KR101923662B1 - 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 고감도 분석방법 및 이를 이용한 분석용 킷트 - Google Patents

비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 고감도 분석방법 및 이를 이용한 분석용 킷트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비인간형 당사슬인 NeuGc를 포함하는 시알산을 고감도로 분석하는 방법에 관한 것으로서, 생체 시료 및 의약품 내 시알산을 선택적으로 유리하고, 비인간형 당사슬 NeuGc의 함량 및 비율을 고감도로 탐지할 수 있는 분석방법에 관한 것이다.

Description

비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 고감도 분석방법 및 이를 이용한 분석용 킷트 {Highly sensitive determination method for sialic acid containing non-human glycan NeuGc and detection kit using thereof}
본 발명은 비인간형 당사슬인 NeuGc를 포함하는 시알산을 고감도로 분석할 수 있는 분석방법에 관한 것으로서, 생체시료 및 의약품 내 시알산을 선택적으로 유리하고 유리된 시알산에서 선택적으로 비인간형 당사슬인 NeuGc 함량 및 비율을 고감도로 탐지할 수 있는 분석방법 및 이를 이용한 분석킷트에 관한 것이다.
인체 내에 존재하는 단백질과 지방은 탄수화물에 의하여 다양한 수식화 (modification) 과정을 거쳐 대부분 당단백질 (glycoprotein)과 당지질 (glycolipid) 형태로 존재한다.
당쇄를 구성하는 탄수화물은 육탄당 (hexose)과 N-아세틸헥소사민 (N-acetyhlhexosamine)을 골격으로 디하이드록시헥소스 (dehydroxyhexose)인 퓨코스와 산성 당류인 시알산 (sialic acid)의 다양한 조합으로 이루어진다. 이들 중 시알산은 NeuAc (N-acetylneuraminic acid)와 NeuGc (N-glycoylneuraminic acid) 두 종류가 존재한다. NeuGc의 경우 CMAH (CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase)라는 효소에 의하여 NeuAc로부터 생성된다. 인간은 진화과정에서 CMAH의 비가역적 변이에 의해 NeuAc로부터 NeuGc를 합성하지 못하여 NeuGc를 당쇄화에 사용하지 못한다. 따라서 NeuGc는 인간이 스스로 합성할 수 없는 비인간형 시알산 (non-human sialic acid) 또는 비인간형 당사슬 (non-human glycan)이라 할 수 있다.
쇠고기, 돼지고기와 같은 적색육에는 상당량의 NeuGc가 포함되어 있다고 알려져 있으며, 인간은 적색육을 섭취함으로써 NeuGc를 섭취하게 된다. 비인간형 시알산 NeuGc는 외래 항원으로 인식됨에도 불구하고 대사과정 중에 인체 조직 내로 흡수되며, 그 결과 Neu5Gc와 항-Neu5Gc 항체의 상호작용은 염증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 실제로 Neu5Gc 녹아웃 마우스가 식품을 통하여 Neu5Gc를 섭취하였을 경우, 항-Neu5Gc 항체와의 작용으로 전신 염증 및 암이 발생하는 것을 확인한 바 있다 (Samraj AN., Pearce OM., Laubli H. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2015; 112: 542-547). 또한, 식품으로부터 흡수되는 Neu5Gc를 함유하는 당사슬은 "제노자가항원 (xenoautoantigen)"으로 작용하여 체내를 순환하는 항-Neu5Gc "제노자가항체 (xeno-autoantibodies)"와 상호작용하여 "제노침샘염 (xenosialitis)"이라는 일련의 염증반응을 촉발한다. 제노침샘염은 발암 및 암의 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Frederico A-S, Kunio K, Varki A., Molecular Aspects of Medicine, 2016;51:16-30).
시알산 (NeuAc, NeuGc) 분석은 현재 형광 유도체화 방법을 이용한 액체크로마토그래피/형광검출기 기반의 분석법이 일반적으로 사용되고 있으며, NeuGc 함량이 높은 식품 분석에 적용되고 있다. 식품과 달리 인간의 조직 및 혈액과 같은 생체시료에는 비인간형 시알산 NeuGc가 극미량으로 존재하기 때문에 기존의 분석법을 적용하여 혈액 또는 조직 내 NeuGc의 함량을 측정하기는 매우 어렵다. 따라서, 질병 바이오마커 발굴 또는 질병의 진행을 모니터하기 위하여 생체시료 내에서 NeuGc를 고감도로 탐지할 수 있는 새로운 분석방법 및 분석킷트가 필요한 상황이다.
한국공개특허공보 10-2009-0129150호 PCT 공개공보 1992022672
Samraj, Annie N., et al. "A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression." Proceedings of the National Academy of Sciences 112.2 (2015): 542-547. Li, Hongwei, and Xingdan Fan. "Quantitative analysis of sialic acids in Chinese conventional foods by HPLC-FLD." Open Journal of Preventive Medicine 4.02 (2014): 57. Ludger (PN. LT-KDMB-A1) DMB siaic acid release and labelling kit
본 발명은 상기 시알산 (NeuAc/NeuGc) 분리 및 분석 방법의 문제점을 해결하고, 생체시료로부터 비인간형 당사슬 시알산인 NeuGc를 고감도로 특이적으로 분리 및 분석할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 비전문가도 고감도로 재현성 있게 시알산을 분석할 수 있는 킷트를 제공하는것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들은 체액 또는 생체 조직, 바이오의약품 및 정제된 당사슬 등과 같이 당을 포함하는 시료를 뉴라미니데이즈 및/또는 시알리데이즈 효소 처리하여 시료 내의 시알산을 분리하였다.
또한, 본 발명자들은 위와 같은 방법으로 분리된 시알산 포함 시료에서 염을 제거하고 시알산을 농축하였다.
농축된 시알산은 형광 표지화하거나 또는 변성 없이 그대로 질량분석하거나 액체크로마토그래피를 수행하여 분석하였다.
본 발명은
가) 시알산을 포함하는 체액, 생체조직, 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체, 올리고당, 세포주, 박테리아, 바이러스 및 바이오의약품 중 1종 이상의 시료에 뉴라미니데이즈 및 시알리데이즈 중 1종 이상의 효소를 처리하거나 온화한 산 가수분해로 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 분리하는 단계;
나) 다공성 흑연화 탄소 고체상 추출 및 HILIC 고체상 추출 중 1종 이상으로 상기 가) 단계를 거친 시료를 탈염하고 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 정제, 농축하는 단계; 및
다) HPLC/FLD 또는 LC/MS로 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 분석하는 단계;를 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가)의 효소처리단계 전에 시료의 N-당사슬 분리단계가 추가된 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 나) 단계 이후 다) 단계 이전 비인간형 당사슬 NeuGc를 형광표지화하는 단계가 추가되는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가) 단계의 효소 처리방법이
a) 50~200㎕의 액상 시료 또는 50~200㎍의 고체상 시료를 취하는 단계;
b) 시료에 단백질 변성 시약을 가하고 90~110℃로 1~3분간 처리하여 단백질을 변성하는 단계;
c) 시료에 뉴라미니데이즈 및 시알리데이즈 중 1종 이상의 효소 1000~2000U를 5~24시간 처리하여 시알산을 분리하는 단계;
d) 시료 내의 단백질을 침전하는 단계; 및
e) 단백질을 침전시킨 시료를 원심분리하고 상층액을 얻는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 가) 단계의 온화한 산 가수분해방법이 정제한 당단백질을 포함하는 시료를 대상으로 수행하며,
a) 50~200㎕의 액상 시료 또는 50~200㎍의 고체상 시료를 취하는 단계;
b) 시료에 단백질 변성 시약을 가하고 90~110℃로 1~3분간 처리하여 단백질을 변성하는 단계;
c) 단백질이 변성된 시료에 PNGase F 1000~300U를 가하고 5~24시간 처리하여 N-당사슬을 분리하는 단계;
d) 단백질을 침전하는 단계;
e) 원심분리 후 상층액을 취하는 단계; 및
f) 취한 상층액에 대하여 온화한 산 가수분해를 수행하는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 나) 단계의 다공성 흑연화 탄소 고체상 추출이
a) 다공성 흑연화 탄소 컬럼을 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
b) 상기 a)의 컬럼을 0.1% TFA가 든 80% 아세토나이트릴 용액 3㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
c) 상기 컬럼을 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
d) 시료를 로딩하는 단계;
e) 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
f) 20% 아세토나이트릴 용액 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계; 및
g) 0.05% TFA가 든 40% 아세토나이트릴 용액 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하며 시료를 용출하는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 1회 분석시 필요한 뉴라미니데이즈 1000 ~ 2000U, 80% 에탄올 0.3~0.5㎖, PGC (Porous graphitized carbon) 카트리지 1개를 포함하며 상기 분석방법으로 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산을 분석하기 위한 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 분석용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 형광표지를 위하여 1회 분석시 필요한 DMB 시약 25~100㎕, 2-머캅토에탄올 1~2㎕, 소듐 하이드로설파이트 150~300㎍ 및 아세트산 1.5~2.5㎕를 더 포함하는 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 분석용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 1회 분석시 필요한 20mM NH4HCO3와 10mM DTT를 포함하는 ABC 완충액 25~75㎕, PNGase F 1000~3000U, 0.01M HCl 150~300㎕, 80% 에탄올 300~500㎕, PGC (Porous graphitized carbon) 카트리지 1개를 포함하며 상기 분석방법으로 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산을 분석하기 위한 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 분석용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 형광표지를 위하여 1회 분석시 필요한 DMB 시약 25~100㎕, 2-머캅토에탄올 1~2㎕, 소듐 하이드로설파이트 150~300㎍ 및 아세트산 1.5~2.5㎕를 더 포함하는 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 분석용 킷트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 DMB (1,2-diamino-4,5-metylenedioxybenzene), PMP (pyridoaxamine 5' phospate) 등과 같이 통상의 기술자에게 널리 알려진 형광표지용 요소를 더 포함하는 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산 분석용 킷트에 관한 것이다.
상기 분석 방법 및 분석용 킷트의 반응 시간, 반응 온도, 용매, 효소의 종류 및 단위, 형광 시약 등은 본 발명이 속하는 기술분야에서 박사 학위를 가진 발명자들을 다수 포함한 발명자들이 오랫동안 축적해온 액체 크로마토그래피 분석 및 질량분석 분야의 노하우를 바탕으로 비전문가도 매뉴얼에 따라 손쉽게 시알산을 분석할 수 있도록 만든 최적의 조건들임을 밝힌다. 위와 같은 여러 가지 반응 조건들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 반복 실험으로 손쉽게 정할 수 있는 것이 아님을 밝혀둔다.
종래 기술은 상대적으로 양이 많은 바이오의약품을 시료로 하여 시알산을 탐지 및 정량한 반면, 본 발명의 분석방법에 따르면 바이오의약품과 같은 어느 정도 정제된 당단백질 외에도 미량의 시알산을 포함하는 체액 시료나 생체조직 시료에도 적용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법 및 킷트는 종래 기술에 비하여 시알산을 탐지하는 감도가 10배 이상 높아 시료 내에 포함된 미량의 시알산도 탐지할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료에서 시알산을 분리한 후 탈염, 정제 및 농축단계를 거치므로 시알산 분석을 방해하는 물질을 배제할 수 있어 부반응을 현저히 낮추므로 고감도로 시알산을 분석할 수 있다.
또한, 본 발명은 정량분석시 별도의 유도체화 단계 없이도 변성되지 않은 상태의 NeuGc를 포함하는 시알산을 그대로 분석할 수 있기 때문에 시료의 손실 및 부반응 가능성을 줄일 수 있어 좀 더 정확하고 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있다.
이뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 분석방법을 수행하기에 적합한 킷트를 제공하므로, 비전문가도 손쉽게 본 발명의 분석방법으로 시알산을 분석할 수 있다.
본 발명의 분석방법 및 분석용 킷트는 식품 내에 함유된 NeuGc 함량을 분석함으로써 암환자 및 발암 위험군의 식이 가이드라인에 대한 학술적 근거를 마련할 수 있다.
또한, 당단백질 의약품의 경우 동물세포주를 이용하여 발현되므로, 의약품 생산시 비인간형 당사슬인 NeuGc가 삽입될 수 있다. 본 발명의 분석방법 및 분석용 킷트를 이용하여 비인간형 당사슬의 함량을 분석함으로써 의약품의 면역원성을 예측할 수 있다.
또한, 비인간형 당사슬 NeuGc의 경우 암 발병과 높은 상관관계가 있다고 알려져 있으나 지금까지는 혈액 및 생체조직 내에서 NeuGc의 직접적인 검출이 어려웠다. 본 발명의 방법 및 킷트를 이용하면 생체시료 내의 NeuGc를 고감도로 측정할 수 있어 질병의 진단 또는 질병의 바이오마커 발굴에 유용하다.
도 1은 본 발명의 비인간형 당사슬 분리 및 분석방법의 일 실시예를 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 방법으로 인간 혈장을 시료로 하여 비인간형 당사슬 NeuGc를 정량한 결과이다.
도 3은 본 발명의 방법으로 당단백질 의약품인 infliximab을 시료로 하여 NeuGc를 정량한 결과이다.
도 4는 본 발명의 방법으로 쇠고기 시료 내의 시알산 함량을 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 방법을 편리하게 수행할 수 있는 시알산 분석킷트의 일 실시예 사진이다.
도 6은 본 발명의 비인간형 당사슬 분석킷트와 종래 시알산 정제킷트로 각각 당단백질 의약품인 infliximab을 분석한 결과이다.
도 7은 도 1의 "A. Enzymatic hydrolysis" 부분의 일 실시예를 도시한 흐름도이다.
도 8은 도 1의 "B. Mild acid hydrolysis" 부분의 일 실시예를 도시한 흐름도이다. 이 실시예에서 “protein denaturation”, “N-glycan release”, “Protein precipitation”, “Centrifugation” 및 “Take supernatant and move to clean microtube” 과정은 시료에 따라 생략할 수 있다.
도 9는 도 1의 "C. Desalting and sialic acid enrichment" 부분의 일 실시예를 도시한 흐름도이다.
도 10은 도 1의 "D. Fluorescent Labeling" 부분의 일 실시예를 도시한 흐름도이다. 이 실시예에서 DMB 시약은 DMB 2㎎, 정제수 325㎕, 아세트산 89㎕, 2-머캅토에탄올 58㎕, 0.25M 소듐 하이드로설파이트 79㎕를 포함하여 총 551㎕로 구성된다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 구성이 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
1. 시료 전처리
1) 인간 혈청 100㎕에 뉴라미니데이즈 5㎕ (1250 unit)와 완충액 150㎕를 넣고 수조에 넣어 반응을 진행하였다 (37℃, 16h).
2) 차가운 에탄올 (-42℃)을 가하고 원심분리 (14,000rpm, 4℃, 20min)하여 시알산이 분리된 당단백질을 제거하였다.
3) PGC (porous graphitic carbon) 카트리지를 이용한 고체상 추출법을 통해 시료 내 염을 제거하고 시알산을 농축하였다.
2. 분석방법
1) 위 전처리에서 얻은 시알산은 LC/QqQ MS (Triple Quadrupole MS)의 다중 반응 모니터링 (Multiple Reaction Monitoring; MRM)을 이용하여 정량분석을 수행하였다. 더 자세히는 희석된 시알산을 오토샘플러 (4℃로 유지됨), 초고압 펌프 및 컬럼오븐으로 구성된 UPLC-MS/MS 시스템을 이용하여 분석하였다. 다중 반응 모니터링 (MRM)은 QqQ MS에서 사용할 수 있는 선택적인 분석법 중 하나로, 첫 번째 4중극 (quadrupole)에서는 분석하고자 하는 물질의 분자만을 통과시켜 충돌 셀 (collision cell)(즉, 두 번째 4중극)에 보내고, 충돌 셀에서 특정한 에너지를 가하여 선택된 분자를 단편화 (fragmentation)하여 단편 이온 (fragment ion)을 생성한다. 세 번째 4중극에서는 충돌 셀에서 생성된 단편 이온 중 표적 물질에 특이적인 단편 이온만 통과시켜 검출한다. 다중 반응 모니터링을 사용할 경우 매트릭스의 간섭물질에 영향을 최소화할 수 있어 좀 더 고감도로 표적 물질을 분석할 수 있으며, 복수의 단편 이온을 모니터링할 경우 이들의 면적비를 통하여 물질의 정량에도 활용할 수 있다. PGC 컬럼 (100× 2.1mm, 3㎛)을 사용하였고, 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 최적화된 분리 조건에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 시료를 로딩한 후 온전한 시알산 용출 농도구배 용액을 분당 0.3ml씩 흘려주었다. 농도구배 용액은 (A) 96.9% 물, 0.1% 포름산(v/v) 수액, 3.0% 아세토나이트릴 및 (B) 9.9% 물, 90.0% 아세토나이트릴, 0.1% 포름산(v/v) 수액이고, 각각 아래 시각에 아래 농도로 처리하였다:, 0% B, 0~0.5 min; 0~10% B, 0.5~6 min; 10~100% B, 6~8 min. 최종적으로 분석 컬럼은 0% B로 3분간 재평형화하였다.
2) 분석된 데이터는 MassLynx를 이용하여 처리되었다.
아래에서는 위와 같은 시료 전처리 및 분석방법의 구체적인 실시예 및 얻어진 결과를 나타내는 도 1 내지 도 5와 표 1, 2에 대하여 설명한다.
도 1
도 1은 본 발명의 비인간형 당사슬 NeuGc를 분리 및 분석하는 방법의 흐름도이다. 이 흐름도는 시료의 특성 및 실험자의 목적에 따라 단계를 선택하여 진행할 수 있도록 설계되어 있다. 시료의 N-당사슬에 포함되어 있는 시알산 중 NeuGc만 확인하고자 하는 경우 첫 단계에 N-당사슬을 특이적으로 분리할 수 있는 효소처리 단계를 추가하여 진행할 수 있다. 하지만, 시료에 함유된 모든 시알산을 확인하는 경우에는 이 단계를 생략하여도 된다. 혈액이나 조직 시료에 산처리를 적용하여 시알산을 분리한 경우 시료의 변형이 일어나 재현성 있는 결과를 얻을 수 없다. 따라서, 본 발명에서는 혈액 및 조직시료에 시알산만을 특이적으로 분리하는 효소 뉴라미니데이즈 (Neuraminidase)를 처리하여 시알산을 유리하여 분석을 진행한다. 산처리를 하더라도 시료의 변형이 적은 의약품의 경우에는 온화한 산처리를 통해 시알산을 유리한다. 그 후 다른 방해요소인 아미노산 및 전해질 등을 제거하고 순수한 시알산만을 정제하기 위하여 다공성 흑연화 탄소 카트리지 (Porous Graphitized Carbon Cartridge)를 이용하여 고체상 추출 (Solid Phase Extraction)을 하여 시알산만을 선택적으로 추출한다. 고체상 추출 과정에서 유기용매 함량 및 pH를 낮춰 용출할 경우 순수한 시알산만을 용출할 수 있다. 상기 과정을 거쳐 정제한 시알산은 직접 LC/MS 시스템에 주입하여 분석하거나, 형광유도체화 과정을 거쳐 LC/FLD에 주입하여 분석할 수 있다. 도 1의 각 단계에 대한 좀 더 구체적인 실시예를 도 7 내지 도 10에 나타내었다. 또한, DMB 표지된 시알산을 분석하기 위한 HPLC/FLD 조건은 다음과 같다. 컬럼: C18 또는 C18의 등가물(페닐, 페닐헥실, HILIC, 다이페닐 등), 컬럼 크기 (50~100 × 1.0~2.1 ㎜ i.d., 1.7~5㎛), 이동상: 정제수, 완충액 또는 다른 용액(예컨대, 포름산, 포름산 암모늄, 초산암모늄 등) (A) 그리고, 메탄올 또는 메탄올에 용해된 용매 A (B), 컬럼 온도: 30~60℃, 농도구배는 이동상과 컬럼에 따라 다양하게 변경 가능하다. 농도구배의 일례를 표 1에 나타내었다. FLD는 여기 파장 373nm, 방출파장 448nm이다.
Time (min) Solvent B (%) Flow rate (㎖/min)
0 15 0.5
1 15 0.5
8 20 0.5
10 95 0.5
변성되지 않은 시알산을 분석하기 위한 LC/MS 분석조건은 다음과 같다. 컬럼은 다공성 흑연화 탄소 컬럼 (PGC) 또는 이의 등가물 (예컨대 HILIC 컬럼)을 사용하며, 컬럼 크기는 50~100 × 1.0~2.1 ㎜ i.d., 1.7~5㎛이다. 이동상은 0.1% 포름산을 3% 아세토나이트릴에 용해한 용액 (A) 및 0.1% 포름산을 90% 아세토나이트릴에 용해한 용액 (B) 또는 완충액 (포름산 암모늄 또는 초산 암모늄) (A) 및 아세토나이트릴에 용해한 용액 A (B)를 사용한다. 컬럼 온도: 30~60℃. 농도구배는 이동상과 컬럼에 따라 다양하게 변경 가능하다. 농도구배의 일례를 표 2에 나타내었다. MRM 전이 조건은 표 3과 같다.
Time (min) Solvent B (%) Flow rate (㎖/min)
0 0 0.3
0.5 0 0.3
6 10 0.3
8 100 0.3
Target Quantitative Qualitative
NeuAc 308 → 87 308 → 167
NeuGc 324 → 116 324 → 87
도 2 : 혈장내 비인간형 당사슬 분석
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 대표적인 생체시료인 혈장에서 비인간형 당사슬인 NeuGc 시알산을 정량한 결과이다. 혈액 시료에 시알산 분리효소인 뉴라미니데이즈를 처리하여 시알산을 선택적으로 분리한 후, 다공성 흑연화 탄소 카트리지 고체상 추출법으로 간섭물질을 제거하고 유리된 시알산을 선택적으로 정제하였다. 정제한 시알산은 다른 전처리과정 없이 LC/MS 시스템에 직접 주입하여 분석하였다. 본 발명에서 NeuGc를 높은 신뢰도로 정량할 수 있는 범위는 액체크로마토그래피/질량분석 (LC/MS) 방법을 이용할 때 0.5pg/㎕ (500 ppt) 내지 50pg/㎕ (50 ppb), 형광 액체크로마토그래피 (LC-FLD)를 이용하는 경우 5pg/㎕ (5ppb) 내지 1ng/㎕ (1ppm)임을 확인하였다. 본 발명을 이용하여 기존 분석법의 감도 한계로 정량할 수 없었던 인간 혈액 내 비인간형 시알산 NeuGc가 160pg/100㎕ (1.6ppb) 수준으로 존재함을 최초로 확인하였다.
도 3: 의약품 내 비인간형 당사슬 분석
도 3은 본 발명을 항체의약품인 infliximab에 적용하여 NeuGc 함량을 분석한 결과이다. 온화한 산처리를 통하여 의약품 내 NeuGc를 선택적으로 유리한 후, PGC SPE를 적용하여 간섭물질을 제거하였다. 정제된 NeuGc를 형광유도체화과정을 거쳐 HPLC-FLD 시스템에 주입하여 분석하였다. 본 발명을 적용한 결과 액체크로마토그래피 (HPLC-FLD) 기반의 분석법으로도 항체의약품인 Infliximab 내에 극미량으로 존재하는 NeuGc를 정량할 수 있었으며, infliximab 의약품 1 μg당 0.2 ng 수준으로 NeuGc가 존재함을 확인할 수 있었다. 도 3은 생체시료뿐만 아니라 의약품 등 다양한 시료에 본 발명의 방법을 적용할 수 있음을 보여주는 결과이다.
도 4: 식품내 시알산 분석
도4는 본 발명을 쇠고기 시료에 적용하여 NeuGc함량을 분석한 결과이다. 온화한 산처리를 통하여 쇠고기 내 시알산을 선택적으로 유리하고, PGC SPE를 통하여 간섭물질을 제거하였다. 정제된 시알산을 형광유도체화 과정을 거쳐 HPLC-FLD 시스템에 주입하여 분석하였다. 본 발명을 적용한 결과, 쇠고기에 함유된 NeuAc와 비인간 시알산인 NeuGc를 동시에 정량할 수 있었으며, 쇠고기 시료에 NeuAc는 1g당 22.4㎍, NeuGc는 1g당 22.4㎍ 수준으로 존재함을 확인할 수 있었다.
도 5: 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석킷트
도 5는 본 발명의 분석법을 기반으로 하여 개발한 비인간형 당사슬 분석 킷트이다. 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석킷트는 시알산 분리/정제 구성요소와 시알산 형광 표지용 구성요소를 포함하여 구성되어 있다. 표 4와 표 5는 각각 시알산 분석킷트의 세부 구성을 보여준다. 표 4는 온화한 산처리를 이용하는 분석킷트의 일 실시예이고, 표 5는 효소 처리를 이용하는 분석킷트의 일 실시예이다.
품명 용량
(1회 기준)
Release component PGC cartridges
ABC Buffer (200 mM NH4HCO3 + 10 mM DTT)
PNGase F (New England Biolabs)
0.01M HCl
80% Ethanol		 1ea
25~75㎕
1000~3000U
150~300㎕
300~500㎕
Labeling
component		 DMB reagent
2-mercaptoethanol
Sodium hydrosulfite
Acetic acid		 25~100㎍
1~2㎕
150~300㎍
1.5~2.5㎕
품명 용량
(1회 기준)
Release component Sialic acid release reagent (neuraminidase)
PGC cartridges
80% Ethanol		 1000~2000U
1ea
300~500㎕
Labeling
component		 DMB reagent
2-mercaptoethanol
Sodium hydrosulfite
Acetic acid		 25~100㎍
1~2㎕
150~300㎍
1.5~2.5㎕
도 6: 기존 분석법과 비교
도 6은 본 발명의 비인간형 당사슬 분석 킷트와 기존의 시알산 분리/정제 킷트에 각각 시료로서 항체의약품인 infliximab을 적용하여 얻은 크로마토그램이다. 파란색 크로마토그램은 기존 분석킷트를 적용하여 분석한 결과이며, 빨간색 크로마토그램은 본 발명의 분석 킷트를 적용한 결과이다. 동일한 양의 시료를 사용한 경우 본 발명이 기존분석법 대비 약 10배 이상의 감도로 비인간형 당사슬 시알산인 NeuGc를 검출할 수 있음을 확인하였다.
종래 킷트 (L사) 본 발명 킷트
비용 900,000원 (20회 기준) 500,000원 (20회 기준)
감도 3pg/㎕ (MS)
30pg/㎕ (LC)		 500fg/㎕ (MS)
3pg/㎕ (LC)
정확성 50~625pg/㎕ (LC) 5~1000pg/㎕ (LC)
적용가능시료 건조 가능한 당단백질
(바이오의약품 포함)		 당단백질(바이오의약품 포함)
혈장
생체조직
식품
본 발명의 분석방법 및 본 발명의 분석킷트를 이용하여 시료의 비인간형 당사슬 NeuGc를 분석하는 경우 특이점 및 장점을 아래에서 좀 더 자세히 설명한다.
1) 시알산 분리효소 사용: 기존 실험방법은 건조된 당단백질에 화학적 산처리를 하여 시료 내 시알산을 분리하였다. 산처리를 이용한 시알산 유리방법의 경우 단백질 변성이 일어나 혈액 및 조직시료와 같은 생체시료의 시알산 분석에 적용이 불가능하다. 본 발명에서는 당단백질에서 시알산만을 선택적으로 유리할 수 있는 효소인 뉴라미니데이즈 (Neuraminidase) 및/또는 시알리데이즈 (Sialidase)를 사용하여 생체시료 내의 시알산 분석에 적용할 수 있다.
2) 다양한 시료에 적용 가능: 위와 같은 이유에서 혈액, 조직 등과 같은 시료에 산처리를 적용하는 경우 시료의 변형을 일으켜 시알산을 분리할 수 없었으나, 본 발명에서는 시료를 시알산 분리효소로 처리하기 때문에 시료 종류에 구애받지 않고 적용할 수 있다. 본 발명을 적용하여 기존의 분석법으로 검출하지 못하였던 혈액 시료에서 비인간형 당사슬 NeuGc를 최초로 검출 및 정량하였다 (도 2).
3) 분리·정제 과정:　시료에서 시알산 유리 후 시알산만을 분리·정제하는 과정 (PGC-SPE clean up)을 추가하여 다른 방해물질 간섭 및 부반응 (side reaction)의 가능성을 차단하여 기존 분석법 대비 10배 이상의 고감도의 분석이 가능하여 시료에 극미량으로 존재하는 비인간형 당사슬 NeuGc를 정량할 수 있다 (도 6). 또한, 본 발명의 비인간형 당사슬 분리/정제방법을 수행하기 편리한 킷트를 만들어 비전문가도 쉽게 본 발명의 분석법을 적용할 수 있도록 하였다 (도4, 도 5).
4) 변성되지 않은 시알산 탐지: 액체크로마토그래피/질량분석기반 (LC/MS) 분석법 적용시 발색단이 없는 당사슬의 검출을 위해 유도체화 과정 (DMB, PMP 등)을 추가하지 않고 NeuGc 원상태 그대로 분석하므로 유도체화 과정 중에 일어날 수 있는 시료 손실 및 부반응을 줄일 수 있어 좀 더 정확하고 재현성 있는 결과를 도출할 수 있다.
5) 시알산 분리 및 정제 과정을 통하여 방해물질 간섭 및 부반응의 가능성을 최소화하여 형광유도체화를 통한 액체크로마토그래피 기반의 분석법을 이용하는 경우에도 극미량의 시료를 정확하게 정량할 수 있다 (도 6).

Claims (14)

  1. 가) 시알산을 포함하는 체액, 생체조직, 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체, 올리고당, 세포주, 박테리아, 바이러스 및 바이오의약품 중 1종 이상의 시료에 뉴라미니데이즈 및 시알리데이즈 중 1종 이상의 효소를 처리하거나 온화한 산 가수분해로 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 분리하는 단계;
    나) 다공성 흑연화 탄소 고체상 추출 및 HILIC 고체상 추출 중 1종 이상으로 상기 가) 단계를 거친 시료를 탈염하고 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 정제, 농축하는 단계; 및
    다) HPLC/FLD 또는 LC/MS로 비인간형 당사슬 NeuGc를 포함하는 시알산을 분석하는 단계;를 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 가)의 효소처리단계 전에 시료의 N-당사슬 분리단계가 추가된 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 나) 단계 이후 다) 단계 이전 비인간형 당사슬 NeuGc를 형광표지화하는 단계가 추가되는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 가) 단계의 효소 처리는
    a) 50~200㎕의 액상 시료 또는 50~200㎍의 고체상 시료를 취하는 단계;
    b) 시료에 단백질 변성 시약을 가하고 90~110℃로 1~3분간 처리하여 단백질을 변성하는 단계;
    c) 시료에 뉴라미니데이즈 및 시알리데이즈 중 1종 이상의 효소 1000~2000U를 5~24시간 처리하여 시알산을 분리하는 단계;
    d) 시료 내의 단백질을 침전하는 단계; 및
    e) 단백질을 침전시킨 시료를 원심분리하고 상층액을 얻는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 가) 단계의 온화한 산 가수분해는 정제한 당단백질을 포함하는 시료에 대하여 수행하며,
    a) 50~200㎕의 액상 시료 또는 50~200㎍의 고체상 시료를 취하는 단계;
    b) 시료에 단백질 변성 시약을 가하고 90~110℃로 1~3분간 처리하여 단백질을 변성하는 단계;
    c) 단백질이 변성된 시료에 PNGase F 1000~3000U를 가하고 5~24시간 처리하여 N-당사슬을 분리하는 단계;
    d) 단백질을 침전하는 단계;
    e) 원심분리 후 상층액을 취하는 단계; 및
    f) 취한 상층액에 대하여 온화한 산 가수분해를 수행하는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 나) 단계의 다공성 흑연화 탄소 고체상 추출은
    a) 다공성 흑연화 탄소 컬럼을 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
    b) 상기 a)의 컬럼을 0.1% TFA가 든 80% 아세토나이트릴 용액 3㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
    c) 상기 컬럼을 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
    d) 시료를 로딩하는 단계;
    e) 정제수 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계;
    f) 20% 아세토나이트릴 용액 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하는 단계; 및
    g) 0.05% TFA가 든 40% 아세토나이트릴 용액 2.5~3.5㎖로 2회 이상 세척하며 시료를 용출하는 단계;를 순차적으로 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석방법.
  7. 상기 청구항 1의 방법으로 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산을 분석하기 위하여 1회 분석시 필요한 뉴라미니데이즈 1000~3000U, 80% 에탄올 300~500㎕, PGC (Porous graphitized carbon) 카트리지 1개를 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석용 킷트.
  8. 청구항 7에 있어서,
    형광표지를 위하여 1회 분석시 필요한 DMB (1,2-diamino-4,5-metylenedioxybenzene) 시약 25~100㎍, 2-머캅토에탄올 1~2㎕, 소듐 하이드로설파이트 150~300㎍ 및 아세트산 1.5~2.5㎕를 더 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석용 킷트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 상기 청구항 1의 방법으로 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산을 분석하기 위하여 1회 분석시 필요한 20mM NH4HCO3와 10mM DTT (Dithiothreitol)를 포함하는 ABC 완충액 25~75㎕, PNGase F 1000~3000U, 0.01M HCl 150~300㎕, 80% 에탄올 300~500㎕, PGC (Porous graphitized carbon) 카트리지 1개를 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석용 킷트.
  12. 청구항 11에 있어서,
    형광표지를 위하여 1회 분석시 필요한 DMB (1,2-diamino-4,5-metylenedioxybenzene) 시약 25~100㎍, 2-머캅토에탄올 1~2㎕, 소듐 하이드로설파이트 150~300㎍ 및 아세트산 1.5~2.5㎕를 더 포함하는 비인간형 당사슬을 포함하는 시알산 분석용 킷트.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP0243200A2 (en) 1986-04-25 1987-10-28 FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. Method of measuring lipid-bound sialic acid and reagent kit for use therein
JP2015513674A (ja) 2012-02-27 2015-05-14 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． シアル酸定量のためのハイスループット方法
WO2016081770A1 (en) * 2014-11-19 2016-05-26 Amgen Inc. Quantitation of glycan moiety in recombinant glycoproteins
KR101743969B1 (ko) 2016-03-21 2017-06-08 충남대학교산학협력단 당단백질 분자량 측정을 이용한 실시간 당쇄화 모니터링 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0243200A2 (en) 1986-04-25 1987-10-28 FUJIREBIO KABUSHIKI KAISHA also trading as FUJIREBIO INC. Method of measuring lipid-bound sialic acid and reagent kit for use therein
JP2015513674A (ja) 2012-02-27 2015-05-14 バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティドＢｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ． シアル酸定量のためのハイスループット方法
WO2016081770A1 (en) * 2014-11-19 2016-05-26 Amgen Inc. Quantitation of glycan moiety in recombinant glycoproteins
KR101743969B1 (ko) 2016-03-21 2017-06-08 충남대학교산학협력단 당단백질 분자량 측정을 이용한 실시간 당쇄화 모니터링 방법

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