JP2000325097A - リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】血清や血漿等のリポ蛋白質を含有する試料中の
ＬＤＬコレステロール及び必要に応じてＨＤＬコレステ
ロールを簡便かつ正確に測定する方法を提供する。 【解決手段】リポ蛋白を含有する試料に、酵素と第１界
面活性剤を作用させることによりＨＤＬコレステロール
を反応させ、必要に応じて、その際消費される化合物ま
たは生成される化合物を測定し、次いで第２界面活性剤
を添加することによりＬＤＬコレステロールを反応さ
せ、その際消費される化合物または生成される化合物を
測定することを特徴とするリポ蛋白コレステロールの測
定方法及び測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、主として臨床検査
の分野での使用を目的とし、リポ蛋白質を含有する試料
中の特定のリポ蛋白質分画のコレステロールを定量する
方法及びリポ蛋白質を含有する試料中の特定のリポ蛋白
質分画のコレステロールを定量する試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、血中コレステロールは血液中の
リポ蛋白質に含まれるものであり、動脈硬化症や心筋梗
塞に関連性が深い診断的指標として重要視されている。
また、リポ蛋白質はアポリポ蛋白質と脂質の複合体であ
り、それぞれの比重によって高密度リポ蛋白質(ＨＤ
Ｌ)、低密度リポ蛋白質(ＬＤＬ)、超低密度リポ蛋白質
(ＶＬＤＬ)及びカイロミクロン(ＣＭ)の４種類に大別さ
れる。

【０００３】古くから臨床検査において実施されてきた
血中総コレステロールの測定は、血中の全てのリポ蛋白
質に含まれるコレステロールを測定するもので、上記疾
患の危険度を予測するものとして重要とされてきた。し
かし、近年の臨床的研究においては、ＬＤＬに含まれる
コレステロールが上記疾患のより正確なリスクファクタ
ーとされ、逆にＨＤＬに含まれるコレステロールは負の
リスクファクターすなわちＨＤＬコレステロール量と上
記疾患の発生頻度の間には負の相関が成り立つため、動
脈硬化に関連する疾患の診断には、ＨＤＬあるいはＬＤ
Ｌに含まれるコレステロールを個別に測定することがよ
り重要であるとされている（動脈硬化２５（１・２）：
１−３４，１９９７）。

【０００４】これらリポ蛋白質の分析法としては、比重
の差を利用した超遠心法の他に電気泳動により分離した
リポ蛋白質を脂質染色により検出する方法や、ＨＰＬＣ
による分離を行った後にコレステロールを含むピークを
酵素試薬により発色検出する反応液体クロマトグラフィ
ー法、免疫化学的方法等があるが、いずれも操作が煩雑
であったり多数の検体を迅速に測定できない等の問題が
あり、日常的な検査にはほとんど用いられていなかっ
た。

【０００５】過去、日常的な臨床検査には、デキストラ
ン硫酸やリンタングステン酸等のリポ蛋白質沈殿剤を用
いてＨＤＬコレステロールを測定する方法が用いられて
きた。これは、先ず血清等の検体にリポ蛋白質沈殿剤と
アルカリ土類金属イオンを加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白
質を凝集させ、これを遠心分離により取り除き上清中に
残存するＨＤＬ中のコレステロールを測定し、さらに血
中総コレステロール値と中性脂肪値を測定し、経験的に
導かれたＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式にこれらの値をあて
はめてＬＤＬコレステロール値を算出するものである。

【０００６】しかしこの方法は、超遠心法等に比較して
簡便ではあるものの、沈殿剤を加えて遠心分離する操作
を含むため、比較的多量の検体量を要し、短時間で多数
の検体を処理することが困難であった。さらに、Ｆｒｉ
ｅｄｅｗａｌｄの式は、ＶＬＤＬ中のコレステロール量
と中性脂肪量の比率がほぼ一定であるという経験則から
導かれたものであるため、リポ蛋白質代謝あるいは脂質
代謝に異常をきたす疾患では大きな誤差を生じるという
問題があった。

【０００７】このような状況の中、血漿あるいは血清中
のリポ蛋白質コレステロールを遠心分離等の前処理なく
自動分析器に搭載可能な分別定量方法が開発されてい
る。

【０００８】それらの中で、ＨＤＬコレステロールを直
接測定するための手法としては、前述の沈澱法を応用し
てＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させて酵素が作用しな
い状態にしておきＨＤＬコレステロールを選択的に反応
させる方法、及び界面活性剤等の沈澱剤以外の物質を用
いてリポ蛋白質コレステロールの酵素反応をコントロー
ルする方法の２つに大別できる。

【０００９】特開平８−１３１１９７号公報では、リポ
蛋白質を凝集させる方法として通常の沈殿法に用いられ
るＨＤＬ以外のリポ蛋白質を沈殿させる沈殿試薬により
凝集を形成させ、更に一般的なコレステロール測定試薬
を組み合わせて使用することにより、凝集しないＨＤＬ
中のコレステロールを測定する方法が開示されている
が、凝集するＨＤＬ以外のリポ蛋白質中のコレステロー
ルも反応検出してしまう等、精度の点では満足のいく測
定法ではなかった。また、特開平６−２４２１１０号公
報には、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させ、凝集しな
いＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた
後に、酵素を失活させ、同時に凝集を再溶解させて吸光
度変化を測定するという手法が開示されているが、この
手法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要であ
り、限定された自動分析機にしか適用できず、汎用性の
点で問題があった。

【００１０】さらに、界面活性剤、ポリアニオン、ある
いは抗体などの凝集剤を適宜選択することにより、ＨＤ
Ｌ以外のリポ蛋白質中のコレステロールを反応阻害し、
血清中のＨＤＬコレステロールのみが優先的に反応する
条件を設定した方法（特開平１１−５６３９５号公報、
特開平９−９６６３７号公報）、ＨＤＬ以外のリポ蛋白
質を凝集させる凝集剤とＬＤＬコレステロール及びＶＬ
ＤＬコレステロールの酵素反応を抑制するアルブミンの
共存下でＨＤＬを選択的に反応させ検出する方法（特開
平９−２８５２９８号公報）が開示されている。

【００１１】界面活性剤を用いて酵素反応をコントロー
ルする方法として、特開昭６３−１２６４９８号公報に
は胆汁酸塩及び非イオン系界面活性剤の存在下に酵素反
応を行い、反応初期には、反応速度がＬＤＬコレステロ
ール濃度に比例し、その後ＨＤＬコレステロール濃度に
比例することを利用した方法が開示されている。比較的
疎水的なＶＬＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロ
ールがＨＤＬコレステロールに先駆けて酵素的に反応し
ていく現象を利用したものとされているが、ＨＤＬ中の
コレステロールと他のリポ蛋白質の中のコレステロール
の反応を完全には分別することはできず、正確性に問題
があった。また、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質に選択的に作
用する界面活性剤の存在下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コ
レステロールを反応消去した後に残存するコレステロー
ルを全て反応させＨＤＬコレステロールを定量する方法
（特開昭６２−６９９９９号公報）、さらにＨＤＬ以外
のリポ蛋白質に選択的に作用する界面活性剤の存在下で
ＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールを反応消去した
後にＨＤＬに選択的に作用する界面活性剤を用いてＨＤ
Ｌコレステロールを反応させ検出する方法（特開平９−
２９９号公報）が開示されている。

【００１２】その他に、リポ蛋白質凝集剤と界面活性剤
を組み合わせた方法として、ＨＤＬに優先的に作用する
界面活性剤とリポ蛋白質コレステロールの酵素反応を抑
制する物質の共存下でＨＤＬを優先的に反応させ検出す
る方法（特開平１１−５６３９５号公報）、リポ蛋白質
コレステロールの反応性をコントロールする糖化合物と
界面活性剤の共存下でＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステ
ロールを反応消去してＨＤＬコレステロールを定量する
方法（特開平７−３０１６３６号公報）等が開示されて
いる。

【００１３】一方、ＬＤＬコレステロールの直接測定試
薬に関してもＨＤＬコレステロールの直接測定試薬と同
じような手法による測定方法が開示されている。リポ蛋
白質凝集剤等を用いたＬＤＬコレステロール測定方法と
して、ＬＤＬのみを凝集させる水溶性ポリマーの存在下
でＬＤＬコレステロールの凝集によって上昇する反応液
濁度を測定する方法（特開平６−２１３８９９号公
報）、ＬＤＬのみを凝集させる凝集剤の存在下でＬＤＬ
以外のリポ蛋白質コレステロールを反応消去した後にＬ
ＤＬコレステロールを反応させ検出する方法（特開平７
−２８０８１２号公報）、ＬＤＬのみを反応阻害する試
薬の存在下でＬＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールを
消去した後に残存したＬＤＬコレステロールを反応させ
検出する、あるいはＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロ
ールを凝集させてＨＤＬコレステロールを反応消去した
後にＬＤＬのみに作用する酵素を用いてＬＤＬコレステ
ロールを測定する方法（Ｗ０９６／２８７３４号公
報）、ＬＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールの酵素反
応を抑制するシクロデキストリン誘導体を用いる方法
（特開平１０−３１１８３３号公報、特開平１１−３０
６１７号公報）等が開示されている。

【００１４】また、界面活性剤を用いたＬＤＬコレステ
ロール測定方法としては、界面活性剤濃度等特定の条件
下で血清中のＬＤＬコレステロールが優先的に酵素反応
することを利用した方法（特開昭５８−１６５８００号
公報）、両性界面活性剤とカルボキシル基またはスルホ
ン基を有する脂肪族アミン類の存在下でＬＤＬコレステ
ロールを選択的に反応させ検出する方法（特開平１０−
８４９９７号公報）、第１工程で界面活性剤を用いてＬ
ＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールを全て反応させた
後に残存したＬＤＬコレステロールを第２工程で別種の
界面活性剤を用いて反応させ検出する方法（特開平１０
−３８８８８号公報）などが開示されている。更に、Ｌ
ＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬコレス
テロールを選択的に反応させ検出する方法（特開平１０
−８０３００号公報）も開示されている。

【００１５】前述のように動脈硬化の発生頻度に対して
ＬＤＬコレステロール値は正の相関を示し、逆にＨＤＬ
コレステロール値は負の相関を示すため、両方のリポ蛋
白質コレステロール値を測定することによって動脈硬化
の発生リスクをより正確に把握することができるが、従
来のリポ蛋白質コレステロールの直接的測定方法はほと
んどがＨＤＬコレステロールあるいはＬＤＬコレステロ
ールのいずれしか定量できないものであるため、ＨＤＬ
コレステロールとＬＤＬコレステロールを定量する場合
には二つの測定方法を併用する必要があった。

【００１６】一般に、遠心分離あるいは電気泳動等のリ
ポ蛋白質の分離操作をしないリポ蛋白質コレステロール
の直接的な測定方法を用いて両リポ蛋白質のコレステロ
ールを同時に定量するためには、先ずＨＤＬ（あるいは
ＬＤＬ）コレステロールを選択的に反応させて定量した
後にＬＤＬ（あるいはＨＤＬ）コレステロールを選択的
に反応させて定量する手法がとられる。

【００１７】例えば、ＷＯ９６/２８７３４号公報のＬ
ＤＬコレステロール測定方法の中の一つに、先ずＨＤＬ
コレステロールを選択的に消去した後に次の工程でＬＤ
Ｌコレステロールを選択的に反応させＬＤＬコレステロ
ールを定量する測定方法が開示されている。これはＨＤ
Ｌコレステロールを消去する段階でＨＤＬコレステロー
ルを定量することができればＨＤＬコレステロール及び
ＬＤＬコレステロール両方の定量が可能となる測定方法
である。しかしこの方法はＨＤＬコレステロールを選択
的に反応させるために、ヘパリン、リンタングステン
酸、デキストラン硫酸、硫酸化シクロデキストリン、硫
酸化オリゴ糖等のリポ蛋白質凝集剤と二価金属イオンに
より、あるいは抗アポ抗体によりＨＤＬ以外のリポ蛋白
質を凝集させて反応阻害する方法である。このようなリ
ポ蛋白質を凝集させる方法は光学的な測定に影響し反応
液の濁度を上昇させコレステロールの測定精度を低下さ
せるという問題を持っており、ＨＤＬコレステロールを
正確に定量するためにはリポ蛋白質凝集塊の溶解工程
（特開平６−２４２１１０号公報）や、反応速度を測定
すること（特開平８−１３１１９５号公報）が必要にな
る。

【００１８】また、特開平１１−９３００号公報ではア
ルブミンと胆汁酸存在下でＨＤＬコレステロールに選択
的に作用する酵素を用いてＨＤＬコレステロールを反応
させ、引き続きＬＤＬコレステロールに選択的に作用す
る酵素を用いてＬＤＬコレステロールを反応させるＨＤ
Ｌコレステロール及びＬＤＬコレステロールの測定方法
が開示されているが、ＬＤＬコレステロールを反応させ
るためにはＨＤＬコレステロールを反応させる酵素とは
別の酵素を使用する必要があり、他の試薬に比して酵素
が高額であることから未だコスト面での問題が残されて
いた。

【００１９】さらに、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステ
ロールに対する酵素反応を抑制する界面活性剤を利用し
てＨＤＬコレステロールを定量する方法も既に多数開示
されている（特開平８−１１６９９６号公報、ＷＯ９７
/４０３７６号公報）。また、ＬＤＬコレステロールの
酵素反応を選択的に促進する界面活性剤を利用したＬＤ
Ｌコレステロールの選択的測定方法（特開平１０−８４
９９７号公報）も開示されている。しかし、一般に界面
活性剤を混合すると各々の界面活性剤が単独で発揮する
作用とは異なる作用が生じるために、単独ではＬＤＬコ
レステロールに選択的に作用する界面活性剤であっても
ＨＤＬコレステロールに選択的に作用する界面活性剤が
共存する反応液に添加した場合にはＬＤＬコレステロー
ルに選択的に作用することは保証されない。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる状況に
鑑みてなされたものであり、特定のリポ蛋白質分画のコ
レステロールの測定方法において、光学的な測定を妨害
し分析装置に影響を与えうる可能性のあるリポ蛋白質を
凝集させることなく、必要に応じてＨＤＬコレステロー
ルの高精度の定量が可能であり、簡便かつ安価で汎用性
の高いＬＤＬコレステロールの測定方法及び測定試薬を
提供することを目的とする。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質に含まれるコレ
ステロールの酵素反応を抑制する第１界面活性剤の共存
下において、ある特定の界面活性剤がＶＬＤＬには作用
することなくＬＤＬのみに選択的に作用してＬＤＬに含
まれるコレステロールと酵素が反応し得る状態にする機
能を有することを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。

【００２２】すなわち本発明は、次の事項に関する。 ［１］（１）リポ蛋白質を含有する試料に、酵素と第１
界面活性剤を加えることによりＨＤＬコレステロールを
選択的に酵素反応させる第１工程、（２）次いで、第２
界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレステロール
を選択的に酵素反応させる第２工程、及び（３）（１）
及び／または（２）の工程において、酵素との反応によ
り消費される化合物または生成される化合物を測定する
ことにより、ＨＤＬコレステロール及び／またはＬＤＬ
コレステロールを測定することを含むことを特徴とする
リポ蛋白質コレステロールの測定方法。 ［２］第１界面活性剤が、胆汁酸誘導体及び／または両
性界面活性剤である上記［１］に記載のリポ蛋白質コレ
ステロールの測定方法。 ［３］第２界面活性剤が、第１界面活性剤の共存下にお
いて用いることにより、第１界面活性剤により酵素反応
を抑制されていたＬＤＬコレステロールを選択的に酵素
反応可能にする機能を有することを特徴とする上記
［１］または［２］に記載のリポ蛋白質コレステロール
の測定方法。 ［４］第２界面活性剤が、ポリオキシエチレン鎖を有す
るノニオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なく
とも１種の界面活性剤である上記［１］ないし［３］の
いずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方
法。 ［５］第２界面活性剤のＨＬＢが、９以上１１未満であ
る上記［４］に記載のリポ蛋白質コレステロールの測定
方法。 ［６］酵素、第１界面活性剤及び第２界面活性剤から構
成されてなり、上記［１］ないし［５］のいずれかに記
載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法において用い
るリポ蛋白質コレステロールの測定試薬。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明は（１）リポ蛋白質を含有
する試料に酵素と第１界面活性剤を加えることにより高
密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）コレステロールを酵素と反応
させること、（２）次いで、第２界面活性剤を加えるこ
とにより、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール
を選択的に酵素と反応させること、及び（３）（１）及
び／または（２）の酵素との反応により消費される化合
物または生成される化合物を測定することにより、ＨＤ
Ｌコレステロール及び／またはＬＤＬコレステロールを
測定することを含むことを特徴とするリポ蛋白質コレス
テロールの測定方法に関する。

【００２４】また、本発明は酵素とＨＤＬ以外のリポ蛋
白質に含まれるコレステロールの酵素反応を抑制する第
１界面活性剤と、第１界面活性剤の共存下においてＬＤ
Ｌに含まれるコレステロールを酵素反応可能にする第２
界面活性剤から構成されるリポ蛋白質コレステロールの
測定試薬である。

【００２５】本発明は第１工程において、酵素とＨＤＬ
以外のリポ蛋白質に含まれるコレステロールの酵素反応
を抑制する第１界面活性剤とをリポ蛋白質を含む試料に
添加した後、酵素の活性が保持される温度範囲において
ＨＤＬに含まれるコレステロールが完全に消費されるま
で反応させる。

【００２６】第１工程において使用する酵素に特に制限
は無く、コレステロールを測定するために通常使用され
るコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼを使用するこ
とができる。

【００２７】用いる酵素の濃度は、試料中のコレステロ
ールの濃度、反応温度及び反応時間等によって設定す
る。例えば、リポ蛋白質を含む試料が血清または血漿で
あり１０分間程度で反応させる場合にはコレステロール
エステラーゼの濃度は０.１Ｕ/ｍｌ〜５０Ｕ/ｍｌ、コ
レステロールオキシダーゼの場合は０.１Ｕ/ｍｌ〜１０
Ｕ/ｍｌに調製する。試薬のｐＨは酵素が活性を失わな
い範囲であればいずれでもよいがｐＨ６.０〜８.０の範
囲が望ましく、１〜２００ｍＭのｐＨ緩衝剤により調節
する。ｐＨ緩衝剤にも特に制限はないが、設定したｐＨ
に対応するｐＫａを持つｐＨ緩衝剤を選択するのが望ま
しく、N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesul
fonate)（ＨＥＰＥＳ）、Piperazine-N,N'-bis(2-ethan
esulfonate)（ＰＩＰＥＳ）、3-(N-Morpholino)propane
sulfonate（ＭＯＰＳ）などが挙げられる。

【００２８】最初に作用させる第１界面活性剤はＨＤＬ
以外のリポ蛋白質に含まれるコレステロールの酵素反応
を抑制する機能を有する界面活性剤であって、第２界面
活性剤と協同的に作用してＬＤＬコレステロールの酵素
反応を促進する機能を有するものであればいずれのもの
でも使用できる。例えば、胆汁酸誘導体として胆汁酸及
びその塩、両性界面活性剤としてラウリルカルホ゛キシメチルヒト゛ロキシエ
チルイミタ゛ソ゛リニウムヘ゛タイン、N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-amm
onio-1-propanesulfonate（ＳＢ３−１４）、N-Hexadec
yl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate（ＳＢ
−１６）、N-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane
sulfonate（ＳＢ３−８）、N-Octadecyl-N,N-dimethyl-
3-ammonio-1-propanesulfonate（ＳＢ３−１８）、N-De
cyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate（Ｓ
Ｂ３−１０）、N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-p
ropanesulfonate（ＳＢ−１２）、胆汁酸誘導体で且つ
両性界面活性剤である3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl
ammonio]propanesulfonate（ＣＨＡＰＳ）あるいは3-
[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]2-hydroxypropa
nesulfonate（ＣＨＡＰＳＯ）等があげられ、これらの
なかでも胆汁酸、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳＯ、ＳＢ３−
１４等が好ましく用いられる。

【００２９】用いる第一界面活性剤の濃度は選択した界
面活性剤に応じて決められる。例えば、胆汁酸、ＣＨＡ
ＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＳＢ３−１４の場合は０.０
１〜１％好ましくは０.１〜０.５％である。

【００３０】本発明において、酵素の活性あるいは界面
活性剤の作用に影響しないものであれば任意の物質を共
存させることができる。例えば、塩化ナトリウム、リン
酸カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化
第１銅等の塩類、血清アルブミン等の蛋白質、アスコル
ビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、カタラーゼ等
の酵素、コレステロールの酵素反応生成物を定量するた
めの色素原体等、更にはＨＤＬ以外のリポ蛋白質に含ま
れるコレステロールの反応を抑制する補助剤を酵素の活
性あるいは界面活性剤の作用に影響しない濃度範囲で共
存させることができる。

【００３１】反応に要する時間は試料中に含まれるコレ
ステロール量、酵素濃度、界面活性剤濃度、反応温度で
決定されるが、ＨＤＬに含まれるコレステロールが酵素
反応により生成するあるいは消費される物質を定量する
一般的な方法で知ることができる。例えば、コレステロ
ール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼ及び
コレステロールオキシダーゼを用いた場合、コレステロ
ールが反応して生成した過酸化水素はパーオキシダーゼ
の共存下４−アミノアンチピリンとN-Ethyl-N-(2-hydro
xy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline（ＴＯＯＳ）、N-E
thyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanil
ine（ＤＡＯＳ）、N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropy
l)-3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline（ＦＤＡＯＳ）等の
トリアンダー試薬の酸化縮合反応により生じる色素の濃
度を吸光度で測定することができ、予め試薬中にパーオ
キシダーゼと４−アミノアンチピリン及びＴＯＯＳを添
加して反応中の吸光度を経時的に測定すると、ＨＤＬコ
レステロールが反応して消費される時間は吸光度が変化
しなくなる時間で知ることができる。

【００３２】また、コレステロールが反応する際に消費
される酸素を酸素電極によって測定することによっても
ＨＤＬコレステロールが反応して消費される時間を知る
ことができる。

【００３３】コレステロール測定用酵素としてコレステ
ロールエステラーゼ及びコレステロールデヒドロゲナー
ゼを用いた場合、コレステロールが反応して生成したＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈを例えば３４０ｎｍの吸光度で紫外吸収で
測定したり、ホルマザン色素を形成させて比色定量する
ことができる。

【００３４】本発明においては、第１工程でＨＤＬコレ
ステロールが反応した後の試料に、第１界面活性剤の共
存下でＬＤＬコレステロールの酵素反応を促進し、かつ
ＶＬＤＬコレステロールの酵素反応を抑制する機能を有
する第２界面活性剤を添加してＬＤＬコレステロールを
反応させる第２工程を有する。用いる第２界面活性剤と
しては、本発明の目的に適合するものであれば特に制限
はないが、ＨＤＬ以外のリポ蛋白質コレステロールの酵
素反応を抑制する第一界面活性剤として、例えば胆汁酸
誘導体あるいは両性界面活性剤を用いた場合には、第２
界面活性剤としてはＨＬＢ値が９以上１１未満のポリオ
キシエチレン鎖を有するノニオン性界面活性剤を用いる
ことが好ましく、これによりＶＬＤＬコレステロールの
反応抑制効果は維持されるがＬＤＬコレステロールに対
する反応抑制が選択的に解除されてＬＤＬコレステロー
ルの反応が促進される。

【００３５】ＨＬＢ値が９より小さいかあるいは１１以
上の場合は、ＶＬＤＬコレステロールの反応も促進され
るため好ましくない。

【００３６】ポリオキシエチレン鎖を有する界面活性剤
は、特開平９−２９９号公報においてＨＤＬ以外のリポ
蛋白質分画中のコレステロールに対する酵素による作用
を抑制する界面活性剤として開示されており、また特開
平１０−３８８８８号公報ではＨＬＢ値が１１以上１３
未満のポリアルキレンオキサイド誘導体が全てのリポ蛋
白質に作用し、ＨＬＢ値が１３以上１５未満のポリアル
キレンオキサイド誘導体がＬＤＬコレステロール以外の
リポ蛋白質に作用することが開示されているが、その単
独での作用から界面活性剤の併用によるコレステロール
の分離測定の効果を確認できるものではなかった。

【００３７】ＨＬＢ値が９以上１１未満のポリオキシエ
チレン鎖を有するノニオン性界面活性剤としては、(ポ
リオキシエチレン)４―ラウリルエーテル、(ポリオキシ
エチレン)６−ラウリルエーテル、(ポリオキシエチレ
ン)８−オレイルエーテル、(ポリオキシエチレン)１０
−セチルエーテル、(ポリオキシエチレン)６−ノニルフ
ェニルエーテル等が挙げられるが、これらの中でも(ポ
リオキシエチレン)４ーラウリルエーテル、(ポリオキシ
エチレン)８−オレイルエーテルが好ましい。

【００３８】尚、ノニオン性界面活性剤のＨＬＢ値は例
えば、「新・界面活性剤入門」（藤本武彦著、昭和４８
年、三洋化成工業株式会社発行）等の周知の方法で算出
する。

【００３９】これら第２試薬は単独で添加してもよい
し、数種を混合してＨＬＢ値を調整して添加してもよ
く、第２試薬の添加濃度は選択した界面活性剤の種類に
応じて決められ、例えばポリオキシエチレンアルキルエ
ーテルの場合は０.０１〜１％、好ましくは０.１〜０.
４％である。

【００４０】用いる第２試薬のｐＨは酵素が活性を失わ
ない範囲であれば特に制限はなく、また第１界面活性剤
のｐＨと一致させる必要もない。

【００４１】ＨＤＬに含まれるコレステロールが完全に
消費された後に、消費されたコレステロールを定量す
る。定量方法としては、公知の方法、例えば反応液にパ
ーオキシダーゼと４−アミノアンチピリン及びＴＯＯＳ
等のトリアンダー試薬を添加して吸光度を測定すること
により消費されたＨＤＬコレステロールを定量できる。
反応液に予めパーオキシダーゼと４−アミノアンチピリ
ン及びトリアンダー試薬を添加して反応中の吸光度を経
時的に測定する場合には反応終点の吸光度から消費され
たＨＤＬコレステロールを定量できる。

【００４２】ＨＤＬコレステロールを測定する必要がな
い場合にはコレステロールの酵素反応生成物が以降のＬ
ＤＬコレステロールの測定に影響しないようにしておく
のがよい。例えば、カタラーゼにより過酸化水素を分解
する、あるいは反応液にパーオキシダーゼと４−アミノ
アンチピリンを加え４ーアミノアンチピリンの無色の二
量体を形成させる等の公知の方法が使用できる。

【００４３】本発明においてはＨＤＬコレステロールに
作用させる酵素をＬＤＬコレステロールにも作用させる
ため、ＬＤＬに作用する酵素を第２工程において新たに
添加する必要はない。

【００４４】本発明において、酵素の活性あるいは界面
活性剤の作用に影響しない範囲内で、任意の物質を同時
に添加することができる。例えば、コレステロールの測
定に一般的に用いられる色素原体、パーオキシダーゼ等
の酵素、塩化ナトリウム等の塩類、界面活性剤を可溶化
するための別種の界面活性剤等を加えることができる。

【００４５】第２工程において一定時間反応させＬＤＬ
に含まれるコレステロールが消費された後に、消費され
たコレステロールを公知の方法で定量することによって
ＬＤＬコレステロールを測定することができる。第１工
程において既にＨＤＬコレステロールの反応生成物を定
量する色素原体等を共存させている場合には、引き続き
吸光度を測定することでＬＤＬコレステロールを定量す
ることができる。

【００４６】例えば、ＨＤＬコレステロールを定量する
必要がなく、コレステロールエステラーゼとコレステロ
ールオキシダーゼを用いてコレステロールを定量する場
合においては、第１工程のＨＤＬコレステロールによっ
て生成する過酸化水素をカタラーゼによって分解し、第
２工程でカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを
共存させ、更にパーオキシダーゼと色素原体の４−アミ
ノアンチピリン及びトリアンダー試薬を共存させること
によってＨＤＬコレステロールを定量することなくＬＤ
Ｌコレステロールを定量できる。あるいは第１工程でパ
ーオキシダーゼと４−アミノアンチピリンを共存させて
生成した過酸化水素を無色の４−アミノアンチピリン二
量体に導いている場合には、第２工程でトリアンダー試
薬を添加することによってＨＤＬコレステロールを定量
することなくＬＤＬコレステロールを定量することがで
きる。

【００４７】このように本発明は、反応液の濁度を上昇
させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせず、使用する酵素に
制限がなく、またＬＤＬコレステロールを反応させる工
程で新たに別の酵素を加える必要がなく、複数の界面活
性剤を組み合わせて用いる点に特徴を有するものであ
り、コレステロール測定に用いられる通常の酵素をその
まま用いてＬＤＬコレステロール及び必要に応じてＨＤ
Ｌコレステロールを同時に定量することができる。

【００４８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるもの
ではない。 （実施例１〜実施例４）１０種類の血清それぞれについ
て下記の方法で測定を行った。

【００４９】１５０ｍＭの塩化ナトリウムとｐＨ緩衝剤
として3-(N-Morpholino)propanesulfonate（ＭＯＰＳ）
３０ｍＭを含む水溶液をｐＨ７.０に調整し、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のコレステロールエステラーゼ
（５Ｕ/ｍｌ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来の
コレステロールオキシダーゼ（１Ｕ/ｍｌ）とＣＨＡＰ
Ｓ（０.２％）を添加し、更にコレステロールの酵素反
応生成物である過酸化水素を定量するためのパーオキシ
ダーゼ（３Ｕ/ｍｌ）、４−アミノアンチピリン（１ｍ
Ｍ）、ＴＯＯＳ（１ｍＭ）を添加し第１工程において用
いる試薬を調製した。また、１５０ｍＭの塩化ナトリウ
ムと３０ｍＭのＭＯＰＳを含む水溶液をｐＨ７.０に調
整し、下記（Ａ）〜（Ｄ）のポリオキシエチレン鎖を有
するノニオン性界面活性剤０.２％を添加した第２工程
における試薬を調製した。血清をアスコルビン酸オキシ
ダーゼ（２０Ｕ/ｍｌ）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム水溶液で１０倍に希釈して３７℃で５分間加温した後
に、その０.１ｍｌを予め３７℃に加温した第１工程に
おいて用いる試薬０.９ｍｌに混和して３７℃で５分間
反応させ（第１工程）、更に第２工程において用いる試
薬１ｍｌを追添して３７℃で５分間反応させ（第２工
程）、該全反応工程の反応液の吸光度（主波長５５０ｎ
ｍ/副波長７００ｎｍ）を経時的に測定した。別にコレ
ステロールパルミテートを０．１％の(Octylphenoxy)po
lyethoxyethanol（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）水溶液
にコレステロール換算で５０ｍｇ/ｄｌ相当の濃度に懸
濁して調製した標準液を血清と同様に第１工程において
用いる試薬と反応させて、吸光度変化量と標準液コレス
テロール濃度から検量線を作成し、第１工程において用
いる試薬と血清を混和して５分間で反応した血清中のコ
レステロール濃度と更に第２工程において用いる試薬を
追添してから５分間で反応した血清中のコレステロール
濃度を算出した。対照法として、反応液体クロマトグラ
フィー法で同一の血清のＨＤＬコレステロール及びＬＤ
Ｌコレステロールを定量した。Ｓｈｏｄｅｘ（昭和電工
株式会社登録商標） ＫＷ−８０４カラム（昭和電工株
式会社製）を用い１５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を溶離液として血清中のリポ蛋白質を分離し、カラム出
口に溶出液とコレステロール検出液を混合させる反応コ
イルを接続して、反応コイル中でカラム溶出液とコレス
テロール検出液混合物を４５℃で３分間反応させた後
に、５５０ｎｍの吸光度を測定することによってリポ蛋
白質各分画のコレステロール量を測定した。尚、コレス
テロール検出液はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のコ
レステロールエステラーゼ（１０Ｕ/ｍｌ）及びＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ属菌由来のコレステロールオキシダー
ゼ（１０Ｕ/ｍｌ）及びパーオキシダーゼ（２０Ｕ／ｍ
ｌ）、４−アミノアンチピリン（２ｍＭ）、ＴＯＯＳ
（２ｍＭ）を含む０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶
液であり、溶出液と１：１に混合するように反応コイル
への流入量を調節した。また、クロマトグラム中のピー
クは超遠心法によって分離したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤ
Ｌ分画を用いて同定した。

【００５０】第１工程で反応した血清中のコレステロー
ル濃度、第２工程で反応した血清中のコレステロール濃
度、反応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって
定量した同一血清中のＨＤＬコレステロール濃度及び反
応液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量し
た同一血清中のＬＤＬコレステロール濃度を表１に示
す。

【００５１】なお、実施例１から実施例４の第２工程で
用いる第２界面活性剤をそれぞれ（Ａ）〜（Ｄ）として
以下に示す。 （Ａ）：（ポリオキシエチレン）３−ノニルフェニルエ
ーテル（ＨＬＢ値７.８） 花王株式会社製エマ
ルゲン９０３ （Ｂ）：（ポリオキシエチレン）４−ラウリルエーテル
（ＨＬＢ値９.６）花王株式会社製エマルゲン１０４Ｐ （Ｃ）：（ポリオキシエチレン）８−オレイルエーテル
（ＨＬＢ値１０.０）花王株式会社製エマルゲン４０８ （Ｄ）：（ポリオキシエチレン）８−ラウリルエーテル
（ＨＬＢ値１２.１）花王株式会社製エマルゲン１０８

【００５２】

【表１】

【００５３】表１に示すように、第１工程で反応するコ
レステロールはＨＤＬコレステロールと高い相関を示
し、また、第２界面活性剤としてＨＬＢ値が９以上１１
未満のポリオキシエチレン鎖を有するノニオン性界面活
性剤を用いた場合には、第２工程で反応するコレステロ
ールはＬＤＬコレステロールと高い相関を示した。 （実施例５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物由来のコ
レステロールオキシダーゼをＳｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属
微生物由来のコレステロールオキシダーゼ（１Ｕ／ｍ
ｌ）に、第１界面活性剤をＣＨＡＰＳからＳＢ３−１４
（０．２％）へ変更し、第２界面活性剤を０.２％のポ
リオキシエチレンラウリルエーテル（花王株式会社製；
エマルゲン１０４Ｐ（ＨＬＢ値９.６））とし、更に第
１工程において色素原体ＴＯＯＳを除き、第２工程でＴ
ＯＯＳを１ｍＭの濃度で添加する以外は実施例１と同様
にして反応を実施した。この条件ではＨＤＬコレステロ
ールを定量することなくＬＤＬコレステロールを定量す
ることができる。反応終了後の反応液の吸光度を測定
し、実施例１から実施例４において作成した検量線を用
いて反応した血清中のコレステロール濃度を算出した。
図１に、第１工程及び第２工程において変化した吸光度
から算出した血清中のコレステロール濃度を縦軸にと
り、実施例１から実施例４と同様にして反応液体クロマ
トグラフィーによって定量した同一血清中のＬＤＬコレ
ステロール濃度を横軸にとった分散図を示す。

【００５４】図１に示すように、本発明の測定方法で定
量される血清中のコレステロールはＬＤＬコレステロー
ルと高い相関を示した。

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、反応液の濁度を上昇さ
せるリポ蛋白質凝集剤を必要とせず、使用する酵素に制
限がない上、ＬＤＬコレステロールを反応させる工程で
新たに別の酵素を加える必要もなく、簡便でかつ安価に
ＬＤＬコレステロールを定量することができ、また必要
に応じてＨＤＬコレステロールを光学的な測定を妨害す
るリポ蛋白質の凝集を形成することなく正確かつ安価に
測定することができる測定方法及び測定試薬を提供する
ことができるため、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野
に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例５のリポ蛋白質コレステロー
ルの測定方法による測定値とＨＰＬＣ測定値との相関関
係の一例を示す分散図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 澤柳 豊治 神奈川県川崎市川崎区扇町５番１号 昭和 電工株式会社総合研究所川崎研究室内 Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA25 BB29 CA25 DA62 DA63 DA64 DA69 FB01 JA01 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ76 QR03 QR12 QR41 QR51 QS20 QX01

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）リポ蛋白質を含有する試料に、酵
   素と第１界面活性剤を加えることによりＨＤＬコレステ
   ロールを選択的に酵素反応させる第１工程、（２）次い
   で、第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレス
   テロールを選択的に酵素反応させる第２工程、及び
   （３）（１）及び／または（２）の工程において、酵素
   との反応により消費される化合物または生成される化合
   物を測定することにより、ＨＤＬコレステロール及び／
   またはＬＤＬコレステロールを測定することを含むこと
   を特徴とするリポ蛋白質コレステロールの測定方法。
2. 【請求項２】 第１界面活性剤が、胆汁酸誘導体及び／
   または両性界面活性剤である請求項１に記載のリポ蛋白
   質コレステロールの測定方法。
3. 【請求項３】 第２界面活性剤が、第１界面活性剤の共
   存下において用いることにより、第１界面活性剤により
   酵素反応を抑制されていたＬＤＬコレステロールを選択
   的に酵素反応可能にする機能を有することを特徴とする
   請求項１または請求項２に記載のリポ蛋白質コレステロ
   ールの測定方法。
4. 【請求項４】 第２界面活性剤が、ポリオキシエチレン
   鎖を有するノニオン性界面活性剤からなる群より選ばれ
   る少なくとも１種の界面活性剤である請求項１ないし請
   求項３のいずれかに記載のリポ蛋白質コレステロールの
   測定方法。
5. 【請求項５】 第２界面活性剤のＨＬＢが、９以上１１
   未満である請求項４に記載のリポ蛋白質コレステロール
   の測定方法。
6. 【請求項６】 酵素、第１界面活性剤及び第２界面活性
   剤から構成されてなり、請求項１ないし請求項５のいず
   れかに記載のリポ蛋白質コレステロールの測定方法にお
   いて用いるリポ蛋白質コレステロールの測定試薬。