用酵素、式（ａ） 【化３】 および式（ｂ） 【化４】 の繰り返し単位[式中、Ｒ1は炭素数４〜３０のアルキル
基、Ｒ2およびＲ3は独立に水素原子あるいはメチル基で
あり、Ｘは水素原子またはＣＯＯＨであり、ＹはＣＯＯ
Ｈ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ(ＯＨ)2を有する基またはそれらから
誘導される基である。]を有し、（ａ）：（ｂ）の質量
比が１：９９〜９９：１の範囲にある高分子化合物、第
１界面活性剤および第２界面活性剤からなり、請求項１
ないし１０のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロー
ルの測定方法を用いることを特徴とするリポ蛋白質コレ
ステロールの測定試薬。 - 【請求項１２】 ＨＤＬコレステロールおよび／または
ＬＤＬコレステロールを定量することを特徴とする請求
項１１に記載のリポ蛋白質コレステロールの測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30732999A JP2001124780A (ja) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | リポ蛋白質コレステロールの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30732999A JP2001124780A (ja) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | リポ蛋白質コレステロールの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001124780A true JP2001124780A (ja) | 2001-05-11 |
Family
ID=17967838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30732999A Pending JP2001124780A (ja) | 1999-10-28 | 1999-10-28 | リポ蛋白質コレステロールの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001124780A (ja) |
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-
1999
- 1999-10-28 JP JP30732999A patent/JP2001124780A/ja active Pending
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