CN103454193A

CN103454193A - 检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN103454193A
Application number: CN2013103974580A
Authority: CN
Inventors: 刘照关; 康英杰
Original assignee: SUZHOU BIOCOMPASS BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU BIOCOMPASS BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明涉及检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒及制备方法，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，应用液瓶中装有应用液，其组分：表面活性剂0.01%~1%，增敏剂0.1%~1%，防腐剂0.01~0.5%，氯化钠1%~20%，缓冲液20~200mmol/L；抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶悬液，其组分：包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L；标准品瓶中装有脂蛋白（a）标准品。实现人血清脂蛋白（a）在生化仪上大批量定量检测，操作简单，灵敏度高。

Description

检测脂蛋白(a)的免疫比浊试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫比浊的检测方法，尤其涉及检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒及其制备方法。

背景技术

脂蛋白（a）快速检测酶免试剂盒，可用于人尿液、血浆和血清检测。见于动脉粥样硬化性心脑血管病、急性心肌梗死、家族性高胆固醇血症、糖尿病、大动脉瘤及某些癌症等。

脂蛋白(a)由肝脏合成，是一组与纤溶酶原有显著同源性的糖蛋白，其受个体遗传基因的影响，呈现相对分子量大小不一的多态性。脂蛋白(a)为动脉硬化的独立危险因子。血清脂蛋白(a)含量主要由遗传决定，不受饮食、性别和年龄的影响，并与其他脂蛋白、载脂蛋白无关。脂蛋白(a)含量增高者心、脑动脉硬化的发病率明显高于正常者。脂蛋白(a)的水平可预测冠心病的转归，与急性心肌梗死的病程演化关系密切。脂蛋白(a)的正常参考范围为10～140mmol/L（0～300毫克/L）。脂蛋白(a)增高可见于急性心肌梗死，缺血性心、脑疾病，动脉硬化症，高脂血症，糖尿病，慢性肾功能不全，冠状动脉搭桥后再狭窄，大动脉瘤及某些癌症。减低则见于肝脏疾病、酗酒、摄入新霉素等药物后。

颗粒增强免疫透射比浊法（particle—enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克降抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应体系的吸光度。这种改变与被测抗原的浓度有一定的相关性，在一定范闹内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前，颗粒增强免疫透射比浊法广泛用于肾功能检测、心脑血管功能检测检测、糖尿病检测和脂类检测等，取得了良好的社会效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒及其制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，特点是：包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，增敏剂0.1%~1%，防腐剂0.01~0.5%，氯化钠1%~20%，缓冲液20~200mmol/L；所述抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L；所述标准品瓶中装有脂蛋白（a）标准品。

进一步地，上述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；所述应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000，聚乙二醇4000，聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

本发明检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

a）制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；

b）制备应用液：将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；

c）配制脂蛋白（a）标准品：选用脂蛋白（a）标准品，由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L。

更进一步地，上述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，在步骤a）中，乳胶微球的粒径为100nm~500nm；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2，质量比为20~200mmol/L；所述清洗储存液pH为7.4~9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L，表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸；所述乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

更进一步地，上述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，步骤b）中，所述缓冲液pH为7.4~9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

再进一步地，上述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，步骤c）中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：

通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清脂蛋白（a）在生化仪上大批量定量检测，操作简单，灵敏度高，不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量，能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。

具体实施方式

检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，增敏剂0.1%~1%，防腐剂0.01~0.5%，氯化钠1%~20%，缓冲液20~200mmol/L；抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L；标准品瓶中装有脂蛋白（a）标准品。

其中，应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000，聚乙二醇4000，聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备工艺步骤为：

a）制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为100nm~500nm；磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2，质量比为20~200mmol/L；清洗储存液pH为7.4~9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L，表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸；乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合；

b）制备应用液：将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，氯化钠1%~20%，缓冲液20~200mmol/L，表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80，防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物，缓冲液pH为7.4~9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸；

c）配制脂蛋白（a）标准品：选用脂蛋白（a）标准品，由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L；其中，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

实施例1

制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为100nm；磷酸盐缓冲液的pH为7.2，质量比为30mmol/L；清洗储存液pH为7.4，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.2%，防腐剂0.05%，缓冲液30mmol/L，表面活性剂为Triton-X405，防腐剂为Proclin-300，缓冲液为甘氨酸；乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

制备应用液：将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0.1%，增敏剂0.1%，防腐剂0.05%，氯化钠5%，缓冲液30mmol/L，表面活性剂为Tween-80，增敏剂聚乙二醇2000，防腐剂为叠氮钠，缓冲液pH为8.0，缓冲液为甘氨酸。

配制脂蛋白（a）标准品：选用脂蛋白（a）标准品，由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L；其中，缓冲液为三羟基氨基甲烷。

实施例2

制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为500nm；磷酸盐缓冲液的pH为9.2，质量比为60mmol/L；清洗储存液pH为9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.4%，防腐剂0.2%，缓冲液60mmol/L，表面活性剂为Triton-X100，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为三羟基氨基甲烷；乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

制备应用液：将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0.4%，增敏剂0.2%，防腐剂0.2%，氯化钠10%，缓冲液60mmol/L，表面活性剂为Tween-20，增敏剂聚乙二醇4000，防腐剂为Proclin-300，缓冲液pH为8.0，缓冲液为三羟基氨基甲烷。

配制脂蛋白（a）标准品：选用脂蛋白（a）标准品，由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L；其中，缓冲液为碳酸盐。

实施例3

制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为200nm；磷酸盐缓冲液的pH为8.0，质量比为120mmol/L；清洗储存液pH为8.4，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.6%，防腐剂0.4%，缓冲液120mmol/L，表面活性剂为Tween-20，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液为碳酸盐；乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

制备应用液：将表面活性剂、增敏剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0.6%，增敏剂0.5%，防腐剂0.4%，氯化钠15%，缓冲液120mmol/L，表面活性剂为Tween-40，增敏剂聚乙二醇6000，防腐剂为叠氮钠，缓冲液pH为9.0，缓冲液为碳酸盐。

实施例4

制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混匀，30~40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为150nm；磷酸盐缓冲液的pH为8.2，质量比为150mmol/L；清洗储存液pH为8.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.8%，增敏剂1.0%，防腐剂0.8%，缓冲液180mmol/L，表面活性剂为Tween-80，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为磷酸盐；乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

制备应用液：将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，表面活性剂0.8%，防腐剂0.8%，氯化钠20%，缓冲液180mmol/L，表面活性剂为Triton-X100，增敏剂聚乙二醇6000，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液pH为7.4，缓冲液为磷酸盐。

配制脂蛋白（a）标准品：选用脂蛋白（a）标准品，由缓冲液稀释成浓度为1000mg/L；其中，缓冲液为甘氨酸。

以下结合采用所述脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒在生化分析仪上进行脂蛋白（a）检测的具体条件：

在日立7080生化仪上的的设定参数：

反应温度：37度

分析方法：2点终点法

主波长：600nm，副波长800nm（可不选）

样本量/应用液/包被脂蛋白（a）抗体的乳胶悬液：3ul/200ul/50ul

反应方向：上升

读点分别为19点及31点

选择多点定标后，仪器自动完成定标，定标OK后，进行常规脂蛋白（a）检测。

本发明通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清脂蛋白（a）在生化仪上大批量定量检测，有以下几个方面突出优点：1）操作简单；2）灵敏度高；3）不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量；4）能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。

需要理解到的是：以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，其特征在于：包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，增敏剂0.1%~1%，防腐剂0.01~0.5%，氯化钠1%~20%，缓冲液20~200mmol/L；所述抗体悬浮液瓶中装有包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被脂蛋白（a）单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L；所述标准品瓶中装有脂蛋白（a）标准品。

2.根据权利要求1所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述应用液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；所述应用液中的增敏剂为聚乙二醇2000，聚乙二醇4000，聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述乳胶悬液中的表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80；所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

4.权利要求1所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤a）中，乳胶微球的粒径为100nm~500nm。

6.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2，质量比为20~200mmol/L。

7.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述清洗储存液pH为7.4~9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：表面活性剂0.01%~1%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液20~200mmol/L，表面活性剂为Triton-X100、Triton-X405、Tween-20、Tween-40或Tween-80，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

8.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述乳胶微球与包被脂蛋白（a）单克隆抗体混合是等体积混合。

9.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤b）中，所述缓冲液pH为7.4~9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。

10.根据权利要求4所述的检测脂蛋白（a）的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤c）中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。