CN103454432A - 检测c-反应蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒及制备方法，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内。应用液瓶中装有应用液，其组分：防腐剂0.01~0.2%，氯化钠1%~20%，缓冲液10~500mmol/L；抗体悬浮液瓶中装有包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶悬液，其组分：包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液10~500mmol/L；标准品瓶中装有C-反应蛋白标准品。实现人血清C-反应蛋白在生化仪上大批量定量检测，操作简单，灵敏度高，不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及免疫比浊的检测方法，尤其涉及检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
C-反应蛋白快速检测酶免试剂盒，可用于人尿液、血浆和血清检测。CRP，肺炎球菌细胞壁c多糖蛋白，一种急性时相（期）蛋白，亦称C反应蛋白，正常参考值≤6mg/L。本身由肝细胞产生能结合肺炎球菌细胞壁糖蛋白，能监测疾病的发展情况为非特异性的检验指标，很多疾病时都可以表现出来。
CRP的检测被广泛用于监测不同的炎症状态，也可用于监测对炎症的治疗效果。随着高灵敏度的检测方法的不断发展，CRP还是心血管疾病强的预测因素，并且是动脉粥样硬化的重要介质。更为重要的是近年来研究发现，在小鼠的狼疮性肾炎中发现，CRP能延迟狼疮性肾炎的发病、降低抗体水平、提高了小鼠的存活率并使尿蛋白症状减轻。依赖钙离子，CRP还能与受损组织以及某些病原微生物结合，表现出其在天然免疫系统中的重要作用。CRP与FcTR的相互作用诱导前炎性细胞因子(IL一6等)的产生，从而放大了炎症反应。CRP在IL一6、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)及其他细胞因子的诱导下能在肝脏快速合成，通常炎症刺激后24～48h血清CRP水平出现峰值，血清CRP水平会从每毫升小于1p-g增加到每毫升几百微克，而且随着疾病的消除，CRP能从血循环中快速清除。由于CRP不受年龄、性别、贫血、妊娠等机体状态和治疗药物等因素的影响，因此CRP是感染性炎症反应的敏感指标。
颗粒增强免疫透射比浊法（particle—enhanced turbidimetricimmunoassay，PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其基本原理是一定粒径胶乳颗粒的表面交联单克隆或多克降抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应体系的吸光度。这种改变与被测抗原的浓度有一定的相关性，在一定范闹内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前，颗粒增强免疫透射比浊法广泛用于肾功能检测、心脑血管功能检测检测、糖尿病检测和脂类检测等，取得了良好的社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，特点是：包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01～0.2%，氯化钠1%～20%，缓冲液10～500mmol/L；所述抗体悬浮液瓶中装有包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%～0.5%，防腐剂0.01～0.5%，缓冲液10～500mmol/L；所述标准品瓶中装有C-反应蛋白标准品。
进一步地，上述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
a）制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，30～40℃旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8℃环境下保存；
b）制备应用液：将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；
c）配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为3.2mg/L。
更进一步地，上述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，步骤a）中，乳胶微球的粒径为50nm～500nm。步骤a）中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2～9.2，质量比为10～500mmol/L。步骤a）中，所述清洗储存液pH为7.4～9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01～0.5%，缓冲液10～500mmol/L，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。步骤a）中，所述乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。步骤b）中，所述缓冲液pH为7.4～9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。步骤c）中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：
通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清C-反应蛋白在生化仪上大批量定量检测，操作简单，灵敏度高，不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量，能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。
具体实施方式
检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶放置于盒体内，应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01～0.2%，氯化钠1%～20%，缓冲液10～500mmol/L；抗体悬浮液瓶中装有包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%～0.5%，防腐剂0.01～0.5%，缓冲液10～500mmol/L；标准品瓶中装有C-反应蛋白标准品。
其中，应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备工艺为：
a）制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，30～40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为50nm～500nm；磷酸盐缓冲液的pH为7.2～9.2，质量比为20～200mmol/L；清洗储存液pH为7.4～9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01～0.5%，缓冲液10～500mmol/L，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸；乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合；
b）制备应用液：将表面活性剂、防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，防腐剂0.01～0.2%，氯化钠1%～20%，缓冲液10～500mmol/L，防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物，缓冲液pH为7.4～9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸；
c）配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L；其中，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
实施例1
制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，35度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为50nm；磷酸盐缓冲液的pH为7.2，质量比为30mmol/L；清洗储存液pH为7.4，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.05%，缓冲液30mmol/L，表防腐剂为Proclin-300，缓冲液为甘氨酸；乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液：将防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，防腐剂0.01%，氯化钠5%，缓冲液30mmol/L，防腐剂为叠氮钠，缓冲液pH为8.0，缓冲液为甘氨酸。
配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L；其中，缓冲液为三羟基氨基甲烷。
实施例2
制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，35度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为200nm；磷酸盐缓冲液的pH为9.2，质量比为60mmol/L；清洗储存液pH为9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.2%，缓冲液60mmol/L，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为三羟基氨基甲烷；乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液：将防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，防腐剂0.05%，氯化钠10%，缓冲液60mmol/L，防腐剂为Proclin-300，缓冲液pH为8.0，缓冲液为三羟基氨基甲烷。
配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L；其中，缓冲液为碳酸盐。
实施例3
制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，35度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为300nm；磷酸盐缓冲液的pH为8.0，质量比为120mmol/L；清洗储存液pH为8.4，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.4%，缓冲液120mmol/L，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液为碳酸盐；乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液：将防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，防腐剂0.1%，氯化钠15%，缓冲液120mmol/L，表面活性剂为Tween-40，防腐剂为叠氮钠，缓冲液pH为9.0，缓冲液为碳酸盐。
配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L；其中，缓冲液为三羟基氨基甲烷。
实施例4
制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，30～40度旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2～8度环境下保存；其中，乳胶微球的粒径为500nm；磷酸盐缓冲液的pH为8.2，质量比为150mmol/L；清洗储存液pH为8.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.5%，缓冲液180mmol/L，防腐剂为叠氮钠，缓冲液为磷酸盐；乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
制备应用液：将防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；其中，防腐剂0.2%，氯化钠20%，缓冲液180mmol/L，防腐剂为叠氮钠和Proclin-300混合物，缓冲液pH为7.4，缓冲液为磷酸盐。
配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L；其中，缓冲液为甘氨酸。
以下结合采用所述C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒在生化分析仪上进行C-反应蛋白检测的具体条件：
在日立7080生化仪上的的设定参数：
反应温度：37度
分析方法：2点终点法
主波长：570nm，副波长800nm（可不选）
样本量/应用液/包被C-反应蛋白抗体的乳胶悬液：3ul/240ul/60ul
反应方向：上升
读点分别为19点及31点
选择多点定标后，仪器自动完成定标，定标OK后，进行常规C-反应蛋白检测。
本发明通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了ELISA和RIA方法的缺点，实现人血清C-反应蛋白在生化仪上大批量定量检测，有以下几个方面突出优点：1）操作简单；2）灵敏度高；3）不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量；4）能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。
需要理解到的是：以上所述仅是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，其特征在于：包括盒体、应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶，所述应用液瓶、抗体悬浮液瓶和标准品瓶置于盒体内，所述应用液瓶中装有应用液，应用液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01~0.2%，氯化钠1%~20%，缓冲液10~500mmol/L；所述抗体悬浮液瓶中装有包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶悬液，乳胶悬液的组分及其重量百分比为：包被C-反应蛋白单克隆抗体的乳胶0.05%~0.5%，防腐剂0.01~0.5%，缓冲液10~500mmol/L；所述标准品瓶中装有C-反应蛋白标准品。
2.根据权利要求1所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述应用液中的防腐剂为叠氮钠或Proclin-300或两者混合物；所述应用液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒，其特征在于：所述乳胶悬液中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物；所述乳胶悬液中的缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
4.权利要求1所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a）制备乳胶悬液：在磷酸盐缓冲液中将乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混匀，30~40℃旋转反应过夜，用清洗储存液进行清洗得到乳胶悬液，置于2~8℃环境下保存；
b）制备应用液： 将防腐剂、氯化钠和缓冲液同溶于水，得到应用液；
c）配制C-反应蛋白标准品：选用C-反应蛋白标准品，由缓冲液稀释成浓度为100mg/L。
5.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，乳胶微球的粒径为50nm~500nm。
6.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.2~9.2，质量比为10~500mmol/L。
7.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述清洗储存液pH为7.4~9.0，清洗储存液的组分及其重量百分比为：防腐剂0.01~0.5%，缓冲液10~500mmol/L，防腐剂为叠氮钠、Proclin-300或两者混合物，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
8.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤a）中，所述乳胶微球与包被C-反应蛋白单克隆抗体混合是等体积混合。
9.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤b）中，所述缓冲液pH为7.4~9.0，缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
10.根据权利要求4所述的检测C-反应蛋白的免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤c）中，所述缓冲液为磷酸盐、碳酸盐、三羟基氨基甲烷或甘氨酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131218 |