JP2010529463A - 差異荷電粒子移動度によるリポ蛋白質の分析 - Google Patents
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Abstract
Description
LDLC=TC−(HDLC+VLDLC)
フリードワルド法は一般的に有用であるが,場合によっては正確性が限定される。例えば,3段階のいずれかにおいて誤差が生じうる。これは,部分的には,この方法が各段階において異なる手順を用いることを必要とするためである。さらに,フリードワルド法は,VLDLC濃度が血漿トリグリセリドの濃度の5分の1であると仮定するため,ある程度間接的である。したがって,ある患者のVLDLがこの比率から外れている場合,さらなる誤差が生ずる。
0.86xゲル直径=IM 直径
により概算される。
粒子直径は次式から得られる:
したがって,dについて解くと,以下の関係が得られる:
血清サンプル(25uL)を,低密度塩溶液(1.151g/mL)(すなわち,“低密度塩サンプル”)またはD2O(各200uL)のいずれかを用いて加工処理した。サンプルを,223,000xGで3.7時間(低密度塩サンプル),または2時間(D2O)遠心分離した。遠心分離後に最上部100uLを取り出して,低密度塩サンプルを酢酸アンモニウム溶液に対して透析し,1:200に希釈した後,差異荷電粒子移動度分析を行った。D2Oサンプルは,遠心分離の直後に酢酸アンモニウムで1:200に希釈した後,差異荷電粒子移動度分析を行った。差異荷電粒子移動度分析の結果を図2に示す。
D2Oを用いる手順の間にHDL(ApoA1)が優先的に減少するか否かを評価するため,図3に示す3つのサンプル(すなわち,749,1043,14:任意の固有の患者識別番号)について,D2Oをアルブミンを除去するためのRGD/DS溶液(それぞれ7.5/2.5mg/mL)とともに用いて,リポ蛋白質を単離した。サンプルはそれぞれ6重に用意した。単離したそれぞれの最上部100uLを,ApoA1(HDL),ApoB(LDL,IDL,VLDL)および総コレステロール(TC)についてそれぞれ分析した。血漿または血清アポリポ蛋白質AIおよびBは,標準化ELISAにより,市販のモノクローナル捕捉抗体(Biodesign International,Saco,MN)および精製しビオチン化した抗ヒトヤギポリクローナル検出抗体(International Immunology Corp.,Murrieta,CA)を用いる非競合的サンドウィッチイムノアッセイで測定した。濃度は,ストレプトアビジンコンジュゲート化ペルオキシダーゼを加え,オルトフェニリンジアミンを用いて発色させることにより測定した。リポ蛋白質較正器は,CDC#1883血清参照材料(Center for Disease Control,Atlanta,GA)およびプールした参照血清(Northwest Lipid Research Clinic,Seattle,WA)を用いて標準化した。総コレステロールは,市販のアッセイキット試薬(Bayer Health Care,Tarrytown,NY)を用いて,製造元の指針にしたがって,マイクロタイタープレートのウエルあたり25μlの血清または血漿プラス200μlのコレステロール試薬の分析用に改変して測定した。発色後,標準,対照,サンプルおよび試薬バックグラウンドをマイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。結果(図3)は,各血清中に存在する総量と比較した各サンプルの平均回収率を示す。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが,ApoA1とApoBの回収が同等であったことからみて,精製手順によってHDLは優先的に減少しなかった。
血清サンプルを,種々の量のRGD(10,15,20,25mg/mL)と混合し,氷上で15分間インキュベーションした後,D2Oのクッションの上に重層した。223,000xGで120分間遠心分離した後,最上部の100μLを取り出し,酢酸アンモニウム溶液で1:200に希釈した。次に,サンプルを差異荷電粒子移動度分析により分析した。結果を図4に示す。
図5を参照すると,抽出/精製物および希釈物の両方において,アルブミンの除去およびリポ蛋白質の回収に及ぼすDSの影響を評価するために,血清サンプル(5uL)を,20μLの7.5mg/mL RGD単独(図5中“C/D”)または20μLの7.5mg/mL RGDと2.5mg/mL DSとの組み合わせ(図5中“A/B”)で抽出した。抽出および希釈の両方について,用いたDSの分子量は10Kである。氷上で15分間インキュベーションした後,各サンプルを223,000xG,10℃で,2時間15分間遠心分離した。最上部の100μLを取り出し,25mM酢酸アンモニウム溶液(図5中“B/D”)または5ug/mL DS(図5中“A/C”)を含む25mM酢酸アンモニウムのいずれかで1:200に希釈した。
図6を参照すると,当該技術分野においてよく知られる方法を用いて,18時間の密度分離により調製したリポ蛋白質含有血清サンプルを透析後に用いて,希釈剤中のDSがLDLの回収に及ぼす効果を評価した。遠心分離した血清サンプルのアリコートを25mM酢酸アンモニウムでDSなしで1:200に希釈し,差異荷電粒子移動度分析を行った。別のアリコートを25mM酢酸アンモニウムで5μg/mLのDSの存在下で1:200に希釈した。各サンプルについて二重に行った試験の結果を図6に示す。
血漿から得たリポ蛋白質含有サンプルをボルテックスにより軽く混合した。5μLのサンプルまたは任意に対照を,7.5mg/mLのRGD(Sigma),2.5mg/mLのDS(Sigma)および0.5mg/mLのEDTA(Spectrum Chemicals)を含む20μLのアルブミン除去試薬と混合し,氷上で15分間インキュベーションした。インキュベーションの後,サンプル混合物をTi42.2超遠心チューブ(Beckmann)中の200μLのD2O(Medical Isotopes)の上に重層した。次にサンプルを10℃で223,000xG(42,000rpm)で135分間超遠心分離した。超遠心分離後,脂質画分(85μL)を遠心チューブの最上部から取り出した。差異荷電粒子移動度による分析の前に,HDL分析用に,サンプルを25mM酢酸アンモニウム,0.5mM水酸化アンモニウム(pH7.4)で最終希釈1:800に希釈した。LDL分析用には,サンプルを5μg/mLのDSを含む同じ希釈剤で1:200に希釈した。最終希釈物はディープウエル96ウエルプレート中に作製し,6℃に維持した冷却板付きオートサンプラーに置いた後,差異荷電粒子移動度分析を行った。
静脈穿刺により採取した全血から血清を分離した。分離後,血清を3つに分けた。1つのアリコートは,当該技術分野においてよく知られる伝統的な方法を用いて,HDL,トリグリセリド,および総コレステロールの含有量について分析した。LDLはこれらの結果から計算した。好ましい態様においては,トリグリセリドが400mg/dLより高い場合,LDLは直接測定した。第2のアリコートは,当該技術分野においてよく知られるイムノアッセイを用いて,そのLp(a)含有量について分析した。第3のアリコートについて,差異荷電粒子移動度分析を用いてリポ蛋白質を分画した。
の関数にフィットする。上述の式4は,2nmより大きい粒子直径について有効である。ある態様においては,フィットの領域は,3−6,3−4,3−5,3−6,4−6,または5−6nm(粒子直径)であり,好ましくは3−4nmである。ある態様においては,差異荷電粒子移動度データ全体を,等式4へのあてはめから得られる関数により補正する。
y’=y * ((d-lowerlimit) * 2 * dimer+(upperlimit-d) * 2) (7)
(yはアルブミン補正曲線であり,y’はアルブミンダイマーの存在の段階的抑制後のアルブミン補正曲線であり,dは粒子直径であり,lowerlimitおよびupperlimitは,それぞれ補正用のサイズの下限および上限であり,dimerは選択されたパーセントダイマー濃度である。ある態様においては,ダイマーの存在が抑制されている領域は,7.9nm(lowerlimit)と8.4nm(upperlimit)との間である。
の関数で表される。ある態様においては,kaは0.1−10,1−5,2−4または2−3の範囲である。ある態様においては,kaは2.56である。ある態様においては,この特定の領域は,0−15,5−10,6−9,7−8,好ましくは7.3−7.5nmである。ある態様においては,アルブミンモノマーの寄与を判定して等式8にベストフィットさせた後,ここから同じ寄与のスケールで等式7を減算することにより差異荷電粒子移動度粒子サイズ分布データを補正する。ある態様においては,等式7を減算することによる補正は,特定の領域,例えば,限定されないが,0−15,2−12,4−10,好ましくは6−10nm中で行う。補正が10−11nmの範囲を意図しないある態様においては,領域10−11nm中の対応する補正は,等式7を(11−直径)倍し,その結果を差異荷電粒子移動度粒子サイズ分布データから減算することにより行う。
Claims (75)
- リポ蛋白質のクラスおよびサブクラスの差異荷電粒子移動度分析に適したリポ蛋白質を精製する方法であって,
(a) サンプルの下に第1の溶液を含む遠心チューブを用意し,前記サンプルは,1またはそれ以上のリポ蛋白質および非リポ蛋白質成分を含み,前記第1の溶液は,1.00g/mLより高く約1.21g/mL以下の第1の密度を有しており;そして
(b) 前記チューブを,前記非リポ蛋白質成分が前記リポ蛋白質から離れてチューブの底に向かって移動するのに十分なように遠心分離に供する,
の各工程を含む方法。 - 前記第1の溶液は,約1.15g/mLから約1.21g/mLの範囲の密度を有する,請求項1記載の方法。
- 前記遠心チューブはさらに,1.00g/mL以上であって前記第1の密度より低い第2の密度を有する第2の溶液を含み,前記第2の溶液は遠心分離の前に前記サンプルの上部に隣接して位置する,請求項1記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質は,HDL,LDL,IDL,Lp(a)およびVLDLからなる群より選択される,請求項1記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質はHDLである,請求項4記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質および非リポ蛋白質成分は血漿サンプルに由来するものである,請求項1記載の方法。
- 前記遠心分離は平衡に到達しない,請求項1または3に記載の方法。
- さらに,
(c) 遠心分離後に,前記精製したリポ蛋白質を前記遠心チューブの最上部から回収する,
の工程を含む,請求項1または3に記載の方法。 - 前記サンプルは,前記1またはそれ以上のリポ蛋白質が前記サンプルから沈殿しない条件下で硫酸デキストランをさらに含む,請求項1または3に記載の方法。
- 前記サンプルはさらに,アルブミンと結合してアルブミン−アルブミン結合化合物複合体を形成しうるアルブミン結合化合物を含み,前記遠心分離により前記アルブミン−アルブミン結合化合物複合体は前記精製したリポ蛋白質から分離される,請求項1記載の方法。
- 前記アルブミン結合化合物は,ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の類似体である,請求項10記載の方法。
- 前記NAD類似体は,Reactive Green 19およびCibacrom Blue 3GAからなる群より選択される,請求項11記載の方法。
- 前記NAD類似体は,常磁性体粒子,デキストラン,アガロースおよびSephadex(登録商標)からなる群より選択されるクロマトグラフィー媒体とコンジュゲートされている,請求項11記載の方法。
- 前記サンプルはさらに,非リポ蛋白質と結合して非リポ蛋白質/非リポ蛋白質捕捉リガンド複合体を形成しうる非リポ蛋白質捕捉リガンドを含み,前記遠心分離により前記非リポ蛋白質/非リポ蛋白質捕捉リガンド複合体は前記リポ蛋白質成分から分離される,請求項1記載の方法。
- 前記非リポ蛋白質捕捉リガンドは,アプタマーおよび抗体からなる群より選択される,請求項14記載の方法。
- 遠心分離の前に,
(i) 前記サンプルを,Lp(a)が沈殿するのに十分な条件下でApoB含有リポ蛋白質用の沈殿剤と混合することによりLp(a)の沈殿物を形成し;そして
(ii) 前記Lp(a)含有沈殿物を前記サンプルから単離する,
ことにより,Lp(a)を前記サンプルから除去する,請求項1または3に記載の方法。 - (i) 前記回収されたリポ蛋白質を,Lp(a)が沈殿するのに十分な条件下で,ApoB含有リポ蛋白質用の沈殿剤と混合することにより,Lp(a)を含む沈殿物を形成し;そして
(ii) 回収したリポ蛋白質から前記Lp(a)含有沈殿物を単離する,
ことにより,前記回収されたリポ蛋白質からLp(a)を除去する,請求項8記載の方法。 - 前記ApoB含有リポ蛋白質用の沈殿剤は,硫酸デキストランおよび二価カチオンを含む,請求項16または17に記載の方法。
- 前記二価カチオンはMg2+である,請求項18記載の方法。
- 精製したLp(a)を得る方法であって,
(1) 請求項16または17のいずれかにしたがって得られた前記Lp(a)含有沈殿物を可溶化し;
(2) 前記可溶化したLp(a)を,Lp(a)−レクチン複合体が形成されるのに適した条件下で,固体支持体に結合したレクチンを含む固体支持体試薬と混合し;
(3) 前記Lp(a)−レクチン複合体を単離し;そして
(4) 前記Lp(a)を前記Lp(a)−レクチン複合体から放出させ,このことにより差異荷電粒子移動度分析に適した精製したリポ蛋白質を提供する,
の各工程を含む方法。 - 前記レクチンは,小麦胚芽アグルチニン(WGA),ライマメアグルチニン(LGA),フィトヘマグルチニン(PHA),およびカブトガニレクチン(HCL)からなる群より選択される,請求項20記載の方法。
- 前記レクチンはWGAである,請求項21記載の方法。
- 前記固体支持体はアガロースを含む,請求項21記載の方法。
- 前記放出は,前記Lp(a)−レクチン複合体をWGAについての競合リガンドで洗浄することを含む,請求項21記載の方法。
- 前記競合リガンドはN−アセチルグルコサミン(NAG)である,請求項24記載の方法。
- 前記放出は,前記Lp(a)−レクチン複合体のジスルフィド還元を含む,請求項21記載の方法。
- 精製したLp(a)を得る方法であって,
(1) 請求項16または17のいずれかにしたがって得られた前記Lp(a)含有沈殿物を可溶化し;
(2) 前記可溶化したLp(a)をガンマグロブリンおよびプロリンと混合して混合物を形成し;
(3) 沈殿剤を加えることにより前記混合物を沈殿させ;そして
(4) 前記沈殿物からLp(a)を回収し,このことにより差異荷電粒子移動度分析に適した精製リポ蛋白質を得る,
の各工程を含む方法。 - 前記沈殿剤は硫酸アンモニウムである,請求項27記載の方法。
- 前記第1の溶液は水性であり,重水を含む,請求項1記載の方法。
- 前記水性溶液は実質的に重水である,請求項29記載の方法。
- 前記第1の溶液は,不活性遠心分離マトリクスと接触している,請求項1記載の方法。
- 前記不活性遠心分離マトリクスは,ゲルスラリーまたは不活性ビーズを含む,請求項31記載の方法。
- 前記ゲルスラリーは,Sephadex(登録商標)ゲルマトリクスを含む,請求項32記載の方法。
- 前記不活性遠心分離マトリクスは不活性ビーズを含む,請求項32記載の方法。
- リポ蛋白質を精製する方法であって,
(a) サンプルおよび前記サンプルの下に隣接して位置する第1の溶液を含む遠心チューブを用意し,前記サンプルは,1またはそれ以上のリポ蛋白質および非リポ蛋白質成分を含み,
ここで,前記サンプルはさらに,Reactive Greenデキストランおよび硫酸デキストランを含み,かつ,前記第1の溶液は重水を含み;そして
(b) 前記チューブを,前記非リポ蛋白質成分が前記リポ蛋白質から離れてチューブの底に向かって移動するのに十分なように遠心分離に供する,
の各工程を含む方法。 - 前記第1の溶液は,1.00g/mLから約1.21g/mLの密度を有する,請求項35記載の方法。
- 前記第1の溶液は,1.00g/mLから約1.10g/mLの密度を有する,請求項35記載の方法。
- 差異荷電粒子移動度分析用にリポ蛋白質を精製する方法であって,前記方法は遠心分離を含まず,前記方法は,
(a) リポ蛋白質および非リポ蛋白質を含む溶液を1またはそれ以上のポリアニオン化合物および1またはそれ以上の二価カチオンと混合し;
(b) 前記混合溶液中でリポ蛋白質を含む沈殿物を形成させ;そして
(c) 工程(b)の後に,沈殿したリポ蛋白質を回収し,これを差異荷電粒子移動度分析に供する,
の各工程を含む方法。 - 前記ポリアニオン化合物は,硫酸デキストラン,アミロペクチン,およびポリビニル硫酸からなる群より選択され,前記二価カチオンはMg2+およびCa2+からなる群より選択される,請求項38記載の方法。
- リポ蛋白質のサイズ分布を分析する方法であって,
(i)請求項1,35,または38のいずれかに記載の方法にしたがって1またはそれ以上のリポ蛋白質を用意し;そして
(ii)前記1またはそれ以上のリポ蛋白質を差異荷電粒子移動度分析に供し,このことにより前記リポ蛋白質のサイズ分布を決定する,
の各工程を含む方法。 - 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質は,個体から得た血漿サンプルに由来する,請求項40記載の方法。
- 前記1またはそれ以上のリポ蛋白質は,HDL,LDL,Lp(a),IDLおよびVLDLからなる群より選択される,請求項40記載の方法。
- (iii) 前記決定されたリポ蛋白質サイズ分布を用いて前記個体の評価を行い,前記評価は,脂質に関連する健康上のリスク,心臓血管疾患,心臓血管疾患のリスク,および治療的介入に対する応答性からなる群より選択される,
の工程をさらに含む,請求項41記載の方法。 - 差異荷電粒子移動度分析用にリポ蛋白質を精製する方法であって,前記方法は遠心分離を含まず,前記方法は,
(a) リポ蛋白質および非リポ蛋白質を含む溶液を,リポ蛋白質と結合してリポ蛋白質/リポ蛋白質捕捉リガンド複合体を形成しうる1またはそれ以上のリポ蛋白質捕捉リガンドと混合し;
(b) 前記リポ蛋白質/リポ蛋白質捕捉リガンド複合体を単離し;そして
(c) 前記リポ蛋白質を前記リポ蛋白質/リポ蛋白質捕捉リガンド複合体から放出させ,前記リポ蛋白質を差異荷電粒子移動度分析に供する,
の各工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記リポ蛋白質は,HDL,LDL,Lp(a),IDLおよびVLDLからなる群より選択される,請求項44記載の方法。
- 前記リポ蛋白質捕捉リガンドは,アプタマーおよび抗体からなる群より選択される,請求項44記載の方法。
- 前記リポ蛋白質捕捉リガンドは抗体である,請求項44記載の方法。
- 工程(ii)は,
(1) 粒子サイズの1またはそれ以上の領域における粒子サイズ分布を決定し;
(2) 非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布に対する寄与を減算して,リポ蛋白質粒子サイズ分布を求め;そして
(3) リポ蛋白質粒子サイズ分布を,ディスプレイ,プリンタ,またはメモリに出力する,
ことを含む,請求項40記載の方法。 - 前記粒子サイズ分布の決定は,前記1またはそれ以上の領域についてベストフィットを決定することを含む,請求項48記載の方法。
- ベストフィットは次式:
で表され,前記ベストフィットの決定はk1の値を計算することを含む,請求項49記載の方法。 - 前記減算は,前記非リポ蛋白質試薬または前記非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布を示す理論的曲線を適用することを含む,請求項48記載の方法。
- 前記非リポ蛋白質試薬は,デキストラン(RGD)とコンジュゲート化したReactive Green 19である,請求項48記載の方法。
- 前記非リポ蛋白質サンプル材料はアルブミンである,請求項48記載の方法。
- リポ蛋白質のサイズ分布を分析する方法であって,
(a) 差異荷電粒子移動度分析に供される1またはそれ以上のリポ蛋白質について,粒子サイズの1またはそれ以上の領域における差異移動度粒子サイズ分布を決定し;
(b) 非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布への寄与を減算して,リポ蛋白質粒子サイズ分布を求め;そして
(c) リポ蛋白質粒子サイズ分布を,ディスプレイ,プリンタまたはメモリに出力する,
の各工程を含む方法。 - 前記粒子サイズ分布の決定は,前記1またはそれ以上の領域についてのベストフィットを決定することを含む,請求項54記載の方法。
- ベストフィットは次式:
で表され;
前記ベストフィットの決定はk1の値を計算することを含む,請求項55記載の方法。 - 前記減算は,非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布を表す理論的曲線を適用することを含む,請求項54記載の方法。
- 前記非リポ蛋白質試薬は,デキストラン(RGD)とコンジュゲート化したReactive Green 19である,請求項54記載の方法。
- 前記非リポ蛋白質サンプル物質はアルブミンである,請求項54記載の方法。
- コンピュータコードを記憶したコンピュータ読み取り可能な媒体であって,前記コンピュータコードは,
(a) 差異荷電粒子移動度分析に供される1またはそれ以上のリポ蛋白質について,粒子サイズの1またはそれ以上の領域における差異移動度粒子サイズ分布を決定し;
(b) 非リポ蛋白質試薬または非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布に対する寄与を減算して,リポ蛋白質粒子サイズ分布を求め;そして
(c) リポ蛋白質サイズ分布を,ディスプレイ,プリンタまたはメモリに出力する,
ことによりリポ蛋白質のサイズ分布を分析するためのものである,コンピュータ読み取り可能な媒体。 - コンピュータのコードは,さらに,前記1またはそれ以上の領域についてのベストフィットを決定することにより粒子サイズ分布を決定することを含む,請求項60記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
- ベストフィットは以下の式:
で表され,ここで,前記ベストフィットの決定はk1の値を計算することを含む,請求項61記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。 - 前記減算は,前記非リポ蛋白質試薬または前記非リポ蛋白質サンプル材料の粒子サイズ分布を表す理論的曲線を適用することを含む,請求項60記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
- 前記非リポ蛋白質試薬は,デキストラン(RGD)とコンジュゲート化したReactive Green 19である,請求項60記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
- 前記非リポ蛋白質サンプル材料はアルブミンである,請求項60記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
- 差異荷電粒子移動度分析用の装置であって,
(a) サンプルをキャピラリーを通して運搬する1またはそれ以上のポンプ;
(b) サンプルがキャピラリー内を流れるときに前記サンプルの粒子に荷電するイオン化装置;および
(c) 前記サンプルについて荷電粒子の差異荷電粒子移動度分析を行うイオン移動度分析装置,
を含む装置。 - さらに,差異荷電粒子移動度分析用のサンプルを前記1またはそれ以上のポンプに提供するオートサンプラーを含む,請求項66記載の装置。
- 前記サンプルはリポ蛋白質を含む,請求項66記載の装置。
- 前記1またはそれ以上のポンプは,サンプルをナノフローポンプに提供する高フローポンプを含み,前記ナノフローポンプはサンプルをキャピラリーに提供する,請求項66記載の装置。
- 高フローポンプはサンプルを1分間に約15−25マイクロリットルの速度で送出し,およびナノフローポンプはサンプルを1分間に約100−200ナノリットルの速度で送出する,請求項69記載の装置。
- 前記イオン化装置は,キャピラリーの一部の周りに導電ユニオンを含む,請求項66記載の装置。
- 前記導電ユニオンは,ここを通るサンプルに電荷を与え,このことによりサンプルの粒子を荷電する,請求項71記載の装置。
- 前記導電ユニオンは,キャピラリーの一部にマイクロタイト領域を形成し,ここを通るサンプルに電荷を与え,このことによりサンプルの粒子を荷電する,請求項71記載の装置。
- 前記マイクロタイト領域は,約5−50ナノリットルのデッドボリュームを有する,請求項73記載の装置。
- 前記マイクロタイト領域は,約10−15ナノリットルのデッドボリュームを有する,請求項74記載の装置。
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