DE3780205T2

DE3780205T2 - Verfahren zur messung von lipidgebundener sialinsaeure und dabei zu verwendender reagenssatz.

Info

Publication number: DE3780205T2
Application number: DE8787303644T
Authority: DE
Inventors: Masami Sugiyama
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 1986-04-25
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1993-02-25
Anticipated expiration: 2007-04-25
Also published as: EP0243200A2; EP0243200B1; JPS62253399A; DE3780205D1; EP0243200A3; US4837144A; JPH0775557B2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von lipidgebundener Sialinsäure (LSA) und einen Reagenzsatz zur Verwendung darin.
Unlängst gab es verschiedene Berichte darüber, daß bei an Krebs leidenden Personen die LSA-Konzentration in deren Blut ansteigt. Es wurde auch berichtet, daß sogar bei einem Patienten, der einen primären Magenkrebs hat und dessen Gesamtsialinsäure-Konzentration noch nicht angestiegen ist, die LSA-Konzentration in seinem Blut signifikant erhöht ist (Oki, S., J. Jpn. soc. Cancer Ther., Vol. 18, Seiten 692-703 (1983)).
Das Verfahren zur Bestimmung der LSA, das von N. Katopodis et al. (Res. Commun. Clin. Path. Pharm., Vol. 30, Seiten 171-180 (1980)) entwickelt wurde, ist in weitem Umfang verwendet worden. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: Zuerst wird eine Probe des Testserums in ein Testrohr pipettiert und dann mit Wasser versetzt. Die Mischung wird auf 4ºC abgekühlt und ein Extraktionsmittel (Chloroform : Methanol = 2 : 1 Volumenteile) zugegeben. Diese Mischung wird während 30 Sekunden kräftig gerührt und bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Das Überstehende wird in ein anderes Testrohr gebracht und eine wäßrige Lösung von Phosphorwolframsäure wird zugegeben zur Ausfällung der LSA. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt und in destilliertem Wasser gelöst. Ein Resocinolreagenz wird zugesetzt und während 20 Minuten bei 100º C reagieren gelassen; danach wird eine Lösungsmittelmischung aus Butylacetat-Butanol zugesetzt zur Extraktion eines gefärbten Materials. Das Absorptionsmaß der Butylacetat-Butanol-Schicht wird bestimmt als Maß der LSA- Konzentration in der Probe.
Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, ist die Methode von Katopodis et al. kompliziert; daher wurde eine enzymatische Methode entwickelt (JA-Patent KOKAI 60-78597). Gemäß dieser Methode wird die Probe in zwei Teile geteilt, nachdem sie Vorbehandlungen, wie Verdünnung und Extraktion freier Fettsäure unterworfen worden war. Ein Teil wird zur Bestimmung der Gesamt-Sialinsäure verwendet; zu dem anderen wird Phosphorwolframsäure zugegeben zur Ausfällung von LSA. Die Sialinsäure-Konzentration in dem nicht mit Phosphorwolframsäure behandelten Teil und auch in der überstehenden Flüssigkeit von dem anderen mit Phosphorwolframsäure behandelten Teil werden durch ein enzymatisches Verfahren bestimmt, wie es z. B. von Sugahara et al. (clin. Chim. Acta, Vol. 108, Seiten 493-498 (1980)) entwickelt wurde und bei dem Neuraminidase und N-Acetylneuraminsäurealdolase eingesetzt werden. Die LSA-Konzentration in der Probe wird berechnet durch Subtraktion der obigen beiden Sialinsäure-Konzentrationen. Dieses Verfahren ist einfacher als die weiter oben angeführte Methode. Indessen führt dieses Verfahren nicht unmittelbar zu der LSA-Konzentration, sie muß vielmehr indirekt durch Subtraktion berechnet werden.
Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Messung von LSA bereitzustellen,welches einfach zu handhaben ist und auch exakte und betriebssichere Meßwerte liefert. Dieses Verfahren soll auch die Reproduzierbarkeit sicherstellen. Insbesondere soll die Erfindung ein LSA-Trennmittel zur Verfügung stellen, dessen Wirksamkeit in der Trennung von anderen Formen der Sialinsäure, wie proteingebundener Sialinsaure, von LSA gut ist, und das geeignet ist zur Messung der LSA unter Einsatz der vorgenannten enzymatischen Methode.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird als erstes ein Verfahren zur Messung von lipidgebundener Sialinsäure zur Verfügung gestellt, welches umfaßt das Inberührungbringen eines ein polares Lösungsmittel enthaltenden Trennmittels für die lipidgebundene Sialinsäure mit einer Probe, die lipidgebundenen Sialinsäure und eine oder mehrere andere Formen von Sialinsäure enthält, das Abtrennen einer überstehenden Flüssigkeit von einem gebildeten Präzipitat, das Reagierenlassen der überstehenden Flüssigkeit mit einem Enzym, das geeignet ist für die Einwirkung auf Sialinsäure in einem lipidgebundenen Zustand unter Bildung eines meßbaren Molekülfragments, und die -Bestimmung des Molekülfragments als Maß für die lipidgebundene Sialinsäure in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus einen Reagenzsatz zum Einsatz für die Messung von lipidgebundener Sialinsäure bereit; dieser enthält als getrennte Komponenten ein EIN POLARES Lösungsmittel umfassendes Trennmittel für die lipidgebundene Sialinsäure, ein Enzymreagenz, welches auf die lipidgebundene Sialinsäure unter Bildung eines meßbaren Molekülfragments einwirkt, sowie ein Reagenz zur Einwirkung auf das Fragment unter Bildung einer colorimetrisch bestimmbaren Verbindung als Maß für die lipidgebundene Sialinsäure in der Probe.
Die Erfindung geht auf die folgenden Feststellungen zurück. Erstens werden im Falle der Behandlung von Proben mit einem Gehalt an Sialinsäure in verschiedenem Zustand mit einem ein polares Lösungsmittel enthaltenden Trennmittel die Sialinsäuren außer LSA gefällt, während LSA in der überstehenden Flüssigkeit verbleibt. Auf diese Weise kann LSA leicht und ohne komplizierte Arbeitsweisen getrennt werden. Zweitens kann die LSA in der überstehenden Flüssigkeit nach der enzymatischen Methode, die von Sugahara et al. entwickelt wurde, bestimmt werden, ohne daß irgendwelche zusätzlichen Arbeitsvorgänge durchzuführen sind; die so erhaltenen Ergebnisse stimmen überein mit denen, die nach der konventionellen Methode von Katopodis et al. erhalten werden.
Das LSA-Trennmittel umfaßt ein polares Lösungsmittel. Geeignete polare Lösungsmittel schließen ein Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Dimethylformamid und Acetonitril. Man kann auch zwei oder mehr der polaren Lösungsmittel miteinander kombinieren. Das LSA-Trennmittel kann aus dem (den) polaren Lösungsmittel(n) allein bestehen, es kann aber auch andere Komponenten enthalten. So kann z. B. eine geringe Menge an Wasser oder einem Protein-Fällungsmittel, wie Heparin dem polaren Lösungsmittel zugesetzt werden. In diesem Falle soll das polare Lösungsmittel vorzugsweise in Mengen von mehr als 90 Vol-% vorliegen.
Die Menge an dem zuzusetzenden LSA-Trennmittel wird hauptsächlich bestimmt durch den Proteingehalt einer jeden Testprobe. Sofern die Probe Serum ist, ist das Volumen des Protein-Fällungsmittels vorzugsweise das 1,2- bis 1,6-fache des Volumens der Probe. Die Reaktionszeit für die Reaktion des LSA-Trennmittels mit der Probe beträgt 5 bis 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Das gebildete Präzipitat wird durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Die Filtration unter Verwendung eines Kerzenfilters wird für eine Automatisierung der Arbeitsweise bevorzugt.
Die Sialinsäure-Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit wird gemessen unter Verwendung eines Enzyms, das für eine Einwirkung auf die Sialinsäure in lipidgebundenem Zustand geeignet ist. Solche Enzyme schließen Neuraminidase und N-Acetylneuraminsäure-aldolase ein. Bei dieser Arbeitsweise wird die in lipidgebundenem Zustand vorliegende Sialinsäure durch die Neuraminidase freigesetzt unter Bildung von N-Acetylneuraminsäure, was die freie Sialinsäure ist, und die N- Acetylneuraminsäure wird durch die N-Acetzylneuraminsäure-aldolase zersetzt in N-Acetylmannosamin und Brenztraubensäure. Alsdann kann der Gehalt an der Brenztraubensäure nach einer bekannten Methode bestimmt werden. So wird z. B. die Brenztraubensäure oxidiert durch Brenztraubensäureoxidase unter Bildung von H&sub2;O&sub2;, und H&sub2;O&sub2; wird dann mit 4-Aminoantipyrin und einem oxidativen Kondensationsmittel, wie N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-m-toluidin in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung einer roten bis violetten Farbe reagieren gelassen. Danach wird die Intensität der Farbe bestimmt durch Messung des Absorptionsgrads bei 550 nm. Die LSA-Konzentration kann z. B. ermittelt werden mittels eines Diagramms, in dem der Absorptionsgrad gegen die Konzentration aufgetragen ist. Ein Reagenzsatz für diese enzymatische Bestimmung ist als solcher im Handel erhältlich. Alternativ kann man Lactatdehydrogenase zur Reaktion bringen mit der obigen Brenztraubensäure in Gegenwart von NADH als Coenzym; die Abnahme der NADH-Konzentration kann ermittelt werden durch Messung des Absorptionsgrads bei 340 bis 370 nm. Die LSA-Konzentration kann aus dem erhaltenen Ergebnis in äquivalenter Weise ermittelt werden.
Sofern eine Testprobe behandelt wird mit einem ein polares Lösungsmittel enthaltenden LSA-Trennmittel, werden verschiedene Komponenten in der Probe, wie proteingebundene Sialinsäure und proteinartige Substanzen gefällt, während das Zielprodukt, die lipidgebundene Sialinsäure in der überstehenden Flüssigkeit verbleibt. Demzufolge kann durch Messung der Sialinsäure-Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit die LSA-Konzentration in der Testprobe leicht ermittelt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist leicht durchführbar und in höchstem Maß reproduzierbar. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet für eine große Anzahl von Proben und kann leicht automatisiert werden. Das Verfahren ist geeignet für die Verwendung bei Krebsvorsorgeuntersuchungen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

95 Volumenteile einer Lösungsmittelmischung aus Methanol/Dimethylformamid (1/1 V/V) werden gemischt mit 5 Volumenteilchen an destilliertem Wasser; die Mischung ist verwendbar als LSA-Trennmittel. Bei jedem Test werden 150ul von diesem LSA-Trennmittel zu 100 uk einer Serumprobe gegeben und durch einen Mischer während 10 Sekunden kräftig gerührt. Das sich bildende Präzipitat wird mittels einer Zentrifuge bei 3000 upm (mehr als 1000 G) abgetrennt, um dabei eine 150ul einer überstehenden Flüssigkeit erhalten.
150ul von jeder der überstehenden Flüssigkeiten aus einem Probeserum und einem Standardserum werden in getrennte schmale Teströhren gebracht; 1 ml von der Enzym-Färbelösung aus dem Reagenzsatz zur Bestimmung der Sialinsäure ("SIALIZYME-550", Fujirebio Inc.) werden zu jeder der Proben zugegeben. Diese Enzym-Färbelösung enthält Neuraminidase, N- Acetylneuraminsäure-aldolase, 4-Aminoantipyrin, Brenztraubensäureoxidase, Peroxidase, N-Ethyl-N-(β-hydroxyethyl)-m-toluidin, MgCL&sub2;, FAD, TPP und andere Substanzen. Diese Mischung wird bei 37ºC während 20 Minuten reagieren gelassen und dann mit 2 ml einer die Reaktion beendenden Lösung, die auch in dem obigen Reagenzsatz vorhanden ist, versetzt. Danach wird der Absorptionsgrad der Mischung bei 550 nm gemessen. Bei dieser Stufe werden 150ul destilliertes Wasser anstelle des Probeserums als Leerreagenz verwendet.
Die LSA-Konzentration der Probe wird berechnet mittels der nachstehenden Formel:
LSA (mg/dl)=Absorbance of Sample·Sialic Acid/Absorbance of Standard
(wenn 100ul von einer Probe vermischt werden mit 150 ml vom LSA-Trennmittel, dann beträgt der Verdünnungsgrad 2,5).
Um die Reproduzierbarkeit zu prüfen, wurde die obige Messung 10mal wiederholt mit jeweils zwei Serumproben. Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt. n = 0 Probe A Probe B CV = Koeffizient der Abweichung
Durch Untersuchung von 26 Serumproben war es möglich eine Korrelation zu erzielen zwischen den Ergebnissen gemäß der vorstehenden Meßmethode und denen, die gemäß der konventionellen Katopodis-Methode erhalten wurden. Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt. n = 26 Korrelations-Koeffizient r = 0,95 Regressionsformel Y = 1,0 X-0,5 (mg/dl) Y = vorliegende Methode X = konventionelle Methode

Beispiel 2

Eine Mischung aus 97 Volumenteilen Methanol und 3 Volumenteilen destilliertem Wasser werden als LSA-Trennmittel verwendet; die LSA-Konzentrationen der beiden Proben (Probe A und Probe B) werden, wie im Beispiel 1 angeführt, gemessen. Die Messungen wurden jeweils 10· wiederholt; die Ergebnisse sind nachstehend angeführt: n = 0 Probe A Probe B Korrelation zu der konventionellen Katopodis-Methode n = 26 Korrelations-Koeffizient Regressionsformel

Beispiel 3

Eine Mischung aus 95 Volumenteilen von Dimethylformamid/Isopropanol (60/40 V/V) und 5 Volumenteilen destilliertem Wasser werden als LSA-Trennmittel verwendet; die LSA-Konzentrationen in den vorgenannten Proben A und B wurden, wie in Beispiel 1 angeführt, gemessen. Die Messungen wurden 10· wiederholt. Die Ergebnisse werden nachstehend aufgeführt. n = 10 Probe A Probe B Korrrelation zu der konventionellen Katopodis-Methode n = 26 Korrelations-Koeffizient Regressionsformel

Beispiel 4

Die Bestimmung der LSA-Konzentration in einer weiteren Serumprobe wurde ,auch entsprechend der konventionellen Katopodis- Methode durchgeführt; die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Messungen wurde miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt. n = 10 vorliegende Methode Konventionelle Methode

Claims

1. Verfahren zur Messung von lipidgebundener Sialinsäure, welches umfaßt das Inberührungbringen eines ein polares Lösungsmittel enthaltenden Trennmittels für die lipidgebundene Sialinsäure mit einer Probe, die lipidgebundene Sialinsäure und eine oder mehrere andere Formen von Sialinsäure enthält, das Abtrennen einer überstehenden Flüssigkeit von einem gebildeten Präzipitat, das Reagierenlassen der überstehenden Flüssigkeit mit einem Enzym, das geeignet ist für die Einwirkung auf Sialinsäure in einem lipidgebundenen Zustand unter Bildung eines meßbaren Molekülfragments, und die Bestimmung des Molekülfragments als Maß für die lipidgebundene Sialinsäure in der Probe.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Trennmittel besteht aus oder enthält ein einziges polares Lösungsmittel.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Trennmittel besteht aus oder enthält eine Mischung aus einem polaren Lösungsmittel und Wasser und der Gehalt an dem polaren Lösungsmittel mehr als 90 Vol.-% beträgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das polare Lösungsmittel besteht aus oder enthält eine Mischung von zwei oder mehr polaren Lösungsmitteln.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, 3 oder 4, wobei das polare Lösungsmittel ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Dimethylformamid und Acetonitril.

6. Verfahren gemäß einem jeden der vorangehenden Ansprüche, wobei das Trennmittel ein Protein-Fällungsmittel enthält.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Protein-Fällungsmittel Reparin ist.

8. Verfahren gemäß einem jeden der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probe Serum ist und das Volumen des Trennmittels das 1,2 bis 1,6-fache des Volumens vom zu untersuchenden Serum ist.

9. Verfahren gemäß einem jeden der vorangehenden Ansprüche, wobei das Enzym Neuraminidase und/oder N-Acetylneuraminsäure- Aldolase ist.

10. Reagenzsatz zum Einsatz für die Messung von lipidgebundener Sialinsäure, enthaltend als getrennte Komponenten ein ein polares Lösungsmittel umfassendes Trennmittel für die lipidgebundene Sialinsäure, ein Enzymreagenz, welches auf die lipidgebundene Sialinsäure unter Bildung eines meßbaren Molekülfragments einwirkt, sowie ein Reagenz zur Einwirkung auf das Fragment unter Bildung einer colorimetrisch bestimmbaren Verbindung als Maß für die lipidgebundene Sialinsäure in der Probe.

11. Reagenzsatz gemäß Anspruch 10, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Dimethylformamid und Acetonitril.

12. Reagenzsatz gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei das Trennmittel für die lipidgebundene Sialinsäure aus einer Mischung von einem polaren Lösungsmittel und Wasser mit einem Gehalt an des polaren Lösungsmittel von mehr als 90 Vol.-% besteht.

13. Reagenzsatz gemäß einem jeden der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Trennmittel für die lipidgebundene Sialinsäure ein Protein-Fällungsmittel enthält.

14. Reagenzsatz gemäß Anspruch 13, wobei das Protein-Fällungsmittel Reparin ist.