DE69615956T2

DE69615956T2 - Methode zur Messung der Menge eines in einem spezifischen Lipoprotein enthaltenen Bestandteils

Info

Publication number: DE69615956T2
Application number: DE69615956T
Authority: DE
Inventors: Toshiro Hanada; Yutaka Miki; Kiyoko Tanaka
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-16
Publication date: 2002-06-20
Anticipated expiration: 2016-07-17
Also published as: US7223546B2; US6162607A; ES2165947T3; EP0754948A1; DE69615956D1; EP0754948B1; US20030180809A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung der Menge einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein einer aus einem lebenden Körper stammenden Probe, wie Serum und Plasma, enthalten ist. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Messung der Menge von Cholesterin bereit, das in Lipoprotein hoher Dichte (im folgenden als HDL bezeichnet) enthalten ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann mit Vorteil auf die automatische quantitative Messung von HDL-Cholesterin angewendet werden, die auf dem Gebiet klinischer Tests verbreitet verwendet wird.
Als Verfahren zur Messung der Menge einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein enthalten ist, wie von Cholesterin, das in HDL enthalten ist, sind verschiedene Verfahren bekannt, einschließlich des Ultrazentrifugentrennverfahrens, des Elektrophoreseverfahrens und des Fällungsverfahrens. Auf dem Gebiet der klinischen Tests wird gewöhnlich und verbreitet das Fällungsverfahren durchgeführt, da dieses Verfahren im Vergleich zum Ultrazentrifugentrennverfahren und zum Elektrophoreseverfahren einfach durchgeführt werden kann.
Bei der Durchführung des Fällungsverfahrens gibt es jedoch noch ein Problem, denn dieses Verfahren kann nicht durchgeführt werden, indem man nur einen herkömmlichen automatischen Analysator verwendet, da dieses Verfahren zwei Schritte umfasst: (1) ein Vorbehandlungsschritt, der a) das Mischen eines Serums mit einem Fällungsmittel und das Bilden von Niederschlägen aus den Lipoproteinen, die von dem speziellen Lipoprotein verschieden sind, b) das Trennen der Niederschläge durch Zentrifugation und c) das Gewinnen des so gebildeten Überstands umfasst; sowie (2) einen Schritt der Messung der Menge der Zielkomponente, die in dem speziellen Lipoprotein im Überstand enthalten ist.
Um dieses Problem zu lösen, wurden einige Verfahren entwickelt; zum Beispiel offenbart die Japanische Offenlegungsschrift Nr. Hei 6-242110 (1994) ein Verfahren, bei dem Lipoproteine, die von dem speziellen Lipoprotein verschieden sind, durch Verwendung eines Fällungsmittels und/oder eines Antikörpers, der gegenüber den von dem speziellen Lipoprotein verschiedenen Lipoproteinen reaktiv ist, agglutiniert werden, dann die Zielkomponente in dem speziellen Lipoprotein zur quantitativen Messung einer Reaktion mit einem Reagens unterzogen wird und danach gleichzeitig oder nach Abbruch der Reaktion das agglutinierte Lipoprotein unter Bildung einer homogenen Lösung aufgelöst wird und dann die optische Extinktion der Lösung gemessen wird.
Dieses Verfahren erfordert jedoch 3 oder 4 Arten von Reagentien und kann daher nur auf solche merklich eingeschränkten automatischen Analysatoren angewendet werden, bei denen eine Messung unter Verwendung von 3 oder 4 Arten von Reagentien durchgeführt werden kann, während dieses Verfahren nicht auf solche automatischen Analysatoren angewendet werden kann, bei denen nur bis zu 2 Arten von Reagentien verwendet werden können, wie sie bei klinischen Tests herkömmlicherweise verwendet werden. Weiterhin hat sich als Mangel eine Senkung der Reproduzierbarkeit der Messung aufgrund der Verwendung von 3 oder 4 Arten von Reagentien gezeigt.
In Anbetracht der obigen Umstände besteht die von der vorliegenden Erfindung zu lösende Aufgabe darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem unter Verwendung eines automatischen Analysators direkt die Menge der Zielkomponente gemessen werden kann, die in einem speziellen Lipoprotein einer aus einem lebenden Körper stammenden Probe enthalten ist, ohne dass eine Vorbehandlung zur Trennung des speziellen Lipoproteins von anderen Lipoproteinen notwendig ist wie bei der Durchführung des Fällungsverfahrens, das bei herkömmlichen klinischen Tests verbreitet verwendet wird.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung der Menge einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein einer aus einem lebenden Körper stammenden Probe enthalten ist, umfassend:
- Mischen der Probe mit einem Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, so dass eine Reaktion stattfinden kann;
- danach Messen der Extinktion (OD&sub1;) des Reaktionsgemischs;
dann Mischen des Reaktionsgemischs mit einem Reagens zur Messung der Komponente, so dass eine Reaktion stattfinden kann;
- danach Messen der Extinktion (OD&sub2;) des letzteren Reaktionsgemischs; und
- Berechnen der Menge der Komponente auf der Basis der Differenz zwischen OD&sub1; und OD&sub2;.
Das Verfahren zur Messung der Menge der Zielkomponente in einer lebenden Probe wird in vitro durchgeführt.
Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit zur Messung einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein enthalten ist, umfassend:
(i) eine Reagenszusammensetzung, die einen Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, sowie ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, enthält; und
(ii) eine Reagenszusammensetzung, die ein Reagens zur Messung der Zielkomponente sowie ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, enthält.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Erfinder haben umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt, um ein Verfahren zur direkten Messung der Menge einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein enthalten ist, unter Verwendung eines automatischen Analysators zu finden, ohne dass eine Vorbehandlung durchgeführt wird, um die von dem speziellen Lipoprotein verschiedenen Lipoproteine zu entfernen.
Als Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass die Messung der Komponente in einem speziellen Lipoprotein, ohne vorher andere Lipoproteine als das spezielle Lipoprotein zu entfernen, möglich ist, indem man eine Probe mit der ersten Reagenslösung mischt, die einen Antikörper enthält, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, so dass eine Reaktion stattfinden kann, und danach eine Extinktion (OD&sub1;) des Reaktionsgemischs misst und dann das Reaktionsgemisch mit der zweiten Reagenslösung mischt, die ein Reagens zur Messung der Komponente in dem Lipoprotein enthält, so dass eine Reaktion stattfinden kann, und danach eine Extinktion (OD&sub2;) des letzteren Reaktionsgemischs misst und die so gemessenen Extinktionen OD&sub1; und OD&sub2; verwendet, und auf der Basis dieses Ergebnisses wurde die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Die Lipoproteine werden gemäß ihren relativen Dichten in Chylomikronen, Lipoprotein sehr geringer Dichte (VLDL), Lipoprotein geringer Dichte (LDL) und HDL eingeteilt.
In der vorliegenden Erfindung können alle diese Lipoproteine als spezielles Lipoprotein, das das Ziel der Messung sein soll, ausgewählt werden. Zur Messung der Menge einer Zielkomponente, die in dem so ausgewählten speziellen Lipoprotein enthalten ist, wird zuerst eine Probe mit einem Antikörper gemischt, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, so dass eine Reaktion stattfinden kann, dann wird die optische Extinktion (OD&sub1;) des so erhaltenen Reaktionsgemischs gemessen, und danach wird das Reaktionsgemischs mit einem Reagens zur Messung der speziellen Komponente gemischt, so dass eine Reaktion stattfinden kann, dann wird die optische Extinktion (OD&sub2;) des letzteren Reaktionsgemischs gemessen, und die Menge der in dem speziellen Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente wird auf der Basis der gemessenen Werte der optischen Extinktionen (OD&sub2;) und (OD&sub1;) bestimmt, ohne eine Operation durchzuführen, um von dem speziellen Lipoprotein verschiedene Lipoproteine zu entfernen.
In der vorliegenden Erfindung umfasst die in dem speziellen Lipoprotein enthaltene Zielkomponente Cholesterin, Triglyceride und Phospholipide.
Der Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, umfasst in der vorliegenden Erfindung solche, die die Wirkung haben, zu verhindern, dass die in anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein enthaltene Zielkomponente an der Reaktion mit einem Reagens zur Messung der Menge der in dem Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente teilnimmt, und der Antikörper kann ungeachtet seiner Herkunft ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, solange er die oben genannte Wirkung hat. Berücksichtigt man jedoch den Grad der verhindernden Wirkung, so ist ein polyklonaler Antikörper zu bevorzugen. Wenn ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, werden vorzugsweise 2 oder 3 Arten oder mehr, vorzugsweise 5 Arten oder mehr, monoklonaler Antikörper verwendet, die jeweils unterschiedliche antigene Determinanten erkennen. Beispiele für den bevorzugten Antikörper in der vorliegenden Erfindung sind ein Anti- Apolipoprotein-Antikörper, wie Anti-Apolipoprotein A, Anti-Apolipoprotein B, Anti- Apolipoprotein C und Anti-Apolipoprotein E, ein Anti-Lipoprotein-Antikörper, wie Anti-α-Lipoprotein-Antikörper und Anti-β-Lipoprotein-Antikörper.
Im Falle der Messung der Zielkomponente in HDL umfasst zum Beispiel der Antikörper, der verwendet werden soll, um zu verhindern, dass die in anderen Lipoproteinen als HDL enthaltene Zielkomponente an der Messreaktion teilnimmt, Anti-Apolipoprotein-B-Antikörper, Anti-Apolipoprotein-C-Antikörper, Anti- Apolipoprotein-E-Antikörper und Anti-β-Lipoprotein-Antikörper.
Diese Antikörper können einzeln oder in Kombination, indem man sie in geeigneter Weise mit irgendwelchen davon mischt, verwendet werden, solange der Antikörper die oben genannte gewünschte verhindernde Wirkung hat. Weiterhin können diese Antikörper solche der enzymatisch oder chemisch zersetzten oder modifizierten Typen sein, wie F(ab')&sub2;, Enzym-Antikörper-Konjugat und Hapten- Antikörper-Konjugat.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der mit anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reagiert und dadurch verhindert, dass die in anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein enthaltenen Zielkomponenten an der Reaktion teilnehmen. Von den Antikörpern sind solche zu bevorzugen, bei denen die Agglutinierung, die durch die Reaktion des Antikörpers mit anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein verursacht wird, nicht so groß ist, dass sie die gewünschte Messung verhindert.
Die zu verwendende Konzentration des Antikörpers, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange sie höher ist als die Konzentration, die in der Lage ist zu verhindern, dass die in den anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein enthaltene Zielkomponente mit dem Reagens zur Messung der Zielkomponente reagiert, und im allgemeinen wird der Antikörper in einer solchen Menge zu der ersten Reagenslösung gegeben, dass seine Konzentration in einem Gemisch aus der ersten und der zweiten Reagenslösung und der zu messenden lebenden Probe im Bereich von 0,001 bis 10 mgAb/ml, vorzugsweise 0,01 bis 1 mgAb/ml, gehalten wird.
Vorzugsweise wird in die Reagenslösung, die einen Antikörper enthält, ein Puffermittel eingebaut.
Jedes Puffermittel kann verwendet werden, solange es die Pufferfähigkeit hat, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, und die Messreaktion der Zielkomponente nicht hemmt, und als Beispiele dafür seien Tris(hydroxymethyl)- aminomethan, Good-Puffer, Phosphate und Borate genannt. Als Beispiele für das Puffermittel, das zur Messung der Menge an Cholesterin in HDL verwendet werden soll, seien zum Beispiel solche genannt, die die Pufferfähigkeit haben, einen pH-Wert von 5,7 bis 9,1 aufrechtzuerhalten, wie Glycin-Derivate einschließlich N-(2-Acetamid)-2-aminoethansulfonsäure und N-(2-Acetamid)imino- 2-essigsäure, Hydroxyalkylamin-Derivate, insbesondere 2-Hydroxyethylamin- Derivate einschließlich N,N-Bis(2-hydroxyethyi)-2-aminoethansulfonsäure, Bis(2- hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan und 3-[N,N-Bis(2-hydroxyethyl)- amino]-2-hydroxypropansulfonsäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Tris- (hydroxymethyl)amin-Derivate einschließlich 3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamin]-2-hydroxypropansulfonsäure und N-Tris(hydroxymethyl)-2-aminoethansulfonsäure, und davon sind die Hydroxyalkylamin-Derivate im Hinblick auf die Messgenauigkeit besonders zu bevorzugen. Insbesondere wenn man es zur Messung der Menge an Cholesterin in HDL verwendet, ist ein Hydroxyalkylamin- Derivat zu bevorzugen.
Die zu verwendende Konzentration des Puffermittels wird im allgemeinen aus einem Bereich von 10 mM bis 1 M, vorzugsweise 20 bis 500 mM, ausgewählt.
Als Reagens zur Messung der Menge der Zielkomponente kann ohne besondere Einschränkung jedes der bekannten Reagentien verwendet werden, die zur Messung der Menge der in dem Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente verwendet werden. Weiterhin werden zur Zeit auf diesem Gebiet verbreitet verschiedene Messverfahren unter Anwendung von Enzymen (d. h. enzymatische Verfahren) verwendet, und Reagentien, die für solche enzymatischen Verfahren verwendet werden, werden aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit in der vorliegenden Erfindung mit Vorteil verwendet.
Als Beispiele für das Reagens zur Messung der Menge des in einem Lipoprotein enthaltenen Cholesterins seien zum Beispiel solche genannt, die in bekannten Messverfahren verwendet werden, wie Reagentien für das Oxidations-/kolorimetrische Verfahren, welches Cholesterin-Oxidase (COD), Cholesterin-Esterase (CHE), Peroxidase (POD) und ein oxidierbares Farbreagens umfasst, und Reagentien für das Ultraviolett-(UV)-spektrometrische Verfahren, welches CHE, Cholesterin-Dehydrogenase (CHD) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) umfasst. Als Beispiele für die Reagentien, die zur Messung der Menge an Triglyceriden in dem Lipoprotein verwendet werden, seien zum Beispiel solche genannt, die in bekannten Messverfahren verwendet werden, wie im Glycerokinase(GK)-Glycerin-3-phosphat-Oxidase-Verfahren, Glycerin-Dehydrogenase-Verfahren und GK-Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase-Verfahren. Als Beispiele für die Reagentien, die zur Messung der Menge an Phospholipid in dem Lipoprotein verwendet werden, seien zum Beispiel solche genannt, die in bekannten Messverfahren verwendet werden, wie im Verfahren der Extraktion mit organischem Lösungsmittel und im Verfahren unter Verwendung von Phospholipase und Cholin-Oxidase.
Jedes dieser Reagentien zur Messung der Menge der Zielkomponente ist im allgemeinen in der Reagenslösung enthalten, die keinen Antikörper enthält (der 2. Lösung), während einige davon, zum Beispiel POD, ein oxidierbares Farbreagens und NAD, auch in der Reagenslösung, die den Antikörper enthält (der 1. Lösung) enthalten sein können. Die Konzentration jedes dieser Reagentien, die in den Reagenslösungen enthalten sein soll, kann in geeigneter Weise aus einem Bereich ausgewählt werden, wie er bei der Messung auf diesem Gebiet gewöhnlich verwendet wird.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Reagenslösung, die keinen Antikörper enthält (die 2. Lösung), enthält vorzugsweise auch ein Tensid. Das Tensid hat die Wirkung, die Messreaktion der in dem speziellen Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente, insbesondere Cholesterin, zu fördern, so dass es möglich wird, die Reaktionszeit zu verkürzen. Bei dem für diesen Zweck zuzusetzenden Tensid kann es sich ohne jede Einschränkung um nichtionische Tenside, amphotere Tenside, kationische Tenside und anionische Tenside handeln, solange sie die Messreaktion der in dem speziellen Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente nicht behindern. Das Tensid umfasst nichtionische Tenside, wie Polyoxyethylencetylether, Polyoxyethylenoleylether, Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylenalkylphenylether einschließlich Polyoxyethylenisooctylphenylether und Polyoxyethylennonylphenylether, Polyethylenglycolmonolaurat, amphotere Tenside, wie Stearylbetain und 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium-Betain, sowie anionische Tenside, wie Cholsäure, Desoxycholsäure und Natriumpolyoxyethylenalkylphenolethersulfat. Von diesen Tensiden sind nichtionische mit einem HLB-Wert von 12 bis 17 im Hinblick auf die Messgenauigkeit zu bevorzugen. Als nichtionische Tenside, die bei der Messung von Cholesterin in HDL verwendet werden, sind solche mit einem HLB-Wert von 12 bis 17 besonders zu bevorzugen. Diese Tenside können allein oder in einer geeigneten Kombination verwendet werden.
Die zu verwendende Konzentration des Tensids ist nicht entscheidend, und im allgemeinen wird es in einer solchen Menge zu der 2. Lösung gegeben, dass die Endkonzentration in dem Gemisch aus der 1. und der 2. Lösung und der zu messenden lebenden Probe 0,001 bis 10% (w/v), vorzugsweise 0,01 bis 1% (w/v), beträgt.
Es ist anzumerken, dass bei der Zugabe des Tensids zu der ersten Lösung möglicherweise ein Messfehler zu beobachten ist, der durch die Zielkomponente verursacht wird, die in anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein enthalten ist.
Ein Agglutinierungspromotor, wie Polyethylenglycol und Polyvinylalkohol, der im allgemeinen bei einem Messverfahren unter Verwendung einer Immunagglutinierungsreaktion verwendet wird, braucht in der 1. oder 2. Lösung, die bei dem Messverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, nicht enthalten zu sein.
Dies bedeutet jedoch nicht, dass die Zugabe des Agglutinierungspromotors vollständig ausgeschlossen werden sollte, sondern der Promotor kann in die 1. und/oder die 2. Lösung eingebaut werden, solange die Menge so groß ist, dass sie die gewünschte Messung nicht behindert.
Das Messverfahren der vorliegenden Erfindung wird zum Beispiel wie folgt durchgeführt. Eine aus einem lebenden Körper stammende Probe, wie Serum und Plasma, wird mit der 1. Lösung gemischt, die einen Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, und ein Puffermittel enthält, so dass bei 2 bis 40ºC eine Reaktion während 3 bis 30 Minuten stattfinden kann, und danach wird die Extinktion (OD&sub1;) des Reaktionsgemischs gemessen. Dann wird das Reaktionsgemisch mit der 2. Lösung gemischt, die ein Reagens zur Messung der Zielkomponente, ein Puffermittel und gegebenenfalls ein Tensid enthält, so dass bei 2 bis 40ºC eine Reaktion während 3 bis 30 Minuten stattfinden kann, und danach wird die Extinktion (OD&sub2;) des letzteren Reaktionsgemischs gemessen.
Der Wert von OD&sub1; wird von OD&sub2; subtrahiert, was OD&sub3; ergibt, und das erhaltene OD&sub3; wird auf eine Eichkurve aufgetragen, die die Beziehung zwischen der Konzentration der zu messenden Zielkomponente und OD&sub3; zeigt, wobei die Eichkurve zuvor angefertigt wurde, indem man dasselbe Verfahren wie oben unter Verwendung derselben Reagentien wie oben mit einer Standardlösung durchführt, die eine bekannte Menge der Zielkomponente in dem speziellen Lipoprotein enthält, wodurch die Menge der Zielkomponente in der Probe erhalten wird. Wenn das Volumen der Lösung, mit der die Messung von OD&sub1; durchgeführt wird, sich von dem Volumen der Lösung unterscheidet, mit der die Messung von OD&sub2; durchgeführt wird, wird der OD&sub1;-Wert im Einklang mit der Differenz korrigiert, bevor er von OD&sub2; subtrahiert wird.
Der Kit der vorliegenden Erfindung zur Messung der Menge einer Zielkomponente in einem speziellen Lipoprotein wird zur Messung der Zielkomponente in dem speziellen Lipoprotein verwendet und umfasst (i) eine Reagenszusammensetzung (die erste Reagenszusammensetzung), die einen Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, und ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, enthält; und (ii) eine Reagenszusammensetzung (die zweite Reagenszusammensetzung), die ein Reagens zur Messung der Menge der Zielkomponente in dem speziellen Lipoprotein, ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, sowie gegebenenfalls ein Tensid enthält, und die bevorzugten Ausführungsformen sind die oben erwähnten.
Ein Teil der Komponenten, die gewöhnlich in der zweiten Reagenszusammensetzung enthalten sind, kann auch in die erste Reagenszusammensetzung eingebaut werden, solange keine behindernde Wirkung auf die Messung beobachtet wird. Wenn zum Beispiel Cholesterin in einem speziellen Lipoprotein mit einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung von Cholesterin-Oxidase (COD), Cholesterin-Esterase (CHE), Peroxidase (POD) und einem Reagens, das durch Kopplung mit 4-Aminoantipyrin durch die Einwirkung von 4-Aminoantipyrin und einem Oxidationsmittel (im folgenden als Färbereagens abgekürzt) eine Farbe entwickelt, als Reagens zur Messung von Cholesterin gemessen wird, ist es wesentlich, einen Antikörper gegen andere Lipoproteine als das spezielle Lipoprotein sowie ein Puffermittel in die erste Reagenszusammensetzung einzubauen und COD und CHE in die zweite Reagenszusammensetzung einzubauen, und die zweite Reagenszusammensetzung enthält vorzugsweise auch ein Tensid, aber auch andere Komponenten können in die erste oder zweite Reagenszusammensetzung eingebaut werden.
Unter dem Gesichtspunkt der Stabilität der Reagenszusammensetzungen wird vorzugsweise eine Kombination aus der ersten Reagenszusammensetzung, in die ein Antikörper gegen andere Lipoproteine als das spezielle Lipoprotein, ein Puffermittel sowie 4-Aminoantipyrin eingebaut werden, und der zweiten Reagenszusammensetzung, in die COD, CHE, POD, ein Färbereagens, ein Puffermittel und ein Tensid eingebaut werden, verwendet.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen und Bezugsbeispielen näher erläutert.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen.
BES: N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure
COD: Cholesterin-Oxidase
CHE: Cholesterin-Esterase
POD: Peroxidase
DAOS: N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin
Triton® X-100 (hergestellt und vertrieben von Rohm & Haas): Polyoxyethylenalkylphenylether (HLB: 13,5)
ACES: N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure
Emalex® NPL-30 (hergestellt und vertrieben von Nihon Emulsion Co.): Polyoxyethylennonylphenylether (HLB: 17)
Triton® X-405 (hergestellt und vertrieben von Rohm & Haas): Polyoxyethylenalkylphenylether (HLB: 17,9)

Beispiel 1

Die Menge des in HDL in Serum enthaltenen Cholesterins wurde nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines automatischen Analysators des Typs Hitachi® 7150 (hergestellt und vertrieben von Hitachi Ltd.) gemessen.

[Proben]

10 Proben von frischem Humanserum

[Reagentien]

1. Reagens (R-1):

Antiserum gegen β-Lipoprotein (12 mgAb/ml, hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1% (w/v)
4-Aminoantipyrin lmM
BES-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) 100 mM

2. Reagens (R-2):

COD 3 Einheiten/ml
CHE 3 Einheiten/ml
POD 1 Einheit/ml
DAOS 1 mM
Triton® X-100 0,05% (w/v)
BES-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) 100 mM

[Messparameter (Messbedingungen)]

Messverfahren: 2-Punkt-Endverfahren [24]-[50]

Probenvolumen: 4 ul
R-1-Volumen 270 ul
R-2-Volumen 90 ul
Messwellenlänge: 700/600 nm
Messtemperatur: 37ºC

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 2

Die Menge des in HDL in Serum enthaltenen Cholesterins wurde nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines automatischen Analysators des Typs Hitachi® 7150 gemessen.

[Proben]

wie in Beispiel 1

[Reagentien]

1. Reagens (R-1):

Antiserum gegen β-Lipoprotein (12 mgAb/ml, hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1% (w/v)
4-Aminoantipyrin lmM
ACES-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) 100 mM

2. Reagens (R-2):

COD 3 Einheiten/ml
CHE 3 Einheiten/ml
POD 1 Einheit/ml
DAOS 1 mM
Triton® X-100 0,05% (w/v)
ACES-NaOH-Pufferlösung (pH 7,0) 100 mM

[Messparameter (Messbedingungen)]

wie in Beispiel 1

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt.

Bezugsbeispiel 1

Mit den in Beispiel 1 verwendeten Serumproben wurde das in HDL enthaltene Cholesterin durch das bekannte Phosphorwolframsäure/Magnesiumsalz-Fällungsverfahren unter Verwendung von HDL-Cholesterin-E-Test-Wako® (hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gemessen.
Das Messverfahren entsprach dem Standardverfahren, das in dem Begleitheft des Kits erläutert ist.

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 ist zu ersehen, dass der Messwert von Cholesterin in HDL nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine hohe Korrelation mit dem Messwert zeigt, der nach dem Verfahren von Bezugsbeispiel 1 (herkömmliches Verfahren) erhalten wurde. Der in Beispiel 1 erhaltene Wert korreliert stärker mit dem Messwert, der in Bezugsbeispiel 1 (herkömmliches Verfahren) erhalten wurde, als der in Beispiel 2 erhaltene Wert, und somit ist zu erwarten, dass BES, das in Beispiel 1 als Puffermittel verwendete 2-Hydroxyethylamin-Derivat, unter dem Aspekt der Messgenauigkeit besonders zu bevorzugen ist.
Die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Messwerte sind eher höher als die in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen. Andererseits ist bekannt, dass die nach dem Verfahren in Bezugsbeispiel 1, dem Phosphorwolframsäure/Magnesiumsalz-Fällungsverfahren, erhaltenen Werte für Cholesterin in HDL eher niedriger sind als die nach dem Standardverfahren, dem Ultrazentrifugentrennverfahren, erhaltenen. Daher ist davon auszugehen, dass die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung (insbesondere Beispiel 1) erhaltenen Messwerte für Cholesterin nahe bei den mit dem Standardverfahren erhaltenen Messwerten liegen.

Beispiel 3

[Proben]

10 Proben von frischem Humanserum

[Reagentien]

1. Reagens (R-1):

Antiserum gegen Apolipoprotein B (12 mgAb/ml, hergestellt und vertrieben von Boehringer Mannheim GmbH) 3% (w/v)
4-Aminoantipyrin 1 mM
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,2) 100 mM

2. Reagens (R-2):

COD 3 Einheiten/ml
CHE 3 Einheiten/ml
POD 1 Einheit/ml
DAOS 1 mM
Emalex® NPL-30 0,05% (w/v)
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,2) 100 mM

[Messparameter (Messbedingungen)]

Messverfahren: 2-Punkt-Endverfahren [16]-[34]
Probenvolumen: 4 ul
R-1-Volumen 270 ul
R-2-Volumen 90 ul
Messwellenlänge: 700/600 nm
Messtemperatur: 37ºC

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Beispiel 4

[Proben]

wie in Beispiel 3

[Reagentien]

1. Reagens (R-1):

2. Reagens (R-2):

COD 3 Einheiten/ml
CHE 3 Einheiten/ml
POD 1 Einheit/ml
DAOS 1 mM
Triton® X-405 0,1% (w/v)
Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,2) 100 mM

[Messparameter (Messbedingungen)]

wie in Beispiel 3

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Bezugsbeispiel 2

Mit den in Beispiel 3 verwendeten Serumproben wurde das in HDL enthaltene Cholesterin durch das bekannte Phosphorwolframsäure/Magnesiumsalz-Fällungsverfahren unter Verwendung von HDL-Cholesterin-E-Test-Wako® (hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gemessen.
Das Messverfahren entsprach dem Standardverfahren, das in dem Begleitheft dieses Kits erläutert ist.

[Ergebnisse]

Die Messergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ist zu ersehen, dass der Messwert von Cholesterin in HDL nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine hohe Korrelation mit dem Messwert zeigt, der nach dem Verfahren von Bezugsbeispiel 2 (herkömmliches Verfahren) erhalten wurde. Der unter Verwendung von Emalex® NPL-30 (HLB 17) als Tensid erhaltene Wert (Beispiel 3) korreliert stärker mit dem Messwert, der in Bezugsbeispiel 2 (herkömmliches Verfahren) erhalten wurde, als der unter Verwendung von Triton® X-405 (HLB 17,9) erhaltene Wert (Beispiel 4). Der Grund für die niedrigeren Messwerte bei der Verwendung von Triton® X-405 wurde diskutiert, und es wird davon ausgegangen, dass die Reaktion innerhalb der Reaktionszeit (3 Minuten) nicht ausreichend beendet wurde. Es zeigt sich also, dass bei der Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf einen automatischen Analysator zur Messung der Menge von Cholesterin in einem speziellen Lipoprotein ein nichtionisches Tensid mit einem HLB von 12-17, zum Beispiel Emalex® NPL-30, vorzugsweise als Tensid verwendet werden kann.
Wie eindeutig aus der Offenbarung in der Beschreibung hervorgeht, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein in einer Probe enthalten ist, bereit, das direkt auf einen automatischen Analysator angewendet werden kann, ohne dass eine Vorbehandlung zur Entfernung von Lipoproteinen, die von dem speziellen Lipoprotein verschieden sind, durchgeführt wird. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird (i) die Menge der in einem speziellen Lipoprotein enthaltenen Zielkomponente unter Verwendung eines herkömmlichen automatischen Analysators gemessen, da die Messung durchgeführt werden kann, indem man nur 2 Arten von Reagenslösungen verwendet, und überdies wird eine Messung mit hoher Genauigkeit durchgeführt, da die Messwerte mit einer ausgezeichneten Reproduzierbarkeit erhalten werden; (ii) die Messung wird nach dem 2- Punkt-Endverfahren durchgeführt, da es nicht erforderlich ist, den Schritt des Wiederauflösens der agglutinierten Lipoproteine, die von dem speziellen Lipoprotein verschieden sind, durchzuführen, um die optische Extinktion einer gleichmäßigen Lösung zur Messung der Zielkomponente, die in dem speziellen Lipoprotein enthalten ist, zu messen. Außerdem liefert das Verfahren der vorliegenden Erfindung die vorteilhafte Wirkung, dass jede nachteilige Wirkung auf die Messung der optischen Extinktion durch in der Probe enthaltene Begleitsubstanzen vermieden wird. Die vorliegende Erfindung liefert auf diesem Gebiet also einen großen Beitrag.

Claims

1. Verfahren zur Messung der Menge einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein einer aus einem lebenden Körper stammenden Probe enthalten ist, umfassend:

- Mischen der Probe mit einem Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, so dass eine Reaktion stattfinden kann;

- danach Messen der Extinktion (OD&sub1;) des Reaktionsgemischs;

- dann Mischen des Reaktionsgemischs mit einem Reagens zur Messung der Komponente, so dass eine Reaktion stattfinden kann;

- danach Messen der Extinktion (OD&sub2;) des letzteren Reaktionsgemischs; und

- Berechnen der Menge der Komponente auf der Basis der Differenz zwischen OD&sub1; und OD&sub2;.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei OD&sub1; von OD&sub2; subtrahiert wird, was OD&sub3; ergibt, und OD&sub3; auf eine Eichkurve aufgetragen wird, die die Beziehung zwischen der Konzentration der zu messenden Komponente und OD&sub3; zeigt, wobei die Eichkurve zuvor unter Verwendung einer Standardlösung angefertigt wurde, die eine bekannte Menge der zu messenden Komponente enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das spezielle Lipoprotein ein Lipoprotein hoher Dichte ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der Zielkomponente um Cholesterin handelt.

5. Kit zur Messung einer Zielkomponente, die in einem speziellen Lipoprotein enthalten ist, umfassend:

(i) eine Reagenszusammensetzung, die einen Antikörper, der gegenüber anderen Lipoproteinen als dem speziellen Lipoprotein reaktiv ist, sowie ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, enthält; und

(ii) eine Reagenszusammensetzung, die ein Reagens zur Messung der Zielkomponente sowie ein Puffermittel mit der Pufferfähigkeit, einen pH- Wert von 5,0 bis 11,0 aufrechtzuerhalten, enthält.

6. Kit gemäß Anspruch 15, wobei die Reagenszusammensetzung (ii) zusätzlich ein Tensid enthält.

7. Kit gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das spezielle Lipoprotein ein Lipoprotein hoher Dichte ist.

8. Kit gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei es sich bei der Zielkomponente um Cholesterin handelt.