CN105974125A - 一种心脑血管疾病特异性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种心脑血管疾病特异性检测试剂盒，所述的试剂盒中的适配子能够高效的特异性的结合ApoBl00。该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以ApoBl00为靶目标，从随机文库中筛选出了能与ApoBl00特异性结合的适配子。通过适配子特异性的结合ApoBl00，从而定量血清中ApoBl00的含量，从而能够快速高效的初步筛选心脑血管疾病。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种心脑血管疾病特异性检测试剂盒。
背景技术
心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”即“四高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人！每年死于心脑血管疾病近300万人，占我国每年总死亡病因的51％。而幸存下来的患者75％不同程度丧失劳动能力，心脑血管疾病已成为人类死亡的重要杀手！
载脂蛋白B(Apolipoprotein B,Apo B)是血浆；脂蛋白中蛋白质的一种，根据氨基酸组成和分布分为Β100、Β48、Β74、Β26和Β50五种亚型。载脂蛋白B100(Apo B100)是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、中密度脂蛋白(Intermediateddensitylipoprotein,IDL)和极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein,VLDL)颗粒上主要的载脂蛋白，由肝脏合成，含有4563个氨基酸残基，分子量约为510KDa。
ApoB作为动脉硬化、冠心病等的危险因子，其与动脉粥样硬化型心血管疾病之间有着密切关系，其功能之一是携带胆固醇，因此ApoB在血液中的含量可作为胆固醇等脂类的指标。患有急性心肌梗死、心脑疾病患者、动脉硬化症、高脂血症、糖尿病、慢性肾功能不全等疾病ApoB含量出现增高。
Apo Biqq与载脂蛋白Al(Apolipoprotein Al)的比值(Apo B/A1)在临床上是心脑血管疾病检测的重要指标，与心肌梗塞、缺血性中风有紧密的联系，是微蛋白尿、糖尿病和新陈代谢综合症的独立风险因子。所以Apo B.水平的检测对疾病的早期预测有一定的意义。
目前在临床实验室检测Apo B100的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。
SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合Apo B100的适配体具有较为重要的意义。
发明内容
本发明的技术方案通过以下步骤实现：
本发明的目的是提供一种Apo B100的核酸适配体序列。
本发明中，所述的Apo B100的核酸适配体(序列1-21)能够特异结合Apo B100。
本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合Apo B100的试剂盒。
从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5'-TTGGACATGAACCAACGTTA-N35-CGACCATGACAACGGCTGAA-3')，其中N35为35个随机寡核苷酸；从中筛选出与APO B100特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：TTGGACATGAACCAACGTTA；引物P2：TTCAGCCGTTGTCATGGTCG，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。
本发明采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以APO B100为正筛靶标筛选与APO B100特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合APO B100的序列，本发明中命名为适配体APO B100-1～21。序列如下：
ApoBl00-1：
TTGGACATGAACCAACGTTAACTACTTACTAACCCCCTCTTAAATTTATCACACTCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-2：
TTGGACATGAACCAACGTTAAAAAACCCAACACCTCCTCTCCCTCCTAAATACAACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-3：
TTGGACATGAACCAACGTTATCTTACATAAATAACAAATCCTCCCACACACCCACCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-4：
TTGGACATGAACCAACGTTACTACTACCCTCTCCTTTACTCCTCATAAATCCAATCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-5：
TTGGACATGAACCAACGTTATCCCTACTCAATTAATACTAATACCATAATACTTCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-6：
TTGGACATGAACCAACGTTATTCTTCCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCTATACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-7：
TTGGACATGAACCAACGTTAACACTAAACATCTTACACTCTCTTTTAACCTCATCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-8：
TTGGACATGAACCAACGTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACTACCTCTACAACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-9：
TTGGACATGAACCAACGTTATACTAATACATTTTACTCCAATATTCATAATACCACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-10：
TTGGACATGAACCAACGTTATAAAATATTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-11：
TTGGACATGAACCAACGTTATTTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-12：
TTGGACATGAACCAACGTTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCATTCTTAATCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-13：
TTGGACATGAACCAACGTTAATCACTACCATTAACTCTAACACTTTCCCCCCCTCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-14：
TTGGACATGAACCAACGTTAATACTTTAATTTAACTCCACTACTCACTCAATCTTCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-15：
TTGGACATGAACCAACGTTATCCCCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTTTATCCCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-16：
TTGGACATGAACCAACGTTAAATCTCATACCATTATCAATCCCATACCATCCATACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-17：
TTGGACATGAACCAACGTTACTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACAATCATCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-18：
TTGGACATGAACCAACGTTATTCTATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-19：
TTGGACATGAACCAACGTTATCTTCTATCATTTAACCTTTCCTCCCAACACACCACGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-20：
TTGGACATGAACCAACGTTATCATCTACTCTTCTCTCCAACTTCTACATAAAAACCGACCATGACAACGGCTGAA
ApoBl00-21：
TTGGACATGAACCAACGTTAAATTCACCTAAACTTTCTTCCTCCATACCTATACCCGACCATGACAACGGCTGAA
本发明的适配子可以用于构建试剂盒，该试剂盒可以用于特异性的分离和定量检测APO B100，具有分离效果快，效率高，节省时间，节约成本的功效。具有极强的应用价值。
本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合APO B100的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为特异性检测APO B100的试剂盒。
具体实施方式
实施例1:核酸适配体筛选
从体外合成的随机寡聚DNA文库，5'-TTGGACATGAACCAACGTTA-N35-CGACCATGACAACGGCTGAA-3'。
所用引物:
F：5，-TTGGACATGAACCAACGTTA-3
R：5，-TTCAGCCGTTGTCATGGTCG-3
(l)APO B100蛋白溶于200μl PBS后加入96孔ELISA板中，4℃过夜。
(2)蛋白包被孔用PBS洗涤6次后，加入200μl 3％BSA(购自上海生工)，孵育2小时。同时，空白96孔ELISA板中加入200μl 3％BSA 37℃孵育2小时。
(3)将随机ssDNA文库(首轮用量为800pmol)溶于200μl 1*SHCMK，95℃变性5min。立即置于冰上10min，使其迅速降至室温，避免ssDNA复性成双链。
(4)将ssDNA加入PBS洗涤6次的空白ELISA孔中，37℃孵育2小时。
(5)上清转入PBS洗涤6次的蛋白包被孔中，37℃孵育2小时后PBS洗涤6次。
(6)结合了ssDNA的酶标孔用200ill洗脱缓冲液重悬，95℃加热5min，取上清，经过乙醇沉淀DNA，溶于Millipore水中，作为下一轮筛选的模板。
(8)取5μl PCR产物上样于5wt％琼脂糖(购自上海生工)，观察条带位置是否正确。从首轮之后，投入的ssDNA次级库的量逐渐减少，如此反复进行14个循环。
第14轮筛选产物的扩增和纯化：将第14轮筛选得到的ssDNA序列，用引物P1，引物P2进行扩增。100μl PCR扩增后体系加入500pl结合液BB(20mmol/L Hepes(pH7.35)，120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，lmmol/LCaC12，lmmol/LMgC12，l％BSA)，充分混匀。将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置lmin，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液。加入700pmol漂洗WB(结合液BB+0.05％Tween20)，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500pmol漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min。取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20pmol 65℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,OOOrpm离心1min。将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心1min。
PCR纯化产物的克隆：取1μl扩增产物，与载体PGM-T在T4DNA连接酶的作用下连接，再将其转化到感受态细胞，取适当体积均匀涂布于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它们分别购自于上海生工)的LA平板，倒置培养皿，于37℃培养12-16小时进行"蓝-白斑筛选"。测序：用接种环挑取筛选平板上的单个白色菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃培养过夜。取菌液lml于离心管中，封膜后送上海生工测序。
测序结果发现其中有21个核酸适配体序列与APO B100具有非常强的亲和性，该21个序列分别是：SEQ ID NO：1-21所示。
实施例2特异性高亲和力的APO B100结合适配子的性能测定
将RNA适配子分别取1.5μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化1h，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的APO B100蛋白37℃孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与APO B100蛋白的解离常数。结果如下：
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
从以上结果可以看出，本发明的21个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没有所述结合特性的适配子能够结合APO B100蛋白。
实施例4降解活性分析
分别采用人血白蛋白，APO B48、APO B74、APO B26和APO B50与21条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与APO B100蛋白结合保持较高的特异性。
将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
实施例5临床试验分析
取105组临床血清样本，患有心脑疾病的患者100例作为实验样本，5例为正常人。
将21个适配子分别与标准品APO B100蛋白通过免疫磁珠分离的方式构建标准品检测的标准曲线。然后将105组临床血清样本分别去10μl加入到无菌离心管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的21组适配子与105组的血清溶液混合孵育20分钟(一种适配子对应检测5组血清样本)，而后磁分离，即可获得相应的分离的APO B100蛋白，通过标准曲线浓度检测发现，其检测的浓度与实际相符，比采用“双抗夹心法”检测试剂盒检测的浓度还要精确，由此可见，可以实现100％的定量检测效果。具有极高的准确性。其中，100组心脑疾病患者的APO B100蛋白浓度明显高于对照的5组50％-200％，具有极大的差异显著性，说明可以用于检测分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉杜护侠
〈120〉一种心脑血管疾病特异性检测试剂盒
〈210〉1
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-1
TTGGACATGAACCAACGTTAACTACTTACTAACCCCCTCTTAAATTTATCACACTCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉2
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-2
TTGGACATGAACCAACGTTAAAAAACCCAACACCTCCTCTCCCTCCTAAATACAACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉3
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-3
TTGGACATGAACCAACGTTATCTTACATAAATAACAAATCCTCCCACACACCCACCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉4
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-4
TTGGACATGAACCAACGTTACTACTACCCTCTCCTTTACTCCTCATAAATCCAATCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉5
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-5
TTGGACATGAACCAACGTTATCCCTACTCAATTAATACTAATACCATAATACTTCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉6
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-6
TTGGACATGAACCAACGTTATTCTTCCAACCTTACCTTCCAAACATCCCCCTATACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉7
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-7
TTGGACATGAACCAACGTTAACACTAAACATCTTACACTCTCTTTTAACCTCATCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉8
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-8
TTGGACATGAACCAACGTTATACCTCTTAAACAATCCTATATACTACCTCTACAACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉9
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-9
TTGGACATGAACCAACGTTATACTAATACATTTTACTCCAATATTCATAATACCACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉10
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-10
TTGGACATGAACCAACGTTATAAAATATTTCAATCTCTCTCTATATCATTCCTCCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉11
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-11
TTGGACATGAACCAACGTTATTTATTACCCTTCAATCACAACACCATTATACTATCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉12
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-12
TTGGACATGAACCAACGTTAATCTTTCCCAACCTCAATTCCATCCATTCTTAATCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉13
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-13
TTGGACATGAACCAACGTTAATCACTACCATTAACTCTAACACTTTCCCCCCCTCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉14
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-14
TTGGACATGAACCAACGTTAATACTTTAATTTAACTCCACTACTCACTCAATCTTCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉15
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-15
TTGGACATGAACCAACGTTATCCCCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTTTATCCCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉16
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-16
TTGGACATGAACCAACGTTAAATCTCATACCATTATCAATCCCATACCATCCATACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉17
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-17
TTGGACATGAACCAACGTTACTTATCCCAATTTTCTCTTCAACATAAACAATCATCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉18
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-18
TTGGACATGAACCAACGTTATTCTATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉19
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-19
TTGGACATGAACCAACGTTATCTTCTATCATTTAACCTTTCCTCCCAACACACCACGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉20
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-20
TTGGACATGAACCAACGTTATCATCTACTCTTCTCTCCAACTTCTACATAAAAACCGACCATGACAACGGCTGAA
〈210〉21
〈211〉75
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉ApoBl00-21
TTGGACATGAACCAACGTTAAATTCACCTAAACTTTCTTCCTCCATACCTATACCCGACCATGACAACGGCTGAA
Claims (3)
1.一种心脑血管疾病特异性检测试剂盒，其特征：其包含核酸适体。
2.如权利要求1所示的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体序列如SEQ ID NO：1-21任一项所示。
3.一种检测心脑血管疾病的方法，其特征在于：使用权利要求1-2任一项所示的试剂盒。
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-
2016
- 2016-05-22 CN CN201610340463.1A patent/CN105974125A/zh active Pending
Patent Citations (4)
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