BRPI0812412B1 - processos para purificação de lipoproteínas adequadas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas da classe ou da subclasse das lipoproteínas, para obtenção de lp(a) purificado, para purificação de lipoproteínas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas, o dito processo não incluindo a centrifugação - Google Patents

Abstract

processos para purificação de lipoproteínas adequadas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas da classe ou da subclasse das lipoproteínas, para obtenção de lp(a) purificado, para purificação de lipoproteínas, para purificação de lipoproteínas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas, o dito processo não incluindo a centrifugação, e para análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas a presente invenção fornece um aparelho e processos de preparação de lipoproteínas partindo de uma amostra biológica, incluindo hdl, ldl, lp(a), idl e vldl, com a finalidade de diagnóstico utilizando processos de análise de mobilidade diferencial de partículas carregadas. são também fornecidos processos para a análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas através da mobilidade diferencial de partículas carregadas, cujas lipoproteínas são preparadas através de processos da invenção. são também fornecidos processos para a avaliação do risco de saúde relacionado a lipídeos, de estado de saúde cardiovascular, do risco de doença cardio- vascular e da capacidade de resposta a uma intervenção terapêutica, cujos processos utilizam as distribuições de tamanhos de lipoproteínas determinadas através dos processos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS PARA PURIFICAÇÃO DE LIPOPROTEÍNAS ADEQUADAS PARA A ANÁLISE DA MOBILIDADE DIFERENCIAL DE PARTÍCULAS CARREGADAS DA CLASSE OU DA SUBCLASSE DAS LIPOPROTEÍNAS, PARA OBTENÇÃO DE LP(A) PURIFICADO, PARA PURIFICAÇÃO DE LIPOPROTEÍNAS PARA A ANÁLISE DA MOBILIDADE DIFERENCIAL DE PARTÍCULAS CARREGADAS, O DITO PROCESSO NÃO INCLUINDO A CENTRIFUGAÇÃO.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se de forma geral aos campos de análise de tamanho de partículas e de análises de partículas biológicas incluindo lipoproteínas para finalidades de diagnóstico utilizando dispositivos e métodos de medida da mobilidade de íons. A presente invenção fornece ainda métodos e aparelhos para a purificação e para o isolamento de moléculas biológicas que incluem, sem limitação, lipoproteínas e complexos biológicos que contêm lipoproteínas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A descrição a seguir é fornecida somente para auxiliar o entendimento da presente invenção. Nenhuma das referências citadas ou informação fornecida é admitida como sendo a técnica anterior da presente invenção.

A doença cardiovascular é a causa principal de morte nos Estados Unidos. Os métodos mais comumente utilizados e aceitos para a determinação do rico de doença cardíaca futura incluem a determinação dos níveis no soro de colesterol e lipoproteínas, em adição à faixa demográfica e à saúde atual do paciente. Há recomendações bem estabelecidas em relação à faixa de valores limites para marcadores bioquímicos, incluindo, por exemplo, sem limitação, níveis de colesterol e de lipoproteínas, para a determinação de risco. Entretanto, as medidas de colesterol e lipoproteínas não são claramente a estória completa porque até 50% das pessoas que estão em risco de doença cardíaca prematura não estão atualmente incluídos nas normas de procedimentos ΑΤΡ III (isto é, normas de procedimentos de Adult Treatment Panei III (Lista de Tratamento de Adultos III) publicada pelo National Colesterol Education Program e pelo National Heart, Lung and Blood Institute).

Os métodos para medir lipoproteínas e outros lipídeos no sangue incluem, por exemplo, sem limitação, a avaliação de colesterol total em

Petição 870180132983, de 21/09/2018, pág. 12/18 jejum, triglicerídeo, concentrações de colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade) e/ou LDL (lipoproteína de baixa densidade). Atualmente, o método mais amplamente utilizado para medir o colesterol LDL é o método indireto de Friedewald (Friedewald e outros, Clin. Chem., 1972, 18:499-502). O ' 5 método de ensaio de Friedewald requer três etapas: 1) determinação de triglicerídeo no plasma (TG) e colesterol total (TC), 2) precipitação de VLDL (lipoproteína de densidade muito baixa) e LDL (lipoproteína de baixa densidade) e 3) quantificação de colesterol HDL (HDLC). Utilizando uma estimativa para VLDLC como um quinto de triglicerídeos no plasma, a concentração de colesterol LDL (LDLC) é calculada através da fórmula: LDLC = TC(HDLC+VLDLC). Embora seja geralmente útil, o método de Friedewald tem acurácia limitada em certos casos. Por exemplo, podem ocorrer erros em qualquer uma das três etapas, em parte porque este método requer que pro< cedimentos diferentes sejam utilizados em cada etapa. Além disso, o método de Friedewald é até um grau indireto, uma vez que é presumido que a concentração de VLDLC constitui um quinto dos triglicerídeos no plasma. Consequentemente, quando o VLDL de alguns pacientes desvia desta proporção, ocorrem inacurácias adicionais.

Outro método para avaliar lipoproteínas no sangue considera a medida do tamanho e da densidade das lipoproteínas. A distribuição de tamanhos das lipoproteínas varia entre os indivíduos devido a influências tanto genéticas quanto não-genéticas. Os diâmetros das lipoproteínas variam tipicamente de aproximadamente 7 nm até aproximadamente 120 nm. Nesta faixa de tamanhos de diâmetro, há subtrações das partículas que são impor25 tantes prognosticadoras de doença cardiovascular. Por exemplo, o VLDL transporta triglicerídeos na corrente sanguínea; assim, altos níveis de VLDL na corrente sanguínea são indicativos de hipertrigliceridemia. Estas subtrações podem ser identificadas através de técnicas analíticas que exibem a quantidade de material como uma função de tamanho ou densidade de lipo30 proteínas.

Em relação à análise de densidade das lipoproteínas, as lipoproteínas isoladas por ultracentrifugação podem ser analisadas em relação às propriedades de flotação através de ultracentrifugação analítica em ambientes com densidades de sais diferentes, permitindo a determinação da densidade de LDL hidratada, como mostrado em Lindgren e outros, Blood Lipids and Lipoproteins: Quantification Composition and Metabolism, Ed. G.

L. Nelson, Wiley, 1992, p. 181-274, que é incorporado aqui como referência. Por exemplo, a classe de LDL pode ser adicionalmente dividida em sete subclasses com base na densidade ou no diâmetro através da utilização de uma técnica de separação preparatória conhecida como ultracentrifugação em gradiente de densidade em equilíbrio. É sabido que níveis elevados de subclasses de LDL específicas, LDL-llla, lllb, IVa e IVb, se correlacionam intimamente com um maior risco de CHD (isto é, doença cardíaca coronariana), incluindo aterosclerose. Além disso, a determinação do nível de colesterol total no soro e dos níveis de colesterol nas frações de LDL e HDL é utili-* zada de forma rotineira como testes de diagnóstico para o risco de doenças cardíacas coronarianas. A distribuição de classes e subclasses de lipoproteínas é um teste de melhor previsão, entretanto, uma vez que é caro e trabalhoso, é tipicamente pedido apenas por médicos somente para um número limitado de pacientes.

Em relação à medida dos tamanhos das lipoproteínas, não há atualmente um único método aceito. Os métodos conhecidos para medir os tamanhos de lipoproteínas dentro de um estabelecimento clínico incluem o perfil auto vertical (VAP) (ver, por exemplo, Kulkarni e outros, J. Lip. Res., 1994, 35:159-168) através do qual um analisador de fluxo é utilizado para a análise enzimática de colesterol nas classes de lipoproteínas separadas por uma ultracentrifugação vertical única de centrifugação curta, com espectrofotometria subsequente e análise dos dados resultantes.

Outro método (ver, por exemplo, Jeyarajah, E.J. e outros, Clin Lab Med., 2006, 26:847-70) emprega ressonância magnética nuclear (RMN) para a determinação das concentrações de subclasses de lipoproteínas.

Neste método, é obtido o espectro de alteração química por RMN de uma amostra no plasma ou no soro do sangue. O espectro observado da amostra toda do plasma é então combinado através de computador com somas pon4 deradas conhecidas de espectros de RMN obtidos anteriormente de subclasses de lipoproteínas. Os fatores de ponderação que fornecem o melhor ajuste entre o espectro da amostra e o espectro calculado são então utilizados para estimar as concentrações de subclasses constituintes de lipoprote5 ínas na amostra de sangue.

Outro método, separação eletroforética em gradiente de gel (ver, por exemplo, a Patente U.S. N² 5.925.229; incorporada aqui como referência) é um procedimento de eletroforese em gradiente de gel para a separação de subclasses de LDL. As frações de LDL são separadas por eletrofo10 rese em gradiente de gel, produzindo resultados que são comparáveis aos obtidos através da ultracentrifugação. Este método gera uma resolução fina de subclasses de LDL e é utilizado principalmente por laboratórios de pesquisa. Entretanto, o método de separação em gel, que depende da coloração uniforme de todos os componentes que são subsequentemente medidos 15 opticamente, sofre de cromogenicidade não uniforme. Ou seja, nem todas as lipoproteínas são coradas igualmente bem. Consequentemente, a captação diferencial de corante pode produzir resultados quantitativos errôneos. Adicionalmente, a cromogenicidade não uniforme pode resultar em resultados qualitativos errôneos, em que os picos medidos podem ser distorcidos em 20 um grau suficiente que pode causar confusão de uma classe ou subclasse de lipoproteína com outra. Além disso, a eletroforese em gradiente de gel pode levar muitas horas até ser completada.

Na verdade, métodos mais recentes para a determinação quantitativa e qualitativa de lipoproteínas partindo de uma amostra biológica fo25 ram descritos por Benner e outros. (Patente U.S. N² 7.259.018; incorporada aqui como referência) cujos métodos empregam dispositivos de mobilidade de tamanhos de particulados e/ou de íons.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Através da presente invenção são fornecidos métodos para a 30 preparação da amostra e aparelhos úteis para análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial (também referida aqui como análise de mobilidade de íons) de lipoproteínas utilizando um analisador molecular de mobilidade eletroforética em fase gasosa.

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método adequado para purificar lipoproteínas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial de classe e subclasse de lipoproteínas, cujo método inclui as etapas a seguir: (a) preparação de um tubo de centrífuga contendo uma primeira solução embaixo de uma amostra, cuja amostra possui uma ou mais lipoproteínas e componentes que não são lipoproteínas, cuja primeira solução possui uma primeira densidade maior que 1,00 g/ml_ e menor que ou igual a aproximadamente 1,21 g/ml_; e (b) submissão do tubo à centrifugação suficiente para fazer com que os componentes que não são lipoproteínas migrem em direção do fundo do tubo e para longe das lipoproteínas, fornecendo assim lipoproteínas purificadas. Em algumas modalidades, a primeira densidade está na faixa de aproximadamente 1,15 g/mL até aproximadamente 1,21 g/mL. Em algumas modalidades, a primeira solução é preferencialmente uma solução aquosa, mais preferencialmente água ou formas deuteradas da mesma.

No contexto deste aspecto da invenção, a amostra que contém lipoproteínas é obtida através do processamento de uma amostra de sangue de um mamífero como descrito aqui, cujo processamento inclui opcionalmente o ajuste da densidade através da adição de sais que incluem, por exemplo, sem limitação, os sais de Cl, Br e/ou I de Na, K e/ou Cs.

Ainda, a este aspecto da invenção, é fornecida em certas modalidades uma segunda solução dentro do tubo de centrífuga, acima e adjacente à amostra, cuja segunda solução tem preferencialmente menor densidade que a primeira solução. Consequentemente, a densidade da segunda solução é maior que ou igual a 1,00 g/mL e menor que a densidade da primeira solução. Em algumas modalidades, a segunda solução é uma solução aquosa. De forma surpreendente, foi observado que a cobertura de uma amostra que contém lipoproteínas em um tubo de centrífuga com uma solução que possui menor densidade resulta em uma maior recuperação de lipoproteína após a separação com centrifugação. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que o fluxo iônico da solução contendo lipoproteínas mais densas para as menos densas, preferencialmente aquosas, a segunda solução coberta modula a flutuabilidade dos lipídeos contidos na mesma, resultando em uma maior recuperação de lipoproteína.

Como utilizado aqui, centrifugação refere-se à separação ou à - 5 análise de substâncias em uma solução como uma função da densidade e do peso molecular relacionado à densidade submetendo a solução a uma força centrífuga gerada pela rotação em alta velocidade em um instrumento apropriado.

Como utilizado aqui, purificar e termos similares referem-se a 10 um aumento na concentração relativa de um componente especificado em relação a outros componentes. Por exemplo, sem limitação, a remoção de lipídeo de uma solução de lipoproteínas constitui a purificação da fração de lipoproteínas, por exemplo, à custa da fração de lipídeos. É entendido que purificação e termos similares no contexto da centrifugação referem-se à 15 separação suficiente em um tubo de centrífuga após a centrifugação para permitir a extração dos componentes separados através de métodos bemconhecidos na técnica que incluem, sem limitação, aspiração e/ou fracionamento. De forma surpreendente, foi observado que a redução da densidade de soluções que contêm lipoproteínas antes da centrifugação, por exemplo, 20 sem limitação, através da redução da concentração de sais das mesmas, resulta em uma maior recuperação de certas frações de lipoproteína, incluindo frações de LDL e HDL.

Os termos lipoproteína e partícula de lipoproteína como utilizados aqui se referem a partículas obtidas de sangue de mamífero que in25 cluem apolipoproteínas montadas de forma biológica com ligações não covalentes para empacotar, por exemplo, sem limitação, colesterol e outros lipídeos. As lipoproteínas preferencialmente referem-se a partículas biológicas que possuem uma faixa de tamanhos de aproximadamente 7 até 120 nm e incluem VLDL (lipoproteínas de densidade muito baixa), IDL (lipoproteínas 30 de densidade intermediária), LDL (lipoproteínas de baixa densidade), Lp(a) [lipoproteína (a)], HDL (lipoproteínas de alta densidade) e quilomicra como definido aqui.

(

O termo apolipoproteína como utilizado aqui se refere a proteínas que se ligam a lipídeos que constituem lipoproteínas. As apolipoproteínas são classificadas em cinco classes principais: Apo A, Apo B, Apo C, Apo D e Apo E, que são conhecidas na técnica.

O termo partícula biológica como utilizado aqui se refere a um material que possui uma montagem ligada de forma sem ser covalente de moléculas derivadas de uma fonte viva. Os exemplos sem limitação de partículas biológicas incluem lipoproteínas montadas, por exemplo, partindo de apolipoproteínas e lipídeos; componentes virais montados partindo de proteínas de revestimento e glicoproteínas ligadas de forma sem ser covalente; complexos imunológicos montados partindo de anticorpos e seus antígenos cognatos e similares.

Os termos marcador, marcador bioquímico e termos similares como utilizado aqui se referem a moléculas biológicas que ocorrem naturalmente (ou derivados das mesmas) com correlações conhecidas a uma doença ou um estado de saúde.

O termo aproximadamente como utilizado aqui no contexto de um valor numérico represente o valor de +/-10% do mesmo.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a purificação de lipoproteínas, cujo método inclui as etapas a seguir: (a) preparação de um tubo de centrífuga contendo uma amostra e uma primeira solução localizada abaixo e adjacente à amostra, a amostra incluindo uma ou mais lipoproteínas e componentes que não são lipoproteínas, em que a amostra inclui ainda Reactive Green dextran (dextran Verde Reativo) e sulfato de dextran (DS), em que a primeira solução contém óxido de deutério (D₂O); e (b) submissão do tubo de centrífuga à centrifugação suficiente para fazer com que os componentes sem ser lipoproteína migrem em direção ao fundo do tubo e para longe das lipoproteínas. Em algumas modalidades, as lipoproteínas purificadas separadas dessa maneira são então removidas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Em algumas modalidades, a densidade da primeira solução é de 1,0 g/ml_ até aproximadamente 1,21 g/mL. Em algumas modalidades, a densidade da pri meira solução é de 1,00 g/mL até aproximadamente 1,10 g/mL. Em algumas modalidades, a primeira solução é substancialmente D₂O.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a purificação de lipoproteínas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, cujos métodos não incluem centrifugação, cujos métodos incluem as etapas a seguir: a) mistura de uma solução que contém lipoproteínas e não-lipoproteínas com um ou mais compostos polianiônicos e um ou mais cátions divalentes; b) permitir que um precipitado que contém lipoproteínas seja formado na solução misturada; e c) após a etapa b), coleta das lipoproteínas precipitadas e submissão das lipoproteínas precipitadas à análise de partículas carregadas de forma diferencial após a ressolubilização.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a purificação de lipoproteínas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, cujos métodos não incluem centrifugação, cujos métodos incluem as etapas a seguir: a) mistura de uma solução que contém lipoproteínas e não-lipoproteínas com um ou mais ligantes de captura de lipoproteínas capazes de se ligar com as lipoproteínas para formar um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas; b) isolamento do complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas; e c) liberação das lipoproteínas do complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas e submissão das lipoproteínas à análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Em algumas modalidades, as lipoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em HDL, LDL, Lp(a), IDL e VLDL. Em algumas modalidades, o ligante de captura de lipoproteínas é selecionado do grupo de aptâmero e anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante de captura de lipoproteínas é um anticorpo.

Em certas modalidades dos aspectos que consideram o isolamento e/ou a purificação de lipoproteínas descritas aqui, a invenção fornece métodos para a análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas, cujos métodos incluem as etapas a seguir: (a) fornecimento de uma ou mais lipoproteínas de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui; e (b) sub missão de uma ou mais lipoproteínas à análise de mobilidade de partículas carregadas, determinando assim a distribuição de tamanhos das lipoproteínas. Em algumas modalidades dos aspectos anteriores, métodos são utilizados para determinar em uma amostra do paciente a concentração de HDL, LDL, IDL e VLDL e mais preferencialmente HDL, LDL, IDL, VLDL e Lp(a). A amostra do paciente é preferencialmente plasma ou soro. Os métodos que são descritos aqui também podem incluir o uso de um padrão interno tal como uma ou mais lipoproteínas marcadas (por exemplo, marcação fluorescente) para monitorar a perda de amostra durante o processamento de forma a serem obtidas determinações mais acuradas da concentração de lipoproteínas na amostra inicial que será avaliada.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas, cujos métodos incluem as etapas a seguir: (a) determinação de uma distribuição de tamanhos de partículas com mobilidade diferencial em uma ou mais regiões de tamanhos de partículas para uma ou mais lipoproteínas submetidas à análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial; (b) subtração da contribuição para a distribuição de tamanhos de partículas de um reagente sem ser lipoproteína ou um material de amostra sem ser lipoproteína para a obtenção de uma distribuição de tamanhos de partículas de lipoproteínas; e (c) transferindo a distribuição de tamanhos de partículas de lipoproteínas para uma tela, uma impressora ou uma memória.

Em outro aspecto, a invenção fornece um meio que pode ser lido pelo computador que inclui um código de computador armazenado no mesmo, o código de computador para a análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas inclui (a) a determinação de uma distribuição de tamanhos de partículas com mobilidade diferencial em uma ou mais regiões de tamanhos de partículas para uma ou mais lipoproteínas submetidas à análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial; (b) a subtração da contribuição para a distribuição de tamanhos de partículas de um reagente sem ser lipoproteína ou um material de amostra sem ser lipoproteína para a obtenção de uma distribuição de tamanhos de partículas de lipoproteínas; e (c) a transferência da lipoproteina distribuição de tamanhos para uma tela, uma impressora ou uma memória.

Em outro aspecto, a invenção fornece aparelhos para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial incluindo (a) uma ou mais adaptadas para transportar a amostra ao longo de um capilar, (b) um ionizador adaptado para carregar partículas da amostra à medida que a amostra flui dentro do capilar e (c) um analisador de mobilidade iônica adaptado para realizar uma análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial na amostra de partículas carregadas. O ionizador pode incluir uma união condutora ao redor de uma parte do capilar. Em uma modalidade, a união condutora forma uma região de microtite em uma parte do capilar e aplica uma carga à amostra que flui ao longo do mesmo, carregando assim as partículas da amostra.

Certas modalidades dos aparelhos compreendem ainda um autoamostrador adaptado para fornecer uma amostra para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial a uma ou mais bombas.

Em algumas modalidades, uma ou mais bombas podem incluir uma bomba de alto fluxo para fornecer a amostra a uma bomba de nanofluxo, a bomba de nanofluxo sendo adaptada para fornecer a amostra ao capilar. A bomba de alto fluxo pode bombear a amostra a uma taxa de aproximadamente 15-25 microlitros por minuto e a bomba de nanofluxo pode bombear a amostra a uma taxa de aproximadamente 100-200 nanolitros por minuto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIG. 1 mostra o efeito da densidade sobre a recuperação de lipoproteínas de uma amostra de plasma durante uma ultracentrifugação de 3,7 h. As amostras foram preparadas em duplicatas utilizando soluções de densidades diferentes e centrifugadas durante 3,7 h. Após coletar a fração de lipoproteínas, esta foi submetida à diálise antes da análise através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Cada quadro mostra o perfil de cada réplica.

Densidades de solução: A = 1,23 g/mL; B = 1,181 g/ml_; C =

1,170 g/mL; D = 1,165 g/mL. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma coordenada de massas em escala arbitrária, cuja coordenada de massa está relacionada de forma linear com o número real de partículas contadas como uma função de tamanho (isto é, diâmetro).

A FIG. 2 mostra uma comparação de recuperação de lipoproteínas do plasma utilizando um D₂O ou um protocolo de baixa concentração de sal (sem D₂O) em um experimento de separação por centrifugação. O perfil escuro reflete uma centrifugação de 2 h utilizando D₂O como a solução densa (1,107 g/mL). O perfil claro reflete uma centrifugação de 3,7 h utilizando KBr como a solução densa (1,151 g/mL). A - indica a altura do pico de albumina para a centrifugação de 2 h; B - indica a altura do pico de albumina para a centrifugação de 3,7 h. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma coordenada de massas em escala arbitrária, como discutido na legenda para a FIG. 1.

A FIG. 3 mostra o resultado da recuperação de Apo A1, Apo B e colesterol total (TC) do plasma utilizando D₂O em combinação com RGD/DS [RGD: Reactive Green 19 (Verde Reativo 19) (RG 19) conjugado com dextran; RGD/DS: RGD em combinação com DS] em um experimento de separação por centrifugação. A abscissa indica o analito medido. Os números associados a cada caixa referem-se a um sistema de numeração de identificação de um único paciente.

A FIG. 4 mostra o resultado da recuperação de lipoproteínas do plasma após purificação por centrifugação utilizando RGD. O RGD foi adicionado nas amostras em várias concentrações e centrifugado durante 2 h e 15 min utilizando D₂O como a solução densa. As alturas do pico de albumina são indicadas para as quatro concentrações diferentes de RGD utilizadas: A, 10 mg/mL de RGD; B, 15 mg/mL de RGD; C, 20 mg/mL de RGD; e D, 25 mg/mL de RGD. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma coordenada de massas em escala arbitrária, como discutido na legenda para a FIG. 1.

A FIG. 5 mostra o resultado da recuperação de lipoproteínas do plasma após a purificação por centrifugação com RGD e ácido etilenodiami natetracídico (EDTA) ou com RGD/DS e EDTA e opcionalmente acetato de amônio (AA). Legenda: (A) extração com 7,5 mg/mL de RGD e 2,5 mg/mL de DS, diluição com acetato de amônio a 25 mM com 5 pg/mL de DS; (B) extração com 7,5 mg/mL de RGD e 2,5 mg/mL de DS, diluição com acetato de amônio a 25 mM; (C) extração com 7,5 mg/mL de RGD, diluição com acetato de amônio a 25 mM com 5 pg/mL de DS; (D) extração com 7,5 mg/mL de RGD, diluição com acetato de amônio a 25 mM. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma coordenada de massas em escala arbitrária, como discutido na legenda para a FIG. 1.

A FIG. 6 mostra o resultado da inclusão de DS no tampão de diluição após a separação de densidade e a diálise tradicionais. A e B: 5 pg/mL de DS incluídos no tampão de diluição de acetato de amônio. C e D: sem DS no tampão de diluição de acetato de amônio. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma coordenada de massas em escala arbitrária, como discutido na legenda para a FIG. 1.

A FIG. 7 mostra o perfil de lipoproteínas resultante em associação com um relato típico do fracionamento de lipoproteínas através da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. A abscissa é o diâmetro de lipoproteína (nm) e a ordenada é uma massa, calculada partindo dos dados de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial e dos parâmetros que são conhecidos na técnica. As áreas mostradas com hachuras indicam o risco relativo, com seções com linhas diagonais representando risco médio, seções com linhas verticais representando risco menor, seções hachuriadas representando risco maior e as seções sombreadas representando risco indeterminado.

A FIG. 8 ilustra um aparelho para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial de acordo com uma modalidade da presente invenção.

As FIGS. 9A e 9B ilustram modalidades de uniões de conjunção para uso com os aparelhos da FIG. 8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

VLDL, IDL, LDL e HDL referem-se às classificações de lipo proteínas que são mostradas na Tabela 1. É entendido que os valores utilizados na Tabela 1 para os tamanhos são determinados por métodos de eletroforese em gel, que são conhecidos na técnica. Com os métodos de análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial divulgados aqui, foi observado que todas as medidas de diâmetro de lipoproteína obtidas com a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial são alteradas para diâmetros menores comparados com os dados obtidos com a eletroforese em gel. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que esta diferença seja devido à calibração dos géis. A alteração parece estar relacionada de forma linear e é aproximada pela fórmula a seguir:

0,86*diâmetro do gel = diâmetro de IM

A Tabela 1 descreve as classes padronizadas e as designações de subclasses atribuídas a várias frações de lipoproteínas utilizando medidas de eletroforese em gel tradicionais: lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDLs) com subclasses VLDL I e II; lipoproteínas de densidade intermediária (IDLs) com subclasses IDL I e II; lipoproteínas de baixa densidade (LDLs) com subclasses I, lia, llb, llla, lllb, IVa e IVb; e lipoproteínas de alta densidade (HDLs), que incluem tipicamente várias subclasses, tais como HDL lia, llb, llla, Ilibe lllc.

Tabela 1. Classe, Subclasse, Densidade e Tamanho de Partículas de Lipoproteínas Principais

Iniciais das Classes Subclasse	Nome Densidade (g/ml)	Diâmetro de Partícula (Â)
VLDL	Lipoproteína de Densidade Muito Baixa
I	<1,006	330-370
II	1,006-1,010	300-330
IDL	Lipoproteína de Densidade Intermediária
I	1,006-1,022	285-300
II	1,013-1,019	272-285
LDL	Lipoproteína de Densidade Baixa
I	1,019-1023	272-285
lla	1,023-1,028	265-272
llb	1,028-1,034	256-265
llla	1,034-1,041	247-256
lllb	1,041-1,044	242-247
IVa	1,044-1,051	233-242
IVb	1,051-1,063	220-233
HDL	Lipoproteína de Densidade Alta
lla	1,063-1,100	98-130
llb	1,100-1,125	88-98
llla	1,125-1,147	82-88
lllb	1,147-1,154	77-82
lllc	1,154-1,203	72-77

Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que as diferenças observadas entre os diâmetros da análise de mobilidade de partí5 cuias carregadas de forma diferencial e os diâmetros da eletroforese em gel também podem ser causadas pela distorção de lipoproteínas que interagem com a matriz de gel sob a influência do campo elétrico forçado intrínseco do gel de eletroforese. A diferença de tamanhos também pode ser causada pelos dados históricos utilizados para converter a densidade das partículas (ob10 tida partindo de separações por ultracentrifugação analíticas) no tamanho das partículas obtido partindo da microscopia eletrônica.

Como utilizado aqui, quilomicra significam partículas biológicas de 70-120 nm de tamanho, com densidades correspondentes menores que 1,006 g/mL. Não foi observado que os quilomicra possuem qualquer significância clínica na previsão de doença cardíaca, por exemplo, CHD.

Apo A como é conhecida na técnica é um componente protéico de HDL. Apo B é um componente protéico de LDL, IDL, Lp(a) e VLDL e, na verdade, é a apolipoproteína primária de lipoproteínas de menor densidade, possuindo o lócus genético humano 2p24-p23, que é conhecido na técnica.

Como utilizado aqui, albumina refere-se às proteínas ubíquas que constituem aproximadamente 60% do plasma, possuindo uma densidade de aproximadamente 1,35 g/mL, como é conhecido na técnica.

Lp(a) e lipoproteína (a) referem-se a um tipo de lipoproteína encontrado no soro que possui uma composição molecular distinta de IDL e LDL, que é encontrado no complexo com apolipoproteína a [apo(a)]. A Lp(a) possui um tamanho de partícula que se sobrepõe ao de LDL e IDL e, portanto, pode interferir na anáiise de tamanho de partículas quando partículas de Lp(a) estão presentes na amostra. Embora alguns pacientes tenham concentrações de Lp(a) baixas que ocorrem naturalmente, acredita-se que seja uma boa prática remover a Lp(a) antes das medidas de tamanhos de LDL para evitar medidas de outra maneiras inacuradas para estes pacientes que possuem concentrações de Lp(a) significativas. Desta maneira, podem ser evitados problemas potenciais de interferência de tamanho de Lp(a).

A presente invenção considera aparelhos e métodos para uso na mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial e na preparação de amostras para mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. A mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial utiliza o princípio de que as partículas de certo tamanho e condição de carga se comportam de uma maneira previsível quando carreadas em um fluxo de ar laminar passado através de um campo elétrico. Consequentemente, a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial é uma técnica para determinar o tamanho de uma partícula carregada que é submetida à análise quando a partícula carregada é exposta a um campo elétrico.

A mobilidade elétrica é uma propriedade física de um íon e está relacionada com a velocidade que um íon adquire quando é submetido a um campo elétrico. A mobilidade elétrica, Z, é definida como r

(D em que V = velocidade terminal e E = campo elétrico que causa o movimento das partículas. O diâmetro das partículas pode ser obtido partindo de „ neC.

Z =

3πηά (2) em que n = número de cargas na partícula (neste caso uma única carga), e = 1,6.^x.1O’¹⁹ coulombs/carga, C_c= fator de correção de erro dependente do tamanho da partícula, η = viscosidade do gás e d = diâmetro das partículas.

Consequentemente, a resolução de d, fornece a relação a seguir:

neC_c E

3πη V (3).

Assim, é obtida uma relação explícita para o diâmetro das partículas como uma função de parâmetros conhecidos. Através do ajustes dos parâmetros em valores diferentes, diâmetros diferentes das partículas das partículas carregadas podem ser selecionados como descrito adicionalmente a seguir e conhecido na técnica. Em métodos preferidos de análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, a força do campo elétrico E que atua sobre a partícula carregada é variada durante a análise.

Na análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, as partículas (por exemplo, lipoproteínas e similares) são carreadas ao longo do sistema utilizando uma série de fluxos laminares de ar. As lipoproteínas em uma solução volátil são introduzidas em uma câmara de eletropulverização contendo aproximadamente 5% de CO₂ na qual as lipoproteínas são dessolvatadas. Na câmara de eletropulverização, as lipoproteínas carregadas dessolvatadas são neutralizadas pelo ar ionizado, introduzido, por exemplo, sem limitação, por um emissor de partículas alfa na câmara. Com base na fórmula de Fuch, uma proporção previsível de partículas emerge da câmara carregando uma única carga e é transportada da câmara para o Analisador de Mobilidade Diferencial (Differential Mobility Analyzer (DMA)). Para detalhes em relação à fórmula de Fuch, é feita referência a Fuchs, N.A.: The Mechanics of Aerosols, Macmillan, 1964. Analisador de Mobilidade Diferencial (Differential Mobility Analyzer), DMA e termos similares referem-se a dispositivos para a classificação de partículas carregadas com base na mobilidade elétrica dos íons, que é conhecida na técnica e descrita aqui. Na análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, quando as partículas possuem uma carga uniforme conhecida, o tamanho das partículas classificadas pode ser determinado partindo da mobilidade das mesmas. No DMA, as partículas entram na superfície externa superior da câmara e são carregadas em um fluxo laminar de ar que flui rapidamente, (isto é, fluxo de blindagem). O fluxo de blindagem é ar filtrado (para remover partículas) que recircula constantemente ao longo do DMA a uma velocidade constante de 20 L/min. À medida que as partículas passam através do DMA (carregadas no fluxo de blindagem) o potencial elétrico ao longo da câmara é aumentado a uma taxa conhecida. À medida que o potencial elétrico muda, as partículas de diâmetro diferente são coletadas através de uma fenda na superfície interna inferior da câmara. As partículas seguem um caminho não linear ao longo do DMA dependendo de sua carga e diâmetro. Em qualquer potencial elétrico fornecido, as partículas de tamanho conhecido seguirão um caminho que permitirá que as mesmas passem através da fenda coletora. As partículas que passam através da fenda coletora são capturadas por outra corrente de ar de fluxo laminar separado e são carregadas para um contador de partículas. O contador de partículas aumenta as partículas através da condensação em um tamanho que pode ser detectado e são contadas, por exemplo, por um sistema de detecção a laser. O conhecimento do potencial elétrico que é aplicado ao DMA quando a partícula foi coletada permite a determinação acurada do diâmetro das partículas e do número de partículas presentes em tal tamanho. Estes dados são coletados e armazenados em depósitos como uma função de tempo para tamanho diferente de partícula. Desta maneira, o número de partículas de qualquer faixa de tamanhos fornecida pode ser determinado e convertido em uma concentração de partículas com base no tempo necessário para coletar os dados, na vazão de amostra que é introduzida no dispositivo de eletropulverização e no número de partículas carregadas em tal tamanho.

Nos métodos da presente invenção que consideram o isolamento e/ou a purificação de lipoproteínas, a coleta inicial e a preparação das amostras podem ser realizadas através de métodos bem-conhecidos na técnica. Tipicamente, uma amostra de sangue em jejum de 2 até 5 ml_ é inicialmente tirada. Os quilomicra não estão tipicamente presentes nos indivíduos que estiveram em jejum durante um período de pelo menos 12 horas; assim, a sobreposição de tamanhos de VLDL e de tamanhos de quilomicron é eliminada pelo jejum. A amostra é então inicialmente rodada em uma centrífuga (por exemplo, centrífuga clínica) preferencialmente durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 2000 xG, cuja centrifugação é suficiente para remover os componentes celulares da amostra. Durante este processo, os componentes celulares mais densos são depositados em camadas no fundo da amostra. Uma amostra de plasma menos densa remanescente que contém lipoproteínas na superfície é então removida utilizando métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, aspiração.

De maneira histórica, na preparação para a centrifugação, uma amostra de plasma poderia ter a densidade ajustada em uma densidade específica utilizando soluções de alta pureza ou sólidos de sais inorgânicos, por exemplo, cloreto de sódio (NaCI), brometo de sódio (NaBr) e similares. Em alguns protocolos anteriores, a densidade específica seria escolhida para ser maior que ou igual à densidade mais alta do material lipoprotéico que será analisado, de forma que o material lipoprotéico flutuaria quando a densidade fosse separada em camadas. Densidade separada em camadas e termos similares referem-se ao assentamento em camadas de componentes em uma solução submetida à centrifugação. Estas densidades são tabeladas na Tabela 1. A amostra com densidade ajustada poderia então ser ultracentrifugada, por exemplo, durante aproximadamente 18 horas a 100.000 xG para separar as proteínas que não são lipoproteínas das lipoproteínas. As proteínas que não são lipoproteínas, particularmente albumina, poderíam ser removidas da amostra de plasma, preferencialmente por ultracentrifugação.

As lipoproteínas flutuariam na superfície da amostra durante a ultracentrifugação. Consequentemente, através da centrifugação sequencial da densidade mais baixa para a densidade mais alta de um ajuste de densidades, as várias classes e subclasses de lipoproteínas poderíam ser sequencialmente extraídas. Tipicamente, seria necessária uma etapa de diálise após a extração de uma amostra centrifugada para remover sais introduzidos para o ajuste da densidade, cuja etapa de diálise necessitaria tipicamente 4-12 h sob condições bem-conhecidas na técnica.

As condições para centrifugação de amostras que contêm lipoproteínas descritas aqui são bem-conhecidas na técnica de separação bioquímica. Por exemplo, sem limitação, as amostras são tipicamente centrifugadas a 10°C durante 1-4 h a 223.000 xG. Em algumas modalidades, a centrifugação emprega uma força centrífuga de 50.000-100.000, 100.000120.000, 120.000-150.000, 150.000-200.000, 200.000-230.000, 230.000250.000 xG ou uma força ainda maior. Em algumas modalidades, o tempo de centrifugação é de 1, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 h ou ainda mais longo. Antes da análise por mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, uma alíquota da fração lipídica é removida (por exemplo, 10-200 pL) da superfície do tubo de centrífuga e diluída (por exemplo, 1:800) em acetato de amônio a 25 mM (AA), hidróxido de amônio a 0,5 mM, pH 7,4. De maneira vantajosa, em algumas modalidades descritas aqui, não é necessária uma etapa de diálise em associação com os métodos da invenção, resultando em menos tempo necessário para a análise.

Nas modalidades da invenção que consideram lipoproteínas, as lipoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em HDL, LDL, IDL, Lp(a) e VLDL. Em algumas modalidades, as lipoproteínas são HDL.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram lipoproteínas, as lipoproteínas podem derivar de uma amostra de plasma, obtida através de métodos bem-conhecidos na técnica ou que são descritos aqui. Os termos espécime biológico, amostra biológica e termos similares referem-se a tecido ou fluido biológico explantado, removido ou coletado de outra maneira incluindo, por exemplo, sem limitação, sangue total, soro e plasma. O termo plasma no contexto de sangue refere-se ao fluido obtido após a separação do sangue total em componentes sólidos e líquidos. O termo soro no contexto de sangue refere-se ao fluido obtido após a separação do sangue total em componentes sólidos e líquidos após ser permitido que coagulasse. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos da presente invenção, a amostra biológica é de origem humana. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos fornecidos aqui, a amostra biológica é soro. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos fornecidos aqui, a amostra biológica é plasma.

Em algumas modalidades da invenção que consideram centrifugação, a centrifugação não atinge o equilíbrio. Equilíbrio de centrifugação e termos similares referem-se à centrifugação realizada durante tempo suficiente e em força centrífuga suficiente de forma que os componentes da solução que está sendo centrifugada atingiram flutuação em densidade neutra, que é bem-conhecida na técnica. De forma surpreendente, foi observado que protocolos de centrifugação reduzidos, como descrito aqui, nos quais o equilíbrio de centrifugação não é atingido, podem, todavia, possibilitar uma purificação significativa de lipoproteínas.

Em algumas modalidades da invenção que consideram centrifugação de amostra contendo lipoproteínas e componentes que não são lipoproteínas, a lipoproteína purificada é coletada da parte superior do tubo de centrífuga após a centrifugação. Parte superior do tubo de centrífuga e termos similares referem-se ao líquido na parte superior de um tubo de centrífuga quando observado fora do rotor da centrífuga que pode, mas não necessariamente, inclui o líquido na parte extremamente superior.

Em qualquer um dos métodos adicionais da presente invenção direcionados para a purificação de lipoproteínas, foi observado de forma surpreendente que a redução da densidade da solução a um valor menor ou igual a aproximadamente 1,21 g/mL durante a centrifugação abaixo do equilíbrio resulta realmente em uma maior recuperação, consequentemente purificação, de LDL e HDL.

A densidade das lipoproteínas pode ser determinada diretamente através de uma variedade de métodos bioquímicos físicos bemconhecidos na técnica, incluindo sem limitação ultracentrifugação em densidade de equilíbrio e ultracentrifugação analítica. A densidade das lipoproteínas também pode ser determinada indiretamente com base no tamanho de partícula e em uma relação conhecida entre tamanho e densidade de partícula. O tamanho das lipoproteínas pode ser determinado através de uma variedade de métodos bioquímicos bem-conhecidos na técnica incluindo, sem limitação, os métodos descritos aqui.

A análise de mobilidade iônica, também conhecida como mobilidade elétrica dos ions ou mobilidade de partículas carregadas, oferece uma vantagem em relação aos outros métodos descritos aqui pelo fato de que não mede apenas o tamanho de partícula de forma acurada com base nos princípios físicos, mas também conta diretamente o número de partículas presentes em cada tamanho, oferecendo assim uma medida direta do tamanho das lipoproteínas e da concentração para cada lipoproteína. A análise de mobilidade de ions tem sido utilizada de forma rotineira na análise de partículas em aerossóis e os analisadores adequados para a análise de mobilidade de ions foram adaptados para analisar macromoléculas biológicas grandes. A análise de mobilidade de ions é uma metodologia muito sensível e acurada, entretanto, um inconveniente é que a análise de mobilidade de ions mede todas as partículas introduzidas no sistema. Consequentemente, é de importância principal isolar e/ou purificar os compostos de interesse antes da análise. As lipoproteínas são candidatas para este método porque as lipoproteínas podem ser isoladas de outras proteínas do soro com base na densidade e outras características descritas aqui.

Os exemplos de resultados da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial para lipoproteínas de amostras de plasma purificadas por centrifugação com densidades variáveis de solução são mostrados na FIG. 1. Nestes experimentos, as amostras de soro (25 pL) foram colocadas sobre uma camada (200 pL) de quatro soluções de sal com densidades diferentes (KBr). As densidades das soluções eram 1,165, 1,170,

1,181 e 1,23 g/mL. Cada amostra foi submetida à ultracentrifugação durante um período de 3,7 h a 223.000 xG. Os 100 pL superiores após a centrifugação foram removidos. As amostras de lipoproteínas fracionadas de cada densidade foram submetidas à diálise durante a noite contra acetato de amônio (25 mM), hidróxido de amônio (0,5 mM), pH 7,4. Após a diálise, cada amostra foi analisada através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial com os perfis resultantes mostrados na FIG. 1. É evidente uma redução nos perfis de lipoproteínas na região de HDL observada nas densidades menores comparadas a 1,23 g/mL. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que esta observação seja por causa da remoção mais eficiente de proteínas do plasma com soluções de sais inferiores.

Com referência adicional à FIG. 1, a abscissa é o tamanho de partícula (isto é, o diâmetro) e a ordenada é uma massa medida arbitrariamente. A área sob as curvas, em uma distribuição de massa de partícula versus uma variável independente (tal como tamanho, densidade, mobilidade etc.), é diretamente representativa da massa de partícula de lipoproteína. A técnica de medida se baseia na contagem de partículas individuais como uma função do tamanho (diâmetro). É, portanto, possível converter o número de partículas em um tamanho específico em um valor de massa utilizando o volume e a densidade das partículas. A densidade das lipoproteínas é uma função bem-conhecida do tamanho de partícula e pode ser obtida, por exemplo, na literatura. Os valores de massa associados ao número são simplesmente medidos para indicar os valores relativos, mas podem ser convertidos na massa real das lipoproteínas no plasma utilizando fatores de diluição junto com as vazões de amostra e de ar que passam ao longo do espectrômetro de mobilidade iônica. Consequentemente, em algumas modalidades, o ajuste da densidade de uma solução que contém lipoproteínas antes da centrifugação fora do equilíbrio em um valor menor que o esperado para separar as lipoproteínas de densidade maior (por exemplo, HDL) resulta realmente na separação de HDL e LDL. De maneira vantajosa, o método de redução da densidade da amostra que contém lipoproteínas também resulta em uma maior separação da albumina.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram a centrifugação de uma amostra que contém lipoproteínas e componentes que não são lipoproteínas, a primeira solução compreende D₂O. Em algumas modalidades, a densidade da primeira solução é determinada substancialmente pelo conteúdo de D₂O, em que a primeira solução possui uma densidade de 1,00 até aproximadamente 1,10 g/mL. A densidade de D₂O é de aproximadamente 1,107 gm/mL a 25°C. Consequentemente, em algumas modalidades da invenção, o componente aquoso inclui 0-99% de D₂O ou até mesmo mais. Em algumas modalidades, a quantidade de D₂O está na faixa, por exemplo, sem limitação, de 10-99, 20-99, 30-99, 40-99, 5099, 10-90, 20-90, 30-90, 40-90, 50-90% e similares. Em algumas modalidades, o conteúdo de D₂O é um valor específico, por exemplo, sem limitação, de aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou até mesmo 100% de D₂O. Em algumas modalidades, a primeira solução é substancialmente D₂O. O termo essencialmente D₂O refere-se ao D₂O que compreende o componente aquoso sem H₂O adicionada a mais. Os termos substancialmente D₂O e termos similares referem-se ao conteúdo de D₂O em uma faixa maior que 50%, por exemplo, sem limitação, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou até mesmo 100% de D₂O.

Em algumas modalidades deste aspecto, a amostra que contém lipoproteínas inclui pouco se algum sal adicionado. Com referência à FIG. 2 (condições experimentais fornecidas no Exemplo 1), que mostra o resultado de um procedimento de centrifugação realizado utilizando D₂O e nenhum sal adicional para o ajuste da densidade e uma solução de sal de baixa densidade sem D₂O, foi observada uma recuperação aproximadamente equivalente de LDL e de certas frações de HDL (por exemplo, HDL-llb e HDL-lla) após 2 h (D₂O) e 3,7 h (solução de sal de baixa densidade). Com referência adicional à FIG. 2, os perfis para procedimentos de centrifugação com D₂O e sal de baixa densidade resultam em perfis similares, com, entretanto, maior quantidade de albumina (pico no início da região de HDL 3) julgada como sendo por causa do menor tempo de centrifugação com a amostra com D₂O.

Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, parece que a redução do conteúdo de sal com um aumento concomitante na densidade utilizando D₂O resulta em um tempo mais curto necessário para a centrifugação e a purificação de lipoproteína de uma amostra que contém lipoproteínas.

Com referência à FIG. 3, sob as condições empregadas para a FIG. 3 (condições experimentais do Exemplo 2) é observada uma recuperação aproximadamente equivalente de Apo A1 e Apo B após a centrifugação, indicando que a menor densidade obtida com D₂O não resulta na recuperação seletiva de partículas menos densas maiores.

Em algumas modalidades do método da presente invenção direcionado para a purificação de lipoproteínas colocando uma solução menos densa acima e adjacente a uma solução de amostra contendo lipoproteínas antes da centrifugação, um único ajuste de densidade da solução que contém lipoproteínas é realizado utilizando sais inorgânicos, preferencialmente NaCI e/ou NaBr. Por exemplo, sobre esta amostra em um tubo de centrífuga pode ser colocada uma segunda solução que possui densidade menor que a densidade da solução de amostra que contém lipoproteínas. Alternativamente, a solução de amostra que contém lipoproteínas pode ser introduzida sob a segunda solução no tubo de centrífuga. O ajuste da densidade da amostra que contém lipoproteínas pode ser selecionado dentro da faixa de 1,00 até aproximadamente 1,21 g/mL de acordo com as densidades na Tabela 1 para separar uma classe de lipoproteínas que possui densidade equivalente ou menor. A densidade da segunda solução pode ser selecionada dentro da faixa de 1,00 g/mL até menos que a densidade da solução de amostra que contém lipoproteínas, preferencialmente na faixa de 1,00 até aproximadamente 1,15 g/mL, mais preferencialmente 1,00 g/mL. Desta maneira, as lipoproteínas HDL, IDL, LDL, Lp(a) e VLDL que possuem densidades menores que a densidade da solução de amostra que contém lipoproteínas podem ser simultaneamente extraídas. De forma surpreendente, foi observado que o fornecimento de uma solução que contém lipoproteínas em um tubo de centrífuga com uma solução que possui menor densidade acima e adjacente à solução que contém lipoproteínas resulta em uma maior recuperação de lipoproteína empregando a separação por centrifugação. Em modalidades preferidas, as frações que contêm lipoproteínas são retiradas da parte mais superior do tubo, no menisco, em direção decrescente ao volume desejado apropriado.

Adicionalmente a estes métodos, foi observado que o tempo necessário para a separação por centrifugação de uma amostra que contém lipoproteínas é reduzido em amostras de menor densidade quando comparado a um período de tempo correspondente necessário para amostras de maior densidade. Os termos período de tempo correspondente e similares no contexto da separação por centrifugação referem-se ao período de tempo de centrifugação necessário para atingir um nível de separação especificado, fornecida uma força centrífuga equivalente durante a centrifugação. Por exemplo, sem limitação, foi observado que uma centrifugação de pelo menos 2 h (a, por exemplo, 230.000 xG) é necessária para remover albumina suficiente de uma amostra típica que contém lipoproteínas, com um menor tempo de centrifugação resultando em uma menor remoção de albumina. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, parece que através da diminuição da densidade da amostra, a albumina e, na verdade, outras proteínas não-lipoprotéicas do plasma, são mais rapidamente separadas em camadas e assim separadas da lipoproteína. Consequentemente, um fator fundamental na otimização da purificação de lipoproteína é a diminuição do tempo de centrifugação para maximizar a perda de albumina e outras proteínas do plasma enquanto que a HDL é mantida.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram a centrifugação da amostra contendo lipoproteínas e de componentes que não são lipoproteínas, a amostra compreende ainda um composto que pode atuar como um agente de precipitação para componentes lipoprotéicos selecionados contidos ali, como é conhecido na técnica. Agente de precipitação refere-se a um composto que pode causar ou promover a precipitação de uma molécula biológica após a adição a uma solução de tal molécula biológica. Um agente de precipitação pode requerer um agente adicional para possibilitar a precipitação. Agente adicional para possibilitar a precipitação e termos similares referem-se a compostos que atuam com um agente de precipitação e podem ser necessários para possibilitar a precipitação pelo agente de precipitação. Os exemplos de agentes de precipitação incluem, sem limitação, sais de íons inorgânicos carregados, preferencialmente, sulfato de amônio, anticorpos, polímeros carregados (por exemplo, DS e similares) opcionalmente na presença de espécies iônicas (por exemplo, cátions divalentes), lectinas e similares. Em algumas modalidades, o agente de precipitação está presente embora sob condições (por exemplo, pH, concentração, ausência de agentes adicionais necessários e similares) em que as lipoproteínas não são precipitadas. Em algumas modalidades, o agente de precipitação é DS. Em algumas modalidades, o agente de precipitação é DS e o agente adicional necessário é um cátion divalente. Em algumas modalidades, a amostra que contém lipoproteínas compreende DS, mas não possui cátions divalentes. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que DS se liga às partículas que contêm lipídeos na presença de cátions divalentes e que o DS que se liga pode interferir com interações de ligação inespecíficas com um aumento de recuperação resultante de certas lipoproteínas. Por exemplo, sem limitação, é observado que a inclusão de DS aumentou significativamente a recuperação de LDL de algumas preparações descritas aqui.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram a centrifugação de amostra contendo lipoproteínas e de componentes que não são lipoproteínas, a amostra compreende ainda um composto que se liga à albumina sob condições adequadas para permitir a formação de um complexo que compreende albumina e um composto que se liga à albumina. Os compostos representativos que se ligam à albumina incluem, sem limitação, corantes aromáticos que se ligam à albumina. O corante aromático que se liga à albumina pode compreender um corante diazo; um sal de metal alcalino, um sal de metal alcalino terroso ou um sal de amina do dito corante diazo; um corante de ácido sulfônico; um sal de metal alcalino, um sal de metal alcalino terroso ou um sal de amina fisiologicamente aceitável do dito corante de ácido sulfônico; ou misturas dos mesmos. Os corantes aromáticos que se ligam à albumina particularmente úteis na presente invenção incluem Azul Reativo 2 (Reactive Blue 2), Azul de Evans, Azul de Tripano, Verde de Bromocresol, Roxo de Bromocresol, Metil Laranja, vermelho Procion HE 3B e similares. Em certas modalidades, o composto que se liga à albumina é um análogo de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD). Os análogos representativos de NAD adequados para uso como compostos que se ligam à albumina incluem, sem limitação, RG 19 e Cibacrom Blue 3GA (CB 3GA).

Nas modalidades do método que consideram o uso de compostos que se ligam à albumina, após a mistura do composto que se liga à albumina com uma amostra que contém lipoproteínas, a amostra é centrifugada como descrito aqui. Em algumas modalidades, o composto que se liga à albumina é conjugado com um meio cromatográfico, cujo conjugado promove a remoção fácil da albumina complexada com o composto que se liga à albumina, por exemplo, sem limitação, por filtração. Em algumas modalidades, é observado que o composto conjugado que se liga à albumina fica separado no fundo do tubo de centrífuga, facilitando assim a remoção (por exemplo, por aspiração etc.) da fração que contém lipoproteínas. Em algumas modalidades em que o composto que se liga à albumina é conjugado com um meio cromatográfico, o meio cromatográfico pode ser partículas paramagnéticas, dextran, agarose ou Sephadex®, preferencialmente dextran. Partícula paramagnética como é conhecida na técnica refere-se a partículas que possui um núcleo de minério de ferro revestido comum ligante, por exemplo, sem limitação, estreptavidina. A afinidade de biotina pela estreptavidina (Kd = 10'¹⁵ M) é uma das interações mais fortes e mais estáveis na biologia. Assim, as partículas paramagnéticas combinam a tecnologia de separação magnética conveniente com a versatilidade e a alta afinidade das interações tal como a interação de biotina-estreptavidina. É observado que compostos conjugados com dextran que se ligam à albumina tendem a permanecer solúveis durante mais tempo que outros meios cromatográficos conjugados descritos aqui. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que quanto mais tempo um composto que se liga à albumina pu28 der interagir com a albumina em uma amostra que contém lipoproteínas, mais complexo contendo albumina será formado, aumentando assim a pureza e a recuperação de lipoproteína.

Em modalidades adicionais do método que consideram o uso de compostos que se ligam à albumina, o composto que se liga à albumina está presente durante a centrifugação em uma concentração de até 50 mg/mL ou ainda maior, sem alteração significativa na quantidade e na proporção relativa das lipoproteínas recuperadas partindo de uma amostra de plasma. Por exemplo, com referência à FIG. 4, as análises de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial de uma amostra que contém lipoproteínas nas quais quantidades variáveis de RG 19 foram incluídas antes da centrifugação, mostram que a inclusão do RG 19 conjugado com dextran (RGD) resulta na recuperação de lipoproteína como pouco, se algum, efeito sobre a distribuição de lipoproteínas; comparar a FIG. 1 com a FIG. 4. Com referência ao Exemplo 3 e à FIG. 4, embora os perfis de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial de HDL e LDL sejam similares, há um decréscimo no tamanho do pico (albumina) no início do pico de HDL 3 com concentração crescente de RGD. Além disso, a altura do pico nas concentrações maiores é similar ao observado nas preparações de sal de menor densidade e centrifugações durante 3,7 h. Em outras modalidades, a concentração do composto que se liga à albumina é, por exemplo, sem limitação, de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou até mesmo de 50 mg/mL.

Em certas modalidades, a invenção possibilita o uso de um composto que se liga à albumina em combinação com DS. Com referência à FIG. 5, o uso de RGD, opcionalmente DS e opcionalmente acetato de amônio (AA), resultou na modulação da recuperação de frações de LDL e HDL como é julgado através da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Com referência ao Exemplo 4 e à FIG. 5, há similaridades na região de HDL dos perfis mostrados na FIG. 5 com maior recuperação de HDL quando DS está presente na extração. Adicionalmente, é observada uma altura baixa do pico de albumina. Acredita-se que o maior pico em uma preparação em HDL 2a (FIG. 5) não é típico da capacidade de reprodu ção. Ainda é significativo o fato da maior recuperação de LDL. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, os resultados apresentados aqui sugerem que o DS presente na extração e o diluente fornecem as melhores recuperação e capacidade de reprodução.

Em certas modalidades, uma amostra purificada que contém lipoproteínas obtida através dos métodos da invenção é adicionalmente diluída antes da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Com referência à FIG. 6 e ao Exemplo 5, foi avaliado o efeito da presença ou da ausência de DS (+/- 5 pg/mL) em uma etapa de diluição de 1:200 com acetato de amônio a 25 mM antes da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Como mostrado na FIG. 6, há um aumento significativo na altura do pico de LDL na presença de DS, enquanto que o perfil do pico de HDL é relativamente inafetado.

Em certos aspectos e modalidades, a invenção considera métodos que empregam um composto que se liga à albumina conjugado com meios cromatográficos em combinação com DS e adicionalmente em combinação com uma solução de D₂O sob e adjacente a uma amostra que contém lipoproteínas em um tubo de centrífuga. Um procedimento típico que emprega este protocolo é fornecido no Exemplo 6.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram a centrifugação de uma amostra contendo lipoproteínas e de componentes que não são lipoproteínas, a amostra compreende ainda um ligante de captura sem ser de lipoproteína capaz de se ligar ao componente que não é lipoproteína para formar um complexo de não-lipoproteína/ligante de captura sem ser de lipoproteína, em que adicionalmente a centrifugação faz com que o complexo de não-lipoproteína/ligante de captura sem ser de lipoproteína seja separado dos componentes lipoprotéicos. Ligante de captura sem ser de lipoproteína e termos similares referem-se a compostos que se ligam a componentes do plasma que não são lipoproteínas. Os exemplos de ligantes de captura sem ser de lipoproteína incluem, sem limitação, anticorpos e aptâmeros que são entendidos na técnica. Por exemplo, sem limitação, a separação de anticorpo (isto é, como ligante de captura sem ser de lipoproteína) do antígeno (isto é, não-lipoproteína) pode ser realizada com uma variedade de métodos que incluem a modulação da temperatura, do pH, da concentração de sal e similares. Para exemplo adicional sem limitação, a separação de aptâmero (isto é, como ligante de captura sem ser de lipoproteína) do alvo do aptâmero (isto é, não-lipoproteína) pode ser realizada com uma variedade de métodos que incluem a modulação da temperatura, do pH, da concentração de sal, de DNase ou de RNase e similares.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que consideram a centrifugação de uma amostra contendo lipoproteínas e de componentes que não são lipoproteínas, A amostra compreende ainda um ligante de captura de lipoproteínas capaz de se ligar ao componente lipoprotéico para formar um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas, adicionalmente em que a centrifugação faz com que o complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas seja separado dos componentes que não são lipoproteínas. Ligante de captura de lipoproteínas e termos similares referem-se a compostos que se ligam a lipoproteínas. Os exemplos de ligantes de captura de lipoproteínas incluem, sem limitação, anticorpos e aptâmeros que são entendidos na técnica. Em modalidades preferidas, o ligante de captura de lipoproteínas é um anticorpo.

Em algumas modalidades de aspectos fornecidos aqui que não consideram a centrifugação de uma amostra contendo lipoproteínas e de componentes que não são lipoproteínas, o método considera um ligante de captura de lipoproteínas capaz de se ligar ao componente lipoprotéico para formar um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas.

O termo aptâmero refere-se a macromoléculas compostas de ácido nucléico, tal como RNA ou DNA, que se ligam fortemente a um alvo molecular específico. Os termos se liga(m), ligação e similares referemse a uma interação ou uma complexação que resulta em um complexo suficientemente estável de forma a permitir a separação. Em algumas modalidades, o aptâmero se liga especificamente a Apo A1, Apo B ou Apo(a). Os métodos para a produção e para a verificação de aptâmeros úteis para a presente invenção são bem-conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Griffin e outros, Patente U.S. N^s 5.756.291, incorporada aqui como referência em sua totalidade e para todas as finalidades.

Como praticado na técnica, o método de seleção (isto é, triagem) do aptâmero requer um conjunto de oligômeros de DNA aleatórios de filamento simples que compreendem tanto sequências aleatórias quanto regiões flanqueadoras de sequência conhecida para servir como um iniciador que se liga aos sítios para a amplificação através da reação em cadeia da polimerase (PCR) subsequente. Tais oligômeros de DNA são gerados utilizando métodos de síntese convencionais bem-conhecidos na técnica. Como uma etapa inicial e opcional, a amplificação através da PCR é realizada através de métodos convencionais e o conjunto amplificado é deixado na forma de DNA em dúplex ou utilizado na forma de DNA de filamento simples após a separação dos filamentos. Opcionalmente, pode ser realizada a transcrição em RNA. O termo conjunto de oligômeros neste contexto refere-se a tal DNA de filamento simples ou em dúplex ou RNA transcrito partindo do mesmo. O termo conjunto refinado de oligômeros refere-se a um conjunto de oligômeros que foi submetido a pelo menos uma rodada de seleção como descrito aqui.

Adicionalmente à triagem do aptâmero mencionada anteriormente, é realizada uma etapa de seleção empregando uma coluna ou outra matriz de suporte (isto é, suporte acoplado ao alvo) que possui a molécula alvo ligada à mesma. A ligação, bem-conhecida na técnica, pode ser através de meios covalentes ou não covalentes. O conjunto de oligômeros ou o conjunto refinado de oligômeros e o suporte acoplado ao alvo são incubados com a finalidade de permitir a formação de complexo oligonucleotídeo-alvo e a fração não complexada do conjunto de oligômeros ou do conjunto refinado de oligômeros é removida do ambiente de suporte, por exemplo, por lavagem através de métodos bem-conhecidos na técnica. A remoção subsequente de oligonucleotídeo através de métodos bem-conhecidos na técnica resulta em uma fração de conjunto refinado de oligômeros que possui maior especificidade pelo alvo em relação a um conjunto de oligômeros ou um conjunto refinado de oligômeros predecessor.

Altemativamente, a triagem do aptâmero mencionada anteriormente pode empregar uma etapa de seleção inversa em que o aptâmero é selecionado para se ligar com outros constituintes da amostra biológica. Neste caso, é empregada uma coluna ou outra matriz de suporte (isto é, suporte acoplado ao constituinte) que possui outros constituintes da amostra biológica ligados à mesma. O conjunto de oligômeros ou o conjunto refinado de oligômeros e o suporte acoplado ao constituinte são incubados com a finalidade de permitir a formação de complexo de oligonucleotídeoconstituinte e a fração não complexada do conjunto de oligômeros ou do conjunto refinado de oligômeros é removida do ambiente de suporte, por exemplo, por lavagem através de métodos bem-conhecidos na técnica. A remoção subsequente de oligonucleotídeo através de métodos bemconhecidos na técnica resulta em uma fração de conjunto refinado de oligômeros que possui maior especificidade por outros constituintes da amostra biológica em relação a um conjunto de oligômeros ou um conjunto refinado de oligômeros predecessor. Os exemplos de outros constituintes da amostra biológica utilizados na etapa de seleção inversa incluem, sem limitação, imunoglobulinas e albuminas.

Em um esquema de triagem de produção típico, o oligonucleotídeo recuperado após a complexação com o alvo ou outro constituinte da amostra biológica é submetido à amplificação através da PCR. As etapas de seleção/amplificação são então repetidas, tipicamente três até seis vezes, com a finalidade de fornecer conjuntos refinados de oligômeros com maior ligação e especificidade ao alvo ou outro constituinte da amostra biológica. As sequências amplificadas obtidas dessa maneira podem ser clonadas e sequenciadas. Opcionalmente, quando um grande número de sequências de aptâmeros individuais específicas para um alvo que foi obtido e sequenciado, a verificação de alinhamento em pares e múltiplos, bem-conhecida na técnica, pode resultar na elucidação de sequências consenso em que uma sequência ou região de nucleotídeos de opcionalmente nucleotídeos contíguos é identificada, cuja presença se correlacionada com a ligação do aptâmero ao alvo. Quando uma sequência consenso é identificada, os oligonu cleotídeos que contêm a sequência consenso podem ser produzidos através de meios sintéticos ou recombinantes convencionais.

O termo anticorpo refere-se a uma imunoglobulina que se liga ao antígeno (por exemplo, lipoproteína ou outro componente da amostra) com alta afinidade e alta especificidade. Neste contexto alta afinidade refere-se a uma constante de dissociação de, por exemplo, sem limitação, 1 μΜ, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM ou de maior afinidade, que caracteriza a reação de ligação do anticorpo com o antígeno para o qual o anticorpo foi produzido. O termo produzido refere-se à produção de anticorpo de alta afinidade através de métodos conhecidos há muito tempo na técnica. Ainda neste contexto, o termo alta especificidade refere-se a uma preferência de ligação de um antígeno alvo por um anticorpo de teste em relação a um antígeno que não é alvo caracterizada por uma razão de constantes de dissociação de, por exemplo, sem limitação, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 ou maior, em favor da ligação do antígeno alvo para o qual o anticorpo de teste foi produzido.

Os métodos de derivatização de anticorpos e aptâmeros considerados pela presente invenção incluem, por exemplo, sem limitação, biotinilação. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o aptâmero é biotinilado de forma que o isolamento subsequente sobre uma matriz conjugada de avidina, por exemplo, sem limitação, uma coluna de cromatografia de avidina, fornece uma separação rápida através de métodos bem-conhecidos na técnica de purificação bioquímica. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o aptâmero biotinilado no complexo com uma lipoproteína é adicionalmente submetido à esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina. O complexo ternário de lipoproteína-reagente de afinidade biotinilado-esfera magnética conjugada com estreptavidina é então isolado através de métodos imunomagnéticos bem-conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades deste aspecto, o ligante de captura de lipoproteínas é ligado a um suporte sólido através do uso de ligantes apropriados bem-conhecidos na técnica. Os exemplos de suportes sólidos incluem, sem limitação, partículas paramagnéticas, esferas, material de ma34 triz em gel (por exemplo, agarose, Sephadex®) e similares.

Adicionalmente a este aspecto, em algumas modalidades a presente invenção fornece métodos para a remoção de Lp(a) da amostra antes da centrifugação, cujo método inclui as etapas a seguir: (a) formação de um precipitado de Lp(a) através da mistura da amostra com um agente de precipitação para lipoproteínas contendo Apo B sob condições suficientes para causar a precipitação de Lp(a); e (b) isolamento do precipitado contendo Lp(a) da primeira solução. Agente de precipitação para lipoproteínas contendo Apo B e termos similares referem-se a compostos conhecidos por precipitarem Apo B, que são bem-conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades da presente invenção que consideram a purificação de lipoproteínas coletadas através de métodos de centrifugação fornecidos aqui, a presente invenção fornece métodos para a remoção de Lp(a) das lipoproteínas coletadas, cujos métodos incluem as etapas a seguir: (a) formação de um precipitado de Lp(a) através da mistura das lipoproteínas coletadas com um agente de precipitação para lipoproteínas que contêm Apo B sob condições suficientes para causar a precipitação de Lp(a); e (b) isolamento do precipitado contendo Lp(a) das lipoproteínas coletadas.

Adicionalmente aos métodos fornecidos aqui para a remoção de Lp(a) de uma solução contendo lipoproteína, um exemplo de agente de precipitação para Apo B é, sem limitação, DS na presença de cátion divalente. Em algumas modalidades, o cátion divalente é Mg²⁺. Foi observado que a inclusão de DS resulta em uma recuperação significativamente maior de LDL com pouco efeito sobre a recuperação de HDL. O DS pode ser misturado com uma amostra que contém lipoproteínas em uma concentração na faixa de aproximadamente 0,1 até 50 mg/mL. Em algumas modalidades, a concentração de DS é de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0 ou até mesmo de 50,0 mg/mL.

Em modalidades adicionais, a invenção fornece métodos para a obtenção de Lp(a) purificada, cujos métodos incluem as etapas a seguir: (a) solubilização do precipitado contendo Lp(a) obtido de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos aqui para isto; (b) mistura do Lp(a) solubilizado com um reagente de suporte sólido contendo uma lectina ligada a um suporte sólido sob condições adequadas para permitir a formação de um complexo de Lp(a)-lectina; (c) isolamento do complexo de Lp(a)-lectina; e (d) liberação da Lp(a) do complexo de Lp(a)-lectina, fornecendo assim lipoproteínas purificadas adequadas, por exemplo, para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial.

Adicionalmente a este método, a lectina pode ser selecionada do grupo que consiste em aglutinina de gérmen de trigo (WGA), aglutinina de feijão-de-lima (LGA), fitohemaglutinina (PHA) e lectina de límulo (HCL). Em algumas modalidades, a lectina é WGA. Em algumas modalidades, o suporte sólido inclui agarose. Os métodos de manipulação de tais lectinas, incluindo a reação com Lp(a) para formar um complexo, de isolamento de tal complexo e de ligação da lectina a um suporte sólido, são bem-conhecidos na técnica.

Adicionalmente a este método, em algumas modalidades a etapa de liberação inclui a lavagem do complexo de Lp(a)-lectina com um ligante competitivo para a lectina. Em algumas modalidades, o ligante competitivo é N-acetilglucosamina (NAG). Em algumas modalidades, a etapa de liberação inclui redução de dissulfeto, utilizando um reagente de redução de dissulfeto que é conhecido na técnica, para reduzir o dissulfeto que se liga à apo (a) e à Apo B, liberando assim LDL.

Em algumas modalidades da presente invenção que consideram a purificação adicional de lipoproteínas coletadas através de métodos de centrifugação fornecidos aqui, a presente invenção fornece métodos para a remoção de Lp(a) das lipoproteínas coletadas, cujos métodos incluem as etapas a seguir: (a) solubilização do precipitado contendo Lp(a) obtido de acordo com qualquer um dos métodos fornecidos aqui para isto; (b) mistura da Lp(a) solubilizada com gama globulinas e prolina; (c) precipitação da mistura através da adição de um agente de precipitação; e (d) recuperação da Lp(a) do precipitado, fornecendo assim lipoproteínas purificadas adequadas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial.

Como é conhecido na técnica, gama globulina refere-se à classe γ de imunoglobulinas. Os exemplos de agentes de precipitação incluem, sem limitação, sais de íons inorgânicos altamente carregados, preferencialmente sulfato de amônio. A concentração de gama globulinas útil para a presente modalidade pode estar na faixa de 0,01-0,1 pg/mL, 0,1-1,0 pg/mL, 1,0-2,0 pg/mL, 2,0-5,0 pg/mL, 5,0-10,0 pg/mL, 10,0-100 pg/mL, 100-1000 pg/mL ou ainda maior. A concentração de prolina pode estar na faixa de 10 μΜ-100 μΜ, 100100 μΜ, 1-2 mM, 2-5 mM, 5-10 mM ou ainda maior.

Adicionalmente aos métodos fornecidos aqui que consideram lipoproteína coletada, em algumas modalidades a solução que contém lipoproteínas está em contato com uma matriz de centrifugação inerte. Matriz de centrifugação inerte e termos similares no contexto de métodos de purificação por centrifugação da presente invenção referem-se a materiais que não reagem quimicamente com as lipoproteínas, mas que, todavia, aumentam a purificação. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que a matriz de centrifugação inerte atua para estabilizar o conteúdo de um tubo de centrifugação após a centrifugação de forma que, por exemplo, produtos artificiais introduzidos durante a desaceleração e/ou a pipetagem de lipoproteína ou outra fração do tubo é minimizada. Os exemplos de matrizes de centrifugação inertes incluem, sem limitação, suspensões de gel ou esferas inertes. Em algumas modalidades, a suspensão de gel é uma matriz de gel Sephadex®. Em algumas modalidades, a matriz de centrifugação inerte inclui esferas inertes. Os exemplos de esferas inertes incluem, sem limitação, esferas de vidro, esferas de poliestireno e similares, adaptadas para afundarem até o fundo da primeira solução em um tubo de centrífuga. As esferas inertes podem ser de qualquer tamanho conveniente, por exemplo, sem limitação, aproximadamente 0,1, 0,2, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2

mesmo menores ou maiores.

Em algumas modalidades do aspecto da presente invenção direcionadas aos métodos para a purificação de lipoproteínas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial através do uso de compostos polianiônicos e um ou mais cátions divalentes, o composto polianiônico é selecionado do grupo que consiste em DS, amilopectina e sulfato de polivinila, preferencialmente DS. Em algumas modalidades, o cátion divalente é selecionado do grupo que consiste em Mg²⁺ e Ca²⁺, preferencialmente Mg²⁺.

Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos para a purificação de lipoproteínas para a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, cujos métodos não incluem centrifugação. Em algumas modalidades, uma solução que compreende lipoproteínas e não-lipoproteínas é misturada com um ou mais ligantes de captura de lipoproteínas capazes de se ligar às lipoproteínas para formar um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas. Em algumas modalidades, após a formação de um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas, o complexo formado dessa maneira é isolado através de métodos conhecidos na técnica que incluem, sem limitação, métodos imunomagnéticos. Em algumas modalidades, após o isolamento de um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas, a lipoproteína é liberada do complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas através de métodos conhecidos na técnica e descritos aqui.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para a análise da distribuição de tamanhos de lipoproteínas através da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Em algumas modalidades, uma ou mais lipoproteínas são obtidas partindo de um fluido corporal tal como uma amostra de plasma de um indivíduo. Em algumas modalidades, a uma ou mais lipoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em HDL, LDL, Lp(a), IDL e VLDL. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a etapa de utilização da distribuição de tamanhos determinados das lipoproteínas para realizar uma avaliação do indivíduo, a avaliação selecionada do grupo que consiste em risco de saúde relacionado a lipídeos, estado de saúde cardiovascular, risco de doença cardiovascular e capacidade de resposta a uma intervenção terapêutica.

Avaliação no contexto de risco de saúde relacionado a lipí deos, estado de saúde cardiovascular e risco de doença cardiovascular, refere-se a uma correlação estatística da distribuição de tamanhos resultantes das lipoproteínas com mortalidade da população e fatores de risco, que são bem-conhecidos na técnica. A avaliação no contexto da capacidade de resposta a uma intervenção terapêutica refere-se à comparação da distribuição de tamanhos das lipoproteínas antes e depois de uma intervenção terapêutica ser realizada. Os exemplos de intervenções terapêuticas incluem, sem limitação, a administração de fármacos a um indivíduo com a finalidade de diminuir o colesterol no soro, de diminuir LDL, IDL e VLDL, Lp(a) e/ou de aumentar HDL, como é conhecido na técnica.

Em algumas modalidades, os resultados de análises de lipoproteínas são informados em um relatório de análise. Relatório de análise refere-se no contexto de análises de lipoproteínas e de outros lipídeos considerados pela invenção a um relatório fornecido, por exemplo, a um médico, outro profissional de cuidado da saúde, epidemiologista e similares, cujo relatório inclui os resultados de análise de um espécime biológico, por exemplo, uma amostra de plasma, de um indivíduo. Os relatórios de análise podem ser apresentados na forma impressa ou eletrônica ou em qualquer forma conveniente para análise, revisão e/ou arquivamento dos dados contidos nos mesmos, como é conhecido na técnica. Um relatório de análise pode incluir a identificação de informação em relação ao indivíduo do relatório, incluindo sem limitação nome, endereço, gênero, informação de identificação (por exemplo, número do seguro social, números do seguro) e similares. Um relatório de análise pode incluir a caracterização bioquímica dos lipídeos na amostra, por exemplo, sem limitação triglicerídeos, colesterol total, colesterol LDL e/ou colesterol HDL e similares, como é conhecido na técnica e/ou descrito aqui. Um relatório de análise pode incluir ainda a caracterização de lipoproteínas e faixas de referência para as mesmas, realizadas nas amostras preparadas através dos métodos fornecidos aqui. O termo faixa de referência e termos similares referem-se a concentrações de componentes de amostras biológicas conhecidas na técnica para refletir faixas normais observadas típicas em uma população de indivíduos. Os exemplos de caracteriza ção de lipoproteínas em um relatório de análise podem incluir as concentrações de lipoproteínas sem ser HDL e de Lp(a) determinadas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Exemplos adicionais de caracterização de lipoproteínas, determinada, por exemplo, através das análises de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial realizadas nas amostras preparadas através dos métodos da invenção, incluem a concentração e a faixa de referência para VLDL, IDL, Lp(a), LDL e HDL e subclasses das mesmas. Um relatório de análise pode incluir ainda a distribuição de tamanhos das lipoproteínas, que é obtida, por exemplo, através da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, de uma amostra preparada através dos métodos da invenção. Os registros incluídos em um exemplo de relatório de análise são fornecidos no Exemplo 7. EXEMPLOS

Exemplo 1 - Comparação de purificação de lipoproteínas utilizando D_?O e solução com baixo teor de sal

Uma amostra de soro (25 pL) foi processada utilizando uma solução de sal de baixa densidade (1,151 g/mL) (isto é, amostra de sal de baixa densidade) ou D₂O (200 pL cada). As amostras foram centrifugadas a 223.000 xG durante 3,7 h (amostra de sal de baixa densidade) ou 2 h (D₂O). Após a remoção dos 100 pL superiores depois da centrifugação, a amostra de sal de baixa densidade foi submetida à diálise contra uma solução de acetato de amônio solução e diluída a 1:200 antes da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. A amostra de D₂O foi diluída diretamente após a centrifugação a 1:200 com acetato de amônio antes da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Os resultados da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial são apresentados na FIG. 2.

Exemplo 2 - Efeito da purificação sobre a recuperação de Apo A, Apo B e TC.

Para avaliar se a HDL (Apo A1) foi preferencialmente perdida nos procedimentos que empregam D₂O, três amostras que são mostradas na FIG. 3 (isto é, 749, 1043, 14: números de identificação do paciente arbi trários e únicos) foram submetidas ao isolamento de lipoproteínas empregando D₂O junto com uma solução de RGD/DS (7,5/2,5 mg/mL, respectivamente) para remover a albumina. As amostras foram cada uma preparadas em cópias de seis. Os 100 pL superiores individuais isolados foram cada um analisados em relação ao conteúdo de Apo A1 (HDL), Apo B (LDL, IDL, VLDL) e colesterol total (TC). As apolipoproteínas Al e B do plasma ou do soro foram medidas através de ELISA padronizado utilizando anticorpos monoclonais de captura disponíveis comercialmente (Biodesign International, Saco, MN) e anticorpos policlonais de detecção de cabra anti humanos, purificados e biotinilados (International Immunology Corp., Murrieta, CA) em um ensaio imunológico no estilo sanduíche não competitivo. A concentração foi medida através da adição de peroxidase conjugada com estreptavidina seguida pelo desenvolvimento de coloração utilizando orto-fenilinadiamina. Os calibradores de lipoproteínas foram padronizados utilizando o material de referência de soro CDC #1883 (Center for Disease Control, Atlanta, GA) e soros de referência agrupados (Northwest Lipid Research Clinic, Seattle, WA). O colesterol total foi medido utilizando reagentes de kits de ensaio disponíveis comercialmente (Bayer Health Care, Tarrytown, NY) de acordo com as instruções do fabricante e modificados para a análise de 25 pL de soro ou plasma mais 200 pL de reagente de colesterol por poço de placa para microtitulação. Os padrões, os controles, as amostras e o fundo de reagentes foram medidos após o desenvolvimento de coloração utilizando uma leitora de placas para microtitulação. Os resultados (FIG. 3) mostram a recuperação média de cada amostra comparada com o total presente em cada soro. Sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, o procedimento de purificação não resultou na perda preferencial de HDL, como era julgado pela recuperação equivalente de Apo A1 e Apo B.

Exemplo 3 - Efeito da variação de RGD sobre a recuperação da fração de lipoproteínas.

Uma amostra de soro foi misturada com quantidades variáveis de RGD (10, 15, 20, 25 mg/mL) e incubada em gelo durante 15 min antes de ser colocada sobre uma camada de D₂O. Após a centrifugação durante 120 min a 223.000 xG, os 100 μΙ_ superiores foram removidos e diluídos 1:200 com uma solução de acetato de amônio. As amostras foram então analisadas através da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Os resultados são mostrados na FIG. 4.

Exemplo 4 - Purificação de lipoproteínas empregando RG 19, DS, AA

Com referência à FIG. 5, com a finalidade de avaliar o efeito de DS sobre a remoção de albumina e a recuperação de lipoproteínas tanto na extração/purificação quanto no diluente, uma amostra de soro (5 pL) foi extraída com 20 pL de 7,5 mg/mL de RGD isoladamente (legenda C/D na FIG. 5) ou 20 pL de uma combinação de 7,5 mg/mL de RGD e 2,5 mg/mL de DS (legenda A/B na FIG. 5). O peso molecular de DS utilizado tanto para a extração quanto para o diluente é de 10K. Após uma incubação de 15 min em gelo cada amostra foi centrifugada durante 2 h e 15 min a 223.000 xG a 10° C. Os 100 pL superiores foram removidos e diluídos 1:200 com uma solução de acetato de amônio a 25 mM (legenda B/D na FIG 5) ou acetato de amônio a 25 mM contendo 5 pg/mL de DS (legenda A/C na FIG 5).

Exemplo 5 - Resultado da purificação de lipoproteínas empregando DS no diluente

Com referência à FIG. 6, uma amostra de soro contendo lipoproteínas preparada através de uma separação de densidade de 18 h, utilizando métodos bem-conhecidos na técnica, foi empregada após a diálise para avaliar o efeito de DS no diluente sobre a recuperação de LDL. Uma alíquota da amostra de soro centrifugada foi diluída 1:200 com acetato de amônio a 25 mM na ausência de DS e submetida à análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Outra alíquota foi diluída 1:200 com acetato de amônio a 25 mM na presença de 5 pg/mL de DS. As corridas em duplicatas de cada amostra são mostradas na FIG. 6.

Exemplo 6 - Purificação de lipoproteínas empregando RG 19, DS, P₂O

As amostras que contêm lipoproteínas obtidas do plasma foram misturadas brevemente com o auxílio de um vortex. Cinco pL de amostra ou opcionalmente do controle, foram misturados com 20 pL de um reagente de remoção de albumina contendo 7,5 mg/mL de RGD (Sigma), 2,5 mg/mL de

DS (Sigma) e 0,5 mg/mL de EDTA (Spectrum Chemicals) e incubados em gelo durante 15 min. Após a incubação a mistura de amostra foi colocada sobre D₂O (Medicai Isotopes) 200 pL em um tubo de ultracentrífuga Ti 42.2 (Beckmann). As amostras foram então ultracentrifugadas a 10°C durante 135 min a 223.000 xG (42.000 rpm). Após a ultracentrifugação a fração de lipídeos (85 pL) foi removida da parte superior do tubo de centrífuga. Antes da análise através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, as amostras foram diluídas até uma diluição final de 1:800 em acetato de amônio a 25 mM, hidróxido de amônio a 0,5 mM, pH 7,4 para a análise de HDL. Para a análise de LDL as amostras foram diluídas 1:200 no mesmo diluente contendo 5 pg/mL de DS. As diluições finais foram realizadas em placas de 96 poços com poços fundos e colocadas em um autoamostrador com a pilha resfriada mantida a 6°C, antes da análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial.

Exemplo 7 - Resultado da purificação e da análise de lipoproteínas em amostras de soro

O soro foi separado do sangue total coletado através da perfuração da veia. Após a separação o soro foi dividido em três partes, uma alíquota foi analisada em relação ao conteúdo de HDL, triglicerídeos e colesterol total utilizando métodos tradicionais bem-conhecidos na técnica. A LDL foi calculada partindo destes resultados. Em modalidades preferidas, se os triglicerídeos fossem superiores a 400 mg/dL então a LDL era medida diretamente. A segunda alíquota foi analisada em relação ao seu conteúdo de Lp(a) utilizando um ensaio imunológico, bem-conhecido na técnica. A análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial foi empregada para a terceira alíquota para fracionar as lipoproteínas.

Em um procedimento de produção típico, a(s) amostra(s) junto com os controles, uma amostra conhecida como sendo o padrão A de LDL (controle A) e uma amostra conhecida como sendo o padrão B (controle B) como é conhecido na técnica, são colocadas sobre o Perkin Elmer JANUS multi-sonda. 30 pL dos controles e da(s) amostra(s) são transferidos para um tubo separado e misturados e 120 pL da solução de RG19 dextran, DS,

EDTA são adicionados. Os tubos são então transferidos para o gelo durante uma incubação de 15 minutos. Após a incubação de 15 min os tubos são devolvidos para a multi-sonda. Nesse meio tempo, os tubos de centrífuga tiveram duas esferas de 4 mm adicionadas aos mesmos e estes são então colocados na multi-sonda em que 120 pL de D₂O são adicionados em cada tubo de centrífuga. Os controles e a(s) amostra(s) são então colocadas sobre o D₂O através da multi-sonda antes de serem transferidos para o rotor da ultracentrífuga (Ti 42.2). As amostras são então centrifugadas durante 135 min a 10°C a 223.000 xG (42.000 rpm). Após a centrifugação, os tubos de centrífuga são removidos cuidadosamente e colocados na multi-sonda em que os 85 pl_ superiores (+/- 5 pL) são removidos para um tubo separado. Uma vez que todas as amostras foram coletadas, a multi-sonda produz duas diluições para cada controle e amostra. Uma diluição é uma diluição final de 1:200 com solução de acetato de amônio contendo 5 pg/mL de DS; a segunda é uma diluição de 1:800 apenas com a solução de acetato de amônio. As duas diluições são então corridas no instrumento de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Após a análise, os números das partículas são convertidos em nmol/L utilizando conversões bemconhecidas na técnica. Os dados da corrida de HDL (1:800) e das lipoproteínas maiores (1:200) são combinados e relatados juntos com os dados bioquímicos das alíquotas 1 e 2. O perfil das lipoproteínas também é relatado assim como a concentração de partículas de LDL totais e o tamanho de partículas máximo de LDL, que é utilizado para determinar o fenótipo de LDL. Um exemplo de relatório de avaliação resultante da combinação destes dados é fornecido na Tabela 2 (representação numérica) e na FIG. 7 (representação gráfica do perfil de lipoproteínas).

Tabela 2. Fração de Lipoproteínas através da Mobilidade lônica
Componente do Ensaio	Dentro da Faixa	Fora da Faixa	Unidades	Faixa de Referência
Painel de Lipídeos
Colesterol, Total		328 (alto)*	mg/dL	<200
Colesterol LDL		249 (alto)	mg/dL	<130
Colesterol HDL	62		mg/dL	>50
Colesterol VLDL	17		mg/dL	<30
Triglicerídeos	85		mg/dL	<150
Colesterol sem ser HDL		266 (alto)	mg/dL	<160
Lipoproteína (a)	25		mg/dL	<75
Perfil de Partículas de LDL
Partículas de LDL, Total	886		nmol/L	272-1181
Tamanho das Partículas de LDL	228,1		Ang	215,4-232,9
Fenótipo de LDL	A		Tipo**	A
Partículas de Lipoproteínas
LDL I grande		226 (alto)	nmol/L	51-186
LDL II grande	426		nmol/L	91-574
LDL III pequena	187		nmol/L	82-442
LDL IV pequena	47		nmol/L	33-129
HDL 2b grande	1425		nmol/L	384-1616
HDL 2a intermediária		5616 (alto)	nmol/L	903-3779
HDL 3 pequena		9229 (alto)	nmol/L	475-4244
IDL 1 grande		39 (alto)	nmol/L	10-38
IDL 2 pequena		66 (alto)	nmol/L	11-48
VLDL grande		1,9 (alto)	nmol/L	0,2-1,8
VLDL intermediária		6,4 (alto)	nmol/L	1,0-5,7
VLDL pequena	25,1		nmol/L	5,8-26,6

* Alta e Baixa referem-se à faixa acima ou abaixo, respectivamente.

** Tipo refere-se ao fenótipo que é determinado pelo tamanho de partículas com limite aproximadamente em LDL II (215,4 A), como é conhecido na téc5 nica.

Para a obtenção de um perfil de lipoproteínas mais acurado utilizando a análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferenci45 al que é discutida anteriormente, é possível ajustar os resultados para qualquer perda de lipoproteína durante a manipulação (por exemplo, centrifugação, pipetagem e diluições da amostra) antes dos aparelhos de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Isto pode ser conseguido através da adição de um ou mais tipos de lipoproteínas marcadas em uma amostra como um padrão interno. Seguindo a marcação durante o processamento, a recuperação da lipoproteína marcada pode ser utilizada para ajuste acima da concentração da mesma lipoproteína, mas não marcada, presente na amostra original. Por exemplo, uma alíquota do isolado de lipoproteínas após a centrifugação é medida em relação ao sinal fluorescente e comparada com uma alíquota diretamente da amostra de estoque inicial (não centrifugada). A diferença no sinal representa a proporção de amostra desconhecida recuperada e permite um cálculo mais acurado da concentração de lipoproteínas no plasma ou no soro.

O método a seguir foi utilizado para conjugar uma molécula fluorescente às subtrações de HDL. Este método pode ser aplicado em outros tipos de lipoproteínas. A HDL foi isolada do plasma através da flotação sequencial para a obtenção de lipoproteínas com um intervalo de densidade de 1,063-1,20 g/mL. A fração de HDL total foi então submetida à diálise com a densidade básica de sal de 1,184 g/mL e centrifugada durante 28 h a 40.000 rpm, 10°C em um rotor Beckman 50.3 de ângulo fixo. O tubo de centrífuga de 6 mL foi então pipetado para a obtenção de subfrações de HDL predominantemente grandes, intermediárias e pequenas, T[0-1], T[1 -3] e T[3-6], respectivamente. As subfrações foram então submetidas à diálise contra 100 mM de NaHCO₃, pH 8,5, 4°C durante a noite. A concentração de proteína foi medida em cada subfração utilizando o método de Lowry.

As subfrações de HDL foram então marcadas com a sonda fluorescente AlexaFluor 488 (ácido carboxílico, 'isômeros mistos' de éster succinimidílico, Molecular Probes Cat # A-20000, Peso Molecular 643,42, Abs @494 nm/Em 517 nm) de acordo com as instruções do fabricante. Sucintamente, as subfrações de HDL foram combinadas com AF488 a uma proporção ótima sugerida de 10:1 (p/p) mantendo as concentrações ótimas de HDL e AF488, >2 mg/mL e 10 mg/mL, respectivamente. O protocolo e as quantidades das soluções utilizadas são listados abaixo na Tabela 3.

Tabela 3: Misturas de Incubação

	Stk Ligante Co	Stk Co AF488	Vol. Total	Sol. total
mg/ml	μΙ	mg	mg/ml	μΙ		mg	μΙ	μΙ
HDL Sol. Interrupção T[0-1]		3,59	560	2,01	10	20,104		0,2010	580	40
T[1-3]		3,18	625	1,99	10	19,875		0,1988	645	40
T[3-6]		6,39	785	5,02	10	50,162		0,5016	835	100
	Total	90,1405		0,901405

- Adicionar a subtração de HDL no frasco de vidro com bastão de agitação magnética

- Durante a agitação à temperatura ambiente, adicionar o volume de AF488 ao ligante lentamente.

- Incubar a mistura durante 1 hora com agitação contínua.

- Adicionar a Solução de Interrupção (1,5 M de Tris, pH 8,0). Incubar à temperatura ambiente 30 min.

- Submeter à diálise as Subtrações de HDL marcadas em 20 mM de Tris, 150 mM de NaCI, 0,27 mM de EDTA, pH 8 [em caixa fgria, proteger da luz] vs. 1 litro durante a noite e alterações do volume do produto da diálise 2 x IL.

As sufrações de HDL marcadas com AF488 foram então testadas em relação à sensibilidade do sinal em várias diluições em tampão de 250 até >30000. As subtrações de HDL marcadas foram então testadas em relação à sensibilidade do sinal quando diluídas em várias preparações de plasma antes e depois da centrifugação para o isolamento de lipoproteínas.

Os testes de diluição e de sensibilidade adicionais foram realizados após um segundo isolamento por centrifugação das subtrações de HDL marcadas em uma densidade <1,23 g/mL para remover a marcação fluorescente não conjugada dos conjugados de HDL:AF488.

A sonda fluorescente fluoresceína 5-EX, éster succinimidílico, obtida na Molecular Probes (Cat # F-6130), foi utilizada para marcar as subtrações de HDL da mesma maneira que a descrita anteriormente para

AF488. Os métodos anteriores também foram utilizados para marcar de forma fluorescente VLDL e LDL. Testes adicionais foram realizados em padrões de peso molecular combinados com marcação flurescente (Pharmacia HMW Standard Mix) contendo tiroglobulina, apoferritina, catalase, lactato 5 desidrogenase e albumina.

Nas modalidades de aspectos da presente invenção que consideram a análise e/ou a exibição das distribuições de lipoproteínas, como exemplificado sem limitação pela FIG. 1, pela FIG. 7 e similares, os dados de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial, obtidos com um 10 analisador de mobilidade iônica, podem ser processados antes da apresentação para interpretação clínica. A não ser que seja especificado de outra maneira, dados de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial e termos similares no contexto de dados brutos provenientes de uma análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial ou da15 dos processados para apresentação para interpretação clínica, referem-se às distribuições de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial que possuem uma variável independente correlacionada com o diâmetro de uma partícula e uma variável dependente observada correlacionada com a contagem de partículas. Em algumas mo20 dalidades, a variável independente é a voltagem ou o campo elétrico correspondente gerado pela voltagem (ver Eqn. 3). Em algumas modalidades, a variável independente é o diâmetro das partículas. Em algumas modalidades, a variável dependente é a contagem de partículas. Em algumas modalidades, a variável dependente é o número de partículas contado durante um 25 período de tempo especificado, por exemplo, sem limitação 0,001-0,01, 0,01-0,1,0,1-1, 1-2 s ou ainda mais longo. Em algumas modalidades, o período de tempo especificado é de 0,1 s.

Processamento dos dados de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial e termos similares referem-se às manipulações 30 dos dados, cujas manipulações, quando compreendidas no total, podem fornecer resultados gráficos e/ou numéricos que acuradamente e de forma que pode ser reproduzida refletem a distribuição e/ou as concentrações de lipo proteínas de classes individuais de lipoproteínas e subclasses das mesmas, dentro de uma amostra. Os exemplos de manipulações úteis no processamento dos dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial incluem, sem limitação, a multiplicação por uma constante, a convolução com uma função, a adição e/ou a subtração de um valor numérico constante ou uma função que inclui, sem limitação, a correção em relação à contribuição de um contaminante, uma integração numérica, uma uniformização e outras manipulções aritméticas conhecidas na técnica. Consequentemente, o processamento dos dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial pode empregado para uma variedade de razões, incluindo sem limitação, a correção para refletir de forma acurada as concentrações fisiológicas de lipoproteínas em uma amostra, o escalonamento para corrigir em relação a um instrumento específico e às eficiências do processo, a remoção de dados que representam contribuições de um contaminante e similares. Instrumento específico e eficiências do processo e termos similares referem-se à detecção e à correção em relação a alterações na concentração de analito (por exemplo, lipoproteína) durante o processamento e a análise. Os exemplos específicos de eficiências do instrumento específico incluem uma diluição aparente introduzida durante o eletropulverização em que a formação do cone de Taylor resulta em uma diluição aparente da lipoproteína no fluxo de gás carregado de partículas resultante. As eficiências são medidas através de métodos que empregam instrumentos que possuem eficiências quantificadas bem-conhecidas pelos versados na técnica. Contribuição de um contaminante e termos similares no contexto dos dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial referem-se a dados, por exemplo, sem limitação, contagem de partículas partindo de um instrumento de mobilidade iônica, que resultam de espécies que não são lipoproteínas contadas no instrumento de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial e incluídos nos dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma dife49 rencial obtidos do mesmo. Os exemplos de espécies que não são lipoproteínas neste contexto incluem, sem limitação, qualquer reagente divulgado aqui e albumina na forma monomérica e/ou multimérica.

Em algumas modalidades, a contribuição para os dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial causada por um reagente descrito aqui é subtraída dos dados de distribuição de tamanhos através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial durante o processamento dos dados. Por exemplo, sem desejar ficar limitado a qualquer teoria, acredita-se que uma contribuição causada por RGD nos dados de distribuição de tamanhos de partículas provenientes de uma análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial (isto é, dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial que possuem contagem de partículas versus o diâmetro das partículas) pode ser representada por uma ou mais funções exponenciais de decomposição ao longo de regiões de diâmetros selecionados. Consequentemente, em algumas modalidades os dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial são ajustados em uma região selecionada para funcionar possuindo a forma da Eqn 4:

₊ (-0.7*d) v, =k_} e (4) em que yi é o melhor ajuste para a contribuição para a mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial que é determinado através de métodos bem-conhecidos na técnica, /q é uma constante empírica do ajuste e d é o diâmetro das partículas. A Eqn. 4 acima é válida para diâmetros das partículas maiores que 2 nm. Em algumas modalidades, a região do ajuste é de

3-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-6 ou 5-6 nm (diâmetro das partículas), preferencialmente 3-4 nm. Em algumas modalidades, o conjunto inteiro de dados de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial é corrigido pela função que resulta de um ajuste na Eqn. 4.

Em algumas modalidades, os dados de distribuição de tama nhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial são adicionalmente processados para explicar uma contribuição causada pela inclusão de albumina na amostra tirada para análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial. Em algumas modalidades, a construção de uma correção para albumina (isto é, curva de correção para albumina) é inicialmente fornecida por uma função com um conjunto de variáves que possui a forma a seguir:

Região	Região dependente de variável, nm	Correção funcional
1	0 <= d < 7	0
2	7 <= d < 7,1	y2=k2*e (-2·56*7·1) Eqn. (5)
3	7,1 < = d <8,5	y3=k3*e ('2’56‘d) Eqn. (6)
4	8,5 <= d < 15	Empírica (proveniente de dados de albumina padrão)

em que y₂ e y₃ são os valores funcionais nas regiões 2 e 3, respectivamente, k2 e kz são constantes empíricas determinadas pelos métodos bemconhecidos na técnica e d é o diâmetro das partículas. Empírico (proveniente de dados de albumina padrão) refere-se ao efeito sobre os dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial da subtração da distribuição de uma quantidade de albumina equivalente à quantidade de albumina na distribuição medida.

Em algumas modalidades, a curva de correção para albumina é adicionalmente modificada para explicar a presença do dímero de albumina. Foi observado de forma empírica que o dímero de albumina está tipicamente presente em amostras para análise de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial na faixa de 1-10%, 1-8%, 2-8%, 2-7%, 2-6%, 2-5%, preferencialmente 2% e que uma curva de correção para albumina pode ser escalonada em uma região particular para explicar e suprimir gradualmente, a presença do dímero de albumina. Em algumas modalidades, o limite inferior de diâmetro desta região particular é de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou ainda de 12 nm. Em algumas modalidades, o limite superior de diâmetro desta região particular é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou ainda de 15 nm. Em algumas modalidades, a faixa desta região particular é de 0-15, 5-10, 7-9, preferencialmente de 7,9-8,4 nm. Consequentemente, a curva de correção para albumina pode ser modificada por uma função que possui a forma de Eqn 7:

y' = y* ((d - limite inferior) * 2 * dímero + (limite superior - d)*2) (7) em que y é a curva de correção para albumina, y* é a curva de correção para albumina após a supressão gradual da presença de dímero de albumina, d é o diâmetro das partículas, limite inferior e limite superior são os limites de tamanhos inferior e superior para a correção, respectivamente e dímero é a porcentagem selecionada de concentração de dímeros. Em algumas modalidades, a região em que a presença de dímero é suprimida fica entre 7,9 nm (limite inferior) e 8,4 nm (limite superior).

Em algumas modalidades, uma curva teórica que representa um monômero de albumina é ajustada à distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial de uma amostra em uma região particular, utilizando métodos de ajuste de curvas bem-conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, esta curva teórica é representada por uma função que possui a forma de Eqn. 8:

y. (8) em que y_m é a distribuição de números teóricos de monômero de albumina, k_m e k_a são constantes derivadas empiricamente. Em algumas modalidades, k_a está na faixa de 0,1-10, 1-5, 2-4 ou 2-3. Em algumas modalidades, k_a é 2,56. Em algumas modalidades, esta região particular é a faixa de 0-15, 510, 6-9, 7-8, preferencialmente de 7,3-7,5 nm. Em algumas modalidades, após a determinação da contribuição de monômero de albumina que resulta no melhor ajuste à Eqn. 8, os dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial são corrigidos através da subração da Eqn. 7 dos mesmos, escalonados pela mesma contribuição. Em algumas modalidades, a correção fornecida pela subtração da Eqn. 7 é realizada em uma região particular, por exemplo, sem limitação, 0-15, 2-12, 4-10, preferencialmente 6-10 nm. Em algumas modalidades em que a correção não considera a faixa de 10-11 nm, uma correção correspondente na região de 10-11 nm é realizada através da multiplicação de Eqn 7, por um fator de (11-diâmetro) e da subtração do resultado proveniente dos dados de distribuição de tamanhos de partículas através da mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial.

O processo descrito anteriormente pode ser implementado em uma variedade de dispositivos eletrônicos, tais como computadores do tipo desktop ou laptop ou dispositivos portáteis, por exemplo. Tais dispositivos são bem-conhecidos pelos versados na técnica. Adicionalmente, os resultados podem ser exibidos em um monitor, impressos ou armazenados em um dispositivo de memória, tal como um disco rígido, um CD ROM, um CD R/W, uma memória flash ou similar. Ainda, os resultados podem ser tornados disponíveis para outros dispositivos através de uma rede, que pode ser uma rede privada ou uma rede pública, tal como a Internet. Sob este aspecto, o dispositivo eletrônico e/ou o dispositivo de memória pode ser acessível através da rede.

Em uma modalidade, os valores medidos são comparados com faixas determinadas empiricamente para a realização de um diagnóstico baseado nos valores no soro ou no plasma de um paciente que se encaixam dentro ou fora de uma faixa. A tabela abaixo ilustra um exemplo de conjunto de faixas para tal diagnóstico:

LDL Total	1189	1279
1	1
272	508

HDL 2b	1616	1153
1
384	169
HDL 2a _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________1	3779	3744
1	1
903	1174
HDL 3	4224	3344
	1
475	613
nmol/L	Feminino	Masculino

LDL I	186	164
1	1
IO	48
LDL II	574	596
	1
o	200
LDL III	442	627
	•
82	136
LDL IV	129	164
i	1
33	38
mmol/L	Feminino	Masculino

Tamanho de partícula de LDL (A)	232,9	230,9
1	1
215,4	212,3
mmol/L	Feminino	Masculino

IDL 1	38	r—
I	1
o
IDL 2	48	59
1
-	CXI
mmol/L	Feminino	Masculino

οο

ΙΟ cxí φ σ c Ε σ>

ο c φ Ζ3 cr φ ο.

CM CXI ο ο“ r- co ιο~ r-

Feminino 5,8 - 26,6

Masculino 5,0 - 23,0

A espectrometria de mobilidade de partículas carregadas de forma diferencial fornece uma maneira de medir a distribuição de tamanhos de nanopartículas com base na mobilidade elétrica das partículas em fase gasosa. Esta metodologia foi adaptada para medir a distribuição de tamanhos de partículas de lipoproteínas. O método foi automatizado e gerou perfis de número de partículas e massa de partículas versus o diâmetro das partículas em aproximadamente um minuto. As lipoproteínas são primeiramente enriquecidas (remoção das proteínas do plasma) através de ultracentrifugação e então diluídas em um tampão volátil e submetidas a eletropulverização. Um processo de neutralização de carga deixa uma fração bem caracterizada das partículas com uma única carga. As partículas carregadas são puxadas através de um Analisador de Mobilidade Diferencial (DMA), que permite que as partículas de um tamanho restrito passe para um contador de partículas como uma função de uma voltagem aplicada ao DMA. Através da varredura da voltagem aplicada, são obtidas as distribuições dos números de partículas para HDL, LDL, IDL e VLDL. As medidas se baseiam nos primeiros princípios e não precisam ser calibradas em relação ao tamanho de partícula. As distribuições dos números de partículas são convertidas nas distribuições de massas de partículas. Utilizando este método, a variação intraensaio em relação ao diâmetro de LDL era <0,6%, em relação à concentração, <10% para HDL e LDL e <15% para IDL e VLDL. A capacidade de reprodução interensaio era <1,0% em relação ao tamanho de partícula de LDL e em relação à concentração, <15% para HDL e LDL e < 20% para IDL e < 25% para VLDL. A tabela a seguir mostra o resumo dos dados, expressos como média e SD, utilizados para gerar faixas de referência para as frações de lipoproteínas individuais. Um total de 259 indivíduos saudáveis (191 F, 68 M) que satisfaziam os critérios atuais de NCEP ΑΤΡ III para níveis ótimos de lipídeos/lipoproteínas: colesterol total (col) <200, col LDL <100, col HDL >40 (M) >50 (F), triglicerídeo <150 mg/dL foi utilizado neste estudo. Os resultados mostram a diferença esperada entre os gêneros, indivíduos do sexo masculino possuindo maiores concentrações de partículas de LDL menores e indivíduos do sexo feminino possuindo maior HDL 2b.

Ρ sexo masculino versus sexo feminino

0,003

0,007

0,506

<0,003

<0,003

SD nmol/L

σ>

v*

o

C\l

5,7

4,8

CO_

1,6

0,4

9*0

Média nmol/L

CO

20

25

29

CM

10,7

3,0

3,7

6*0

1,2

Gênero

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Fração de Lipoproteí- na

IDL 1 _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________i

IDL 2

VLDL pequeno

VLDL intermediário

VLDL grande

P sexo masculino versus sexo feminino

0,071

<0,003

0,850

<0,003

<0,003 I

<0,003

0,012

<0,003

CO O O o V

SD nmol/L

! 847

602

299

258

719

655

24

cõ

103

125

125

σ>

35

Γ 29

227

co σ> T~

Angstron

4,48

4,19

Média nmol/L

1443

1646

834

494

2343

2325

70

84

212

313

336

407

CM

! 100

727

893

Angstron

225,7

221,7

Gênero

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino |

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Feminino

Masculino

Fração de Lipoproteí- na

HDL 3

HDL 2b

HDL 2a

LDL IV

LDL III

LDL II

LDL I

LDL Total

Diâmetro do Pico de LDL

Foram determinadas as faixas para o restante da população (anormal) com um ou mais critérios fora das normas de procedimentos de ATP III. Estas exibiam diferenças esperadas com maiores concentrações de LDL menor assim como menor tamanho e menor concentração de HDL 2b (B) com pouca alteração em HDL 2a e 3.

Os métodos descritos anteriormente podem ser realizados em uma variedade de aparelhos. Por exemplo, a Patente U.S. N² 7.259.018 a Benner e outros descreve um aparelho através do qual uma solução de amostra em um tubo de centrifugação é expelida através de um tubo capilar no qual se torna ionizada através do processo de eletropulverização à medida que sai do tubo capilar. Assim, a pressão diferencial causada pela câmara pressurizada transfere a amostra ionizada para um fluxo de gás, que então carrega a amostra para um analisador de mobilidade. Uma vez que a amostra no tubo de centrifugação é analisada, outro tubo de amostra é colocado dentro da câmara pressurizada. Neste arranjo, entretanto, uma vez que somente um volume pequeno de amostra é fornecido a qualquer momento para um tubo de centrifugação, a vazão da amostra ao longo do capilar pode variar substancialmente ao longo do tempo mesmo se a pressão na câmara pressurizada for mantida, afetando assim as determinações quantitativas provenientes do analisador de mobilidade iônica baseadas nas vazões previstas.

As modalidades da presente invenção estão direcionadas a estas preocupações. De acordo com as modalidades da invenção, uma vazão constante é atingida através do bombeamento da amostra através de um capilar e através da ionização (ou adição de cargas) da amostra dentro do capilar durante o fluxo para o analisador de mobilidade iônica. A Figura 8 ilustra um exemplo de aparelho para análise de mobilidade de íons de acordo com uma modalidade da invenção. O aparelho de análise de mobilidade de íons 10 da Figura 8 inclui um analisador de mobilidade iônica 20 similar ao que é ilustrado na Patente U.S. N² 7.259.018. O analisador de mobilidade iônica 20 é capaz de contar as partículas que fluem através do mesmo. O analisador de mobilidade iônica 20 pode ser fornecido com um dispositivo eletrônico (não mostrado), tal como um computador, capaz de processar os dados de acordo com, por exemplo, o algoritmo descrito anteriormente.

Um fluxo de partículas carregadas da amostra é fornecido ao analisador de mobilidade iônica 20 partindo de um autoamostrador 22. O autoamostrador 22 pode ser um sistema robótico para fornecer automaticamente uma amostra. Um tal autoamostrador é o modelo HTC PAL, Leap Technologies of Carrboro, North Carolina. Em uma modalidade, o autoamostrador é um dispositivo robótico que fornece apenas a amostra purificada partindo de uma prateleira de tubos ou partindo de uma placa de vários poços para a(s) bomba(s). O autoamostrador 22 pode fornecer um suprimento substancialmente contínuo de amostras para análise de mobilidade de íons sem a necessidade de intervenção humana substancial.

A amostra proveniente do autoamostrador 22 é fornecida para uma primeira bomba 26 através de uma porta de injeção 24. Sob este aspecto, o autoamostrador 22 pode incluir um reservatório (não mostrado) no qual a amostra purificada fica contida. A porta de injeção 24 pode ser uma parte da primeira bomba 26. A primeira bomba 26 é uma bomba de alta vazão (ou alto fluxo) capaz de bombear a amostra partindo do autoamostrador 22 a uma vazão relativamente alta (por exemplo, maior que ou igual a 1,0 microlitro por minuto). Em uma modalidade, a bomba de alta vazão bombeia a amostra partindo do autoamostrador 22 a uma taxa de aproximadamente

5-20 microlitros por minuto. Mais preferencialmente, a bomba de alto fluxo bombeia a amostra a uma taxa de aproximadamente 10 microlitros por minuto. As bombas de alto fluxo adequadas são obtidas na Eksigent Technologies, 2021 Las Positas Ct Suite 161, Livermore, CA.

Partindo da primeira bomba 26, a amostra é fornecida para uma segunda bomba 30. A segunda bomba 30 é uma bomba de vazão baixa (ou de nanofluxo) capaz de bombear a amostra para um capilar 34 a uma taxa relativamente baixa (por exemplo, menor que ou igual a 1,0 microlitros por minuto) para possibilitar a inonização ou a adição de cargas apropriada das partículas da amostra, como descrito abaixo. Em uma modalidade, a bomba de nanofluxo bombeia a amostra para o capilar a uma taxa de aproximada mente 100-200 nanolitros por minuto. Mais preferencialmente, a bomba de nanofluxo bombeia a amostra a uma taxa de aproximadamente 200 nanolitros por minuto. As bombas de nanofluxo adequadas são obtidas na Eksigent Technologies, 2021 Las Positas Ct Suite 161, Livermore, CA.

Em uma modalidade, uma montagem de bombas de combinação pode ser utilizada no lugar das duas bombas. Por exemplo, uma montagem de bombas pode incluir um componente de alto fluxo e um ou mais componentes de nanofluxo. Um exemplo de montagem de bombas de combinação é NanoLC 1-D, disponível na Eksigent Technologies, 2021 Las Positas Ct Suite 161, Livermore, CA.

Em uma modalidade, a primeira bomba 26 pode fornecer a amostra para um grande número de bombas de nanofluxo através de uma única válvula 28 ou de um grande número de válvulas.

O fluxo até e ao longo do capilar 34 pode ser controlado através de uma válvula 32, que pode fazer parte da segunda bomba 30 ou pode ser uma válvula separada posicionada dentro do capilar 34. A válvula 32 garante uma vazão constante da amostra ao longo do capilar 34 a jusante da válvula 32. A válvula 32 pode ser controlada eletronicamente para manter a vazão constante. Sob este aspecto, a válvula pode ser controlada em resposta a sensores ou medidores posicionados a jusante da válvula 32.

As partículas da amostra são carregadas durante seu fluxo ao longo do capilar 34 por um ionizador 40. Como será entendido pelos versados na técnica, a ionização ou a adição de cargas real das partículas pode ocorrer à medida que as partículas saem do capilar para dentro do analisador de mobilidade iônica. Em uma modalidade, o ionizador 40 é uma montagem de uniões condutoras posicionada ao redor de uma posição do capilar 34. Uniões condutoras (também conhecidas como junções condutoras) aplicam uma corrente elétrica ao redor de um fluxo muito fino para fornecer uma carga elétrica para o fluxo. Um exemplo de montagem de uniões condutoras é descrito na Patente U.S. N- 7.075.066, que é incorporada aqui como referência em sua totalidade. As partículas carregadas da amostra são então fornecidas através do capilar 34 para o analisador de mobilidade iônica 20.

As Figuras 9A e 9B ilustram exemplos de modalidades da união condutora para uso na adição de cargas ao fluxo das partículas da amostra ao longo do capilar. Com referência primeiramente à Figura 9 A, uma montagem de uniões condutoras 40a é formada ao redor do capilar 34. Uma região de ionização 35 do capilar 34 é circundada por uma união condutora 42. Uma voltagem aplicada à união condutora 42 leva à adição de cargas nas partículas no fluxo através da região de ionização 35 do capilar 34. Para uma explicação detalhada da operação da montagem de uniões condutoras 40a, pode-se fazer referência à Patente U.S. N- 7.075.066.

Agora com referência à Figura 9B, outra modalidade de uma montagem de uniões condutoras é ilustrada. Na modalidade da Figura 9B, uma montagem de uniões condutoras 40b forma uma região de microtite 37 em uma parte do capilar 34 ao longo do qual a amostra flui. A região de microtite 37 pode formar uma junta ou um selo, entre duas seções do capilar. A região de microtite 37 possui um pequeno volume inerte no qual as partículas da amostra são carregadas. Em uma modalidade, a região de microtite 37 possui um volume inerte de aproximadamente 5-50 nanolitros. Em uma modalidade mais preferida, a região de microtite 37 possui um volume inerte de aproximadamente 10-15 nanolitros. A região de microtite 37 é preferencialmente formada de aço inoxidável. A montagem de uniões condutoras 40b inclui uma união condutora 44 formada ao redor da região de microtite 37. Uma voltagem aplicada à união condutora 44 causa a adição de carga nas partículas no fluxo ao longo da região de microtite 37.

Assim, o analisador de mobilidade iônica 20 é fornecido com um nanofluxo controlado da amostra a uma taxa substancialmente invariável de tempo. Sob este aspecto, a vazão varia preferencialmente em menos de cinco por cento de uma taxa nominal, mais preferencialmente em menos que dois por cento e, mais preferencialmente em menos que um por cento. Isto permite que uma análise mais coerente e confiável seja realizada pelo analisador de mobilidade iônica 20.

Todas as patentes e outras referências citadas no relatório descritivo são incorporadas como referência em suas totalidades, incluindo quaisquer tabelas e figuras, até a mesma extensão como se cada referência tivesse sido incorporada como referência em sua totalidade individualmente.

Um versado na técnica consideraria rapidamente que a presente invenção está bem adaptada para a obtenção das finalidades e das vantagens mencionadas, assim como as inerentes aqui. Os métodos, as divergências e as composições descritas aqui como representantes atuais de modalidades preferidas são exemplos e não é pretendido que sejam limitações do âmbito da invenção. As alterações contidas aqui e outros usos que ocorrerão aos versados na técnica, que são abrangidos dentro do espírito da invenção, são definidos pelo âmbito das reivindicações.

Será facilmente evidente para um versado na técnica que substituições e modificações variáveis podem ser realizadas na invenção divulgada aqui sem se afastar do âmbito e do espírito da invenção. Assim, tais modalidades adicionais estão dentro do âmbito da presente invenção e das reivindicações a seguir.

A invenção descrita de forma ilustrativa aqui pode ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente divulgados aqui. Assim, por exemplo, em cada caso contido aqui qualquer um dos termos compreendendo, consistindo essencialmente em e consistindo em pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Os termos e as expressões que foram empregados são utilizados como termos de descrição e não de limitação e não há intenção de que no uso de tais termos e expressões sejam excluídos quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou partes das mesmas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do âmbito da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que embora a presente invenção tenha sido divulgada especificamente por modalidades preferidas e características opcionais, uma modificação e uma variação dos conceitos divulgados aqui podem ser recorridas pelos versados na técnica e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do âmbito desta invenção que é definido pelas reivindicações em anexo.

Em adição, quando as características ou os aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush ou outros grupos alternativos, os versados na técnica reconhecerão que a invenção também é descrita aqui em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de 5 membros do grupo de Markush ou de outro grupo.

Ainda, a não ser que seja indicado o contrário, quando vários valores numéricos são fornecidos para as modalidades, modalidades adicionais são descritas tomando qualquer um dos dois valores diferentes como os pontos finais de uma faixa. Tais faixas também estão dentro do âmbito da 10 invenção descrita.

Assim, modalidades adicionais estão dentro do âmbito da invenção e dentro das reivindicações a seguir.

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo para purificação de lipoproteínas adequadas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas da classe ou da subclasse das lipoproteínas, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende:

   (a) o preparo de um tubo de centrífuga que contém uma primeira solução embaixo de uma amostra e uma segunda solução acima da dita amostra, a dita amostra compreendendo lipoproteínas de alta densidade (HDL) e componentes não-lipoprotéicos, a dita primeira solução possuindo uma primeira densidade maior que 1,00 g/mL e menor que ou igual a aproximadamente 1,21 g/mL; e a dita segunda solução possuindo uma segunda densidade maior ou igual a 1,00 g/mL e menor do que a dita primeira densidade; e (b) a submissão do dito tubo à centrifugação suficiente para fazer com que os ditos componentes não-lipoprotéicos migrem em direção ao fundo do tubo e para longe das ditas lipoproteínas, fornecendo assim lipoproteínas purificadas;

   em que a dita amostra compreende ainda sulfato de dextran sob condições em que o dito HDL não são precipitados da dita amostra.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita primeira solução possui uma densidade na faixa de aproximadamente 1,15 g/mL até aproximadamente 1,21 g/mL.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende ainda três ou mais de LDL, IDL, Lp(a) e VLDL.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas lipoproteínas HDL e componentes não-lipoprotéicos são provenientes de uma amostra de plasma.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita centrifugação não atinge o equilíbrio.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

   Petição 870180132983, de 21/09/2018, pág. 13/18 (c) a coleta das ditas lipoproteínas purificadas da parte superior do dito tubo de centrífuga após a centrifugação.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende ainda um composto de ligação à albumina capaz de se ligar à albumina para formar um complexo de albuminacomposto de ligação à albumina e em que a dita centrifugação faz com que o dito complexo de albumina-composto de ligação à albumina seja separado das ditas lipoproteínas purificadas.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito composto de ligação à albumina é um análogo de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD).
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de NAD é selecionado do grupo consistindo em Reactive Green 19 and Cibacrom Blue 3GA.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de NAD é conjugado a um meio cromatográfico selecionado do grupo que consiste em partículas paramagnéticas, dextran, agarose e Sephadex®.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita amostra compreende ainda um ligante de captura de não-lipoproteína capaz de se ligar a não-lipoproteína para formar um complexo de não-lipoproteína/ligante de captura de não-lipoproteína e em que a dita centrifugação faz com que o dito complexo de não-lipoproteína/ligante de captura de não-lipoproteína seja separado dos ditos componentes de lipoproteína.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito ligante de captura de não-lipoproteína é selecionado do grupo que consiste em aptâmero e anticorpo.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Lp(a) é removido da dita amostra antes da centrifugação através de:

    (i) formação de um precipitado de Lp(a) através da mistura da diPetição 870180132983, de 21/09/2018, pág. 14/18 ta amostra com um agente de precipitação para lipoproteína que contém

    Apo B sob condições suficientes para causar a precipitação de Lp(a); e (ii) isolamento do dito Lp(a) que contém o precipitado da dita amostra.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que Lp(a) é removido das ditas lipoproteínas coletadas através de:

    (i) formação de um precipitado que compreende Lp(a) através da mistura das ditas lipoproteínas coletadas com um agente de precipitação para lipoproteína que contém Apo B sob condições suficientes para causar a precipitação de Lp(a); e (ii) isolamento do dito Lp(a) que contém o precipitado das lipoproteínas coletadas.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o dito agente de precipitação para lipoproteína que contém Apo B compreende sulfato de dextran e um cátion divalente.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito cátion divalente é Mg²⁺.
17. 17. Processo para obtenção de Lp(a) purificado, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende:

    (a) a solubilização do dito Lp(a) que contém o precipitado obtido de acordo com a reivindicação 13 ou 14;

    (b) a mistura do dito Lp(a) solubilizado com um reagente em suporte sólido contendo uma lectina liga a um suporte sólido sob condições adequadas para permitir a formação de um complexo Lp(a)-lectina;

    (c) o isolamento do dito complexo Lp(a)-lectina; e (d) a liberação do dito Lp(a) do dito complexo Lp(a)-lectina, fornecendo assim lipoproteínas purificadas adequadas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas.
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a dita lectina é selecionada do grupo que consiste em aglutinina de gérmen de trigo (WGA), aglutinina de feijão-de-lima (LGA), fitohemaglutinina (PHA) e lectina de límulo (HCL).

    Petição 870180132983, de 21/09/2018, pág. 15/18
19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a dita lectina é WGA.
20. 20. Processo para obtenção de Lp(a) purificado, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende:

    (a) a solubilização do dito Lp(a) contendo o precipitado obtido de acordo com a reivindicação 13 ou 14;

    (b) a mistura do dito Lp(a) solubilizado com gama globulinas e prolina para formar uma mistura;

    (c) a precipitação da dita mistura através da adição de um agente de precipitação; e (d) a recuperação do Lp(a) do dito precipitado, fornecendo assim lipoproteínas purificadas adequadas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas.
21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito agente de precipitação é sulfato de amônio.
22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita primeira solução é aquosa e compreende óxido de deutério.
23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dita solução aquosa é substancial mente óxido de deutério.
24. 24. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira solução está localizada abaixo e adjacente à dita amostra em que a dita amostra que compreende ainda dextran Reactive Green, e em que a dita primeira solução compreende óxido de deutério..
25. 25. Processo para purificação de lipoproteínas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas, o dito processo não incluindo a centrifugação, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende:

    (a) a mistura de uma solução que compreende lipoproteínas e não-lipoproteínas com um ou mais compostos polianiônicos e um ou mais cátion divalentes;

    Petição 870180132983, de 21/09/2018, pág. 16/18 (b) a permissão de que um precipitado que contém lipoproteínas seja formado na dita solução misturada; e (c) após a etapa (b), a coleta das lipoproteínas precipitadas e a submissão das mesmas à análise de mobilidade diferencial de partículas carregadas.
26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito composto polianiônico é selecionado do grupo que consiste em sulfato de dextran, amilopectina e sulfato de polivinila e em que o dito cátion divalente é selecionado do grupo que consiste em Mg²⁺ e Ca²⁺.
27. 27. Processo para purificação de lipoproteínas para a análise da mobilidade diferencial de partículas carregadas, o dito processo não incluindo centrifugação, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende:

    (a) a mistura de uma solução que compreende lipoproteínas e não-lipoproteínas com um ou mais ligantes de captura de lipoproteínas capazes de se ligarem às lipoproteínas para formar um complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas;

    (b) o isolamento do dito complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas; e (c) a liberação das ditas lipoproteínas do dito complexo de lipoproteína/ligante de captura de lipoproteínas e a submissão das ditas lipoproteínas à análise de mobilidade diferencial de partículas carregadas.
28. 28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as ditas lipoproteínas são selecionadas do grupo que consiste em HDL, LDL, Lp(a), IDL e VLDL.
29. 29. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o dito ligante de captura de lipoproteínas é selecionado do grupo que consiste em aptâmero e anticorpo.
30. 30. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o dito ligante de captura de lipoproteínas é um anticorpo.