CN103454193A - 检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒及制备方法,应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,应用液瓶中装有应用液,其组分:表面活性剂0.01%~1%,增敏剂0.1%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶悬液,其组分:包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;标准品瓶中装有脂蛋白(a)标准品。实现人血清脂蛋白(a)在生化仪上大批量定量检测,操作简单,灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及免疫比浊的检测方法,尤其涉及检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
脂蛋白(a)快速检测酶免试剂盒,可用于人尿液、血浆和血清检测。见于动脉粥样硬化性心脑血管病、急性心肌梗死、家族性高胆固醇血症、糖尿病、大动脉瘤及某些癌症等。
脂蛋白(a)由肝脏合成,是一组与纤溶酶原有显著同源性的糖蛋白,其受个体遗传基因的影响,呈现相对分子量大小不一的多态性。脂蛋白(a)为动脉硬化的独立危险因子。血清脂蛋白(a)含量主要由遗传决定,不受饮食、性别和年龄的影响,并与其他脂蛋白、载脂蛋白无关。脂蛋白(a)含量增高者心、脑动脉硬化的发病率明显高于正常者。脂蛋白(a)的水平可预测冠心病的转归,与急性心肌梗死的病程演化关系密切。脂蛋白(a)的正常参考范围为10~140mmol/L(0~300毫克/L)。脂蛋白(a)增高可见于急性心肌梗死,缺血性心、脑疾病,动脉硬化症,高脂血症,糖尿病,慢性肾功能不全,冠状动脉搭桥后再狭窄,大动脉瘤及某些癌症。减低则见于肝脏疾病、酗酒、摄入新霉素等药物后。
颗粒增强免疫透射比浊法(particle—enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法,其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克降抗体,当交联有抗体的微球与抗原结合后,在短时间内会迅速聚集在一起,改变了反应体系的吸光度。这种改变与被测抗原的浓度有一定的相关性,在一定范闹内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服了ELISA和RIA方法的缺点,已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前,颗粒增强免疫透射比浊法广泛用于肾功能检测、心脑血管功能检测检测、糖尿病检测和脂类检测等,取得了良好的社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现:
检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,特点是:包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,所述应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,增敏剂0.1%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;所述抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;所述标准品瓶中装有脂蛋白(a)标准品。
进一步地,上述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000,聚乙二醇4000,聚乙二醇6000或聚乙二醇8000;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;
b)制备应用液: 将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;
c)配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L。
更进一步地,上述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,在步骤a)中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm;所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L;所述清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸;所述乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
更进一步地,上述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,步骤b)中,所述缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
再进一步地,上述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,步骤c)中,所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在:
通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服了ELISA和RIA方法的缺点,实现人血清脂蛋白(a)在生化仪上大批量定量检测,操作简单,灵敏度高,不易受人为因素干扰,检测稳定性和重复性好,能真实反映被检测物的含量,能利用生化分析仪进行检测,容易实现自动化,适于临床推广应用。
具体实施方式
检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,增敏剂0.1%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;标准品瓶中装有脂蛋白(a)标准品。
其中,应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000,聚乙二醇4000,聚乙二醇6000或聚乙二醇8000;应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备工艺步骤为:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm;磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L;清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸;乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合;
b)制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物,缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸;
c)配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L;其中,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
实施例1
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为100nm;磷酸盐缓冲液的pH为7.2,质量比为30mmol/L;清洗储存液pH为7.4,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.2%,防腐剂0.05%,缓冲液30mmol/L,表面活性剂为Triton-X405,防腐剂为Proclin-300,缓冲液为甘氨酸;乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.1%,增敏剂0.1%,防腐剂0.05%,氯化钠5%,缓冲液30mmol/L,表面活性剂为Tween-80,增敏剂聚乙二醇2000,防腐剂为叠氮钠,缓冲液pH为8.0,缓冲液为甘氨酸。
配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L;其中,缓冲液为三羟基氨基甲烷。
实施例2
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为500nm;磷酸盐缓冲液的pH为9.2,质量比为60mmol/L;清洗储存液pH为9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.4%,防腐剂0.2%,缓冲液60mmol/L,表面活性剂为Triton-X100,防腐剂为叠氮钠,缓冲液为三羟基氨基甲烷;乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.4%,增敏剂0.2%,防腐剂0.2%,氯化钠10%,缓冲液60mmol/L,表面活性剂为Tween-20,增敏剂聚乙二醇4000,防腐剂为Proclin-300,缓冲液pH为8.0,缓冲液为三羟基氨基甲烷。
配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L;其中,缓冲液为碳酸盐。
实施例3
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为200nm;磷酸盐缓冲液的pH为8.0,质量比为120mmol/L;清洗储存液pH为8.4,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.6%,防腐剂0.4%,缓冲液120mmol/L,表面活性剂为Tween-20,防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物,缓冲液为碳酸盐;乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.6%,增敏剂0.5%,防腐剂0.4%,氯化钠15%,缓冲液120mmol/L,表面活性剂为Tween-40,增敏剂聚乙二醇6000,防腐剂为叠氮钠,缓冲液pH为9.0,缓冲液为碳酸盐。
配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L;其中,缓冲液为三羟基氨基甲烷。
实施例4
制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;其中,乳胶微球的粒径为150nm;磷酸盐缓冲液的pH为8.2,质量比为150mmol/L;清洗储存液pH为8.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.8%,增敏剂1.0%,防腐剂0.8%,缓冲液180mmol/L,表面活性剂为Tween-80,防腐剂为叠氮钠,缓冲液为磷酸盐;乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液: 将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;其中,表面活性剂0.8%,防腐剂0.8%,氯化钠20%,缓冲液180mmol/L,表面活性剂为Triton-X100,增敏剂聚乙二醇6000,防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物,缓冲液pH为7.4,缓冲液为磷酸盐。
配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L;其中,缓冲液为甘氨酸。
以下结合采用所述脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒在生化分析仪上进行脂蛋白(a)检测的具体条件:
在日立7080生化仪上的的设定参数:
反应温度:37度
分析方法:2点终点法
主波长:600nm,副波长800nm(可不选)
样本量/应用液/包被脂蛋白(a)抗体的乳胶悬液:3ul/200ul/50ul
反应方向:上升
读点分别为19点及31点
选择多点定标后,仪器自动完成定标,定标OK后,进行常规脂蛋白(a)检测。
本发明通过颗粒增强的方式,放大了抗原抗体反应,弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点,同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点,克服了ELISA和RIA方法的缺点,实现人血清脂蛋白(a)在生化仪上大批量定量检测,有以下几个方面突出优点:1)操作简单;2)灵敏度高;3)不易受人为因素干扰,检测稳定性和重复性好,能真实反映被检测物的含量;4)能利用生化分析仪进行检测,容易实现自动化,适于临床推广应用。
需要理解到的是:以上所述仅是本发明的优选实施方式,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,其特征在于:包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶,所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内,所述应用液瓶中装有应用液,应用液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,增敏剂0.1%~1%,防腐剂0.01~0.5%,氯化钠1%~20%,缓冲液20~200mmol/L;所述抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶悬液,乳胶悬液的组分及其重量百分比为:包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%,表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L;所述标准品瓶中装有脂蛋白(a)标准品。
2.根据权利要求1所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,其特征在于:所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000,聚乙二醇4000,聚乙二醇6000或聚乙二醇8000;所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物;所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒,其特征在于:所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80;所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物;所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
4.权利要求1所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
a)制备乳胶悬液:在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混匀,30~40度旋转反应过夜,用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液,置于2~8度环境下保存;
b)制备应用液: 将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水,得到应用液;
c)配制脂蛋白(a)标准品:选用脂蛋白(a)标准品,由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L。
5.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:在步骤a)中,乳胶微球的粒径为100nm~500nm。
6.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2,质量比为20~200mmol/L。
7.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述清洗储存液pH为7.4~9.0,清洗储存液的组分及其重量百分比为:表面活性剂0.01%~1%,防腐剂0.01~0.5%,缓冲液20~200mmol/L,表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80,防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
8.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤a)中,所述乳胶微球与包被脂蛋白(a)单克隆抗体混合是等体积混合。
9.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤b)中,所述缓冲液pH为7.4~9.0,缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
10.根据权利要求4所述的检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒的制备方法,其特征在于:步骤c)中,所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
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