KR100346658B1 - 콜레스테롤의정량방법 - Google Patents

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Abstract

효소적 측정법에 의해 콜레스테롤을 측정하기 전에 리포단백질을 함유하는 검체에 고비중 리포단백질 이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 첨가함을 특징으로 하는 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤을 정량적으로 측정하는 방법을 개시한다.
본 방법은 원심분리 등의 전처리 필요가 없고, 간편한 조작으로 효율 좋게 HDL중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 또한 적은 시료로 간편하게 조작함으로서 특이적인 측정이 가능하기 때문에 각종 자동 분석 장치에 적용할 수 있어서, 임상 검사의 영역에서도 극히 유용하다.

Description

콜레스테롤의 정량방법 {METHOD FOR QUANTITATIVELY DETERMINING CHOLESTEROL}
콜레스테롤과 같은 혈청지질은 리포단백질과 결합한다. 리포단백질은 물리적 성상에 차이에 따라 카이로 미크론, 초저비중 리포단백질, 저비중 리포단백질(LDL), 고비중 리포단백질(HDL)등으로 분류된다. 이들 리포단백질중, LDL은 동맥경화 야기성을 가지며, HDL은 항동맥경화 작용을 갖는 것으로 알려졌다.
역학적으로 HDL중의 콜레스테롤치는 동맥경화성 질환의 발증빈도와 역상관(逆相關)을 나타내는 것이 판명되었으며, 오늘날에는 허혈성 심질환의 예방이나 진단을 목적으로 HDL중의 콜레스테롤의 측정이 널리 행하여지고 있다.
HDL중의 콜레스테롤의 측정방법으로서는, 예를 들면 초원심분리에 의해 HDL을 다른 리포단백질과 분리한 후, 콜레스테롤 측정하는 방법, 전기냉동에 의해 분리한 후에 지질의 염색을 행하고 그의 발생강도를 측정하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법은 모두 조작이 번잡하거나, 다수의 검체를 처리할 수 없는것 등의 문제가 있으므로 임상적으로는 거의 사용되지 않고 있다.
HDL 중의 콜레스테롤의 측정방법으로서 현재 임상 검사의 영역에서 일반적으로 널리 사용되고 있는 방법은 검체에 침전제를 가하여 HDL이외의 리포단백질을 응집시키고, 이를 원심분리에 의해 제거하고, 분리된 HDL만을 함유하는 상청중의 콜레스테롤을 측정하는 침전법이다.
이 방법은 초원심법이나 전기냉동법에 비교하여 간편할지라도, 침진제를 가하여 분리하는 조작을 포함하기 때문에 비교적 다양의 검체량을 필요로 하고, 또한 분석오차가 생길 가능성이 높고, 전분석공정을 완전히 자동화할 수 없었다.
한편, 효소적으로 HDL중의 콜레스테롤을 분별정량하는 방법도 검토되고 있다. 예를 들면, 담즙산염 또는 비이온계면활성제 존재하에 효소반응을 행하는 방법(일본국 특개소 63-126498호 공보)이 알려져 있다. 이 방법은 반응 초기의 효소반응속도는 LDL 농도에 비례하고, 그 후 HDL중의 콜레스테를 농도에 비례하는 것을 이용한 것이나, HDL중의 콜레스테롤과 다른 리포단백질중의 콜레스테롤의 반응을 완전히 분별할 수 없고, 측정되는 대상이 LDL중의 콜레스테롤로부터 HDL중의 콜레스테롤을 단계적이 아니고, 오버랩하면서 서서히 변화하기 때문에 정확한 방법이라 할 수 없다.
또한, HDL이외의 리포단백질을 내리 응집시켜 놓고, HDL종의 콜레스테롤만을 효소적으로 반응시킨 후에, 효소를 불활성화시킴과 동시에 응집된 리포단백질을 재용해하여 흡광도를 측정하는 방법(일본국 특개평 6-242110호 공보)이 알려져 있다. 그러나, 이 방법은 적어도 3회의 시약을 첨가할 필요가 있기 때문에 한정된 자동분석장치밖에 적용할 수 없고, 범용성의 점에서 문제가 있다. 또한, 침전 재용해시에는 고농도의 염을 사용하는 등, 분석 기기에 대한 손상이나 시약 폐기의 점에서 만족할 만한 것은 아니다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
따라서, 본 발명의 목적은 원심분리 등의 전처리가 필요 없고, 간편한 조작으로 효율 좋게 측정할 수 있으며, 각종 자동분석장치에 적용할 수 있는 HDL중의 콜레스테롤의 정량방법을 제공하는데 있다.
이러한 실정에서 본 발명자는 예의 연구한 결과, 검체에 HDL이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질과 계면활성제를 첨가한 후 효소적으로 콜레스테롤을 측정하면 HDL중의 콜레스테롤을 효율 좋게 정량할 수 있고, 더욱이 자동분석장치에도 적용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 원심분리 등의 전처리가 필요 없고, 소량의 시료로 간단히 조작함으로서 효율 좋게 고비중의 리포단백질중의 콜레스테롤을 측정하는 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 리포단백질을 함유하는 검체에 고비중 리포단백질 이외의 리 포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 첨가한 후, 효소적 측정법에 의해 콜레스테롤을 측정하는 것을 특징으로 하는 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 HDL이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질로서는 HDL과 HDL 이외의 리포단백질과 친화성이 있는 물질이면 좋으며, 예를 들면 덱스트린 술페이트, 인텅그스텐산 및 헤파린과 같은 폴리아니온; 마그네슘이온 또는 칼슘 이온과 같은 2가 금속 이온; 폴리에틸렌글리콜과 같은 수용성 폴리머; HDL이외의 리포단백질에 대한 항체 등을 들 수 있다.
이들 물질은 1종 또는 2종이상 조합하여 사용할수 있다. 또한 이들중, 특히 폴리아니온과 2가금속이온을 조합하는 것이 바람직하다. 이들 물질의 사용량은 특별히 제한되지 않고, 또한 물질의 종류에 따라 다르나, 이들 물질과 HDL이외의 리포 단백질과 복합체를 형성하고 있으면 좋고 응집물을 형성하여도 또는 형성하지 않아도 좋다. 예를 들면 폴리아니온과 2가금속이온 조합하여 사용하는 경우, 시료와 혼합하였을 때의 농도가 폴리아니온 0.02∼2중량%, 2가 금속 이온 10∼500mM로 되는 것이 바람직하고, 특히 폴리아니온 0.05∼1중량%, 2가 금속 이온 20∼200mM되는 범위에서 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 사용하는 계면 활성 제로서는 콜레스테롤의 효소적 측정계(測定系)에 대하여 저해 효과를 갖는 것, 즉 리포단백질을 용해하지 않는 것이 바람직하고, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르술페이트, 알킬벤젠술포네이트 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 알킬에테르의 바람직한 예로서는 폴리옥시에틸렌세틸에테르(HLB 14) (시판품으로서 카오사의 Emulgen 220이 있다)을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르의 바람직한 예로서는 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 HLB 15 (시판품으로서는 카오사의 Emulgen 913)을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물의 바람직한 예로서는 시판품으로서 아사히 덴카 주식회사의 Pluronic F88을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 술페이트의 바람직한 예로서는 나트륨 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르술페이트(시판품으로서 카오사의 Emal 20C가 있다)등을 들 수 있다. 알킬벤젠술포네이트의 바람직한 예로서는 나트륨 도데실 벤젠 술포네이트를 들 수 있다.
이를 계면활성제는 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있고, 그의 사용량은 특별히 한정되는 것은 아니나, 시료와 혼합할 때의 농도가 0.01∼5중랑%, 특히 0.05∼1중량%로 되는 범위로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 우선 HDL 이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 검체에 첨가한, 이 때에는 이들 물질을 혼합하여 동일 시약으로 첨가하여도, 또는 각각 별개의 시약으로서 첨가하여도 좋다.
다음에 이와 같이 HDL이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 첨가한 검체를 직접 콜레스테롤의 측정에 건다. 즉, 원심분기 등의 전 처리를 할 필요가 없다.
콜레스테롤의 특정 방법으로서는 공지의 효소적 측정법의 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 효소 시약으로서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 조합하여 사용하는 것이 바람직하다.
효소 시약을 첨가한 후, 일정 시간의 시그널 량을 측정함으로서 측정 대상인 콜레스테롤 농도를 구할 수 있으며, 또한 분석의 정확도를 높일 목적에서 효소 시약을 첨가한 후, 정해진 2점의 시간에서의 시그널 량을 비교함으로서(2 point 법), 콜레스테롤의 농도를 구할 수 있다.
또한, 이를 효소시약 등을 첨가한 후, 최종적으로 콜레스테롤을 검출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 퍼옥시다아제와 색원체(chromogen)를 다시 조합하여 행하는 흡광도 분석, 보효소나 과산화수소를 직접 검출하는 방법 등을 들 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더 상세히 설명한, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
리포단백질을 함유하는 혈청검체 No. 1∼No. 10에 대하여 본 발명의 방법 및 종래의 침전법에 의해 HDL 중의 콜레스테롤을 정량하고, 이들 측정치를 비교했다. 결과를 표1에 나타난다.
즉, 검체 4㎕에 인텅그스텐산 0.2%, 염화마그네숨 100mM 및 폴리옥시에텔렌-폴리옥시프로필렌 축합물(아사히 덴카 주식회사 제 Pluronic F-68) 0.5%를 함유하는 시약 300㎕를 가하고, 콜레스테롤 에스테라제 0.2U/㎖, 콜레스테롤 옥시다아제 0.2U/㎖, 퍼옥시다아제 0.3U/㎖, N,N-디메틸메타톨루이딘 0.04%, 4-아미노안티피린 0.05% 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 시약을 가했다. 이어서 545nm에서 흡광도의 차를 측정함으로 HDL중의 콜레스테롤 농도를 구하였다. 이상의 조작은 히다치 7150형 자동 분석장치를 사용하여 행했다.
한편, 침전법에 의해 HDL중의 콜레스테롤을 측정함에 있어, 덱스트린 술페이트 0.3% 및 염화 마그네슘 2%을 함유하는 수용액 0.2㎖를 검체 0.2㎖와 혼화하고, 3000rpm에서 10분간 원심 분리했다. 상청 5㎕를 채취하고, 전기와 동일한 콜레스테를 측정 시약 3㎖와 혼합하고, 37℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 545nm에서 흡광도를 측정하고, HDL중의 콜레스테를 농도를 구했다.
[표 1]
표 1의 결과로부터 본 발명 방법은 간편한 조작인 것에 불구하고, 종래의 침전법과 같은 정도의 측정치가 얻어졌다.
실시에 2;
리포단백질을 함유하는 검체 No. 11∼No. 20에 대하여 본 발명 방법 및 종래의 침전법에 의해 HDL중의 콜레스테롤을 정량하고, 이들 측정치를 비교했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
즉, 검체 4㎕에 인텅그스텐산 0.2%, 덱스트란 술페이트 1.8g/ℓ, 염화마그네슘 100mM 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물(아시히 덴카 주식회사 제Pluronic F-68) 0.2%를 함유하는 시약 300㎕를 가하고, 다음에 실시에 1과 동일한 콜레스테롤 측정 시약 100㎕를 가했다. 이하, 실시예 1과 동일하게 하여 HDL 중의 콜레스테롤 농도를 구했다.
또한, 침전법에 대해서도 실시예 1과 동일하게 측정했다.
[표 2]
표 2로부터 본 발명 방법은 적은 시료를 사용하고 간편한 조작으로 행할 수 있음에도 불구하고, 종래의 침전법과 같은 정도의 측정치가 얻어졌다.
본 발명에 따르면, 원심분리 등의 전처리 필요가 없고, 간편한 조작으로 효율 좋게 HDL 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 또한 적은 시료로 간편하게 조작함으로서 특이적인 측정이 가능하기 대문에 각종 자동 분석 장치에 적용할 수 있어서, 임상 검사의 영역에서도 극히 유용하다.

Claims (5)

  1. 리포단백질을 함유하는 검체에 고비중 리포단백질 이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 첨가한 후, 효소적 측정법에 의해 콜레스테롤을 측정함을 특징으로 하는 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량방법.
  2. 제 1항에 있어서, 고비중 리포단백질 이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질 및 계면활성제를 첨가한 검체를 직접 콜레스테롤의 측정에 거는 것이 특징인 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 고비중 리포단백질 이외의 리포단백질과 복합체를 형성하는 물질이 폴리아니온, 2가 금속이온, 수용성 고분자 화합물 또는 고비중 리포단백질 이외의 리포단백질에 대한 항체인 것이 특징인 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 계면활성제가 리포단백질을 용해하지 않는 것이 특징인 고비중 리포단백질중의 콜레스테롤의 정량방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 콜레스테롤의 측정을 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 조합하여 행하는 것이 특징인 고비중 리포단백질중의콜레스테롤의 정량방법.
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