ES2583639T3 - Producción de aceites específicos en microorganismos heterótrofos - Google Patents

Abstract

Una célula del género Prototheca que comprende un gen exógeno donde dicho gen exógeno está en unión operativa con un promotor y codifica una sacarosa invertasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de aceites específicos en microorganismos heterótrofos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

15 aldehídos, alcoholes, y alcanos, así como también con los métodos y reactivos para modificarlas genéticamente con el objetivo de mejorar la eficiencia productiva y modificar el tipo y la composición de los aceites que ellas producen.

La presente invención se relaciona con la producción de aceites, combustibles, y oleoquímicos elaborados a partir de microorganismos. En particular, la descripción se relaciona con microalgas oleaginosas, con los métodos de cultivo de las mismas para la producción de compuestos útiles, incluyendo lípidos, ésteres de ácidos grasos, ácidos grasos,

10 Esta solicitud incluye un listado de secuencias mostrado en las páginas 1-72 anexas en la presente.

5 Estados Unidos núm. 61/118,590, presentada el 28 de noviembre de 2008, solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/118,994, presentada el 1 de diciembre de 2008, solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/174,357, presentada el 30 de abril de 2009, y la solicitud provisional de patente de los Estados Unidos núm. 61/219,525, presentada el 23 de junio de 2009.

Esta solicitud reivindica los beneficios de conformidad con 35 U.S.C. 119(e) de la solicitud provisional de patente de los imagen1

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El combustible fósil es un término general para los depósitos geológicos de combustible enterrado de materiales orgánicos, formados a partir de plantas y animales descompuestos, que han sido transformados en aceite crudo, hulla,

20 gas natural o aceites pesados por exposición al calor y presión en la corteza terrestre durante cientos de millones de años. Los combustibles fósiles son una fuente finita, no renovable.

El incremento de la demanda energética por la globalización económica también ha ejercido presión en el aumento del costo de los hidrocarburos. Además de la energía, muchas industrias, incluyendo los productores de plástico y sustancias químicas, dependen en gran medida de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para sus

25 procesos de fabricación. Las alternativas rentables a las fuentes actuales de suministro podrían contribuir a atenuar la presión ascendente en la energía y los costos de estas materias primas.

La publicación PCT núm. 2008/151149 describe los métodos y materiales para cultivar microalgas para la producción de aceite y particularmente ejemplifica la producción de combustible diesel a partir del aceite producido por las microalgas Chlorella protothecoides. Existe aún una necesidad de métodos mejorados para producir aceite a partir de microalgas,

30 particularmente de métodos que produzcan aceites de longitud de cadena más corta y con mayor grado de saturación y sin pigmentos, con mayor rendimiento y eficiencia. La presente invención satisface esta necesidad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención, según se reivindica, proporciona células del género Prototheca que contienen un gen exógeno y en donde dicho gen exógeno está en unión operativa con un promotor y codifica una sacarosa invertasa. En algunas realizaciones 35 la célula es una variedad de las especies Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii, y en otra realización la célula tiene una secuencia ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85, o 95 % de identidad de nucleótidos con una o más de las sec. con núm. de ident.: 11-19. En la invencion, según se reivindica, el gen exógeno es una secuencia codificante que está en unión operativa con un promotor, y en algunas realizaciones el promotor es de un gen endógeno para una especie del género Prototheca. En otras realizaciones la secuencia codificante comprende 40 una secuencia dirigida al plastidio de microalgas, y en algunas realizaciones la microalga es una especie del género Prototheca o Chlorella así como de otros géneros de la familia Chlorellaceae. En algunas realizaciones, la secuencia dirigida al plastidio tiene al menos 20, 25, 35, 45, o 55% de identidad de secuencia de aminoácidos con una o más de las sec. con núm. de ident.: 127-133 y es capaz de dirigir una proteína codificada por un gen exógeno que no se encuentra en el genoma plastídico del plastidio. En otras realizaciones, el promotor se regula de manera ascendente en 45 respuesta a la reducción o eliminación del nitrógeno en el medio de cultivo de la célula, tal como al menos una regulación ascendente de tres veces determinada por la abundancia del transcrito en una célula del género Prototheca cuando el ambiente extracelular cambia de contener al menos 10 mM o 5 mM de nitrógeno a no contener nada de nitrógeno. En otras realizaciones, el promotor comprende un segmento de 50 nucleótidos o más de una de las sec. con núm. de ident.: 91-102. En otras realizaciones, la célula tiene una secuencia de ARNr 23S con al menos 70, 75, 80, 85 o

50 95% de identidad de nucleótidos con una o más de las sec. con núm. de ident.: 11-19. En otras realizaciones, el gen exógeno se integra a un cromosoma de la célula. La invención también proporciona el uso de células del género Prototheca que comprenden un gen exógeno, donde dicho gen exógeno esta en unión operativa con un promotor y codifica una sacarosa invertasa para producir un lípido, opcionalmente en donde el lípido se utiliza además para la producción de un aceite, combustible o producto oleoquímico.

55 En realizaciones adicionales de las células de la invención, la célula es del género Prototheca y contiene un gen exógeno de la acil graso-ACP tioesterasa y un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C8 que es al menos 0.3% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C10 que es al menos 2% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C12 que es al menos 2% de los lípidos totales de la célula, una cantidad de C14 que es al menos 4% de los lípidos totales de la célula, y una cantidad de C8-C14 que es 10-30%, 20

15 Se divulgan composiciones de aceite de triglicéridos, así como las células que contienen las composiciones de aceite de triglicéridos con un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 y uno o microgramos/ml de carotenoides totales, menos de 0.4 microgramos/ml de carotenoides totales, menos de 0.001 microgramos/ml de licopeno, menos de 0.02 microgramos/ml de beta caroteno, menos de 0.02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0.40-0.60 miligramos de gamma-tocoferol por 100 gramos de aceite; 0.2-0.5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, menos de 0.4 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 4-8 mg por 100 gramos de aceite de campesterol, y 40-60 mg por 100 gramos de aceite de estigmasterol. En algunas realizaciones de la divulgación, las composiciones de aceite de triglicéridos tienen un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 p/p o porcentaje de área de la composición de triglicéridos, una cantidad de C8 de al menos 0.3% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C10 de al menos 2% p/p o porcentaje de área, una cantidad de C12 de al menos 2% p/p o

o porcentaje de área y métodos para preparar composiciones de triglicéridos que incluye cultivar las células ya mencionadas, en donde las células comprenden además un gen exógeno que codifica para una sacarosa invertasa y la sacarosa se suministra como fuente de carbono. En algunas realizaciones de esta divulgación la sacarosa invertasa tiene al menos 50, 60, 70, 80, o 90% de identidad de aminoácidos con una o más de las sec. con núm. de ident.: 3, 2029 y 90.

30%, o al menos 10, 20 o 30% de los lípidos totales de la célula y contiene además un gen exógeno sacarosa invertasa. imagen2En algunas realizaciones, la célula es una cepa de las especies stagnora o Prototheca zopfii5

25 porcentaje de área, una cantidad de C14 de al menos 4% p/p o porcentaje de área, y una cantidad de C8-C14 que es 10-30%, 20-30%, o al menos 10, 20 o 30% p/p o porcentaje de área. En otras realizaciones de la divulgación, la composición de aceite de triglicéridos se mezcla con al menos otra composición seleccionada del grupo consistente de: soya, colza, canola, palma, almendra de palma, coco, maíz, residuos vegetales, sebo de China, oliva, girasol, semilla de algodón, grasa de pollo, sebo de vacuno, sebo porcino, microalgas, macroalgas, Cuphea, lino, cacahuate, grasa blanca selecta, manteca de cerdo, Camelina sativa, semillas de mostaza, nuez de marañón, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, euforbia, semillas de calabaza, cilantro, camelia, ajonjolí, cártamo, arroz, árbol del tung, cacao, copra, amapola del opio, semillas de ricino, nuez lisa, jojoba, jatrofa, macadamia, nueces del Brasil, aguacate, petróleo, o una fracción destilada de cualquiera de los aceites anteriores.

Los métodos divulgados también incluyen procesar los aceites antes mencionados realizando una o más de las

35 reacciones químicas de la lista consistente de: transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis para producir ácidos grasos libres, y saponificación. Se divulgan además, los combustibles hidrocarburos obtenidos a partir de la hidrogenación e isomerización de los aceites mencionados anteriormente y ésteres de alquilo de ácidos grasos obtenidos a partir de la transesterificación de los aceites mencionados anteriormente. En algunas realizaciones de la divulgación, el combustible hidrocarburo se obtiene a partir de triglicéridos aislados de células del género Prototheca en donde el intervalo de destilación según ASTM D86 T10-T90 es de al menos 25ºC. En otras realizaciones, el combustible éster de alquilo de ácidos grasos se obtiene a partir de triglicéridos aislados de células del género Prototheca en donde la composición tiene un tiempo de maceración en frío de menos de 120 segundos según ASTM D6751 A1.

Se divulga una composición que comprende (a) un polisacárido que comprende uno o más monosacáridos de la lista

45 que consiste en 20-30 porciento molar de galactosa; 55-65 porciento molar de glucosa; y 5-15 porciento molar de manosa; (b) proteína; y (c) ADN que contiene una secuencia de ARNr 23S con identidad nucleotídica de al menos 70, 75, 80, 85 o 95% de una o más de las sec. con núm. de ident.: 11-19; y (d) un gen exógeno. En algunas realizaciones de la divulgación el gen exógeno se selecciona de la sacarosa invertasa y de la acil graso-ACP tioesterasa, y en otras realizaciones la composición comprende, además, lípidos con un perfil lipídico de al menos 4% de C8-C14. En otras realizaciones, la composición se formula para consumo como alimento animal.

Se divulgan ácidos nucleicos recombinantes que codifican promotores que se regulan de manera ascendente en respuesta a la reducción o eliminación del nitrógeno en el medio de cultivo de la célula del género Prototheca, tal como al menos una regulación ascendente de 3 veces determinada por la abundancia del transcripto cuando el ambiente extracelular cambia de contener al menos 10 mM o 5 mM de nitrógeno a no contener nada de nitrógeno. En algunas 55 realizaciones de la divulgación, el ácido nucleico recombinante contiene un segmento de 50 nucleótidos o más de una de las sec. con núm. de ident.: 91-102. La divulgación también incluye vectores de ácidos nucleicos que contienen un casete de expresión que comprende (a) un promotor que es activo en una célula del género Prototheca; y (b) una secuencia codificante en unión operativa con el promotor en donde la secuencia codificante contiene los codones preferidos o los segundos más preferidos de la Tabla 1 para al menos 20, 30, 40, 50, 60, u 80% de los codones de la secuencia codificante. En algunos vectores, la secuencia codificante comprende una secuencia dirigida al plastidio, dentro del marco con una acil graso-ACP tioesterasa, incluyendo la tioesterasa que tiene actividad hidrolítica hacia uno

o más sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. Algunos vectores incluyen secuencias dirigidas al plastidio que codifican péptidos capaces de dirigir una proteína al plastidio de una célula del género

Se divulgan métodos para producir composiciones de triglicéridos que comprende (a) cultivar una población de células del género Prototheca en presencia de una fuente fija de carbono, en donde: (i) las células contienen un gen exógeno; 15 (ii) las células acumulan al menos 10, 20, 30, 40, 60, o 70% de su peso seco de las células en forma de lípidos; y (iii) la fuente fija de carbono se selecciona de un grupo consistente de sorgo y material celulósico despolimerizado; y (b) aislar los componentes lipídicos de los microorganismos cultivados. En algunas realizaciones de la divulgación, la fuente fija de carbono es material celulósico despolimerizado seleccionado del grupo consistente de rastrojo de maíz, Miscanthus, sorgo forrajero, pulpa de remolacha y bagazo de caña de azúcar, que se sometieron opcionalmente a un proceso de 20 lavado con agua antes de la etapa de cultivo. En algunos métodos, la fuente fija de carbono es material celulósico despolimerizado y el nivel de glucosa de este material celulósico despolimerizado se concentra a un nivel de al menos 300g/litro, al menos 400 g/litro, al menos 500 g/litro o al menos 600g/litro antes de la etapa de cultivo y se alimenta al cultivo todo el tiempo mientras las células crecen y acumulan lípidos. En algunos métodos el gen exógeno codifica una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hidrolítica hacia uno o más sustratos acil graso-ACP de longitud de

10 Se divulga un ácido nucleico recombinante que tiene al menos 80, 90, 95 o 98% de identidad de nucleótidos con una o ambas de las sec. con núm. de ident.: 134-135 y un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína que tiene al menos 80, 90, 95 o 98% de identidad de aminoácidos con una o ambas de las sec. con núm. de ident.: 136-137.

5 Prototheca, en donde la secuencia es de al menos 200 nucleótidos de longitud, y algunos vectores comprenden la primera y segunda secuencias endógenas de ácidos nucleicos del genoma nuclear de la célula del género Prototheca, en donde la primera y segunda secuencias (a) son cada una de al menos 200 nucleótidos de longitud; (b) flanquean el casete de expresión; y (c) se localizan en el mismo cromosoma Prototheca a una distancia de no más de 5, 10, 15, 20, y 50 kB.

Prototheca, incluyendo los de microalgas y aquellos en donde la secuencia dirigida al plastidio tienen al menos 20, 25, imagen3capaz de dirigir una proteína al plastidio de una célula del género Prototheca. divulgación comprenden secuencias endógenas de ácidos nucleicos

25 cadena C8, C10, C12 o C14, y en algunos métodos los triglicéridos tienen un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 y uno o más de los siguientes atributos: 0.1-0.4 microgramos/ml de carotenoides totales; menos de 0.02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0.40-0.60 miligramos de gamma-tocoferol por 100 gramos de aceite; 0.2-0.5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 4-8 mg por 100 gramos de aceite de campesterol, y 40-60 mg por 100 gramos de aceite de estigmasterol.

30 Otros métodos divulgados incluyen producir una composición de triglicéridos que comprende: (a) cultivar una población de microorganismos en presencia de material celulósico despolimerizado, en donde: (i) el material celulósico despolimerizado se somete a un proceso de lavado con agua antes de la etapa de cultivo; (ii) las células acumulan al menos 10, 20, 30, 40, 60, o 70% de su peso seco de las células en forma de lípidos; y (iii) el material celulósico despolimerizado se concentra a al menos 300, 400, 500, ó 600 g/litro de glucosa antes de la etapa de cultivo; (iv) los

35 microorganismos se cultivan en una reacción de lote alimentado, en la cual el material celulósico despolimerizado de al menos 300, 400, 500, o 600 g/litro de glucosa se alimenta a los microorganismos; y (b) aislar los componentes lipídicos de los microorganismos cultivados. En algunas realizaciones de la divulgación, la fuente fija de carbono es material celulósico despolimerizado seleccionado del grupo consistente de rastrojo de maíz, Miscanthus, sorgo forrajero, pulpa de remolacha y bagazo de caña de azúcar. En otras realizaciones, los microorganismos son una especie del género

40 Prototheca y contienen un gen exógeno que incluye un acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hidrolítica hacia uno o más sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. Otro método divulgado abarca fabricar aceite de triglicéridos cultivando una célula que tiene una secuencia ARNr 23S con al menos 90 o 96% de identidad de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 30 en presencia de sacarosa como fuente de carbono.

Se divulgan métodos para fabricar un producto químico que comprende llevar a cabo una o más reacciones químicas de

45 la lista consistente de transesterificación, hidrogenación, hidrocraqueo, desoxigenación, isomerización, interesterificación, hidroxilación, hidrólisis, y saponificación de un aceite de triglicéridos, en donde el aceite tiene un perfil lipídico de al menos 4% C8-C14 y uno o más de los siguientes atributos: 0.1-0.4 microgramos/ml de carotenoides totales; menos de 0.02 miligramos de clorofila por kilogramo de aceite; 0.10-0.60 miligramos de gamma-tocoferol por 100 gramos de aceite; 0.1-0.5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite, 1-8 mg por 100 gramos de aceite

50 de campesterol, y 10-60 mg por 100 gramos de aceite de estigmasterol. Algunos métodos se realizan al fabricar el aceite mediante el cultivo de células del género Prototheca que comprende un gen exógeno acil graso-ACP tioesterasa que codifica una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hidrolítica hacia uno o más sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena C8, C10, C12 o C14. En algunos métodos, la reacción de hidrólisis se selecciona del grupo consistente de saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática, hidrólisis catalítica, e hidrólisis

55 con agua caliente comprimida, incluyendo una reacción de hidrólisis catalítica en donde el aceite se divide en glicerol y ácidos grasos. En otros métodos, los ácidos grasos se someten a una reacción de aminación para producir compuestos grasos nitrogenados o una reacción de ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos. En algunas realizaciones, el aceite se somete a un método de desdoblamiento de triglicéridos, seleccionado del grupo consistente de división enzimática y división por presión. En algunos métodos, la reacción de hidrólisis es seguida por una reacción de

60 condensación. Otros métodos incluyen realizar una reacción de hidroprocesamiento del aceite, en donde opcionalmente el producto de la reacción de hidroprocesamiento se somete a una reacción de desoxigenación o condensación antes o simultáneamente a la reacción de hidroprocesamiento. Otros métodos incluyen adicionalmente una reacción de eliminación del gas. Los métodos adicionales incluyen procesar los aceites mencionados anteriormente

15 La Figura 5 muestra los resultados del análisis de transferencia de tipo Southern de tres transformantes de la cepa UTEX 1435, como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 6 muestra un esquema de la construcción transgénica del codón optimizado y del codón no optimizado suc2 (sacarosa invertasa de levadura (yInv)). Se indican los sitios de restricción relevantes del clonaje y las flechas indican la dirección de la transcripción.

La Figura 4 muestra los mapas de los casetes usados en las transformaciones de Prototheca, como se describe en el Ejemplo 3.

10 Las Figuras 1 y 2 ilustran las curvas de crecimiento de las especies Prototheca y Chlorella luteoviridis cepa SAG 2214 cultivadas en sorgo como fuente de carbono. La Figura 3 muestra el crecimiento en el tiempo de SAG 2214 en glucosa y sacarosa.

5 esterificación en los aceites mencionados anteriormente, opcionalmente una reacción de transesterificación. Otros métodos incluyen realizar una mencionados anteriormente, en donde, opcionalmente, una reacción de hidroxilación es seguida por la reacción de condensación.

mediante una reacción de desoxigenación seleccionada del grupo consistente de: una reacción de hidrogenólisis, imagen4consecutiva, y una reacción de hidrogenación-hidrogenólisis combinada. En desoxigenación es seguida por la reacción de condensación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

20 La Figura 7a muestra los resultados del crecimiento de Prototheca moriformis en azúcares derivados de celulosa (rastrojo de maíz, pulpa de remolacha, caña de sorgo, Miscanthus y control de glucosa). El crecimiento se expresa en medidas de densidad óptica (lecturas A750).

La Figura 7b muestra los resultados de los experimentos de crecimiento usando Prototheca moriformis usando diferentes niveles de azúcares celulósicos derivados del rastrojo de maíz en comparación con el control glucosa/xilosa.

25 La Figura 7c muestra el impacto de la xilosa sobre la producción de lípidos en cultivos de Prototheca.

La Figura 7G muestra el impacto de la concentración de sal (Na2SO4) y del antiespumante en el crecimiento (en peso seco de células (PSC)) de Prototheca.

La Figura 8 muestra el impacto del tratamiento hidrotérmico de varios materiales celulósicos (bagazo de caña de azúcar, caña de sorgo, Miscanthus y pulpa de remolacha) y la corriente de azúcar resultante en el crecimiento de Prototheca.

30 La Figura 9 muestra la disminución de los niveles de hidroximetil furfurales (HMF) y furfurales en la biomasa celulósica (bagazo de caña de azúcar, caña de sorgo, Miscanthus y pulpa de remolacha) después de ciclos repetidos de tratamiento hidrotérmico.

La Figura 10 muestra un esquema del proceso de sacarificación de los materiales celulósicos para generar las corrientes de azúcar adecuadas para el uso en la producción heterotrófica de aceite en un fermentador.

35 La Figura 11 muestra la disminución de los niveles de HMF y de los furfurales en bagazo de caña de azúcar explotado después de ciclos repetidos de tratamiento hidrotérmico.

La Figura 12 muestra un esquema de las construcciones de tioesterasa usadas en las transformaciones de Prototheca. Los promotores heterólogos beta-tubulina (determinante NeoR) y glutamato deshidrogenasa se derivan de Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella sorokiniana, respectivamente. La nitrato reductasa 3´UTR se derivó de Chlorella

40 vulgaris. Se indican los sitios de restricción relevantes del clonaje y las flechas indican la dirección en que ocurre la transcripción.

La Figura 13 muestra un cromatograma del diesel renovable producido a partir del aceite de triglicérido de Prototheca.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención surge a partir del descubrimiento de que la Prototheca y ciertos microorganismos relacionados

45 tienen propiedades inesperadamente ventajosas para la producción económica y en grandes cantidades de aceites, combustibles, y otras composiciones de hidrocarburos o lipídicas, así como del descubrimiento de métodos y reactivos para alterar genéticamente estos microorganismos para mejorar estas propiedades. Los aceites producidos por estos microorganismos se pueden usar en el combustible para la transportación, en la industria petroquímica y/o alimentaria y cosmética, entre otras aplicaciones. La transesterificación de los lípidos produce ésteres de ácidos grasos de cadena

50 larga útiles como biodiesel. Otros procesos enzimáticos y químicos pueden modificarse para producir ácidos grasos, aldehídos, alcoholes, alcanos y alquenos. En algunas aplicaciones, se produce diesel renovable, combustible de reactor, u otros compuestos hidrocarburos. Se divulgan también métodos para cultivar microalgas con una productividad

15 invención: Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2da edición, 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Ediciones Walker, 1988); The Glossary of Genetics, 5ta Edición, R. Rieger y otros (editores), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usan en este documento, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos, a menos que se especifique de otra manera.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por una persona experta en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan al experto una definición general de muchos de los términos usados en esta

Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones para conveniencia del lector. La Sección I proporciona las definiciones de los términos usados en la presente. La Sección 2 proporciona una descripción de las condiciones de 5 cultivo útiles en los métodos divulgados. La Sección 3 proporciona una descripción de los materiales y métodos de ingeniería genética. La Sección 4 proporciona una descripción de la ingeniería genética de Prototheca para permitir la utilización de la sacarosa. La Sección 5 proporciona una descripción de la ingeniería genética de Prototheca para modificar la biosíntesis de los lípidos. La Sección 6 describe los métodos para producir combustibles y sustancias químicas. La Sección 7 describe los ejemplos y realizaciones de la invención. La descripción detallada de la invención

elevada y un alto rendimiento lipídico, y/o para la producción más rentable de las composiciones descritas en la imagen5presente.

10 es seguida por los ejemplos que ilustran varios aspectos y realizaciones de la invención.

I. DEFINICIONES

20 “Activo en microalgas” se refiere a un ácido nucleico que es funcional en las microalgas. Por ejemplo, un promotor que se ha usado para manejar un gen de resistencia a los antibióticos para impartir resistencia antibiótica a una microalga transgénica está activo en las microalgas.

“Proteína portadora de acilos” o “ACP”, es una proteína que se une a una cadena acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos como un tiol éster al tiol distal de la porción de 4-fosfopantoteína y comprende un componente

25 del complejo de la ácido graso sintasa.

“Molécula de Acil-CoA” o “acil-CoA”, es una molécula que comprende una porción acilo covalentemente unida a la coenzima A a través de un enlace tiol éster en el tiol distal de la porción de 4-fosfopantoteína de la coenzima A.

“Porcentaje de área”, se refiere al área de picos observados usando los métodos de detección FAME GC/FID, en los que cada ácido graso en la muestra se convierte en un metil éster de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por 30 ejemplo, un pico separado se observa para un ácido graso de 14 átomos del carbono sin insaturaciones (C14:0) comparado con cualquier otro ácido graso, por ejemplo C14:1. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su porcentaje de la composición en la mezcla y se calcula en base a la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir [área bajo el pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100). Con referencia a los perfiles lipídicos de los aceites y las células de la invención y de la divulgación, "al menos 4% de C8

35 C14" significa que al menos el 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición de los glicerolípidos extraídos, tiene una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.

“Axénico”, es un cultivo de un organismo libre de contaminación por otros organismos vivos.

“Biodiesel”, es un éster de alquilo de ácidos grasos producido biológicamente adecuado para su uso como combustible en un motor de diesel.

40 “Biomasa”, es el material producido por el crecimiento y/o propagación de células. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular, así como material extracelular, incluye pero no se limita a, los compuestos secretados por una célula.

“Biorreactor”, es un recinto total o parcial donde se cultivan las células, opcionalmente en suspensión.

"Catalizador" es un agente, tal como una molécula o un complejo macromolecular, capaz de facilitar o promover una

45 reacción química de un reactante a su producto sin convertirse en una parte del producto. Un catalizador aumenta la velocidad de una reacción, después de lo cual, el catalizador puede actuar sobre otro reactante para formar el producto. Un catalizador generalmente disminuye la energía de activación total requerida para la reacción, de modo que esta ocurre más rápidamente o a una temperatura más baja. Así, un equilibrio de la reacción puede lograrse más rápidamente. Los ejemplos de catalizadores incluyen enzimas, que son catalizadores biológicos; calor, que es un

50 catalizador no biológico; y metales usados en los procesos de refinamiento de los aceites fósiles.

“Material celulósico”, es el producto de la digestión de la celulosa, incluyendo glucosa y xilosa, y opcionalmente compuestos adicionales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de material celulósico incluyen bagazo de caña de azúcar, pulpa de azúcar de remolacha, rastrojos de maíz, astillas de madera, aserrín y pasto varilla.

15 condiciones seleccionadas y/o controladas incluyen el uso de un medio definido (con características conocidas como pH, fuerza iónica, y fuente de carbono), y condiciones especificas de temperatura, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono, y crecimiento en un biorreactor. Cultivar no se refiere al microorganismos en la naturaleza o en otra parte sin la intervención humana; por ejemplo, no es un cultivo el crecimiento natural de un organismo que finalmente se convierte en un fósil para producir el petróleo crudo geológico.

“ADN complementario” o “ADNc”, define a una copia de ADN del ARNm, normalmente obtenida por transcripción 10 inversa del ARN mensajero (ARNm) o por amplificación (por ejemplo, vía reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”)). “Cultivado”, y variantes de este como “cultivo” y "fermentado”, se refieren al fomento intencional del crecimiento (incremento del tamaño celular, contenido celular, y/o actividad celular) y/o propagación (incremento en el número de células vía mitosis) de una o varias células mediante el uso combinación de ambos, crecimiento y propagación, puede ser nombrada como

5 facilitan el crecimiento y/o proliferación de una, o un subconjunto de las dos o más células, mientras se mantiene el crecimiento celular para el resto. “Cofactor”, es cualquier molécula, distinta del sustrato, necesaria para que una enzima pueda realizar su actividad enzimática.

“Co-cultivo”, y variantes de este como “co-cultivar” y “co-fermentar”, se refieren a la presencia de dos o más tipos de imagen6

20 “Citólisis”, es la lisis de células en un entorno hipotónico. La citólisis es provocada por la ósmosis excesiva, o por el movimiento del agua, hacia el interior de una célula (hiperhidratación). La célula no puede resistir la presión osmótica del agua en su interior, y explota.

“Comida deslipidada” y “biomasa microbiana deslipidada”, es la biomasa microbiana después que el aceite (incluyendo los lípidos) se extraen o aíslan de ella, ya sea mediante el uso de extracción mecánica (es decir, ejercida por una prensa

25 expulsora) o extracción por solvente, o ambos. La comida deslipidada tiene una cantidad reducida de aceites/lípidos comparado con la biomasa microbiana antes de la extracción o aislamiento de los aceites/lípidos, pero contiene alguna cantidad residual de aceites/lípidos.

“Vector de expresión” o “construcción de expresión” o “plásmido” o “construcción de ADN recombinante”, se refieren a un ácido nucleico generado mediante la intervención humana, incluyendo medios recombinantes o de síntesis química

30 directa, con una serie de ácidos nucleicos específicos que permiten la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico para ser transcrito operativamente unido a un promotor.

“Gen exógeno”, es un ácido nucleico que codifica para la expresión de un ARN y/o proteína que se ha introducido

35 (“transformado”) en una célula. Una célula transformada puede definirse como una célula recombinante, dentro de la cual se puede introducir un gen(es) exógeno(s) adicional(es). El gen exógeno puede ser de una especie diferente (heterólogo), o de la misma especie (homólogo) con respecto a la célula que se transforma. Así, un gen exógeno puede incluir un gen homólogo que ocupa una localización diferente en el genoma de la célula o está bajo un control diferente, con respecto a la copia endógena del gen. Un gen exógeno puede estar presente en más de una copia en la célula. Un

40 gen exógeno puede mantenerse en una célula como una inserción en el genoma o como una molécula episomal.

“Proporcionada exógenamente”, se refiere a una molécula proporcionada al medio de cultivo de un cultivo celular.

“Prensado con expulsor”, es un método mecánico para extraer el aceite de materias primas como la soya y las semillas de colza. Una prensa expulsora es una máquina de tornillo que presiona el material a través de una cavidad enjaulada en forma de barril. La materia prima entra por un lado de la prensa y la torta sale por el otro lado, mientras el aceite se

45 filtra entre las barras de la jaula y se recoge. La máquina usa fricción y presión continua de las unidades de tornillo para mover y comprimir la materia prima. El aceite sale a través de pequeñas aberturas que no permiten que pasen los sólidos. Como la materia prima se prensa, típicamente la fricción provoca calentamiento.

La “acil graso-ACP tioesterasa”, es una enzima que cataliza la escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilos (ACP) durante la síntesis de los lípidos.

50 La “acil graso-CoA/aldehído reductasa”, es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un alcohol primario.

La “acil graso-CoA reductasa”, es una enzima que cataliza la reducción de una molécula de acil-CoA a un aldehído.

La “aldehído graso decarbonilasa”, es una enzima que cataliza la conversión de un aldehído graso a un alcano.

La “aldehído graso reductasa”, es una enzima que cataliza la reducción de un aldehído a un alcohol primario.

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“Fuente fija de carbono”, es una molécula o moléculas que contienen carbono, típicamente una molécula orgánica que está presente a temperatura y presión ambiente en forma sólida o líquida en un medio de cultivo, que se puede utilizar por un microorganismo cultivado allí.

“Homogenato”, es la biomasa que se ha roto físicamente.

“Hidrocarburo”, es una molécula que contiene sólo átomos de hidrógeno y carbono, donde los átomos de carbono están covalentemente unidos para formar una cadena principal lineal, ramificada, cíclica, o parcialmente cíclica a la que se unen los átomos de hidrógeno. La estructura molecular de los compuestos hidrocarburos varía de la más simple, en forma de metano (CH4), que es un constituyente del gas natural, a una muy fuerte y muy compleja, tales como algunas moléculas como los asfaltenos encontrados en el aceite crudo, petróleo, y betún. Los hidrocarburos pueden encontrarse en forma gaseosa, líquida, o sólida, o en cualquier combinación de estas formas, y pueden tener uno o más dobles o triples enlaces entre los átomos del carbono adyacentes a la cadena principal. Por lo tanto, el término incluye alcanos, alquenos, lípidos y parafinas lineales, ramificadas, cíclicas o parcialmente cíclicas. Los ejemplos incluyen propano, butano, pentano, hexano, octano, y escualeno.

“Relación hidrógeno:carbono”, es la relación de átomos de hidrógeno con respecto a los átomos de carbono en una molécula sobre una base de átomo a átomo. La relación puede usarse para referirse al número de átomos de carbono y de hidrógeno en una molécula de hidrocarburo. Por ejemplo, el hidrocarburo con la relación más alta es el metano CH4 (4:1).

“Fracción hidrofóbica”, es la porción, o fracción de un material que es más soluble en una fase hidrófoba comparado con una fase acuosa. Un fragmento hidrófobo es substancialmente insoluble en agua y normalmente es no polar.

“Incremento del rendimiento lipídico", se refiere al aumento en la productividad de un cultivo microbiano, por ejemplo, incrementando el peso seco de células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de células que constituyen los lípidos, o incrementando la cantidad total de lípidos por litro de volumen de cultivo por unidad de tiempo.

El “promotor inducible”, es un promotor que media la transcripción de los genes operativamente unidos en respuesta a un estímulo particular.

“En unión operativa”, es la unión funcional entre dos secuencias de ácidos nucleicos, como una secuencia control (típicamente un promotor) y la secuencia unida (típicamente una secuencia que codifica a una proteína, también llamada secuencia codificante). Un promotor está en una unión operativa con un gen exógeno si puede mediar la transcripción del gen.

“In situ”, significa “en el lugar” o “en su posición original”.

“Concentración limitante de un nutriente”, es la concentración de un compuesto en un cultivo que limita la propagación de un organismo en el cultivo. Una concentración "no limitante de un nutriente" es una concentración que ayuda a la propagación máxima durante un período dado del cultivo. Así, el número de células producidas durante un período dado del cultivo es más bajo en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente es no limitante. Se dice que un nutriente está "en exceso" en un cultivo, cuando el nutriente está presente en una concentración mayor que la necesaria para la propagación máxima.

“Lipasa”, es una enzima soluble en agua que cataliza la hidrólisis de ésteres unidos a sustratos lipídicos insolubles en agua. Las lipasas catalizan la hidrólisis de lípidos en gliceroles y ácidos grasos.

“Enzima modificante de lípidos”, se refiere a una enzima que altera la estructura covalente de un lípido. Los ejemplos de enzimas modificantes de lípidos incluyen una lipasa, una acil graso-ACP tioesterasa, una acil graso-CoA/aldehído reductasa, una acil graso-CoA reductasa, una aldehído graso reductasa, y una aldehído graso decarbonilasa.

“Enzima de la vía de los lípidos”, es cualquier enzima que juega un papel en el metabolismo de los lípidos, es decir, en la síntesis de los lípidos, modificación, o degradación, y cualquier proteína que modifica químicamente los lípidos, así como las proteínas portadoras.

Los “lípidos”, son una clase de moléculas que son solubles en solventes no polares (como el éter y el cloroformo) y son relativa o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípidos tienen estas propiedades porque están constituidas por largas colas de hidrocarburos que son de naturaleza hidrofóbica. Los ejemplos de lípidos incluyen los ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, esterol lípidos incluyendo colesterol y hormonas esteroideas, lípidos de prenol incluyendo terpenoides, alcoholes grasos, ceras, y poliquétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos unidos a azúcares, o glicolípidos, y lípidos unidos a proteínas). Las “grasas” son un subgrupo de lípidos denominados “triacilglicéridos”.

“Lisado”, es una solución que contiene el contenido de células lisadas.

15 que perdieron la capacidad de realizar la fotosíntesis, como ciertas especies de algas dinoflageladas y especies del género Prototheca. “Microorganismo” y “microbio”, son organismos microscópicos unicelulares. “Co-expresados naturalmente”, con referencia a dos proteínas o genes significa que las proteínas o sus genes se coexpresan de forma natural en un tejido u organismo del que se derivan, por ejemplo, debido a que los genes que

“Microalga”, es un organismo microbiano eucariota que contiene un cloroplasto o plastidio, y opcionalmente es capaz de realizar la fotosíntesis, o un organismo microbiano procariota que es capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen los fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono en energía, como lo hacen los heterótrofos, los cuales pueden vivir únicamente a costa de una fuente fija de carbono. Las microalgas incluyen 10 organismos unicelulares que se separan de células hermanas poco tiempo después de la división celular, tales como las Chlamydomonas, así como microbios, tales como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio multicelular fotosintético simple de dos tipos de células diferentes. Las microalgas incluyen células tales como Chlorella, Dunaliella, y Prototheca. Las microalgas también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión célula-célula, tales como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. Las microalgas también incluyen microorganismos heterótrofos obligados

“Lisar”, es la perturbación de la membrana celular y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico o célula 5 suficiente para liberar al menos algún contenido intracelular.

“Lisis”, es la rotura de la membrana plasmática y opcionalmente de la pared celular de un organismo biológico suficiente imagen7comprometen su integridad.

20 codifican a las dos proteínas están bajo el control de una secuencia reguladora común o debido a que se expresan en respuesta al mismo estímulo.

“Choque osmótico”, es la ruptura de las células en una solución después de una reducción repentina de la presión osmótica. El choque osmótico se induce a veces para liberar los componentes celulares de estas células a una solución.

“Enzima de degradación de los polisacáridos”, es cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis o sacarificación, de 25 cualquier polisacárido. Por ejemplo, las celulasas catalizan la hidrólisis de celulosa.

“Polisacáridos” o “glicanos”, son los carbohidratos hechos de monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. La celulosa es un polisacárido que forma parte de ciertas paredes celulares de las plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por enzimas para producir monosacáridos como la glucosa y la xilosa, así como disacáridos más grandes y oligosacáridos.

30 “Promotor”, es una secuencia control de ácidos nucleicos que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente, un promotor incluye necesariamente secuencias de ácidos nucleicos cercanas al sitio de inicio de la transcripción, como, por ejemplo, en el caso del promotor de la polimerasa de tipo II, un elemento TATA. Un promotor también incluye, opcionalmente, potenciadores distales o elementos represores, que se pueden encontrar a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción.

35 “Recombinante”, es una célula, ácido nucleico, proteína o vector, que se modificó debido a la introducción de un ácido nucleico exógeno o la alteración de un ácido nucleico nativo. Así, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en las células nativas (no recombinantes) o expresan genes nativos de manera diferente a como estos genes son expresados por una célula no recombinante. Un “ácido nucleico recombinante” es un ácido nucleico formado originalmente in vitro, en general, por la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, usando

40 polimerasas y endonucleasas, o de otra manera están en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Los ácidos nucleicos recombinantes se pueden producir, por ejemplo, para colocar dos o más ácidos nucleicos en unión operativa. Así, un ácido nucleico aislado o un vector de expresión formado in vitro por la ligadura de moléculas de ADN que normalmente no se unen en la naturaleza, se consideran ambos recombinantes para los propósitos de esta invención. Una vez que se obtiene un ácido nucleico recombinante y se introduce en una célula o en un organismo

45 huésped, este se puede replicar usando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped; sin embargo, estos ácidos nucleicos, una vez producidos por métodos recombinantes, aunque posteriormente se repliquen intracelularmente, siguen considerándose recombinantes para los propósitos de esta invención. Del mismo modo, una “proteína recombinante” es una proteína producida usando técnicas de recombinación, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante.

50 “Diesel renovable”, es una mezcla de alcanos (como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18:0) producidos mediante la hidrogenación y desoxigenación de los lípidos.

“Sacarificación”, es un proceso de conversión de biomasa, por lo general biomasa celulósica o lignocelulósica, en azúcares monoméricos, como glucosa y xilosa. El material celulósico o biomasa “sacarificada” o “despolimerizada” se refiere al material celulósico o a la biomasa que se convirtió en azúcares monoméricos a través de la sacarificación.

55 “Sonicación”, es el proceso de ruptura de materiales biológicos, tales como una célula, mediante el uso de la energía de las ondas de sonido.

15 Especies y cepas de Prototheca La Prototheca es un microorganismo notable para su uso en la producción de lípidos, debido a que puede producir altos niveles de lípidos, particularmente lípidos adecuados para la producción de combustible. Los lípidos producidos por Prototheca tienen cadenas de hidrocarburos de menor longitud y un mayor grado de saturación que los producidos por otras microalgas. Además, los lípidos de Prototheca están generalmente libres de pigmentos (niveles bajos a

10 Prototheca recombinantes, para la producción de lípidos. Por conveniencia para el lector, esta sección se subdivide en subsecciones. La Subsección 1 describe las especies Prototheca y sus cepas, y cómo identificar nuevas especies de Prototheca y sus cepas y microalgas relacionadas por comparación de ADN genómico. La Subsección 2 describe los biorreactores útiles para el cultivo. La Subsección 3 describe los medios de cultivo. La Subsección 4 describe la producción de aceite de acuerdo con los métodos de cultivo ilustrativos de la invención.

La presente invención se relaciona, en general, con el cultivo de cepas de Prototheca, en particular con cepas de

5 la sacarosa como fuente de energía. Las proteínas codificadas por un gen de utilización de la sacarosa se refieren en la presente como "enzimas de utilización de la sacarosa" e incluyen los transportadores de sacarosa, sacarosa invertasas, y hexoquinasas como las glucoquinasas y las fructoquinasas.

“Gen de utilización de la sacarosa”, es un gen que, cuando se expresa, ayuda a la capacidad de una célula para utilizar

“Especies de furfural”, es 2-furancarboxaldehído o un derivado que conserva las mismas características estructurales imagen8básicas.

II. CULTIVO

20 indetectables de clorofila y ciertos carotenoides) y en todo caso contienen mucho menos pigmentos que lípidos de otras microalgas. Además, las células de Prototheca recombinantes proporcionadas por la invención se pueden usar para producir lípidos con mayor rendimiento y eficiencia, y a un costo reducido, en relación con la producción de lípidos a partir de otros microorganismos. Las cepas ilustrativas de Prototheca para su uso en los métodos de la invención incluyen. Además, estas microalgas crecen heterotróficamente y pueden ser modificadas mediante ingeniería genética

25 como Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (incluyendo UTEX 327), Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (incluyendo cepas de UTEX 1441, 1435), y Prototheca zopfii. Las especies del género Prototheca son heterótrofas obligadas.

Las especies de Prototheca usadas en la invención se pueden identificar por amplificación de ciertas regiones diana del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa específica de Prototheca puede lograrse por amplificación 30 y secuenciación de ADN nuclear y/o de cloroplastos usando cebadores y metodología que usa cualquier región del genoma, por ejemplo, usando los métodos descritos en Wu y otros, Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121. Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences. Los métodos bien establecidos para el análisis filogenético, tales como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosomal (ITS1 e ITS2 ADNr), ARNr 23S, ARNr 18S, y otras regiones conservadas del genoma, se pueden usar por aquellos expertos en la materia

35 para identificar especies no solo de Prototheca sino también otros organismos productores de lípidos e hidrocarburos con perfiles lipídicos y capacidad de producción similares. Para ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas ver además, por ejemplo, Genetics, agosto de 2005; 170(4): 1601-10 y RNA, abril de 2005;11(4):361-4.

Así, la comparación de ADN genómico puede usarse para identificar especies adecuadas de microalgas que se usan en la presente invención. Las regiones de ADN genómico conservadas, tales como pero sin limitarse al ADN que codifica 40 para ARNr 23S, se puede amplificar a partir de especies de microalgas y comparar con secuencias consenso para seleccionar especies de microalgas que estén taxonómicamente relacionadas con las microalgas preferidas usadas en la presente invención. Abajo se muestran los ejemplos de la comparación de las secuencias de ADN para especies del género Prototheca. La comparación del ADN genómico también puede ser útil para identificar especies de microalgas que han sido mal identificadas en una colección de cepas. A menudo, una colección de cepas identificará especies de

45 microalgas en base a sus características fenotípicas y morfológicas. El uso de estas características puede conllevar a la categorización incorrecta de las especies o del género de una microalga. El uso de la comparación del ADN genómico puede ser un mejor método de categorización de especies de microalgas basado en su relación filogenética.

Las microalgas para usar en la presente invención tienen, típicamente, secuencias de ADN genómico que codifican para ARNr 23S con al menos 99%, al menos 95%, al menos 90%, o al menos 85% de identidad de nucleótidos con al menos

50 una de las secuencias enumeradas en las sec. con núm. de ident.: 11-19.

Para la comparación de secuencia para determinar el porcentaje de identidad de nucleótidos o de aminoácidos, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, contra la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, si es necesario se designan coordenadas posteriores, y se designan los parámetros del programa del

55 algoritmo de secuencia. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba(s) con relación a la secuencia de referencia, basado en los parámetros de programa designados.

Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, el cual se describe en Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para ejecutar los análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (en el sitio 10 web www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica, en primer lugar, identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, las cuales combinan o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo del parámetro T, cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. El parámetro T se refiere como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y otros, supra). Los aciertos de las palabras vecinas inicales se comportan como semillas para iniciar 15 las búsquedas y encontrar HSP más largos que las contengan. Después, los aciertos de las palabras vecinas se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que se incremente la puntuación de alineamiento acumulativa. Para las secuencias nucleotídicas, las puntuaciones acumulativas se calculan usando los parámetros M (puntuación recompensa para un par de residuos que combinan; siempre > 0) y N (puntuación castigo para residuos que no combinan; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, la puntuación acumulativa se calcula usando una 20 matriz de puntuación. Las extensiones de los aciertos de las palabras en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en una cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquiera de las secuencias. Para identificar si el ácido nucleico o el polipéptido está dentro del alcance de la invención se adecúan los parámetros definidos en los programas BLAST. El 25 programa BLASTN (para las secuencias nucleotídicas) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62. El programa TBLATN (usando secuencias de proteínas para secuencias de nucleótidos) usa como defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM 62 (véase

5 FASTA, y TFASTA del paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase generalmente Ausubel y otros, supra).

La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, imagen9homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

30 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de la secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con que dos secuencias de nucleótidos o de

35 aminoácidos coincidan al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación entre el ácido nucleico del ensayo y uno de referencia es menor de aproximadamente 0.1, con más preferencia si es menor de aproximadamente 0.01 y con mayor preferencia si es menor de aproximadamente 0.001.

Otras consideraciones que afectan la selección de los microorganismos para su uso en la invención incluyen, además 40 de la producción de lípidos o hidrocarburos adecuados para la producción de aceites, los combustibles y oleoquímicos:

(1) alto contenido de lípidos como porcentaje del peso celular; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de manipulación por ingeniería genética; y (4) facilidad de procesamiento de la biomasa. En realizaciones particulares, el microorganismo salvaje o modificado mediante ingeniería genética produce células que contienen al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, o al menos 70% o más de lípidos. Los organismos

45 preferidos crecen heterotróficamente (en azúcar en ausencia de luz).

2. Biorreactor

Los microorganismos se cultivan con dos propósitos, el de realizar manipulaciones genéticas y para la producción de hidrocarburos (por ejemplo, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). El primer tipo de cultivo se realiza a pequeña escala e inicialmente, al menos, bajo condiciones en las que el microorganismo inicial pueda crecer. Los

50 cultivos para la producción de hidrocarburos se realizan usualmente a gran escala (por ejemplo, 10,000 l, 40,000 l, 100,000 l o biorreactores más grandes) en un biorreactor. La Prototheca se cultiva, típicamente, en los métodos de la divulgación en medio líquido en un biorreactor. Típicamente, el biorreactor no permite la entrada de la luz.

El biorreactor o fermentador se usa para cultivar células de microalgas durante las varias fases de su ciclo fisiológico. Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para su uso en métodos de crecimiento y propagación heterotrófica. Para 55 producir biomasa para su uso en alimentos, las microalgas se fermentan preferiblemente en grandes cantidades de líquido, tales como cultivos en suspensión como se muestra en un ejemplo. Los biorreactores tales como los fermentadores de acero pueden alojar volúmenes muy grandes de cultivo (se usan biorreactores de 40,000 litros y más de capacidad en varias realizaciones). Los biorreactores típicamente permiten, además, el control de las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno, y niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores 60 se configuran típicamente, por ejemplo usando puertos unidos a tuberías, para permitir que los componentes gaseosos como el oxígeno o el nitrógeno sean burbujeados a través del líquido de cultivo. Otros parámetros del cultivo, tales como Los puertos de los biorreactores se pueden usar para introducir, o extraer, gases, sólidos, semisólidos y líquidos, de la cámara del biorreactor que contiene las microalgas. Aunque muchos biorreactores tienen más de un puerto (por ejemplo, uno para la entrada del medio y otro para el muestreo), no es necesario que solamente una sustancia entre o 20 salga por el puerto. Por ejemplo, un puerto se puede usar para hacer fluir el medio de cultivo dentro del biorreactor y posteriormente para el muestreo, entrada de gas, salida de gas, u otros propósitos. Preferiblemente, un puerto de muestreo se puede usar repetidamente sin que se altere de forma comprometedora la naturaleza axénica del cultivo. Un puerto de muestreo puede configurarse con una válvula u otro dispositivo que permita detener o iniciar la circulación de la muestra o proporcionar un medio de muestreo continuo. Típicamente, los biorreactores tienen al menos un puerto que

15 entrada de gas y entrada del medio no se mantiene para la reproducción de las microalgas hasta que se haya alcanzado el incremento deseado en número de dichas microalgas.

Los biorreactores equipados con dispositivos tales como aspas de agitación e impulsores, mecanismos de balanceo, barras de agitación, medios para infundir gas presurizado, se pueden usar para mezclar los cultivos de microalgas. La mezcla puede ser continua o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un régimen de flujo turbulento de

10 biorreactor. Así, en algunas realizaciones el medio de cultivo acuoso no fluye a través del biorreactor después de la inoculación.

Los biorreactores se pueden configurar para que el medio de cultivo fluya a través del biorreactor durante todo el período de tiempo en que las microalgas se reproducen e incrementan su número. En algunas realizaciones, por 5 ejemplo, el medio puede ser infundido dentro del biorreactor después de la inoculación, pero antes que las células alcancen la densidad deseada. En otros casos, el biorreactor se llena con el medio de cultivo al inicio de un cultivo, y no se infunde más medio de cultivo después que el cultivo es inoculado. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo en el que las microalgas se reproducen e incrementan su número; sin embargo, durante este período de tiempo las cantidades del medio de cultivo acuoso no fluyen a través del

el pH del medio de cultivo, la identidad y concentración de los oligoelementos, y otros constituyentes del medio, también imagen10se pueden manipular más fácilmente usando un biorreactor.

25 permite la inoculación de un cultivo y dicho puerto puede usarse, además, con otros fines tales como la entrada de medio o gas.

Los puertos de los biorreactores permiten manipular el contenido gaseoso de los cultivos de microalgas. Para ilustrar, parte del volumen de un biorreactor puede ser gas en lugar de líquido, y las entradas de gas del biorreactor permiten el bombeo de gases hacia dentro del biorreactor. Los gases que se pueden bombear beneficiosamente dentro de un

30 biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, tales como argón y otros gases. Los biorreactores están típicamente equipados para permitir que el usuario controle la velocidad de entrada del gas en el biorreactor. Como se denotó anteriormente, al aumentar el flujo de gas dentro del biorreactor aumenta la mezcla del cultivo.

El aumento del flujo gaseoso afecta también la turbidez del cultivo. La turbulencia se puede lograr colocando un puerto de entrada de gas debajo del nivel del medio de cultivo acuoso, de manera tal que el gas que entre al biorreactor

35 burbujee hacia la superficie del cultivo. Uno o mas puertos de salida de gas permiten que el gas escape, impidiendo de este modo que la presión aumente gradualmente en el biorreactor. Preferiblemente, el puerto de salida de gas conduce hacia una válvula “en una sola dirección” que impide que microorganismos contaminantes entren al biorreactor.

3. Medio

El medio de cultivo de microalgas contiene, típicamente, componentes tales como una fuente fija de nitrógeno, una

40 fuente fija de carbono, oligoelementos, opcionalmente un tampón para mantener el pH, y fosfato (típicamente proporcionado como una forma de sal fosfato). Otros componentes pueden incluir sales tales como cloruro de sodio, particularmente para microalgas marinas. Las fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, nitrógeno molecular, nitrato, sales de nitrato, amoniaco (puro o en forma de sal, como (NH4)2SO4 y NH4OH), proteínas, harina de soya, licor de maíz fermentado, y extracto de levadura. Los ejemplos

45 de oligoelementos incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso, y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl2, H3BO3, CoCl2·6H2O, CuCl2·2H2O, MnCl2·4H2O y (NH4)6Mo7O24·4H2O.

De acuerdo con los métodos de la presente divulgación los microorganismos útiles se encuentran en varios lugares y ambientes a través del mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de crecimiento particular para un crecimiento óptimo y generación de constituyentes de lípidos y/o

50 hidrocarburos puede ser difícil de predecir. En algunos casos, ciertas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer en un medio particular de crecimiento debido a la presencia de algún componente inhibitorio o a la ausencia de un requerimiento nutricional esencial necesario por una cepa particular del microorganismo.

Los medios de crecimiento sólidos y líquidos generalmente están disponibles de una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de un medio en particular que sea adecuado para una amplia gama de cepas de

55 microorganismos, pueden encontrarse, por ejemplo, en línea en el sitio web http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para su colección de cultivo de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada incluyen los descritos en la publicación PCT núm. 2008/151149.

15 Adicionalmente, la patente de Estados Unidos núm. 5,900,370 describe formulaciones de medios y condiciones adecuadas para la fermentación heterótrofa de las especies de Prototheca. Para la producción de aceite, es importante la selección de una fuente fija de carbono, ya que como el costo de la fuente fija de carbono debe ser lo suficientemente bajo para que la producción de aceite resulte económica. Así, aunque las fuentes de carbono adecuadas incluyen, por ejemplo, acetato, floridosida, fructosa, galactosa, ácido glucurónico, glucosa, glicerol, lactosa, manosa, N-acetilglucosamina, ramnosa, sacarosa, y/o xilosa, la selección de materias primas que contengan dichos compuestos es un aspecto importante de los métodos divulgados. Las materias primas adecuadas, útiles de acuerdo con los métodos divulgados incluyen, por ejemplo, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado, suero de leche, melaza, papa, sorgo, sacarosa, azúcar de remolacha, caña de azúcar, arroz, y trigo. Las fuentes de carbono pueden proporcionarse además como una mezcla, tal como una mezcla de

5.0 a 5.2 (véase Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). Otros medios adecuados para su uso con los métodos de la invención pueden ser fácilmente identificados consultando la URL identificada anteriormente, o consultando otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP, o CCALA. SAG se refiere a la Colección de Cultivo de Algas en la Universidad de Göttingen (Göttingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivo de algas y protozoos dirigida por la Asociación Escocesa para las Ciencias Marinas (Escocia, Reino Unido), y CCALA se refiere al laboratorio de colección de cultivo de algas en el Instituto de Botánica (Třeboň, República Checa).

En un ejemplo particular, el medio Proteosa es adecuado para cultivos axénicos, y un volumen de 1l del medio (pH~6.8) imagen11de NaNO3, 0.17 mM de CaCl2·2H2O, 0.3 mM de MgSO4·7H2O, 0.43 mM, 1.29 mM de KH25 medio de aislamiento de Prototheca

25 sacarosa y pulpa de azúcar de remolacha despolimerizada. Una o más fuentes de carbono pueden proporcionarse a una concentración de al menos aproximadamente 50 µM, al menos aproximadamente 100 µM, al menos aproximadamente 500 µM, al menos aproximadamente 5 mM, al menos aproximadamente 50 mM, y al menos aproximadamente 500 mM de una o más fuentes fijas de carbono proporcionadas exógenamente. Las fuentes de carbono de particular interés para los propósitos de la presente divulgación incluyen, celulosa (en forma despolimerizada), glicerol, sacarosa, y sorgo, cada uno de estos se discute abajo con más detalle.

De acuerdo con la presente divulgación, los microorganismos se pueden cultivar usando biomasa celulósica despolimerizada como una materia prima. La biomasa celulósica (por ejemplo, rastrojo como rastrojo de maíz) es económica y fácilmente disponible; sin embargo los intentos de usar este material como una materia prima para la levadura han fracasado. En particular, se ha encontrado que estas materias primas tienen un efecto inhibitorio en el

35 crecimiento de la levadura, y la levadura no puede usar los azúcares de 5 carbonos producida a partir de materiales celulósicos (por ejemplo, xilosa a partir de hemicelulosa). En contraste, las microalgas pueden crecer en material celulósico procesado. Los materiales celulósicos incluyen, por lo general, aproximadamente 40-60% de celulosa, aproximadamente 20-40% de hemicelulosa; y 10-30% de lignina.

Los materiales celulósicos adecuados incluyen los residuos de cosechas energéticas herbáceas y leñosas, así como cultivos agrícolas, es decir, partes de plantas, principalmente tallos y hojas no eliminadas de los campos con el alimento principal o el producto de fibra. Los ejemplos incluyen desechos agrícolas tales como el bagazo de caña de azúcar, cascarilla de arroz, fibra de maíz (incluyendo tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja del trigo, paja del arroz, pulpa del azúcar de remolacha, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos, desechos forestales tales como madera y entresacas de madera blanda, madera dura y blanda y desechos de las operaciones de la madera, desechos de madera tales como

45 desechos de las fábricas (astillas de madera, aserrín) y desechos de plantas de celulosa, desechos urbanos, tales como pedazos de papel de desechos sólidos municipales, desechos urbanos de madera y desechos urbanos verdes tales como los recortes de césped municipales y desechos de construcción de madera. Los materiales celulósicos adicionales incluyen cosechas celulósicas dedicadas tales como pasto varilla, madera híbrida de álamo, miscantus, fibras de caña, y fibras de sorgo. Los azúcares de 5 carbonos que se producen a partir de estos materiales incluyen la xilosa.

Los materiales celulósicos se tratan para aumentar la eficiencia con la que el microbio puede utilizar el(los) azúcar(es) contenidos en los materiales. Se divulgan nuevos métodos para el tratamiento de materiales celulósicos después de la explosión con ácidos para que los materiales sean adecuados para usar en un cultivo heterótrofo de microbios (por ejemplo, microalgas y levaduras oleaginosas). Como se discutió anteriormente, la biomasa lignocelulósica está compuesta por varias fracciones, incluyendo celulosa, un polímero cristalino de enlaces beta 1,4-glucosídicos (un

55 azúcar de 6 carbonos), hemicelulosa, un polímero más estrechamente asociado compuesto predominantemente de xilosa (un azúcar de 5 carbonos), y en menor cantidad manosa, galactosa, arabinosa, lignina, un polímero aromático complejo formado por alcohol sinapílico y sus derivados, y pectinas, las cuales son cadenas lineales de un ácido alfa poligalacturónico 1,4 enlazado. Debido a la estructura polimérica de la celulosa y la hemicelulosa, los azúcares (por ejemplo, glucosa y xilosa monomérica) en ellos no se encuentran en una forma tal que se puedan usar (metabolizar) de manera eficiente por muchos microbios. Para estos microbios, el procesamiento posterior de la biomasa celulósica para generar los azúcares monoméricos que componen los polímeros, puede ser de gran ayuda para asegurar que los materiales celulósicos se usen de manera eficiente como materia prima (fuente de carbono).

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La biomasa celulósica o de celulosa se somete a un proceso, denominado “explosión”, en el cual la biomasa se trata con ácido sulfúrico (u otro) diluido a presión y temperatura elevadas. Este proceso condiciona la biomasa de manera que se pueda someter de manera eficiente a la hidrólisis enzimática de las fracciones celulósicas y hemicelulósicas en monómeros de glucosa y xilosa. Los azúcares monoméricos que se obtienen se denominan azúcares celulósicos. Los azúcares celulósicos pueden usarse posteriormente por los microorganismos para producir varios metabolitos (por ejemplo, lípidos). La etapa de explosión con ácido da como resultado la hidrólisis parcial de la fracción de hemicelulosa para obtener monosacáridos. Estos azúcares se liberan completamente de la biomasa mediante un tratamiento posterior. En algunas realizaciones, este tratamiento consiste en un tratamiento hidrotérmico que incluye el lavado del material explotado con agua caliente, lo cual elimina contaminantes tales como las sales. Esta etapa no es necesaria para las fermentaciones celulósicas de etanol debido a que en esos procesos se usan concentraciones de azúcares más diluidas. En otras realizaciones, el tratamiento posterior es un tratamiento adicional con ácido. En aún otras realizaciones, el tratamiento posterior es la hidrólisis enzimática del material explotado. Estos tratamientos se pueden usar además en cualquier combinación. El tipo de tratamiento puede afectar el tipo de azúcar liberado (por ejemplo, azúcares de cinco carbonos versus azúcares de seis carbonos) y la etapa en la cual se liberan en el proceso. Como consecuencia, se pueden crear diferentes corrientes de azúcares, que pueden ser, de manera predominante, de cinco o de seis átomos de carbono. Estas corrientes enriquecidas de cinco o seis átomos de carbono, se pueden dirigir después a los microorganismos específicos con diferentes capacidades de utilización del carbono.

Los métodos de la presente divulgación típicamente implican la fermentación a densidades celulares más altas que las que se logran con la fermentación etanólica. Debido a las densidades más altas de los cultivos para la producción de aceites celulósicos heterótrofos, la fuente fija de carbono (por ejemplo, la(s) corriente(s) de azúcar de derivados celulósicos) está, preferiblemente, en forma concentrada. El nivel de glucosa del material celulósico despolimerizado es, preferiblemente, de al menos 300 g/litro, al menos 400 g/litro, al menos 500 g/litro o al menos 600 g/litro antes de la etapa de cultivo, el cual es opcionalmente un cultivo tipo lote alimentado, en el que las células se alimentan con el material a lo largo del tiempo mientras crecen y acumulan lípidos. En la producción de etanol celulósico, las corrientes de azucares celulósicos no se usan a estos intervalos de concentración ni cerca de estos. Así, para generar y mantener las altas densidades de la célula durante la producción del aceite lignocelulósico, la(s) materia(s) prima(s) de carbono se deben suministrar a los cultivos heterótrofos en forma muy concentrada. Sin embargo, cualquier componente en la corriente de alimentación que no sea sustrato y que no se metabolice por el microorganismo oleaginoso se acumulará en el biorreactor, lo que conduce a problemas si el componente es tóxico o tiene actividad inhibitoria sobre la producción del producto final deseado. Aunque la lignina, y los subproductos derivados de la lignina, subproductos derivados de carbohidratos, tales como, furfurales e hidroximetilfurfurales y las sales derivadas de la generación de los materiales celulósicos (durante el proceso de explosión y el proceso de neutralización posterior), e incluso los azúcares no metabolizados pentosa/hexosa, pueden presentar problemas en las fermentaciones etanólicas, estos efectos se amplifican significativamente en los procesos en los cuales su concentración en la materia prima inicial es alta. Para lograr concentraciones de azúcar en el intervalo de 300g/l (o superior) para los azúcares de seis carbonos que se pueden usar en producciones a gran escala de los aceites lignocelulósicos descritos en la presente, la concentración de estos materiales tóxicos puede ser 20 veces mayor que la concentración típicamente presente en las fermentaciones etanólicas de la biomasa celulósica.

El tratamiento con el proceso de explosión del material celulósico utiliza cantidades significativas de ácido sulfúrico, calor y presión, liberando de esta forma subproductos de carbohidratos, específicamente furfurales e hidroximetilfurfurales. Los furfurales e hidroximetilfurfurales se producen durante la hidrólisis de la hemicelulosa mediante la deshidratación de la xilosa en furfural y agua. En algunas realizaciones divulgadas, estos subproductos (por ejemplo, furfurales e hidroximetilfurfurales) se eliminan del material lignocelulósico sacarificado antes de la introducción en el biorreactor. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el proceso de eliminación de los subproductos de carbohidratos se realiza mediante tratamiento hidrotérmico de los materiales celulósicos explotados. Además, se divulgan métodos en los cuales las cepas capaces de tolerar compuestos tales como los furfurales o hidroximetilfurfurales se usan para la producción de aceites lignocelulósicos. En otra realización, la presente invención también proporciona métodos y microorganismos que no solo son capaces de tolerar los furfurales en el medio de fermentación, sino que son realmente capaces de metabolizar estos subproductos durante la producción del aceite lignocelulósico.

El proceso de explosión también genera niveles significativos de sales. Por ejemplo, las condiciones típicas de la explosión pueden dar como resultado conductividades superiores a los 5 mS/cm cuando la biomasa celulósica explotada se resuspende en una relación de 10:1 agua:sólidos (peso seco). En ciertas realizaciones de la presente divulgación, la biomasa explotada diluida se somete a sacarificación enzimática, y el sobrenadante obtenido se concentra hasta 25 veces para su uso en el biorreactor. El nivel de sal (medido por conductividad) en la(s) corriente(s) de azúcar concentrada, puede ser inaceptablemente alto (hasta 1.5 M Na+ equivalentes). Las sales adicionales se generan también con la neutralización de los materiales explotados para el proceso de sacarificación enzimática posterior. Se divulgan métodos para eliminar estas sales de manera que la(s) corriente(s) de azúcar celulósica concentrada resultante se pueda usar en los procesos heterótrofos para producir aceite lignocelulósico. En algunas realizaciones, el método de eliminación de estas sales es la desionización con resinas, tales como, pero sin limitarse a, DOWEX Marathon MR3. En ciertas realizaciones, la etapa de desionización con resina ocurre antes de la concentración del azúcar o el ajuste del pH y el tratamiento hidrotérmico de la biomasa antes de la sacarificación, o cualquier combinación del procedimiento; en otras realizaciones la etapa es llevada a cabo después de uno o más de estos

15 sacarificación enzimática de la biomasa celulósica lavada. En una realización preferida se usa Accellerase (Genencor). La etapa III comprende la recuperación de los azúcares mediante centrifugación o decantación y enjuague de la biomasa sacarificada. La biomasa resultante (sólidos) es un componente denso energético, rico en lignina que puede usarse como combustible o eliminar como desecho. La corriente de azúcar recuperada durante el proceso de centrifugación/decantado y enjuague se recoge. La etapa IV comprende la microfiltración

10 incluyen el uso de resinas de desalado y de intercambio iónico, ósmosis inversa, tratamiento hidrotérmico (como el descrito anteriormente), o simplemente por resuspensión repetida en agua desionizada y centrifugación. Esta etapa de lavado resulta en una corriente celulósica cuya conductividad se encuentra entre 100-300 μS/cm y la eliminación de cantidades significativas de furfurales e hidroximetilfurfurales. Lo decantado de esta etapa de lavado se puede guardar para concentrar los azúcares de cinco carbonos liberados de la fracción de hemicelulosa. La etapa II comprende la

Una realización preferida para el proceso de preparación de la biomasa celulósica explotada para producción de aceite lignocelulósico heterótrofo usando microbios oleaginosos se representa en la Figura 10. La etapa I comprende ajustar el pH de la biomasa celulósica explotada resuspendida en un intervalo de 5.0-5.3, seguido del lavado de la biomasa celulósica tres veces. Esta etapa de lavado se puede realizar usando una variedad de medios que

procesos. En otras realizaciones, el proceso de explosión en sí se cambia para evitar la generación de sales a niveles imagen125

20 contaminantes sólidos y recuperar el permeado. La etapa V comprende una etapa de concentración que se puede realizar usando un evaporador a vacío. Esta etapa puede incluir, opcionalmente, la adición de agentes antiespumantes tales como el P’2000 (Sigma/Fluka), el cual se necesita algunas veces debido al contenido proteico de la materia prima de azúcar resultante.

La fuente de carbono puede ser, como alternativa, glicerol, incluyendo los subproductos de glicerol acidulado y no

25 acidulado obtenidos de la transesterificación del biodiesel. En una realización, la fuente de carbono incluye el glicerol y al menos una de las otras fuentes de carbono. En algunos casos, todo el glicerol y al menos una de las otras fuentes fijas de carbono se suministran al microorganismo al comienzo de la fermentación. En algunos casos, el glicerol y al menos una de las otras fuentes fijas de carbono se suministran al microorganismo simultáneamente en una proporción predeterminada. En algunos casos, el glicerol y al menos una de las otras fuentes fijas de carbono se alimentan a los

30 microbios a una velocidad predeterminada durante el curso de la fermentación.

Algunas microalgas se someten a división celular de manera más rápida en presencia de glicerol que en presencia de glucosa (véase la publicación PCT núm. 2008/151149). En estos casos, los procesos de crecimiento en dos etapas en los que las células se alimentan primeramente con glicerol para aumentar rápidamente la densidad celular, y después se alimentan con glucosa para acumular lípidos, pueden mejorar la eficiencia con la que se producen los lípidos. El uso

35 del subproducto de glicerol del proceso de transesterificación proporciona ventajas económicas significativas al ponerlo nuevamente en el proceso de producción. También se proporcionan otros métodos de alimentación tales como mezclas de glicerol y glucosa. La alimentación de tales mezclas proporciona, además, los mismos beneficios económicos. Además, se proporcionan métodos para alimentar las microalgas con azúcares alternativos, tales como la sacarosa en varias combinaciones con glicerol.

40 En otra realización de la divulgación de la invención, la fuente de carbono es sacarosa, incluyendo una materia prima compleja que contiene sacarosa, tal como el jugo espeso de la caña del procesamiento de la caña de azúcar. En una realización, el medio de cultivo incluye, además, al menos una enzima de utilización de la sacarosa. En algunos casos, el medio de cultivo incluye una sacarosa invertasa. En una realización, la enzima sacarosa invertasa es una enzima sacarosa invertasa secretable codificada por un gen de sacarosa invertasa exógeno expresado por la población de

45 microorganismos. De esta manera, en algunos casos, como se describe más detalladamente en la Sección IV, abajo, las microalgas se modifican por ingeniería genética para que expresen una enzima de utilización de la sacarosa, tal como, un transportador de sacarosa, una sacarosa invertasa, una hexoquinasa, una glucoquinasa, o una fructoquinasa.

Las materias primas complejas que contienen sacarosa incluyen a los desechos de melaza del procesamiento de la caña de azúcar; el uso de estos productos de desecho del procesamiento de la caña de azúcar de bajo valor pueden

50 proporcionar ahorros significativos de los costos de producción de hidrocarburos y otros aceites. El sorgo es otra materia prima compleja que contiene sacarosa que es útil en los métodos divulgados, incluyendo sirope de sorgo y sorgo puro. El sirope de sorgo se produce a partir del jugo de la caña dulce de sorgo. Su perfil de azúcares se compone fundamentalmente de glucosa (dextrosa), fructosa y sacarosa.

4. Producción de aceite

55 Para la producción de aceite de acuerdo con los métodos de la divulgación, es preferible cultivar las células en la oscuridad, como es el caso, por ejemplo, cuando se usan fermentadores extremadamente grandes (40.000 litros y más) que no permiten que la luz afecte al cultivo. Las especies de Prototheca crecen y se propagan, para la producción de aceite en un medio que contiene una fuente fija de carbono y en ausencia de luz; ese cultivo se conoce como cultivo heterótrofo.

15 período de latencia, la velocidad de crecimiento aumenta constantemente y entra en la fase log o exponencial. La fase exponencial, a su vez, es seguida por una desaceleración del crecimiento debido a la disminución de nutrientes y/o el aumento de sustancias tóxicas. Después de esta desaceleración, el crecimiento se detiene, y las células entran en una fase estacionaria o estado constante, dependiendo del ambiente particular proporcionado a las células. La producción de lípidos por las células divulgada en la presente puede ocurrir durante la fase exponencial

10 presentes en exceso. Los parámetros de las condiciones de cultivo pueden manipularse para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lípidos producidos y/o la producción de un aceite específico. Como se mencionó anteriormente, un biorreactor o fermentador se usa para permitir que las células se sometan a las diversas fases de su ciclo de crecimiento. Como ejemplo, se puede introducir un inóculo de las células productoras de lípidos en un medio, seguido por un período de latencia (fase lag) antes que las células comiencen a crecer. Tras el

Como ejemplo, un inóculo de las células de microalgas productoras de lípidos se introduce en el medio; hay un período imagen135

20 incluyendo la fase estacionaria en donde los nutrientes se suministran, o todavía están disponibles, para permitir la continuación de la producción de lípidos en ausencia de división celular.

Preferiblemente, los microorganismos que crecen usando las condiciones descritas en la presente y que se conocen en la materia, comprenden al menos aproximadamente 20% en peso de lípidos, preferiblemente al menos aproximadamente 40% en peso, con mayor preferencia al menos aproximadamente 50% en peso, y con la máxima 25 preferencia al menos aproximadamente 60% en peso. Las condiciones del proceso se pueden ajustar para aumentar el rendimiento de los lípidos adecuados para un uso particular y/o para reducir los costos de producción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una microalga se cultiva en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, como por ejemplo, nitrógeno, fósforo o azufre, mientras que se proporciona un exceso de energía fija de carbono como la glucosa. La limitación del nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento de lípidos microbianos, por encima del 30 rendimiento de lípidos microbianos en un cultivo en el que el nitrógeno se suministra en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento de los lípidos es al menos aproximadamente: 10%, 50%, 100%, 200% o 500%. El microbio puede cultivarse en presencia de una cantidad limitante de un nutriente por una parte del período total de cultivo o por todo el período. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se mueve entre una concentración limitante y una concentración no limitante, al menos dos veces durante el período total de cultivo. El

35 contenido de lípidos de las células se puede aumentar al continuar el cultivo por períodos de tiempo mayores, mientras que se proporcione un exceso de carbono, limitando o no el nitrógeno.

En otra realización, el rendimiento de lípidos aumenta al cultivar un microbio productor de lípidos (por ejemplo, microalgas) en presencia de uno o más cofactor(es) para una enzima de la vía de los lípidos (por ejemplo, una enzima para la síntesis de ácidos grasos). En general, la concentración del(de los) cofactor(es) es suficiente para aumentar el 40 rendimiento de lípidos microbianos (por ejemplo, ácidos grasos) por encima del rendimiento de lípidos microbianos en ausencia del (de los) cofactor(es). En una realización particular, el(los) cofactor(es) se proporcionan al cultivo mediante la inclusión de un microbio en el cultivo (por ejemplo, microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica para el(los) cofactor(es). Como alternativa, el(los) cofactor(es) se pueden proporcionar a un cultivo mediante la inclusión de un microbio (por ejemplo, microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica para una proteína que participa en la

45 síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la vía de los lípidos, tales como, por ejemplo: biotina, pantotenato. Los genes que codifican para los cofactores adecuados para su uso en la divulgación o que participan en la síntesis de tales cofactores son bien conocidos y se pueden introducir en los microbios (por ejemplo, microalgas), usando construcciones y técnicas como las descritas anteriormente.

50 Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo, y métodos de crecimiento y propagación heterótrofa descritos en la presente, se pueden combinar de manera adecuada para mejorar la eficiencia del crecimiento microbiano y la producción de lípidos y/o proteínas.

La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceites/lípidos por peso seco se ha generado usando diferentes métodos de cultivo, los que se conocen en la materia (véase la publicación PCT núm. 2008/151149). 55 La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en la presente y útiles de conformidad con la presente divulgación, comprende al menos 10% de aceite de microalgas por peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas comprende al menos 25%, al menos 50%, al menos 55%, o al menos 60% de aceite de microalgas por peso seco. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas contiene de 10-90% de aceite de microalgas, de 25-75% de aceite de microalgas, de 40-75% de aceite de microalgas, o de 50-70% de aceite de

60 microalgas por peso seco.

15 cártamo, arroz, árbol del tung, cacao, copra, amapola del opio, semillas de ricino, nuez, jojoba, macadamia, nueces del Brasil, aguacate, petróleo, o una fracción destilada de cualquiera de los aceites anteriores. La composición del aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los ácidos grasos que constituyen los glicerolípidos, también se puede manipular mediante la combinación de la biomasa o el aceite de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunas realizaciones, al menos dos de las especies de microalgas distintas tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. Las distintas especies de microalgas se pueden cultivar juntas o por separado, como se describe en la presente, de preferencia bajo condiciones heterótrofas, para generar los aceites respectivos. Las diferentes especies de microalgas pueden contener distintos porcentajes de los distintos ácidos grasos que constituyen los glicerolípidos de la célula.

5 características de la longitud y la saturación de las moléculas de ácidos grasos (y los aceites de microalgas) pueden manipularse para modificar las propiedades o proporciones de las moléculas de ácidos grasos en los aceites de microalgas divulgados, a través de las condiciones de cultivo o por vía de la ingeniería genética de los lípidos, como se describe con más detalle a continuación en la Sección IV. Por lo tanto, se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas de una sola especie de algas, por mezcla de la biomasa o aceite de algas a partir de dos o más especies de microalgas, o por una mezcla de aceite de algas divulgada con aceites de otras fuentes tales como soya, colza, canola, palma, almendra de palma, coco, maíz, residuos vegetales, algodón, grasa de pollo, sebo de vacuno, sebo porcino, microalgas, macroalgas, microbios, cufea, lino, cacahuate, grasa blanca selecta, manteca de cerdo, Camelina sativa, semillas de mostaza, nuez de anacardo, avena, lupino, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza (lino), avellana, euforbia, semillas de calabaza, cilantro, camelia, ajonjolí,

El aceite de microalgas de la biomasa descrita en la presente, o extraída de la biomasa para su uso en los métodos y imagen14composiciones divulgados, puede comprender glicerolípidos con una o esterificados distintos. Los glicerolípidos comprenden una

Generalmente, las cepas de Prototheca tienen muy poco o no tienen ácidos grasos con longitud de cadena C8-C14. Por

25 ejemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435), Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438) no contienen (o contienen cantidades indetectables) de ácidos grasos C8, entre 0-0.01% de ácidos grasos C10, entre 0.03-2.1% de ácidos grasos C12 y entre 1.0-1.7% de ácidos grasos C14.

En algunos casos, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica para una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hacia los sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena C8-10, que tienen al menos 0.3%, al menos 0.8%, al menos 1.5% o más ácidos grasos de longitud de cadena C8 y al menos 0.3%, al menos 1.0%, al menos 3.0%, al menos 5% o más ácidos grasos de longitud de cadena C10. En otros casos, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica para una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad sobre sustratos acil-ACP adiposos de longitud de cadena C12, que tiene al menos 3.0%, al menos 5%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 13% o más ácidos grasos de longitud de cadena C12 y al menos 1.5%, al menos 2%, o al menos 3% o más ácidos grasos de

35 longitud de cadena C14. En otros casos, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica para una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hacia los sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena C14, que tiene al menos 4.0%, al menos 7%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25% o más ácidos grasos de longitud de cadena C14, y al menos 0.4%, al menos 1%, al menos 1.5%, o más ácidos grasos de longitud de cadena C12.

En los ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hacia los sustratos acil graso ACP de longitud de cadena C8 y C10, que tienen entre 0.31.58% de ácidos grasos de longitud de cadena C8 y entre 0.35-6.76% de ácidos grasos de longitud de cadena C10. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hacia el sustrato acil graso-ACP de longitud de cadena C12, que tiene entre 3.9-14.11% de ácidos

45 grasos de longitud de cadena C12 y entre 1.95-3.05% de ácidos grasos de longitud de la cadena C14. En otros ejemplos no limitantes, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica una acil graso-ACP tioesterasa que tiene actividad hacia los sustratos acil graso ACP de longitud de cadena C14, que tiene entre 4.40-17.35% de ácidos grasos de longitud de cadena C14 y entre 0.4-1.83% de ácidos grasos de longitud de cadena C12. En algunos casos, las cepas de Prototheca contienen un transgen que codifica una acil graso-ACP tioestera que tiene actividad hacia los sustratos acil graso-ACP de longitud de cadena entre C8 y C14 que tienen entre 3.5-20% de ácidos grasos de cadena media (C8-C14). En algunos casos, mantener las cepas de Prototheca transgénicas bajo presión selectiva constante y elevada para conservar los genes exógenos, es ventajoso para aumentar los ácidos grasos deseados de una longitud de cadena específica. En un ejemplo no limitante, el Ejemplo 5 demuestra un incremento del doble de los ácidos grasos de longitud de cadena C14 (más de 30% de ácidos grasos de longitud de cadena C8-C14) cuando se reserva el cultivo

55 de Prototheca moriformis que contiene un gen exógeno de tioesterasa de preferencia C14. Los altos niveles de retención del gen exógeno también se pueden lograr mediante la inserción de genes exógenos en los cromosomas nucleares de las células usando la recombinación homóloga de vectores y los métodos divulgados en la presente. Se divulgan las células recombinantes que contienen genes exógenos integrados a los cromosomas nucleares.

El aceite de microalgas también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas, o incorporados en el aceite de microalgas a partir del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en mayor o menor cantidad dependiendo de las condiciones del cultivo usado para cultivar las microalgas, las especies de microalgas, el método de extracción usado para recuperar el aceite de microalgas a partir de la biomasa y otros factores que pueden

15 huésped recombinantes útiles en la divulgación de la presente invención, que incluyen pero sin limitarse a, células huésped de Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani, y Prototheca stagnora recombinantes. La descripción de estos métodos y los materiales se divide en subsecciones para la conveniencia del lector. En la subsección 1, se describen los métodos de transformación. En la subsección 2, se describen métodos de ingeniería genética por medio del uso de la recombinación homóloga. En la subsección 3, se describen vectores de expresión y los

La presente invención divulga métodos y materiales para modificar genéticamente células de Prototheca y células

10 totales. En algunos casos el aceite de Prototheca comprende entre 0.40-0.60 miligramos de gamma-tocoferol por cada 100 gramos de aceite. En otros casos, el aceite de Prototheca comprende entre 0.2-0.5 miligramos de tocotrienoles totales por gramo de aceite.

5 Los otros constituyentes pueden incluir, sin limitación, fosfolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (por ejemplo, alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno, etc), xantófilas (por ejemplo, criptoxantina), y varios compuestos orgánicos o inorgánicos. En algunos casos, el aceite extraído de las especies de Prototheca comprende no más de 0.02 mg/Kg de clorofila. En algunos casos, el aceite extraído de las especies de Prototheca comprende no más de 0.4 mcg/ml de carotenoides

afectar la composición del aceite de microalgas. Los ejemplos no limitantes de dichos constituyentes incluyen los imagen15miligramos/gramo de aceite.

iii. MÉTODOS Y MATERIALES DE INGENIERÍA GENÉTICA

20 componentes.

1. Métodos de Ingeniería – Transformación

Las células se pueden transformar por cualquier técnica adecuada que incluyen, por ejemplo, electroporación, biolística, (ver Maruyama y otros (2004), Biotechnology Techniques 8:821-826), transformación por perlas de vidrio y transformación por filamentos finos de carburo de silicio. Otro método que se puede usar comprende la formación de

25 protoplastos y el uso de CaCl2 y polietilenglicol (PEG) para introducir ADN recombinante en células de microalgas (ver Kim y otros (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73, que reporta el uso de este método para la transformación de Chorella ellipsoidea). La cotransformación de microalgas se puede usar para introducir dos moléculas diferentes de vectores en una célula simultáneamente (ver, por ejemplo Protist 2004 dic;155(4):381-93).

Para la transformación de una célula de Prototheca se pueden usar, además, métodos biolísticos (ver, por ejemplo,

30 Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, patente de Estados Unidos núm. 4,945,050); electroporación (Fromm y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828); el uso de un rayo láser, la microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en una microalga.

2. Métodos de Ingeniería -Recombinación Homóloga

La recombinación homóloga es la capacidad de las secuencias de ADN complementarias para alinearse e intercambiar

35 las regiones de homología. El ADN transgénico ("donante") que contiene secuencias homólogas a las secuencias genómicas diana ("patrón") se introduce en el organismo y luego tiene lugar la recombinación dentro del genoma en el sitio de la secuencia genómica homóloga correspondiente. Las etapas mecanísticas de este proceso, en la mayoría de los casos, incluyen: (1) aparear los segmentos de ADN homólogos, (2) la introducción de roturas de doble cadena en la molécula de ADN de los donantes, (3) la invasión de la molécula de DNA patrón por los extremos libres del ADN del

40 donante seguida de la síntesis de ADN; y (4) la resolución de los eventos de reparación de las rupturas de la doble cadena que resultan en los productos finales de la recombinación.

La habilidad para llevar a cabo la recombinación homóloga en un organismo huésped tiene muchas implicaciones prácticas, por lo que se puede llevar a cabo a nivel genético molecular y es útil en la generación de un microbio oleaginoso que puede producir aceites específicos. Por su propia naturaleza la recombinación homóloga es un evento 45 preciso dirigido a los genes, por lo tanto, la mayoría de las líneas transgénicas que se generan con la misma secuencia de orientación serán esencialmente idénticas en términos de fenotipo, por lo que requieren la evaluación de muchos menos eventos de transformación. La recombinación homóloga también apunta a eventos de inserción de genes en el cromosoma del huésped, lo que resulta en una estabilidad genética excelente, incluso en ausencia de selección genética. Debido a que diferentes locus cromosómicos pudieran impactar en la expresión génica, incluso de promotores

50 heterólogos/UTR, la recombinación homóloga puede ser un método para buscar un locus en un ambiente genómico no familiar y evaluar el impacto de estos ambientes en la expresión génica.

Una aplicación particularmente útil de ingeniería genética que usa la recombinación homóloga es cooptar elementos reguladores específicos del huésped tales como promotores/UTR para dirigir la expresión de genes heterólogos en una forma altamente específica. Por ejemplo, se podría esperar que la ablación precisa de los genes de la estearoil ACP

55 desaturasa endógena con un casete de genes para la FATB (tioesterasa) heteróloga específica para C12:0 y un marcador selectivo adecuado, disminuya drásticamente los niveles endógenos de los ácidos grasos C18:1 concomitante con aumento de los niveles de los ácidos grasos C12:0. El Ejemplo 13 describe la construcción de orientación para la recombinación homóloga que es adecuada para la ablación de un gen endógeno de la estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis.

15 huésped, ya sea como un plásmido de ADN superenrollado con un esqueleto de vector adicional, un producto de PCR sin esqueleto de vector, o como una molécula lineal. En algunos casos, puede ser ventajoso exponer primero las secuencias homólogas dentro del ADN transgénico (ADN donante) con una enzima de restricción. Esta etapa puede incrementar la eficiencia de la recombinación y disminuir la ocurrencia de eventos no deseados. Otros métodos para incrementar la eficiencia de recombinación incluyen el uso de PCR para generar ADN transgénico transformado que contiene extremos lineales homólogos a las secuencias genómicas objetivo.

La recombinación homóloga se puede lograr por medio del uso de construcciones de orientación que contienen pedazos de secuencias endógenas para "orientar" el gen o región de interés en el genoma endógeno de la célula huésped. Tales secuencias de orientación pueden situarse ya sea 5' del gen o región de interés, 3' del gen/región de interés o incluso flanquean el gen/región de interés. Tales construcciones de orientación se pueden transformar dentro de la célula

5 regiones codificantes de proteínas en un esfuerzo por modificar las actividades de enzimas como la especificidad por el sustrato, las afinidades y la Km, y por lo tanto afectar el cambio que se desea en el metabolismo de la célula huésped. La recombinación homóloga proporciona un medio poderoso para manipular el genoma del huésped, lo que da como resultado la mutagénesis dirigida, la conversión de genes, la eliminación de genes, la duplicación de genes, la inversión de genes y el intercambio de elementos de regulación de la expresión génica tales como promotores, potenciadores y 3'UTR.

Debido a que la recombinación homóloga es un evento preciso dirigido a los genes, se puede usar para modificar con imagen16regiones flancos. reguladoras que afectan la expresión de genes de ARN y/o proteínas.

3. Vectores y componentes de vectores

Los vectores para la transformación de microorganismos, de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante técnicas familiares conocidas por los expertos en la materia en vista de la divulgación de la presente. Un vector contiene, típicamente, uno o más genes en el que cada gen codifica para la expresión de un producto deseado

25 (el producto del gen) y se une operativamente a una o más secuencias de control que regulan la expresión de genes o dirigen el producto del gen a una localización particular en la célula recombinante. Para ayudar al lector, esta subsección se divide en subsecciones. La Subsección A describe las secuencias de control que se encuentran, típicamente, en los vectores, así como nuevas secuencias de control que se proporcionan en la presente invención. La Subsección B describe genes que se encuentran, típicamente, en los vectores, así como nuevos métodos de optimización del codón y genes que se preparan por medio del uso de los mismos proporcionados por la invención.

A. Secuencias de control

Las secuencias de control son ácidos nucleicos que regulan la expresión de una secuencia codificante o dirigen un producto del gen a una localización particular dentro o fuera de la célula. Las secuencias de control que regulan la expresión incluyen, por ejemplo, los promotores que regulan la transcripción de una secuencia codificante y

35 terminadores que terminan la transcripción de una secuencia codificante. Otra secuencia de control es una secuencia 3' no traducida que se localiza al final de una secuencia codificante que codifica una señal de poliadenilación. Las secuencias de control que dirigen los productos de genes a una localización particular incluyen las que codifican péptidos señal, los cuales dirigen la proteína a la que están unidos a una localización particular dentro o fuera de la célula.

Por lo tanto, un diseño de vector ejemplar para la expresión de un gen exógeno en una microalga contiene una secuencia que codifica para un producto del gen deseado (por ejemplo, un marcador de selección, una enzima que modifica la vía de los lípidos, o una enzima de utilización de la sacarosa) en una unión operativa con un promotor activo en microalgas. Como alternativa, si el vector no contiene un promotor en unión operativa con la secuencia codificante de interés, la secuencia codificante se puede transformar dentro de las células de tal manera que se convierte en

45 operativamente unida a un promotor endógeno en el punto de la integración del vector. Se demostró que el método de transformación sin promotor funciona en microalgas (ver por ejemplo Plant Journal 14:4, (1998), p.441-447).

Muchos promotores están activos en microalgas, incluyendo los promotores que son endógenos a las algas que se transforman, así como promotores que no son endógenos a las algas que se transforman (es decir, promotores de otras algas, promotores de plantas superiores, y los promotores de virus de plantas o virus de algas). Los promotores exógenos o endógenos ilustrativos que son activos en microalgas (así como los genes de resistencia a antibióticos funcionales en microalgas) se describen en la publicación PCT núm. 2008/151149 y las referencias citadas allí).

El promotor que se usa para expresar un gen exógeno puede ser el promotor que se une naturalmente a ese gen o puede ser un gen heterólogo. Algunos promotores están activos en más de una especie de microalgas. Otros promotores son específicos de especie. Los promotores ilustrativos incluyen promotores tales como β-tubulina de 55 Chlamydomonas reinhardtii, que se usa en los Ejemplos a continuación y promotores virales, tales como el virus del mosaico de la coliflor (CMV) y virus de la Chlorella, los cuales mostraron ser activos en múltiples especies de microalgas (ver, por ejemplo Plant Cell Rep. 2005 marzo; 23(10-11):727-35; Microbiol J 2005 agosto;43 (4):361-5; Mar Biotechnol (NY) 2002 enero;4(1):63-73). Otro promotor que es adecuado para usar para la expresión de genes exógenos en Prototheca es el promotor/5'UTR de la glutamato deshidrogenasa de la Chlorella sorokiniana (sec. con núm. de ident.: 69). Opcionalmente, se usan al menos 10, 20, 30, 40, 50, o 60 nucleótidos o más de estas secuencias que contienen un promotor. Los promotores ilustrativos útiles para la expresión de genes exógenos en Prototheca se enumeran en el

15 esencialmente inactivo o regular ascendentemente, preferiblemente de forma substancial, la transcripción de un gen unido operativamente que se transcribe a un nivel bajo. La inclusión de la secuencia de control de la región de terminación es opcional, y si se emplea, entonces la elección será principalmente la de conveniencia, ya que la región de terminación es relativamente intercambiable. La región de terminación puede ser nativa a la región de iniciación de la transcripción (el promotor), puede ser nativa de la secuencia

Un promotor se puede caracterizar, generalmente, como constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos son generalmente activos o funcionan para guiar la expresión en todo momento (o en ciertos momentos del ciclo de vida de la célula) en el mismo nivel. Los promotores inducibles, por el contrario, se activan (o se vuelven inactivos) o se regulan 10 significativamente ascendente o descendentemente solamente en respuesta a un estímulo. Ambos tipos de promotores encuentran aplicación en los métodos divulgados. Los promotores inducibles útiles en la invención incluyen aquellos que median la transcripción de un gen unido operativamente en respuesta a un estímulo, tal como una molécula pequeña suministrada exógenamente (por ejemplo, glucosa, como en la sec. con núm. de ident.: 1), temperatura (calor o frío), la falta de nitrógeno en los medios de cultivo, etc. Los promotores adecuados pueden activar la transcripción de un gen

5 ejemplo, in Biochem Biophys Res Commun. 1994 octubre 14;204(1):187-94; Plant Mol Biol. 1994 octubre;26(1):85-93; Virology. 2004 agosto 15;326(1):150-9; y Virology. 2004 enero 5;318(1):214-23.

listado de secuencias de esta solicitud, tal como el promotor del gen HUP1 de la Chlorella (sec. con núm. de ident.: 1) y imagen17el promotor de la nitrato reductasa Chlorella ellipsoidea Chlorella también se pueden usar para expresar genes en Protothecapatente de Estados Unidos 6,395,965. Los promotores adicionales activos en Prototheca

20 de ADN de interés, o se puede obtener de otra fuente. Ver, por ejemplo, Chen y Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.

La presente divulgación también proporciona secuencias de control y genes recombinantes y vectores que las contienen lo que proporciona la expresión compartimentalizada de un gen de interés. Los organelos para la orientación son los cloroplastos, los plastidios, las mitocondrias y el retículo endoplásmico. Además, la presente divulgación proporciona

25 secuencias de control y los genes recombinantes y vectores que las contienen lo que proporciona la secreción de una proteína fuera de la célula.

Las proteínas que se expresan en el genoma nuclear de Prototheca se pueden dirigir a los plastidios mediante señales dirigidas al plastidio. Las secuencias dirigidas a los plastidios endógenas para Chlorella se conocen, tales como genes en el genoma nuclear de Chlorella que codifican proteínas que se dirigen a los plastidios; ver, por ejemplo los números

30 de acceso AY646197 y AF499684 en GenBank, y en una realización, tales secuencias de control se usan en los vectores divugados en la presente para dirigir la expresión de una proteína a un plastidio de Prototheca.

Los ejemplos a continuación describen el uso de secuencias dirigidas a los plastidios de algas para dirigir las proteínas heterólogas al compartimiento correcto en la célula huésped. Las bibliotecas de ADNc se realizaron por medio del uso de células de Prototheca moriformis y Chlorella protothecodies y se describen en los Ejemplos 12 y Ejemplo 11 debajo. 35 Las secuencias se evaluaron por BLAST y se analizaron por homología con proteínas conocidas que transitan a plastidio/cloroplasto. Los ADNc que codifican estas proteínas se clonaron y las secuencias dirigidas a los plastidios se aislaron de estos ADNc. Las secuencias de aminoácidos de las secuencias dirigidas a los plastidios de algas se identificaron a partir de las bibliotecas de ADNc y las secuencias de aminoácidos de la acil graso ACP tiosterasa de planta que se usan en los ejemplos de expresión heteróloga debajo se enumeran en la sec. con núm. de ident.: 127

40 133.

En otra realización de la presente divulgación, la expresión de un polipéptido en Prototheca se dirige al retículo endoplásmico. La inclusión de una señal de retención o clasificación apropiada en un vector de expresión garantiza que las proteínas se retengan en el retículo endoplasmático (RE) y no vayan hacia abajo adentro de Golgi. Por ejemplo, el vector IMPACTVECTOR1.3, de Wageningen UR-Plant Research International, incluye la señal KDEL de retención o

45 clasificación bien conocida. Con este vector, la retención en el RE tiene una ventaja práctica ya que se reportó que mejora los niveles de expresión 5 veces o más. La razón principal de esto parece ser que el RE contiene concentraciones más bajas y/o proteasas diferentes responsables de la degradación post-traduccional de proteínas que se expresan que las presentes en el citoplasma. Se conocen las señales de retención del RE funcionales en microalgas verdes. Por ejemplo, ver Proc Natl Acad Sci USA. 26 de abril de 2005, 102(17):6225-30.

50 En otra realización de la presente divulgación, un polipéptido se dirige para su secreción fuera de la célula en los medios de cultivo. Ver Hawkins y otros, Current Microbiology Vol. 38 (1999), p. 335-341 para los ejemplos de señales de secreción activa en Chlorella que se pueden usar, de acuerdo con los métodos de la invención, en Prototheca.

B. Optimización de genes y codón

Por lo general, un gen incluye un promotor, la secuencia codificante, y las secuencias de control de la terminación.

55 Cuando se ensambla por tecnología de ADN recombinante, un gen puede denominarse un casete de expresión y se puede flanquear por sitios de restricción para la inserción adecuada dentro de un vector que se usa para introducir el gen recombinante dentro de una célula huésped. El casete de expresión se puede flanquear por secuencias de ADN del genoma u otros ácidos nucleicos diana para facilitar la integración estable del casete de expresión en el genoma por recombinación homóloga. Como alternativa, el vector y su casete de expresión pueden permanecer sin integrarse, en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

cuyo caso, el vector incluye, típicamente, un origen de replicación que es capaz de proporcionar la replicación del ADN del vector heterólogo.

Un gen común presente en un vector es un gen que codifica para una proteína, cuya expresión permite a la célula recombinante que contiene la proteína diferenciarse de las células que no expresan la proteína. Tal gen y su producto génico correspondiente, se llama un marcador de selección. Cualquiera de una gran variedad de marcadores de selección se puede emplear en una construcción transgénica útil para transformar Prototheca. Los ejemplos de marcadores de selección adecuados incluyen el gen de resistencia G418, el gen de la nitrato reductasa (ver Dawson y otros (1997), Current Microbiology 35:356-362.), el gen de la higromicina fosfotransferasa (HPT; ver Kim y otros (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73), el gen de la neomicina fosfotransferasa y el gen ble, que confiere resistencia a la fleomicina (Huang y otros. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197-205). Los métodos para determinar la sensibilidad de las microalgas a los antibióticos son bien conocidos. Por ejemplo, Mol Gen Genet. 16 de octubre de 1996; 252(5):572-9.

Para los propósitos de la presente invención, el vector de expresión que se usa para preparar una célula huésped recombinante de la invención incluirá al menos dos, y a menudo tres, genes, si uno de los genes es un marcador de selección. Por ejemplo, una Prototheca genéticamente modificada de la invención se puede hacer por la transformación con vectores de la invención que comprenden, además de un marcador de selección, un gen exógeno, que codifica una sacarosa invertasa y opcionalmente un gen de la acil ACP tioesterasa. Uno o ambos genes se pueden expresar por medio del uso de un promotor inducible, el cual permite controlar el tiempo de expresión relativo de estos genes para mejorar el rendimiento de los lípidos y la conversión a ésteres de ácidos grasos. La expresión de los dos o más genes exógenos puede estar bajo el control del mismo promotor inducible o bajo el control de diferentes promotores inducibles (o constitutivos). En la última situación, la expresión de un primer gen exógeno se puede inducir por un primer período de tiempo (durante el cual la expresión de un segundo gen exógeno puede o no inducirse) y la expresión de un segundo gen exógeno se puede inducir por un segundo período de tiempo (durante el cual la expresión del primer gen exógeno puede o no inducirse).

También se divulga una modalidad en la que los dos o más genes exógenos (además de cualquier marcador de selección) son: una acil graso ACP tiosterasa y una acil graso-CoA/aldehído reductasa, cuyas acciones combinadas rinden un producto del alcohol. Además se proporcionan otras combinaciones de genes exógenos, que incluyen, sin limitación, una acil graso ACP tiosterasa y una acil graso-CoA reductasa para generar aldehídos. En una realización, el vector proporciona la combinación de una acil graso ACP tiosterasa, una acil graso-CoA reductasa y una aldehído graso decarbonilasa para generar alcanos. En cada una de estas realizaciones, uno o más de los genes exógenos se pueden expresar por medio del uso de un promotor inducible.

Otros vectores ilustrativos que expresan dos o más genes exógenos incluyen aquellos que codifican tanto un transportador de sacarosa y una enzima sacarosa invertasa y aquellos que codifican un marcador de selección y una sacarosa invertasa secretada. La Prototheca recombinante transformada con cualquier tipo de vector produce lípidos a un costo de fabricación más bajo debido a la capacidad generada por ingeniería de usar la caña de azúcar (y azúcares derivados del azúcar de caña) como fuente de carbono. La inserción de los dos genes exógenos que se describieron anteriormente se puede combinar con la interrupción de la biosíntesis de polisacáridos a través de mutagénesis dirigida y/o al azar, la cual dirige el flujo cada vez mayor de carbono a la producción de lípidos. Individualmente y en combinación, la conversión trófica, las modificaciones para alterar la producción de lípidos y el tratamiento con enzimas exógenos alteran la composición lipídica producida por un microorganismo. La alteración puede ser un cambio en la cantidad de lípidos producidos, la cantidad de una o más especies de hidrocarburos producidos en relación con otros lípidos, y/o los tipos de especies de lípidos que se producen en el microorganismo. Por ejemplo, las microalgas se pueden modificar para producir una mayor cantidad y/o porcentaje de TAG.

Para la expresión óptima de una proteína recombinante, es beneficioso emplear secuencias de codificación que producen ARNm con codones que se usan preferentemente por la célula huésped que se va a transformar. Así, la expresión adecuada de los transgenes puede requerir que el uso del codón del transgén coincida con el codón específico con sesgo en el organismo en el que se expresa el transgén. Los mecanismos exactos subyacentes a este efecto son muchos, pero incluyen el equilibrio adecuado de los almacenes de ARNt aminoacilados disponibles con las proteínas que se sintetizan en la célula, acoplado a una traducción más eficiente de los transgénicos de ARN mensajero (ARNm) cuando se satisface esta necesidad. Cuando el uso de codones en el transgén no es optimizado, los almacenes de ARNt disponibles no son suficientes para permitir la traducción eficiente del ARNm heterólogo lo que resulta en el estancamiento y la terminación ribosomal y la posible inestabilidad del ARNm transgénico.

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos con codones optimizados útiles para la expresión exitosa de proteínas recombinantes en Prototheca. El uso de codones en la especie Prototheca se analizó mediante el estudio de secuencias de ADNc que se aislaron de Prototheca moriformis. Este análisis representa el interrogatorio de más de 24, 000 codones y dio como resultado la Tabla 1 debajo.

Tabla 1. Uso preferido del codón en cepas de Prototheca.

Ala

GCG 345 (0.36) Asn AAT 8 (0.04)

GCA

66 (0.07) AAC 201 (0.96)

GCT

101 (0.11)

TCA 31 (0.06) His CAT 42 (0.21) TCT 55 (0.10) CAC 154 (0.79) TCC 173 (0.31)

Gly GGG 92 (0.12) GGA 56 (0.07) Ser AGT 16 (0.03) GGT 76 (0.10) AGC 123 (0.22) GGC 559 (0.71) TCG 152 (0.28)

Glu GAG 377 (0.96) Arg AGG 33 (0.06) GAA 14 (0.04) AGA 14 (0.02) CGG 102 (0.18) Phe TTT 89 (0.29) CGA 49 (0.08) TTC 216 (0.71) CGT 51 (0.09) CGC 331 (0.57)

Asp GAT 43 (0.12) Gln CAG 226 (0.82) GAC 316 (0.88) CAA 48 (0.18)

GCC 442 (0.46) Pro CCG 161 (0.29) imagen18CCA Cys TGT 12 (0.10) CCT TGC 105 (0.90) CCC

Ile ATA 4 (0.01) Thr ACG 184 (0.38) ATT 30 (0.08) ACA 24 (0.05) ATC 338 (0.91) ACT 21 (0.05)

ACC 249 (0.52) Lys AAG 284 (0.98) AAA 7 (0.02) Val GTG 308 (0.50) GTA 9 (0.01)

Leu TTG 26 (0.04) GTT 35 (0.06) TTA 3 (0.00) GTC 262 (0.43) CTG 447 (0.61) CTA 20 (0.03) Trp TGG 107 (1.00) CTT 45 (0.06) CTC 190 (0.26) Tyr TAT 10 (0.05)

TAC 180 (0.95) Met ATG 191 (1.00) Terminación TGA/TAG/TAA

En otras realizaciones, se optimizaron los codones en el gen en el vector recombinante con referencia a una cepa de microalgas que no sea una cepa Prototheca. Por ejemplo, los métodos de registro para la expresión de genes en las microalgas se describen en la patente de Estados Unidos 7,135,290. Información adicional para la optimización del

5 codón está disponible, por ejemplo, en la base de datos de uso de codones de GenBank.

Mientras los métodos y materiales de la invención permiten la introducción de cualquier gen exógeno en Prototheca, los genes relacionados con el uso de la sacarosa y la modificación de la vía de lípidos son de particular interés, como se discute en las secciones siguientes.

IV. UTILIZACIÓN DE LA SACAROSA

10 En la realización, la célula de Prototheca recombinante de la invención contiene, además, uno o varios genes exógenos para la utilización de la sacarosa. En varias realizaciones, el o más genes codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en una fructocinasa, una glucocinasa, una hexocinasa, una sacarosa invertasa, un transportador de sacarosa. Por ejemplo, la expresión de un transportador de sacarosa y una sacarosa invertasa permite a la Prototheca transportar la sacarosa al interior de la célula desde el medio de cultivo e hidroliza la sacarosa para producir

15 glucosa y fructosa. Opcionalmente, una fructocinasa se puede expresar también en los casos donde la actividad de la hexocinasa endógena es insuficiente para la fosforilación máxima de fructosa. Los ejemplos de los transportadores de sacarosa adecuados son los números de acceso en Genbank CAD91334, CAB92307 y CAA53390. Los ejemplos de fructocinasas adecuadas son los números de acceso en Genbank P26984, P26420 y CAA43322.

En una realización, la presente invención proporciona una célula huésped de Prototheca que secreta una sacarosa

20 invertasa. La secreción de una sacarosa invertasa evita la necesidad de la expresión de un transportador que pueda transportar la sacarosa hacia el interior de la célula. Esto se debe a que la invertasa secretada cataliza la conversión de una molécula de sacarosa en una molécula de glucosa y una molécula de fructosa, las cuales se pueden transportar y usar por los microbios proporcionados por la invención. Por ejemplo, la expresión de una sacarosa invertasa (tales como sec. con núm. de ident: 3) con una señal de secreción (tal como sec. con núm. de ident: 4 (de levadura), sec. con núm.

25 de ident: 5 (de plantas superiores), sec. con núm. de ident: 6 (señal consenso de secreción de eucariotas), y sec. con

La expresión exitosa de una sacarosa invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto de la presente invención, ya que demuestra que las proteínas heterólogas (recombinantes) se pueden expresar en la célula de alga y transitar con éxito fuera de la célula y en el medio de cultivo en una forma completamente activa y funcional. Por lo tanto, la presente 20 invención proporciona métodos y reactivos para expresar una amplia y diversa gama de proteínas heterólogas en microalgas y secretarlas fuera de la célula huésped. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas industriales, tales como, por ejemplo, lipasas, proteasas, celulasas, pectinasas, amilasas, esterasas, oxidorreductasas, transferasas, lactasas, isomerasas e invertasas, así como proteínas terapéuticas tales como, por ejemplo, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos de talla completa que comprenden dos cadenas ligeras y dos pesadas, Fab, scFv (fragmento

15 métodos para la selección de las células huésped recombinantes por medio del uso de una invertasa como un marcador de selección poderoso para la genética molecular de algas.

10 invención proporciona células Prototheca recombinantes con codón optimizado para el gen de la invertasa, incluye pero no se limita al gen de la invertasa de levadura, integrado en su genoma de forma tal que el gen de la invertasa se expresa según se evaluó por la actividad de la invertasa y la hidrólisis de la sacarosa. La presente invención también proporciona genes de la invertasa útiles como marcadores de selección en las células Prototheca recombinantes, ya que estas células son capaces de crecer en sacarosa, mientras que sus contrapartes no transformadas no pueden, y

5 Las especies de Prototheca que expresan una invertasa en un medio que contiene sacarosa son una especie preferida de microalgas para la producción de aceite. El Ejemplo 3 ilustra cómo los métodos y reactivos divulgados se pueden usar para expresar una invertasa recombinante de levadura y secretarla desde una célula Prototheca recombinante. La expresión y direccionalidad extracelular de esta proteína completamente activa permite resultantes crecer en sacarosa, mientras que sus contrapartes no transformadas no pueden. Por lo tanto, la presente

núm. de ident: 7 (combinación de secuencia señales de plantas superiores y el consenso de eucariota) genera la imagen19de energía, usar la sacarosa como fuente de energía extracelular.

25 variable de simple cadena), anticuerpos tipo-camello, fragmentos de anticuerpos, fusiones de fragmentos de anticuerpos, fusiones de anticuerpo-receptor, insulina, interferones, y los factores de crecimiento tipo insulina.

La expresión exitosa de una sacarosa invertasa en Prototheca también ilustra otro aspecto de la presente invención, ya que proporciona métodos y reactivos para el uso de péptidos de tránsito de hongos en las algas para dirigir la secreción de proteínas en Prototheca; y métodos y reactivos para determinar si un péptido puede funcionar, y su capacidad de 30 funcionar, como un péptido de tránsito en células de Prototheca. Los métodos y reactivos de la invención se pueden usar como una herramienta y plataforma para identificar otros péptidos para transportar con éxito proteínas al exterior de una célula, y que la invertasa de levadura tiene gran utilidad en estos métodos. Como se demuestra en este ejemplo, la eliminación del péptido de tránsito de invertasa endógeno de levadura y su sustitución por otros péptidos de tránsito, ya sean endógenos a las algas huésped o de otras fuentes (eucariotas, procariotas y virus), puede identificar si

35 cualquier péptido de interés puede funcionar como un péptido de tránsito para guiar a las proteínas en su salida de la célula.

Los ejemplos de sacarosa invertasas adecuadas incluyen los identificados por los números de acceso en Genbank CAB95010, NP_012104 y CAA06839. Los ejemplos no limitantes de invertasas adecuadas se enumeran a continuación en la Tabla 2. Las secuencias de aminoácidos para cada invertasa de la lista se incluyen en el listado de secuencias a

40 continuación. En algunos casos, el gen de utilización de la sacarosa exógena adecuado para su uso en los métodos y los vectores de la invención codifica una sacarosa invertasa que tiene al menos 40, 50, 60, 75, o 90% o más identidad de aminoácidos con una sacarosa invertasa que se selecciona de la Tabla 2.

Tabla 2. Sacarosa invertasa.

Descripción

Organismo Núm. acceso en Genbank sec. con núm. de ident.:

Invertasa

Chicorium intybus Y11124 sec. con núm. de ident.:20

Invertasa

Schizosaccharomyces pombe AB011433 sec. con núm. de ident.:21

beta-fructofuranosidasa (invertasa)

Pichia anomala X80640 sec. con núm. de ident.:22

Invertasa

Debaryomyces occidentalis X17604 sec. con núm. de ident.:23

Invertasa

Oryza sativa AF019113 sec. con núm. de ident.:24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Invertasa

cepa Allium AJ006067 sec. con núm. de ident.:25

Invertasa

Beta vulgaris subsp. Vulgaris AJ278531 sec. con núm. de ident.:26

beta-fructofuranosidasa (invertasa)

Bifidobacterium breve UCC2003 AAT28190 sec. con núm. de ident.:27

Invertasa

Saccharomyces cerevisiae NP_012104 sec. con núm. de ident.:8 (nucleótido)

sec. con núm. de ident.:28 (aminoácido)

Invertasa A

Zymomonas mobilis AAO38865 sec. con núm. de ident.:29

La secreción de una invertasa al medio de cultivo por Prototheca permite a las células crecer también en melazas residuales del procesamiento de la caña de azúcar como lo hacen en glucosa pura de grado-reactivo; el uso de este producto de desecho de poco valor del procesamiento de la caña de azúcar puede proporcionar importantes ahorros en los costos en la producción de lípidos y otros aceites. Por lo tanto, la presente invención proporciona un cultivo microbiano que contiene una población de microorganismos Prototheca, y un medio de cultivo que comprende (i) sacarosa y (ii) una enzima sacarosa invertasa. En varias realizaciones la sacarosa en el cultivo viene de sorgo, remolacha azucarera, caña de azúcar, melaza, o material celulósico despolimerizado (que opcionalmente puede contener lignina). En otro aspecto, los métodos y reactivos divulgados en la presente aumentan significativamente el número y tipos de materias primas que puede usar la Prototheca recombinante. Mientras que los microbios que se ejemplifican aquí se alteran de tal forma que pueden usar la sacarosa, los métodos y reactivos relevantes se pueden aplicar de manera que las materias primas, tales como las celulósicas son utilizables por un microbio huésped modificado con capacidad para secretar celulasas, pectinasas, isomerasas, o similares, de tal manera que los productos de degradación de las reacciones enzimáticas ya no son simplemente tolerados, sino más bien se usan como fuente de carbono por el huésped.

V. INGENIERÍA DE LA VÍA DE LOS LÍPIDOS

Además de alterar la capacidad de Prototheca de usar materias primas como las materias primas que contienen sacarosa, la presente divulgación también proporciona Prototheca recombinante que se modificó para alterar las propiedades y/o proporciones de los lípidos producidos. La vía puede además, o como alternativa, modificarse para alterar las propiedades y/o proporciones de varias moléculas de lípidos que se producen a través del procesamiento enzimático de los lípidos y los intermedios en las vías del ácido graso. En varias realizaciones, las células de Prototheca recombinante tienen, en comparación con sus contrapartes no transformadas, un rendimiento de lípidos optimizado por unidad de volumen y/o por unidad de tiempo, la longitud de la cadena de carbono (por ejemplo, para la producción de diesel renovable o para aplicaciones de la industria química que requieren materias primas lipídicas), número reducido de dobles o triples enlaces, opcionalmente a cero, y un aumento de la relación hidrógeno:carbono de una especie particular de lípidos o de una población de lípidos distintos.

En realizaciones particulares, una o más enzimas clave que controlan puntos de ramificación en el metabolismo de la síntesis de ácidos grasos se regularon ascendente o descendentemente para mejorar la producción de lípidos. La regulación ascendente se puede lograr, por ejemplo, mediante la transformación de células con construcciones de expresión en las que un gen que codifica la enzima de interés se expresa, por ejemplo, por medio del uso de un promotor fuerte y/o elementos potenciadores que aumentan la transcripción. Tales construcciones pueden incluir un marcador de selección de manera que los transformantes pueden ser objeto de selección, la cual puede resultar en una amplificación de la construcción y un aumento en el nivel de expresión de la enzima codificada. Los ejemplos de enzimas adecuadas para la regulación ascendente de acuerdo con los métodos incluyen la piruvato deshidrogenasa, que desempeña un papel en la conversión del piruvato a acetil-CoA (ejemplos, algunas de microalgas, incluyen números de acceso en Genbank NP_415392; AAA53047; Q1XDM1; y CAF05587). La regulación ascendente de la piruvato deshidrogenasa puede aumentar la producción de acetil-CoA, y de ese modo aumentar la síntesis de ácidos grasos. La acetil-CoA carboxilasa cataliza la etapa inicial en la síntesis de ácidos grasos. En consecuencia, esta enzima se puede regular ascendentemente para aumentar la producción de ácidos grasos (ejemplos, algunas de microalgas, incluyen números de acceso de Genbank BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP_536879; NP_045833 y BAA57908). La producción de ácidos grasos también se puede incrementar por regulación ascendente de la proteína portadora de acilo (ACP), la cual transporta las cadenas de acilo en crecimiento durante la síntesis de ácidos grasos (ejemplo, algunas de microalgas, incluyen números de acceso en Genbank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433). La glicerol-3-fosfato acil transferasa cataliza el paso limitante de la velocidad de la síntesis de ácidos grasos. La regulación ascendente de esta enzima puede aumentar la producción de ácidos grasos (por ejemplo, algunas de microalgas, incluyen números de acceso en Genbank AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857 y ABO94442).

15 cuenta si ellas se coexpresan naturalmente o no en un tejido u organismo particular. Por lo tanto, la presente divulgación contempla tanto pares de estas enzimas que se coexpresan naturalmente como aquellas que comparten una afinidad para interactuar una con la otra para facilitar la escisión de una cadena de carbono de longitud específica a partir de ACP.

10 decarboxilasa (ver la Tabla 6), aldehídos grasos reductasas y escualeno sintasas (ver el número de acceso en Genbank AF205791). En algunas realizaciones, los genes que codifican la acil graso ACP tioesterasa y una proteína portadora de acilo que se coexpresa naturalmente se transforman dentro de una célula Prototheca, opcionalmente con uno o más genes que codifican otras enzimas para la modificación de lípidos. En otras realizaciones, la ACP y la acil graso ACP tioesterasa pueden tener una afinidad una por la otra que da una ventaja cuando las dos se usan juntas, sin tomar en

5 producción de lípidos. Los ejemplos incluyen las proteínas de unión a elementos reguladores del esterol, (SREBP), tales como SREBP-1a y SREBP-1c (para ejemplos ver los números de acceso en Genbank NP_035610 y Q9WTN3). Se divulgan también células de Prototheca recombinantes que se modificaron para contener uno o más genes exógenos que codifican enzimas para la modificación de lípidos tales como, por ejemplo, acil graso-ACP tioesterasas (ver la Tabla 3), acil graso-CoA/aldehído reductasas (ver la Tabla 4), acil graso-CoA reductasas (ver la Tabla 5), aldehídos grasos

La regulación ascendente o descendente de los genes se puede aplicar a los reguladores globales que controlan la imagen20de la síntesis de ácidos grasos se regula positiva o

En aún otras realizaciones de la divulgación, un gen exógeno que codifica una desaturasa se transforma dentro de una

20 célula de Prototheca en conjunto con uno o más genes que codifican otras enzimas de modificación de lípidos para proporcionar modificaciones con respecto a la saturación de lípidos. La estearoil ACP desaturasa (ver, por ejemplo, números de acceso al GenBank AAF15308; ABM45911; y AAY86086), por ejemplo, cataliza la conversión de estearoil ACP a oleoil ACP. La regulación ascendente de este gen puede aumentar la proporción de ácidos grasos monoinsaturados producida por una célula, mientras que la regulación descendente puede reducir la proporción de

25 monoinsaturados. Del mismo modo, la expresión de una o más desaturasas de glicerolípidos se puede controlar para alterar la relación de ácidos grasos insaturados a saturados tales como ácido graso ω-6 desaturasa, ácidos grasos ω-3 desaturasa, o ω-6-oleato desaturasa. En algunas realizaciones, la desaturasa se puede seleccionar con referencia a una longitud de cadena de carbón deseada, de manera que la desaturasa es capaz de hacer modificaciones en ubicaciones específicas dentro de un sustrato de longitud de carbonos especificado, o sustratos que tienen una longitud

30 de carbonos dentro de un rango especificado.

Así, en realizaciones particulares de la divulgación, los microbios que se divulgan son manipulados genéticamente para expresar uno o más genes exógenos seleccionados de una acil-ACP tioesterasa, una acil-CoA/aldehído reductasa, una acil graso-CoA reductasa, una aldehído graso reductasa, una aldehído graso decarbonilasa, o una proteína portadora de acilo naturalmente coexpresada. Los métodos de expresión adecuados se describen anteriormente en relación con la 35 expresión de un gen de la lipasa, incluyendo, entre otros métodos, la expresión inducible y la expresión compartimentada. Una acil graso ACP tioesterasa escinde un ácido graso de una proteína portadora de acilo (ACP) durante la síntesis de lípidos. Mediante procesamiento enzimático adicional, el ácido graso escindido se combina entonces con una coenzima para producir una molécula de acil-CoA. Este acil-CoA es el sustrato para la actividad enzimática de la acil graso-CoA reductasa para producir un aldehído, así como para una acil graso-CoA/aldehído

40 reductasa para producir un alcohol. El aldehído que se produce por la acción de la acil graso-CoA reductasa identificada arriba es el sustrato para la actividad enzimática adicional ya sea por una aldehído graso reductasa para producir un alcohol, o una aldehído graso decarbonilasa para producir un alcano o alqueno.

En algunas realizaciones, los ácidos grasos, glicerolípidos, o alcoholes primarios correspondientes, aldehídos, alcanos o alquenos, que se generan por los métodos que se describen en la presente, contienen 8, 10, 12 o 14 átomos de 45 carbono. Los ácidos grasos preferidos para la producción de diesel, biodiesel, diesel renovable, o combustible de reactor, o los correspondientes alcoholes primarios, aldehídos, alcanos y alquenos, para aplicaciones industriales contienen de 8 a 14 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, los ácidos grasos anteriores, así como las otras moléculas de hidrocarburo correspondientes, están saturados (sin ningún doble o triple enlace carbono-carbono), mono insaturados (un solo doble enlace); poli insaturado (dos o más dobles enlaces); es lineal (no cíclico) o ramificado. Para

50 la producción de combustible, se prefiere una mayor saturación.

Las enzimas que se describen directamente arriba tienen una especificidad preferencial para la hidrólisis de un sustrato que contiene un número específico de átomos de carbono. Por ejemplo, una acil graso-ACP tioesterasa puede tener preferencia por la escisión de un ácido graso que tiene 12 átomos de carbono de ACP. En algunas realizaciones, la ACP y la tioesterasa de longitud específica pueden tener una afinidad una por la otra que las hace especialmente útiles 55 en una combinación (por ejemplo, los genes exógenos de la ACPy la tioesterasa se pueden coexpresar naturalmente en un determinado tejido u organismo del cual se derivan). Por lo tanto, en varias realizaciones, las células de Prototheca recombinantes divulgadas pueden contener un gen exógeno que codifica una proteína con especificidad para catalizar una actividad enzimática (por ejemplo, la escisión de un ácido graso de una ACP, la reducción de un acil-CoA a un aldehído o un alcohol, o la conversión de un aldehído a un alcano) con respecto al número de átomos de carbono 60 contenidos en el sustrato. La especificidad enzimática puede, en varias realizaciones, ser por un substrato que tiene de 8 a 34 átomos de carbono, preferentemente de 8 a 18 átomos de carbono, y con mayor preferencia de 8 a 14 átomos de

15 con núm. de ident.: 63, la secuencia de aminoácidos sin STP está en la sec. con núm. de ident.: 139, y la secuencia de ADNc con el codón optimizado que se basa en la Tabla 1 se encuentra en la sec. con núm. de ident.: 64), que tiene una preferencia por un sustrato acil graso ACP con longitud de la cadena de carbono de 12. Otras acil graso-ACP tioesterasas adecuadas para usar con los microbios y métodos de la divulgación incluyen, sin limitarse a, las enumeradas en la Tabla 3.

En ejemplos no limitantes sino ilustrativos, la presente divulgación proporciona vectores y células Prototheca huésped que expresan una tioesterasa exógena y en consecuencia producen lípidos enriquecidos, en relación con el perfil 5 lipídico de las células Prototheca no transformadas, en la longitud de la cadena para la cual es específica la tioesterasa. Las tioesterasas ilustradas son (i) Cinnamomum camphorum FatB1 (núm. de acceso al GenBank Q39473, la secuencia de aminoácidos está en la sec. con núm. de ident.: 59, la secuencia de aminoácidos sin secuencia dirigida a plastidios (STP) está en la sec. con núm. de ident.: 139, y la secuencia de ADNc con el codón optimizado que se basa en la Tabla 1 está en la sec. con núm. de ident.: 60), la cual tiene una preferencia por el sustrato acil graso ACP, con una longitud 10 de cadena de carbono de 14, (ii) Cuphea hookeriana FatB2 (núm. de acceso al GenBank AAC49269, la secuencia de aminoácidos está en sec. con núm. de ident.: 61, la secuencia de aminoácidos sin STP está en la sec. con núm. de ident.: 138, y la secuencia de ADNc con el codón optimizado que se basa en la Tabla 1 se encuentra en la sec. con núm. de ident.: 62), que tiene una preferencia por un sustrato acil graso ACP con longitud de la cadena de carbono de 8-10, y (iii) Umbellularia Fat B1 (núm. de acceso al GenBank Q41635, la secuencia de aminoácidos se incluye en la sec.

carbono. Una especificidad preferida es por un substrato que tiene menos, es decir, 12, en lugar de más, es decir, 18 imagen21átomos de carbono.

20 Tabla 3. Acil graso-ACP tioesterasas y números de acceso al GenBank.

Umbellularia californica acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAC49001) Cinnamomum camphora acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #Q39473) Umbellularia californica acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #Q41635) Myristica fragrans acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAB71729) Myristica fragrans acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAB71730) Elaeis guineensis acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #ABD83939) Elaeis guineensis acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAD42220) Populus tomentosa acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #ABC47311) Arabidopsis thaliana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #NP_172327) Arabidopsis thaliana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAA85387) Arabidopsis thaliana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAA85388) Gossypium hirsutum acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #Q9SQI3) Cuphea lanceolata acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAA54060) Cuphea hookeriana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAC72882) Cuphea calophylla subsp. mesostemon acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #ABB71581) Cuphea lanceolata acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAC19933) Elaeis guineensis acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAL15645) Cuphea hookeriana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #Q39513) Gossypium hirsutum acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAD01982) Vitis vinifera acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAN81819) Garcinia mangostana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAB51525) Brassica juncea acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #ABI18986) Madhuca longifolia acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAX51637) Brassica napus acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #ABH11710) Oryza sativa (cultivares grupo índica) acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #EAY86877) Oryza sativa (cultivares grupo japónica) acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #NP_001068400) Oryza sativa (cultivares grupo índica) acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #EAY99617) Cuphea hookeriana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAC49269) Ulmus Americana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAB71731) Cuphea lanceolata acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #CAB60830) Cuphea palustris acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAC49180) Iris germanica acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAG43858) Cuphea palustris acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #AAC49179) Myristica fragrans acil graso-ACP tioesterasa (GenBank# AAB71729) Cuphea hookeriana acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #U39834) Umbelluaria californica acil graso-ACP tioesterasa (GenBank # M94159) Cinnamomum camphora acil graso-ACP tioesterasa (GenBank #U31813)

Los ejemplos debajo describen el éxito de la orientación y la expresión heteróloga de la acil graso ACP tioesterasas de Cuphea hookeriana, Umbellularia californica, Cinnamomun camphora en especies de Prototheca. Adicionalmente, las alteraciones en el perfil de ácidos grasos se confirmaron en la expresión de las células huésped de estas acil graso-ACP 25 tioesterasas heterólogas. Estos resultados fueron inesperados dada la falta de identidad de secuencia entre las

15 estas acil graso-ACP tioesterasas. Treinta y nueve de cuarenta acil graso-ACP tioesterasas de plantas superiores que se estudiaron mostraron la secuencia LDMNQH que rodea los residuos N y H en el extremo amino terminal de la tríada, mientras que todas las secuencias de algas que se identificaron tenían la secuencia MDMNGH. Dada la baja identidad de secuencia de aminoácidos y las diferencias que rodean la tríada catalítica de las tioesterasas, los resultados exitosos de expresión de acil graso-ACP tioesterasas exógenas que se obtuvieron y describieron en los Ejemplos fueron

10 Cuando las secuencias de aminoácidos de estos dos ADNc se analizaron por BLAST contra la base de datos NCBI, las dos secuencias más homólogas fueron las de acil graso-ACP tioesterasas de Chlamydomonas reinhardtii y Arabidopsis thaliana. Sorprendentemente, el nivel de identidad de aminoácidos entre las acil graso-ACP tioesterasas de Prototheca moriformis y las tioesterasas de plantas superiores fue bastante bajo, con sólo 49 y 37% de identidad. Además, también hay una sutil diferencia en las secuencias que rodean la porción amino terminal de la tríada catalítica (NXHX36C) entre

5 ellos en el péptido de tránsito a plastidios. Un análisis más detallado de la secuencia genómica de Prototheca moriformis confirmó que estos dos ADNc se codificaron de hecho en cóntigos separados, y aunque muy homólogos, se codificaron por dos genes distintos. La secuencia de ADNc y aminoácidos de las dos acil graso-ACP tioesterasas de Prototheca moriformis, P.moriformis acil graso ACP tioesterasa-1 y P.moriformis acil graso ACP tioesterasa -2, se muestran como sec. con núm. de ident.: 134-137.

tioesterasas de algas y de plantas superiores en general, y entre las acil graso-ACP tioesterasas de imagen22moriformis y las acil graso-ACP tioesterasas heterólogas enumeradas arriba. tioesterasas de Prototheca moriformis.

20 inesperados, especialmente si se tiene en cuenta el hecho de que la actividad de las acil graso-ACP tioesterasas exógenas dependía de una interacción funcional proteína-proteína con la proteína portadora de acilo endógena de Prototheca.

Las acil graso-CoA/aldehído reductasas adecuadas para su uso con los microbios y métodos de la divulgación incluyen, sin limitarse a, los enumerados en la Tabla 4.

25 Tabla 4. Acil graso-CoA/aldehído reductasas enumeradas por los números de acceso al GenBank.

AAC45217, YP_047869, BAB85476, YP_001086217, YP_580344, YP_001280274, YP_264583, YP_436109, YP_959769, ZP_01736962, ZP_01900335, ZP_01892096, ZP_01103974, ZP_01915077, YP_924106, YP_130411, ZP_01222731, YP_550815, YP_983712, YP_001019688, YP_524762, YP_856798, ZP_01115500, YP_001141848, NP_336047, NP_216059, YP_882409, YP_706156, YP_001136150, YP_952365, ZP_01221833, YP_130076, NP_567936, AAR88762, ABK28586, NP_197634, CAD30694, NP_001063962, BAD46254, NP_001030809, EAZ10132, EAZ43639, EAZ07989, NP_001062488, CAB88537, NP_001052541, CAH66597, CAE02214, CAH66590, CAB88538, EAZ39844, AAZ06658, CAA68190, CAA52019, y BAC84377

Las acil graso-CoA reductasas adecuadas para su uso con los microbios y métodos de la divulgación incluyen, sin limitarse a, las enumeradas en la Tabla 5.

Tabla 5. Acil graso-CoA reductasas enumeradas por los números de acceso al GenBank.

NP_187805, ABO14927, NP_001049083, CAN83375, NP_191229, EAZ42242, EAZ06453, CAD30696, BAD31814, NP_190040, AAD38039, CAD30692, CAN81280, NP_197642, NP_190041, AAL15288, y NP_190042

Las aldehído graso decarbonilasas adecuadas para su uso con los microbios y métodos de la divulgación incluyen, sin limitarse a, las enumeradas en la Tabla 6.

Tabla 6. Aldehído graso decarbonilasas enumeradas por los números de acceso al GenBank.

NP_850932, ABN07985, CAN60676, AAC23640, CAA65199, AAC24373, CAE03390, ABD28319,

NP_181306, EAZ31322, CAN63491, EAY94825, EAY86731, CAL55686, XP_001420263, EAZ23849,

NP_200588, NP_001063227, CAN83072, AAR90847, y AAR97643

35 Las combinaciones de acil graso-ACP tioesterasas que se coexpresan de manera natural y las proteínas portadoras de acilo son adecuadas para su uso con los microbios y métodos de la divulgación.

Los ejemplos adicionales de enzimas de modificación de lípido o hidrocarburo incluyen secuencias de aminoácidos contenidas en, referenciadas en, o codificada por secuencias de ácido nucleico contenidas o referenciadas en, cualquiera de las siguientes patentes de Estados Unidos: 6,610,527; 6,451,576; 6,429,014; 6,342,380; 6,265,639;

40 6,194,185; 6,114,160; 6,083,731; 6,043,072 ; 5,994,114; 5,891,697; 5,871,988; 6,265,639, y descritas adicionalmente en el GenBank con números de acceso: AAO18435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791; y CAA03710.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Otras enzimas adecuadas para su uso con los microbios y los métodos de la divulgación incluyen aquellas que tienen al menos el 70% de identidad de aminoácidos con una de las proteínas que se listan en las Tablas 3-6, y que exhiben la correspondiente actividad enzimática deseada (por ejemplo, la escisión de un ácido graso de una proteína portadora de acilo, la reducción de un acil-CoA a un aldehído o un alcohol, o la conversión de un aldehído a un alcano). En realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una secuencia que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente.

Al seleccionar la combinación deseada de genes exógenos a expresarse, se puede adaptar el producto generado por el microbio, el cual se puede extraer entonces de la biomasa acuosa. Por ejemplo, el microbio puede contener: (i) un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP tioesterasa; y, opcionalmente, (ii) una proteína portadora de acilo coexpresada de manera natural o una proteína portadora de acilo que tiene, de otra manera, afinidad por la acil graso-ACP tioesterasa (o viceversa), y, opcionalmente, (iii) un gen exógeno que codifica una acil graso-CoA/aldehído reductasa o una acil graso ACP reductasa y, opcionalmente, (iv) un gen exógeno que codifica una aldehído graso reductasa o una aldehído graso decarbonilasa. El microbio, bajo las condiciones de cultivo que se describen en la presente, sintetiza un ácido graso unido a una ACP y la acil graso-ACP tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, mediante procesamiento enzimático adicional, una molécula de acil graso-CoA. Cuando está presente, el acil graso-CoA/aldehído reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol. Del mismo modo, la acil graso-CoA reductasa, cuando está presente, cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído. En aquellas realizaciones en las que un gen exógeno que codifica una acil graso-CoA reductasa está presente y se expresa para producir un producto aldehído, una aldehído graso reductasa, codificada por el tercer gen exógeno, cataliza la reducción del aldehído a un alcohol. Del mismo modo, un aldehído graso decarbonilasa cataliza la conversión del aldehído a un alcano o un alqueno, cuando está presente.

Los genes que codifican tales enzimas se pueden obtener a partir de células que ya se conoce que presentan una producción de lípidos significativa, tales como Chlorella protothecoides. Los genes que ya se conoce que tienen un papel en la producción de lípidos, por ejemplo, un gen que codifica una enzima que satura los dobles enlaces, se puede transformar de forma individual dentro de células receptoras. Sin embargo, en la práctica de la invención no es necesario hacer suposiciones a priori en cuanto a cuáles genes son necesarios. Los métodos para la identificación de genes que pueden alterar (mejorar) la producción de lípidos en las microalgas se describen en la publicación PCT núm. 2008/151149.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una célula Prototheca que se modificó genéticamente para expresar una enzima de la vía de lípidos a un nivel alterado en comparación con una célula de tipo salvaje de la misma especie. En algunos casos, la célula produce más lípidos en comparación con la célula de tipo salvaje cuando ambas células se cultivan en las mismas condiciones. En algunos casos, la célula se modifica genéticamente y/o se selecciona para expresar una enzima de la vía de lípidos en un nivel más alto que el de las células de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la vía de lípidos se selecciona del grupo que forman la piruvato deshidrogenasa, la acetil-CoA carboxilasa, la proteína portadora de acilo, y la glicerol-3 fosfato aciltransferasa. En algunos casos, la célula se modifica genéticamente y/o se selecciona para expresar una enzima de la vía de lípidos en un nivel inferior a la célula de tipo salvaje. En al menos una realización en la cual la célula expresa la enzima de la vía de lípidos en un nivel inferior, la enzima de la vía de lípidos comprende la citrato sintasa.

En algunas realizaciones de la divulgación, la célula se modifica genéticamente y/o se selecciona para expresar un regulador global de la síntesis de ácidos grasos en un nivel alterado en comparación con la célula de tipo salvaje, por lo que los niveles de expresión de una pluralidad de genes sintéticos de ácidos grasos están alterados en comparación con la célula de tipo salvaje. En algunos casos, la enzima de la vía de lípidos comprende una enzima que modifica un ácido graso. En algunos casos, la enzima de la vía de lípidos se selecciona de una estearoil-ACP desaturasa y una glicerolípido desaturasa.

En otras realizaciones, la presente divulgación se dirige a un microbio productor de aceite que contiene uno o más genes exógenos, en donde los genes exógenos codifican la(s) proteína(s) seleccionadas del grupo consistente de una acil graso-ACP tioesterasa, una acil graso-CoA reductasa, una aldehído graso reductasa, una acil graso-CoA/aldehído reductasa, una aldehído graso decarbonilasa, y una proteína portadora de acilo. En una realización, el gen exógeno se encuentra en unión operativa con un promotor, que se induce o reprime en respuesta a un estímulo. En algunos casos, el estímulo se selecciona del grupo que forman una molécula pequeña que se suministra exógenamente, calor, frío y nitrógeno limitado o nulo en el medio de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se expresa en un compartimento celular. En algunas realizaciones, el compartimento celular se selecciona del grupo que consiste en un cloroplasto, un plastidio y una mitocondria. En algunas realizaciones el microbio es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora o Prototheca zopfii.

En una realización de la divulgación, el gen exógeno codifica una ácido graso acil-ACP tioesterasa. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una proteína portadora de acilo (ACP). En algunos casos, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de una ACP. En una realización, la tioesterasa codificada por el gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP.

La presente divulgación también proporciona una célula de Prototheca recombinante que contiene dos genes exógenos, en donde el primer gen exógeno codifica una acil graso-ACP tioesterasa y el segundo gen exógeno codifica una proteína que se selecciona del grupo que consiste de una acil graso-CoA reductasa, una acil graso-CoA/aldehído reductasa, y una proteína portadora de acilo. En algunos casos, los dos genes exógenos están cada uno en unión 10 operativa con un promotor, el cual es inducible en respuesta a un estímulo. En algunos casos, cada promotor es inducible en respuesta a un estímulo idéntico, tal como nitrógeno limitado o nulo en el medio de cultivo. La limitación o ausencia total de nitrógeno en el medio de cultivo estimula la producción de aceite en algunos microorganismos, tales como la especie Prototheca, y se puede usar como un disparador para inducir la producción de aceite a altos niveles. Cuando se usa en combinación con los métodos de ingeniería genética divulgados en la presente, el lípido como un 15 porcentaje del peso seco de las células se puede llevar a altos niveles tales como al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% y al menos 75%; los métodos descritos en la presente proporcionan células con esos niveles de lípidos, en donde el lípido es al menos 4% C8-C14, al menos 0.3% C8, al menos 2% C10, al menos 2% C12, y al menos 2% C14. En algunas realizaciones las células están por encima de 25% lípido por peso seco de las células y contienen lípido que es al menos 10% C8-C14, al menos 20% C8-C14, al menos 30% C8-C14, 10-30% C8

En una realización, el gen exógeno codifica una acil graso-CoA/aldehído reductasa. En algunos casos, la reductasa imagen23CoA de 10 a 14 carbonos al alcohol primario correspondiente. 5 exógeno cataliza la reducción de un acil graso-CoA de 12 carbonos a dodecanol.

20 C14 y 20-30% C8-C14.

Los novedosos aceites que se divulgan en la presente son distintos de otros aceites de origen natural con alto contenido de ácidos grasos de micro-cadena, tales como el aceite de palma, aceite de almendra de palma y aceite de coco. Por ejemplo, los niveles de contaminantes tales como los carotenoides son mucho más altos en el aceite de palma y el aceite de almendra de palma que en los aceites divulgados. Los aceites de palma y de almendra de palma, en

25 particular, contienen alfa y beta carotenos y licopeno en cantidades mucho más altas que las que hay en los aceites divulgados. Además, se encuentran más de 20 carotenoides diferentes en el aceite de almendra de palma y palma, mientras que los Ejemplos demuestran que los aceites divulgados contienen muy pocas especies de carotenoides y niveles muy bajos. Adicionalmente, los niveles de los compuestos de vitamina E tales como tocotrienoles son mucho más altos en los aceites de palma, almendra de palma y de coco que en los aceites divulgados.

30 En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una ACP. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una acil graso-CoA/aldehído reductasa que cataliza la reducción de un acil graso-CoA de 8 a 18 carbonos a un alcohol primario correspondiente. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 10 a 14 carbonos de una ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil graso-CoA

35 de 10 a 14 carbonos al correspondiente alcohol primario, en donde la tioesterasa y la reductasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbono. En una realización, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 12 carbonos de una ACP, y la reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil graso-CoA de 12 carbonos a dodecanol. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica para una acil graso-CoA reductasa la cual cataliza la reducción de un acil graso-CoA de 8 a 18 carbonos al

40 aldehído correspondiente. En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo que se coexpresa naturalmente con la acil graso-ACP tioesterasa.

En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica para una acil graso-CoA reductasa, y el microbio contiene además un tercer gen exógeno que codifica una aldehído graso decarbonilasa. En algunos casos, la tioesterasa codificada por el primer gen exógeno cataliza la escisión de un ácido graso de 8 a 18 carbonos de una ACP, la

45 reductasa codificada por el segundo gen exógeno cataliza la reducción de un acil graso-CoA de 8 a 18 carbonos a un aldehído graso correspondiente, y la decarbonilasa codificada por el tercer gen exógeno cataliza la conversión de un aldehído graso de 8 a 18 carbonos a un alcano correspondiente, en donde la tioesterasa, la reductasa, y la decarbonilasa actúan sobre la misma longitud de cadena de carbono.

En algunas realizaciones, el segundo gen exógeno codifica una proteína portadora de acilo, y el microbio contiene

50 además un tercer gen exógeno que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en una acil graso-CoA reductasa y una acil graso-CoA/aldehído reductasa. En algunos casos, el tercer gen exógeno codifica una acil graso-CoA reductasa, y el microbio contiene además un cuarto gen exógeno adicional que codifica una aldehído graso decarbonilasa.

La presente invención también proporciona métodos para producir un alcohol que comprende el cultivo de una

55 población de células Prototheca recombinantes en un medio de cultivo, en donde las células contienen (i) un primer gen exógeno que codifica una acil graso-ACP tioesterasa, y (ii) un segundo gen exógeno que codifica una acil grasoCoA/aldehído reductasa, y las células sintetizan un ácido graso vinculado a una proteína portadora de acilo (ACP), la acil graso-ACP tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, a través de la transformación posterior, una acil graso-CoA y la acil graso-CoA/aldehído reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un alcohol.

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La presente divulgación también proporciona métodos para producir una molécula de lípido en una célula de Prototheca. En una realización, el método comprende cultivar una población de células Prototheca en un medio de cultivo, en donde las células contienen (i) un primer gen exógeno codifica una acil graso-ACP tioesterasa, y (ii) un segundo gen exógeno que codifica un acilo graso-CoA reductasa, y en donde los microbios sintetizan un ácido graso enlazado a una proteína portadora de acilo (ACP), la acil graso-ACP tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP para producir, a través de la transformación posterior, acil graso-CoA reductasa, y la acil graso-CoA reductasa cataliza la reducción de la acil-CoA a un aldehído.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir una molécula de ácido graso que tiene una cadena de carbono de longitud especificada en una célula de Prototheca. En una realización, el método comprende cultivar una población de células Prototheca que produce lípidos en un medio de cultivo, en donde los microbios contienen un gen exógeno que codifica una acil graso-ACP tioesterasa, que tiene una actividad específica o preferencial por cierta longitud de cadena de carbono, tal como 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono, y en donde los microbios sintetizan un ácido graso unido a una proteína portadora de acilo (ACP) y la tioesterasa cataliza la escisión del ácido graso de la ACP cuando el ácido graso se sintetizó a la longitud específica de la cadena de carbono.

En las varias realizaciones descritas anteriormente, la célula Prototheca puede contener al menos un gen exógeno que codifica una enzima de la vía de los lípidos. En algunos casos, la enzima de la vía de los lípidos se selecciona del grupo que consiste en una estearoil ACP desaturasa, una glicerolípido desaturasa, una piruvato deshidrogenasa, una acetil-CoA carboxilasa, una proteína portadora de acilo, y una glicerol-3 fosfato aciltransferasa. En otros casos, la célula Prototheca contiene una enzima de modificación de lípidos que se seleccionó del grupo que consiste en una acil graso-ACP tioesterasa, una acil graso-CoA/aldehído reductasa, una acil graso-CoA reductasa, una aldehído graso reductasa, una aldehído graso decarbonilasa, y/o una proteína portadora de acilo

VI. COMBUSTIBLES Y PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Para la producción de combustible de acuerdo con los métodos de la divulgación, se recolectan los lípidos producidos por las células de la invención, o se recogen de otra manera, por cualquier medio conveniente. Los lípidos se pueden aislar por extracción de las células completas. Primero las células se rompen, y entonces lípidos intracelulares y asociados a la membrana/pared celulares así como los hidrocarburos extracelulares, se pueden separar de la masa celular, tal como mediante el uso de centrifugación como se describe anteriormente. Los lípidos intracelulares producidos en los microorganismos, en algunas realizaciones, se extraen después de las lisis de las células del microorganismo. Una vez extraídos, los lípidos se refinan posteriormente para producir aceites, combustibles o productos oleoquímicos.

Después de la culminación del cultivo, los microorganismos se pueden separar del caldo de fermentación. Opcionalmente, la separación se efectúa por centrifugación para generar una pasta concentrada. La centrifugación no elimina las cantidades significativas de agua intracelular proveniente de los microorganismos y no es una etapa de secado. La biomasa se puede lavar opcionalmente con una solución de lavado (por ejemplo, agua DI) para deshacerse del caldo de fermentación y los residuos celulares. Opcionalmente, la biomasa microbiana lavada también se puede secar (secado en el horno, liofilizada, etc.) antes de la ruptura celular. Como alternativa, las células se pueden lisar sin separación de parte o todo el caldo de fermentación, cuando se completa la fermentación. Por ejemplo, las células pueden estar en una proporción de menos de 1:1, v:v de células con respecto al líquido extracelular cuando ellas se lisan.

Los microorganismos que contienen un lípido se pueden lisar para producir un lisado. Como se detalla en la presente, la etapa de lisar un microorganismo (también conocida como lisis celular) se puede lograr por cualquier medio conveniente, incluyendo lisis inducida por calor, adición de una base, adición de un ácido, uso de enzimas como las proteasas y enzimas de degradación de polisacáridos tales como las amilasas, usando ultrasonido, lisis mecánica, usando choque osmótico, infección con un virus lítico, y/o expresión de uno o más genes líticos. La lisis se realiza para liberar las moléculas intracelulares producidas por el microorganismo. Cada uno de estos métodos para la lisis de un microorganismo se puede usar como un método único o en combinación simultánea o secuencial. La magnitud de la ruptura celular se puede observar por análisis microscópico. Usando uno o varios de los métodos descritos en la presente, se observa típicamente más del 70% de ruptura celular. Preferentemente la ruptura celular es más del 80%, con más preferencia más del 90% y con la máxima preferencia aproximadamente 100%.

En realizaciones particulares, el microorganismo se lisa después del crecimiento, por ejemplo, para incrementar la exposición del lípido celular y/o el hidrocarburo a la extracción o procesamiento posterior. El momento de la expresión de la lipasa (por ejemplo, a través de un promotor inducible) o de la lisis celular, se pueden ajustar para optimizar el rendimiento de los lípidos y/o hidrocarburos. A continuación se describen una serie de técnicas de lisis. Estas técnicas se pueden usar individualmente o en combinación.

En una realización divulgada, la etapa de lisis de un microorganismo comprende el calentamiento de una suspensión celular que contiene el microorganismo. En esta realización, el caldo de fermentación que contiene los microorganismos (o una suspensión de microorganismos aislados a partir del caldo de fermentación) se calienta hasta que los microorganismos, es decir, las paredes celulares y las membranas de los microorganismos se degraden o se rompan. Típicamente, las temperaturas que se aplican son al menos de 50 °C. Temperaturas más altas, tales como, al menos 30°C, al menos 60°C, al menos 70°C, al menos 80°C, al menos 90°C, al menos 100 °C, al menos 110°C, al menos 120°C,

15 mismos. Una base preferida es el KOH. El tratamiento con base de las microalgas para la ruptura celular se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 6,750,048. En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo comprende la adición de un ácido a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La lisis ácida se puede llevar a cabo usando un ácido a una concentración de 10 a 500 mN o preferentemente de 40 a 160 nM. La lisis ácida se realiza preferentemente a

10 En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo comprende la adición de una base a una suspensión celular que contiene el microorganismo. La base debe ser lo suficientemente fuerte para hidrolizar al menos una porción de los compuestos proteicos de los microorganismos usados. Las bases que son útiles para solubilizar las proteínas se conocen en la materia de la química. Las bases ejemplares que son útiles en estos métodos incluyen, pero sin limitarse a, hidróxidos, carbonatos y bicarbonatos de litio, sodio, potasio, calcio y mezclas de los

5 tratamiento con vapor de las microalgas para la ruptura celular se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 6,750,048. En algunas realizaciones, el tratamiento con vapor se puede lograr por aspersión de vapor en el fermentador y mantenimiento del caldo de cultivo a una temperatura deseada por menos de aproximadamente 90 minutos, preferentemente menos de aproximadamente 60 minutos, y con más preferencia menos de aproximadamente 30 minutos.

al menos 130 °C o superiores, se usan para la lisis celular más eficiente. El lisado de las células mediante tratamiento imagen24

20 temperatura por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo, 40-160°, y preferentemente una temperatura de 50130°). Para temperaturas moderadas (por ejemplo, temperatura ambiente a 100°C y particularmente de temperatura ambiente a 65°C), el tratamiento con ácido puede ser útil en combinación con sonicación u otros métodos de ruptura celular.

En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo comprende la lisis del

25 microorganismo mediante el uso de una enzima. Las enzimas de preferencia para la lisis de un microorganismo son las proteasas y las enzimas que degradan polisacáridos tales como hemicelulasa (por ejemplo, la hemicelulasa de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # H2125), pectinasa (por ejemplo, la pectinasa de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # P2401), Mannaway 4.0 L (Novozymes), celulasa (por ejemplo, la celulasa de Trichoderma viride, Sigma Aldrich, St. Louis, MO; # C9422) y driselasa (por ejemplo, la driselasa de Basidiomycetes sp.; Sigma

30 Aldrich, St. Louis, MO; # D9515).

En otras realizaciones de la presente divulgación, la lisis se lleva a cabo usando una enzima, tal como, por ejemplo, una celulasa tal como una enzima de degradación de polisacáridos, opcionalmente proveniente de Chlorella o un virus de Chlorella, o una proteasa, tal como la proteasa de Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinasa K, las proteasas que se listan en Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Y. y otros., Journal of Polymers and the

35 Environment, Volumen 8, número 1, enero 2000, p. 29-32(4), Alcalase 2.4 FG (Novozymes), y Flavourzyme 100 L (Novozymes). Cualquier combinación de una proteasa y una enzima de degradación de polisacáridos también se puede usar, incluyendo cualquier combinación de las proteasas y las enzimas que degradan polisacáridos anteriores.

En otra realización, la lisis se puede realizar usando una prensa expulsora. En este proceso, la biomasa se fuerza a pasar a través de un dispositivo de tipo rosca a alta presión, lisando las células y causando que los lípidos intracelulares

40 se liberen y se separen de la proteína y la fibra (y los otros componentes) en la célula.

En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo se realiza mediante ultrasonido, es decir, sonicación. De esta manera, las células pueden también lisarse con sonido de alta frecuencia. El sonido se puede producir por vía electrónica y se transporta a través de una punta metálica a una suspensión celular apropiadamente concentrada. Esta sonicación (o ultrasonicación) altera la integridad celular basada en la formación de cavidades en la

45 suspensión celular.

En otra realización de la presente divulgación, la etapa lisis de un microorganismo se lleva a cabo por lisis mecánica. Las células se pueden lisar mecánicamente y, opcionalmente, homogeneizarse para facilitar la recolección de los hidrocarburos (por ejemplo, los lípidos). Por ejemplo, un disruptor de presión se puede utilizar para bombear una célula que contiene la mezcla a través de una válvula de orificio restringido. Se aplica alta presión (hasta 1500 bar), seguido 50 por una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La ruptura celular se lleva a cabo por tres mecanismos diferentes: impacto en la válvula, alta cizalla del líquido en el orificio, y la repentina caída de presión después de la descarga, causando una explosión de la célula. El método libera las moléculas intracelulares. Como alternativa, se puede usar un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con pequeñas partículas abrasivas, tales como gránulos. Las células se rompen debido a las fuerzas de cizalla, el molido entre los

55 gránulos, y las colisiones con los gránulos. Los gránulos rompen las células para liberar los contenidos celulares. Las células también se pueden romper por las fuerzas de cizalla, tal como con el uso de mezclado (tal como con una licuadora de alta velocidad o Waring como ejemplos), prensa francesa, o incluso centrifugación en el caso de paredes celulares débiles, para romper las células.

15 realización, un microorganismo de acuerdo con la invención se modifica por ingeniería genética para producir una proteína lítica que lisa al microorganismo. Este gen lítico se puede expresar con un promotor inducible, por lo que las células primero se pueden crecer a una densidad deseable en un fermentador, seguido por la inducción del promotor para expresar el gen lítico para lisar las células. En una realización, el gen lítico codifica para una enzima o divulgación que degrada los polisacáridos. En ciertas otras realizaciones, el gen lítico es un gen de un virus lítico. De esta manera,

En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo comprende la autolisis. En esta

10 chlorella adecuado. Se conocen los métodos de infectar las especies de Chlorella con un virus de chlorella. Ver, por ejemplo, Adv. Virus Res. 2006; 66: 293-336; Virology, 25 de abril de 1999; 257(1):15-23; Virology, 5 de enero de 2004; 318(1): 214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000; (44): 161-2; J. Virol. marzo de 2006; 80(5): 2437-44; y Annu. Rev. Microbiol. 1999; 53: 447-94.

En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo comprende la infección del microorganismo con un virus lítico. Se conoce una amplia variedad de virus para lisar los microorganismos adecuados 5 para usar, y la selección y el uso de un virus lítico particular para un determinado microorganismo se encuentra dentro del nivel de experiencia en la materia. Por ejemplo, el virus de paramecium bursaria chlorella (PBCV-1) es el prototipo de un grupo (familia Phycodnaviridae, género Chlorovirus) de virus de ADN de doble cadena de gran tamaño, icosaédricos, que forman placas, se replican en, y lisan, ciertas algas verdes unicelulares eucariotas similares a Chlorella. En consecuencia, cualquier microalga sensible se puede lisar mediante infección del cultivo con un virus de

En otra realización de la presente divulgación, la etapa de lisis de un microorganismo se realiza mediante la aplicación imagen25de un choque osmótico.

20 por ejemplo, un gen lítico proveniente de un virus de Chlorella se puede expresar en una célula de alga, ver Virology 260, 308-315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); y Virology 230, 361– 368 (1997). La expresión de los genes líticos se hace preferentemente usando un promotor inducible, tal como un promotor activo en microalgas que se induce mediante un estímulo, tal como la presencia de una molécula pequeña, la luz, el calor y otros estímulos.

25 Existen varios métodos para separar los lípidos a partir de los lisados celulares producidos por los métodos anteriores. Por ejemplo, los lípidos y los derivados de los lípidos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos, y los hidrocarburos, tales como los alcanos, se pueden extraer con un solvente hidrofóbico como el hexano (ver Frenz y otros, 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Los derivados de los lípidos y los lípidos también se pueden extraer usando licuefacción (ver, por ejemplo, Sawayama y otros., 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 e Inoe y otros, 1993,

30 Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274); licuefacción de petróleo (ver, por ejemplo, Minowa y otros, 1995, Fuel 74 (12): 17351738); y extracción de CO2 supercrítico (ver, por ejemplo, Mendes y otros, 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328334). Miao y Wu describen un protocolo de recuperación de lípidos de microalgas a partir de un cultivo de Chlorella prototheocoides, en el cual las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron mediante liofilización. El polvo de las células resultante se pulverizó en un mortero y entonces se extrajeron con n

35 hexano (Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97: 841-846).

De esta manera, los lípidos, derivados de lípidos e hidrocarburos generados por los microorganismos de la presente invención o divulgación se pueden recuperar mediante extracción con un solvente orgánico. En algunos casos, el solvente orgánico preferido es el hexano. Típicamente, el solvente orgánico se añade directamente al lisado sin separación previa de los componentes del lisado. En una realización, el lisado generado por uno o varios de los

40 métodos descritos anteriormente se pone en contacto con un solvente orgánico por un período de tiempo suficiente para permitir que los lípidos y/o los componentes de los hidrocarburos formen una solución con el solvente orgánico. En algunos casos, la solución puede refinarse adicionalmente para recuperar los lípidos o los componentes de los hidrocarburos específicos deseados. Los métodos de extracción con hexano son bien conocidos en la materia.

Los lípidos y derivados de lípidos, tales como aldehídos grasos, alcoholes grasos, y los hidrocarburos, tales como los

45 alcanos producidos por las células, como se describe en la presente, pueden modificarse mediante el uso de una o más enzimas, incluyendo una lipasa, como se describió anteriormente. Cuando los hidrocarburos se encuentran en el ambiente extracelular de las células, una o más enzimas se pueden añadir a ese ambiente bajo condiciones en las cuales la enzima modifica el hidrocarburo o completa su síntesis a partir de un precursor del hidrocarburo. Como alternativa, los hidrocarburos se pueden aislar parcialmente o completamente del material celular antes de la adición de

50 uno o más catalizadores tales como las enzimas. Estos catalizadores se agregan exógenamente, y su actividad ocurre fuera de la célula o in vitro.

De esta manera, los lípidos y los hidrocarburos producidos por las células in vivo o modificados enzimáticamente in vitro, tal como se describe en la presente, pueden opcionalmente procesarse de manera adicional por medios convencionales. El procesamiento puede incluir "craqueo" (descomposición molecular) para reducir el tamaño, y por lo 55 tanto incrementar la proporción de hidrógeno:carbono de las moléculas de hidrocarburos. Los métodos de craqueo catalítico y térmico se usan rutinariamente en el procesamiento de los hidrocarburos y de los aceites de triglicéridos. Los métodos catalíticos involucran el uso de un catalizador, tal como un catalizador ácido sólido. El catalizador puede ser de sílice-alúmina o una zeolita, los cuales resultan en la ruptura heterolítica o asimétrica, de un enlace carbono-carbono para resultar en un carbocatión y un anión hidruro. Estos intermediarios reactivos entonces sufren ya bien o un 60 reordenamiento o la transferencia del hidruro con otro hidrocarburo. Las reacciones, por lo tanto, pueden regenerar los intermediarios para dar lugar a un mecanismo de cadena automultiplicativa. Los hidrocarburos también pueden

15 Bioengineering, Vol. XXIV: 193-205 (1982)), una publicación sobre hidrocraqueo de hidrocarburos producidos por microalgas. En realizaciones alternativas, la fracción se trata con otro catalizador, tal como un compuesto orgánico, calor y/o un compuesto inorgánico. Para el procesamiento de los lípidos en biodiesel, transesterificación como se describe en la Sección IV del presente documento.

Los métodos catalíticos y térmicos son estándares en las plantas de procesamiento de hidrocarburos y refinación de petróleo. De esta manera, los hidrocarburos que se producen por las células, como se describe en la presente, pueden recolectarse y procesarse o refinarse a través de medios convencionales. Ver Hillen y otros (Biotechnology and

10 homolítica o simétrica, y produce alquenos que pueden saturarse enzimáticamente de forma opcional, como se describe anteriormente.

5 Los métodos térmicos involucran el uso de temperatura y presión elevadas para reducir el tamaño del hidrocarburo. Se puede usar una temperatura elevada de aproximadamente 800°C y una presión de aproximadamente 700kPa. Estas condiciones generan "luz", un término que se usa a veces para referirse a las moléculas de hidrocarburos ricas en hidrógeno (a diferencia de las del flujo de fotones), mientras generan además, por condensación, moléculas de hidrocarburos más pesadas las cuales carecen relativamente de hidrógeno. La metodología proporciona la ruptura

procesarse para reducir, opcionalmente a cero, el número de dobles enlaces o triples carbono-carbono de los mismos. imagen26Los hidrocarburos también pueden procesarse para quitar o eliminar un anillo o

Los hidrocarburos producidos a través de los métodos de la presente divulgación, son útiles en una variedad de

20 aplicaciones industriales. Por ejemplo, la producción de sulfonato de alquilbenceno lineal (LAS), un surfactante aniónico usado en casi todos los tipos de detergentes y productos de limpieza, utiliza los hidrocarburos que comprenden generalmente una cadena de 10-14 átomos de carbono. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 6,946,430; 5,506,201; 6,692,730; 6,268,517; 6,020,509; 6,140,302; 5,080,848 y 5,567,359. Los surfactantes, tales como LAS, se pueden usar en la fabricación de composiciones para el cuidado personal y detergentes, tales como los

25 descritos en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,942,479; 6,086,903; 5,833,999; 6,468,955 y 6,407,044.

Un interés creciente se dirige al uso de los componentes de los hidrocarburos de origen biológico en los combustibles, tales como biodiesel, diesel renovable y combustible de reactor, ya que los materiales de partida biológicos renovables pueden sustituir a los materiales de partida derivados de los combustibles fósiles que están disponibles, y su uso, por lo tanto, es deseable. Existe una necesidad urgente de métodos para la producción de componentes de hidrocarburos a

30 partir de materiales biológicos. La presente divulgación satisface esta necesidad al proporcionar métodos para la producción de biodiesel, diesel renovable y combustible de reactor usando los lípidos generados por los métodos descritos en la presente como un material biológico para producir biodiesel, diesel renovable y combustible de reactor.

Los combustibles diesel tradicionales son destilados del petróleo ricos en hidrocarburos parafínicos. Ellos tienen intervalos de ebullición tan amplios como de 370° a 780°F, los cuales son adecuados para la combustión en un motor de 35 ignición por compresión, tal como un vehículo de motor diesel. La American Society of Testing and Materials (ASTM), establece el grado de diesel de acuerdo con el intervalo de ebullición, junto con los intervalos permisibles de otras propiedades del combustible, tales como el número de cetano, punto de nube, punto de inflamación, viscosidad, punto de anilina, contenido de azufre, contenido de agua, contenido de cenizas, corrosión de la tira de cobre, y residuos de carbono. Técnicamente, cualquier material destilado de hidrocarburos derivados de biomasa o de otro tipo que cumpla

40 con la especificación apropiada de la ASTM, se puede definir como combustible diesel (ASTM D975), combustible de reactor (ASTM D1655), o como biodiesel si es un éster metílico de ácido graso (ASTM D6751).

Después de la extracción, los lípidos y/o los componentes de los hidrocarburos recuperados a partir de la biomasa microbiana descrita en la presente, se pueden someter a tratamiento químico para fabricar un combustible para su uso en vehículos a diesel y motores a reacción.

45 El biodiesel es un líquido que varía en color – entre dorado y marrón oscuro – en dependencia de la materia prima usada en la producción. Es prácticamente inmiscible en agua, tiene un alto punto de ebullición y baja presión de vapor. El biodiesel se refiere a un combustible procesado equivalente al diesel para su uso en vehículos con motor diesel. El biodiesel es biodegradable y no tóxico. Un beneficio adicional del biodiesel con respecto a los combustibles diesel convencionales, es el menor desgaste del motor. Típicamente, el biodiesel comprende ésteres de alquilo de C14-C18.

50 Varios procesos convierten la biomasa o un lípido producido y aislado según lo descrito en la presente, en los combustibles diesel. Un método preferido para producir biodiesel es la transesterificación de un lípido como se describe en la presente. Un éster de alquilo preferido para su uso como biodiesel es un éster metílico o éster etílico.

El biodiesel producido por un método descrito en la presente se puede usar solo o mezclado con combustible diesel convencional en cualquier concentración en la mayoría de los vehículos modernos de motores diesel. Cuando se

55 mezcla con el combustible diesel convencional (diesel), el biodiesel puede estar presente en aproximadamente de 0.1% a aproximadamente 99.9%. Gran parte del mundo usa un sistema conocido como el factor "B", para indicar la cantidad de biodiesel en cualquier mezcla de combustible. Por ejemplo, el combustible que contiene 20% de biodiesel se etiqueta como B20. El biodiesel puro se refiere como B100.

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El biodiesel también puede usarse como combustible de calefacción en calderas domésticas y comerciales. Las calderas de aceite que existen pueden contener partes de caucho, y pueden requerir conversión para funcionar con biodiesel. El proceso de conversión es, por lo general, relativamente sencillo, el cual involucra el intercambio de las partes de caucho por partes sintéticas debido a que el biodiesel es un fuerte solvente. Debido a su fuerte poder solvente, el quemado del biodiesel incrementará la eficiencia de las calderas. El biodiesel puede usarse como un aditivo en las formulaciones de diesel para incrementar la lubricidad del combustible Ultra-Low Sulfur Diesel (ULSD) puro, lo cual es ventajoso, ya que éste prácticamente no tiene contenido de azufre. El biodiesel es un mejor solvente que el petrodiesel y se puede usar para separar los depósitos de los residuos en las líneas de combustible de los vehículos que previamente han funcionado con el petrodiesel.

El biodiesel puede producirse por transesterificación de los triglicéridos contenidos en la biomasa rica en aceites. Por lo tanto, también se proporciona un método para producir biodiesel. En una realización preferida, el método para producir biodiesel comprende las etapas de (a) cultivar un microorganismo que contiene lípidos usando los métodos descritos en la presente, (b) lisar un microorganismo que contiene lípidos para producir un lisado, (c) aislar los lípidos a partir del microorganismo lisado y (d) transesterificar la composición lipídica, mediante lo cual se produce el biodiesel. Los métodos para el crecimiento de un microorganismo, lisar un microorganismo para producir un lisado, tratar el lisado en un medio que comprende un solvente orgánico para formar una mezcla heterogénea y separar el lisado tratado en una composición lipídica, se han descrito anteriormente y también se pueden usar en el método de producción de biodiesel.

El perfil lipídico del biodiesel usualmente es muy similar al perfil de lípidos del aceite como materia prima. Los demás aceites proporcionados por los métodos y las composiciones divulgadas en la presente se pueden someter a transesterificación para producir biodiesel con los perfiles de lípidos, que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14, (b) al menos 0,3% de C8; (c) al menos 2% de C10, (d) al menos 2% de C12, y (e) al menos 30% de C8-C14.

Las composiciones de lípidos se pueden someter a transesterificación para producir ésteres de ácidos grasos de cadena larga, útiles como biodiesel. Las reacciones de transesterificación preferidas se describen a continuación e incluyen transesterificación catalizada por bases y transesterificación usando lipasas recombinantes. En un proceso de transesterificación catalizada por bases, los triglicéridos se hacen reaccionar con un alcohol, tal como metanol o etanol, en presencia de un catalizador alcalino, típicamente hidróxido de potasio. Esta reacción forma ésteres metílicos o etílicos y glicerina (glicerol) como un subproducto.

Los aceites animales y vegetales se hacen típicamente de triglicéridos que son ésteres de ácidos grasos libres con el alcohol trihídrico, glicerol. En la transesterificación, el glicerol en un triacilglicérido (TAG) se sustituye por un alcohol de cadena corta tal como el metanol o el etanol. Un esquema de la reacción típica es el siguiente:

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En esta reacción, el alcohol se desprotona con una base para hacerlo un nucleófilo más fuerte. Comúnmente, el etanol

o metanol se usan en gran exceso (hasta 50 veces). Normalmente, esta reacción se llevará a cabo de forma excesivamente lenta o no ocurrirá en lo absoluto. El calor, así como un ácido o una base, se pueden usar para ayudar a la reacción a que se lleve a cabo más rápidamente. El ácido o la base no se consumen por la reacción de transesterificación, por lo que no son reactivos sino catalizadores. Casi todo el biodiesel se produce usando la técnica de catalización con base, ya que ésta sólo requiere bajas temperaturas y presiones y produce por encima del 98% de rendimiento de conversión (siempre y cuando el aceite de partida sea bajo en humedad y libre de ácidos grasos).

La transesterificación también se lleva a cabo, como se mencionó anteriormente, usando una enzima, tal como una lipasa en lugar de una base. La transesterificación catalizada por la lipasa se puede llevar a cabo, por ejemplo, a una temperatura entre la temperatura ambiente y 80°C, y una relación molar del TAG con respecto al alcohol inferior mayor de 1:1, preferentemente aproximadamente 3:1. Las lipasas adecuadas para su uso en la transesterificación incluyen, pero no se limitan, a las que se enumeran en la Tabla 7. Otros ejemplos de lipasas útiles para la transesterificación se encuentran en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 4,798,793; 4,940,845; 5,156,963; 5,342,768; 5,776,741 y WO89/01032. Tales lipasas incluyen, pero sin limitarse a, lipasas producidas por microorganismos de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Mucor, Pseudomonas, Rhizomucor, Candida, y Humicola y lipasa del páncreas.

Tabla 7. Lipasas adecuadas para su uso en la transesterificación.

Lipasa de Aspergillus niger ABG73614, lipasa B de Candida antarctica (novozym-435) CAA83122, lipase de Candida cylindracea AAR24090, lipasa de Candida lipolytica (Lipasa L; Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), lipasa de Candida rugosa (por ejemplo, Lipasa-OF; Meito Sangyo Co., Ltd.), lipasa de Mucor miehei (Lipozyme IM 20), lipasa de Pseudomonas fluorescens AAA25882, lipasa de Rhizopus japonicas (Lilipase A10FG) Q7M4U7_1, lipasa deRhizomucor miehei B34959, lipasa de Rhizopus oryzae (Lipasa F) AAF32408, lipasa de Serratia marcescens (Enzima SM) ABI13521, lipasa de Thermomyces lanuginosa CAB58509, Lipasa P (Nagase ChemteX Corporation), y Lipasa QLM (Meito Sangyo Co., Ltd., Nagoya, Japón)

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Un reto para usar una lipasa para la producción de ésteres de ácido graso adecuados para biodiesel es que el precio de la lipasa es mucho mayor que le precio del hidróxido sódico (NaOH) usado por los procesos con base fuerte. Este reto se abordó usando una lipasa inmovilizada, que se puede reciclar. Sin embargo, la actividad de la lipasa inmovilizada 5 debe mantenerse después de reciclarse por un número mínimo de ciclos para permitir un proceso basado en lipasa que compita con el proceso de base fuerte en términos de costo de producción. Las lipasas inmovilizadas se someten a envenenamiento por los alcoholes inferiores típicamente usados en la transesterificación. La patente de los Estados Unidos núm. 6,398,707 (concedida el 4 de junio 2002 a Wu y otros) describe los métodos para incrementar la actividad de las lipasas inmovilizadas y la regeneración de las lipasas inmovilizadas con actividad reducida. Algunos métodos

10 adecuados incluyen sumergir una lipasa inmovilizada en un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no menor que 3 durante un período de tiempo, preferentemente de 0.5-48 horas, y con la máxima preferencia de 0.5-1.5 horas. Algunos métodos adecuados también incluyen el lavado de una lipasa inmovilizada desactivada con un alcohol que tiene un número de átomos de carbono no menor que 3, y luego sumergir la lipasa inmovilizada desactivada en un aceite vegetal durante 0.5-48 horas.

15 En realizaciones particulares, una lipasa recombinante se expresa en los mismos microorganismos que producen los lípidos sobre los cuales actúa la lipasa. Las lipasas recombinantes adecuadas incluyen las que se listan más arriba en la Tabla 7 y/o que tienen los números de acceso en el GenBank que se enumeran en la Tabla 7 anterior, o un polipéptido que tiene al menos el 70% de identidad de aminoácidos con una de las lipasas enumeradas anteriormente en la Tabla 7 y que exhibe actividad de lipasa. En las realizaciones adicionales, la actividad enzimática está presente en una

20 secuencia que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de identidad con una de las secuencias descritas anteriormente, todas las cuales se incorporan en la presente mediante referencia, como si estuvieran completamente definidas. El ADN que codifica para la lipasa y el marcador seleccionable es preferentemente ADNc de codón optimizado. Los métodos de recodificar los genes para la expresión en microalgas

25 se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 7,135,290.

La norma internacional común para el biodiesel es EN 14214. ASTM D6751, la norma de biodiesel más común que se referencia en los Estados Unidos y Canadá. Alemania usa la norma DIN EN 14214 y el Reino Unido exige el cumplimiento de la norma BS EN 14214. Las pruebas industriales básicas para determinar si los productos se ajustan a estas normas típicamente incluyen cromatografía de gases, HPLC, y otras. El biodiesel que cumple las normas de

30 calidad no es muy tóxico, con un índice de toxicidad (DL50) mayor de 50 ml/kg.

Aunque el biodiesel que cumpla con las normas ASTM tiene que ser no tóxico, puede haber contaminantes que tiendan a cristalizar y/o precipitar y se desprendan de la solución como sedimentos. La formación de sedimentos es particularmente un problema cuando el biodiesel se usa a temperaturas más bajas. El sedimento o los precipitados pueden causar problemas tales como la disminución del flujo del combustible, la obstrucción de las tuberías de 35 combustible, la obstrucción de filtros, etc. Existen procesos bien conocidos en la materia que tratan específicamente de la eliminación de estos contaminantes y sedimentos en el biodiesel, con el objetivo de producir un producto de mayor calidad. Los ejemplos de estos procesos incluyen, pero sin limitarse al tratamiento previo del aceite para eliminar contaminantes tales como fosfolípidos y ácidos grasos libres (por ejemplo, desgomado, refinado cáustico y filtración con adsorbente de sílice) y filtración en frío. La filtración en frío es un proceso que se desarrolló específicamente para 40 eliminar cualquiera de las partículas y sedimentos que están presentes en el biodiesel después de la producción. Este proceso enfría al biodiesel y filtra cualquiera de los sedimentos o precipitados que puedan formarse cuando el combustible se usa en una temperatura más baja. Este proceso es bien conocido en la materia y se describe en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007-0175091. Los métodos adecuados pueden incluir el enfriamiento del biodiesel a una temperatura inferior a aproximadamente 38°C, de manera que las impurezas y los

45 contaminantes precipiten como partículas en el líquido del biodiesel. La tierra de diatomeas u otro material de filtrado se pueden entonces añadir al biodiesel enfriado para formar una pasta, que luego puede filtrarse a través de una hoja de presión u otro tipo de filtro para eliminar las partículas. El biodiesel filtrado, a continuación se puede pasar a través de un filtro de pulido para eliminar los sedimentos restantes y la tierra de diatomeas, con el fin de producir el producto de biodiesel final.

50 El Ejemplo 14 describe la producción de biodiesel usando aceite de triglicéridos proveniente de Prototheca moriformis. La Cold Soak Filterability según el método de ASTM D6751 A1 del biodiesel producido en el Ejemplo 14 fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba involucra la filtración de 300 ml de B100, enfriado a 40°F durante 16 horas, se le deja calentar a temperatura ambiente, y se filtra al vacío usando fibra de vidrio de 0.7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites como se divulgan en la presente pueden transesterificarse para generar biodiesel con un

55 tiempo de maceración en frío de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.

Procesos posteriores también se pueden usar si el biodiesel se usa particularmente a temperaturas frías. Estos procesos incluyen el acondicionamiento para el invierno y el fraccionamiento. Ambos procesos se diseñan para mejorar el flujo en frío y el desempeño en el invierno del combustible mediante la reducción del punto de nube (la temperatura a la que el biodiesel empieza a cristalizar). Existen varios enfoques para preparar el biodiesel para el invierno. Un método

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consiste en mezclar el biodiesel con diesel de petróleo. Otro enfoque es usar aditivos que pueden bajar el punto de nube del biodiesel. Otro enfoque consiste en eliminar los ésteres de metilo saturados indiscriminadamente, mediante la mezcla en aditivos, permitiendo la cristalización de las grasas saturadas y luego filtrando los cristales. El fraccionamiento separa selectivamente los ésteres de metilo en componentes o fracciones individuales, lo que permite la eliminación o inclusión de los ésteres de metilo específicos. Los métodos de fraccionamiento incluyen el fraccionamiento con urea, fraccionamiento con solvente y destilación térmica.

Otro valioso combustible proporcionado por los métodos de la presente divulgación es el diesel renovable, el cual comprende alcanos, tales como C10:0, C12:0, C14:0, C16:0 y C18: 0, y por lo tanto se distingue del biodiesel. El diesel renovable de alta calidad se obtiene conforme a la norma ASTM D975. Los lípidos producidos por los métodos de la presente divulgación pueden servir como materia prima para producir el diesel renovable. Por lo tanto, se proporciona un método para producir diesel renovable. El diesel renovable puede producirse mediante al menos tres procesos: procesamiento hidrotérmico (hidrotratamiento); hidroprocesamiento y licuefacción indirecta. Estos procesos generan destilados que no son ésteres. Durante estos procesos, los triacilglicéridos producidos y aislados como se describe en la presente, se convierten a alcanos.

En una realización, el método para la producción del diesel renovable comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípido usando los métodos descritos en la presente, (b) lisar el microorganismo para producir un lisado, (c) aislar el lípido a partir del microorganismo lisado, y (d) desoxigenar e hidrotratar el lípido para producir un alcano, produciéndose así el diesel renovable. Los lípidos adecuados para la fabricación del diesel renovable se pueden obtener a través de la extracción proveniente de la biomasa microbiana usando un solvente orgánico tal como el hexano, o a través de otros métodos, tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,928,696. Algunos métodos apropiados pueden incluir prensado mecánico y centrifugación.

En algunos métodos, el lípido microbiano primero se craquea conjuntamente con el hidrotratamiento para reducir la longitud de la cadena de carbono y saturar los dobles enlaces, respectivamente. Después, el material se isomeriza conjuntamente también con el hidrotratamiento. La fracción de nafta se puede eliminar después mediante destilación, seguido de una destilación adicional para evaporar y destilar los componentes deseados en el combustible diesel con vistas a cumplir con una norma ASTM D975, mientras que los componentes más pesados de lo deseado se dejan para cumplir con la norma D975. Los métodos de hidrotratamiento, hidrocraqueo, desoxigenación e isomerización de los aceites modificados químicamente, incluyendo los aceites de triglicéridos, son bien conocidos en la materia. Ver por ejemplo las solicitudes de patente europea EP1741768 (A1); EP1741767 (A1); EP1682466 (A1); EP1640437 (A1); EP1681337 (A1); EP1795576 (A1); y las patentes de los Estados Unidos 7,238,277; 6,630,066; 6,596,155; 6,977,322; 7,041,866; 6,217,746; 5,885,440; 6,881,873.

En una realización del método de producción del diesel renovable, el tratamiento del lípido para producir un alcano se lleva a cabo por hidrotratamiento de la composición lipídica. En el procesamiento hidrotérmico, típicamente la biomasa se hace reaccionar en agua a una temperatura y presión elevadas para formar aceites y residuos sólidos. Las temperaturas de conversión son típicamente de 300º a 660ºF, con presión suficiente para mantener el agua primariamente como un líquido, de 100 a 170 atmósferas como estándar. Los tiempos de reacción son del orden de 15 a 30 minutos. Después que la reacción se completa, los orgánicos se separan del agua. De tal modo se produce un destilado apropiado para el diesel.

En algunos métodos para preparar el diesel renovable, la primera etapa del tratamiento de un triglicérido es el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido por desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En algunos métodos, la hidrogenación y desoxigenación ocurren en la misma reacción. En otros métodos la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización se realiza entonces opcionalmente, también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Los componentes de nafta se eliminan preferentemente por medio de destilación. Como ejemplos, ver las patentes de los Estados Unidos 5,475,160 (hidrogenación de los triglicéridos), 5,091,116 (desoxigenación, hidrogenación y extracción de gas), 6,391,815 (hidrogenación), y 5,888,947 (isomerización).

Un método apropiado para la hidrogenación de los triglicéridos incluye preparar una solución acuosa de sales de cobre, zinc, magnesio y lantano y otra solución de metales alcalinos o preferentemente, carbonato de amonio. Las dos soluciones se pueden calentar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C y se miden en conjunto en un recipiente de precipitación a velocidades tales que el pH en el recipiente de precipitación se mantenga entre 5.5 y 7.5 con el objetivo de formar un catalizador. Agua adicional se puede usar inicialmente en el recipiente de precipitación o añadirse al mismo tiempo que la solución de sal y la solución de precipitación. El precipitado resultante puede lavarse completamente, secarse, calcinarse a aproximadamente 300°C y activarse en hidrógeno a temperaturas que se encuentran en el intervalo de aproximadamente 100°C a aproximadamente 400°C. Uno o más triglicéridos se pueden contactar después y reaccionar con hidrógeno en presencia del catalizador descrito anteriormente en un reactor. El reactor puede ser un reactor de lecho de goteo, un reactor gas-sólido de lecho fijo, un reactor de columna de burbujas empacada, un reactor de tanque de agitación continua, un reactor de fase de suspensión, o cualquier otro tipo de reactor adecuado conocido en la materia. El proceso se puede llevar a cabo por lotes o en forma continua. Las temperaturas de reacción están típicamente en el intervalo de aproximadamente 170°C a aproximadamente 250°C, mientras que las presiones de reacción están típicamente en el intervalo de aproximadamente 300 psig a aproximadamente 2000 psig. Por otra parte, la relación molar del hidrógeno con respecto a los triglicéridos en el

15 contacto con el nitrógeno, bajo al menos una presión que se encuentra en el intervalo desde aproximadamente la presión atmosférica hasta las anteriores, durante al menos aproximadamente 5 minutos. Los métodos adecuados para la isomerización incluyen el uso de isomerización alcalina y otra isomerización de aceites conocida en la materia. El hidrotratamiento y el hidroprocesamiento en última instancia conducen a una reducción en el peso molecular de la

10 presiones son normalmente de 40 a 100 atmósferas. Los tiempos de reacción están típicamente en el orden de 10 a 60 minutos. Los catalizadores sólidos se emplean para aumentar ciertas velocidades de reacción, mejorar la selectividad de determinados productos, y optimizar el consumo de hidrógeno. Los métodos adecuados para la desoxigenación de un aceite incluyen calentar un aceite a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 350°F hasta aproximadamente 550°F y mantener el aceite caliente continuamente en

5 parcial de hidrógeno. Los productos producidos por tales procesos de hidrogenación, incluyen alcoholes grasos, glicerol, rastros de parafinas y triglicéridos sin reaccionar. Estos productos se separan normalmente por medios convencionales tales como, por ejemplo, destilación, extracción, filtración, cristalización, y similares. Las refinerías de petróleo usan el hidroprocesamiento para eliminar las impurezas mediante el tratamiento de las fuentes con hidrógeno. Las temperaturas de conversión del hidroprocesamiento son típicamente de 300º a 700º F. Las

proceso divulgado, está típicamente en el intervalo de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 700:1. El proceso se imagen29aproximadamente 5 h-1 .

20 fuente de los triglicéridos. La molécula de triglicéridos se reduce a cuatro moléculas de hidrocarburos bajo las condiciones de hidroprocesamiento: una molécula de propano y tres moléculas de hidrocarburos más pesados, típicamente en el intervalo de C8 a C18.

Así, en una realización, el producto de una o más reacción(es) química(s) que se llevan a cabo en las composiciones lipídicas divulgadas en la presente, es una mezcla de alcanos que comprende el diesel renovable de acuerdo a la norma

25 ASTM D975. La producción de hidrocarburos por microorganismos es revisada por Metzger y otros, Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y A Look Back en the U.S. Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998).

Las propiedades de la destilación de un combustible diesel se describen en términos de T10-T90 (temperatura a 10% y 90%, respectivamente, volumen destilado). El diesel renovable se produjo a partir del aceite de triglicéridos de 30 Prototheca moriformis y se describe en el Ejemplo 14. La T10-T90 del material producido en el Ejemplo 14 fue de 57.9°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización, y otra modificación covalente de los aceites que se divulgan en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (tal como el filtrado en frío) divulgados en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovable con otros intervalos de T90-T10, tales como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65°C usando los aceites de triglicéridos producidos de acuerdo con los métodos

35 divulgados en la presente.

La T10 del material producido en el Ejemplo 14 fue 242.1ºC. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización, y otra modificación covalente de los aceites divulgados en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como el filtrado en frío) divulgados en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovable con otros valores de T10, tales como T10 entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y al menos

40 de 290.

La T90 del material producido en el Ejemplo 14 fue de 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización, y otra modificación covalente de los aceites divulgados en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como el filtrado en frío) divulgados en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovable con otros valores de T90, tales como T90 entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y al menos

45 de 290.

La FBP del material producido en el Ejemplo 14 fue de 300°C. Los métodos de hidrotratamiento, isomerización, y otra modificación covalente de los aceites divulgados en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como el filtrado en frío) divulgados en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovable con otros valores de FBP, tales como FBP entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y de al

50 menos 300.

Otros aceites proporcionados por los métodos y las composiciones de la divulgación se pueden someter a combinaciones de hidrotratamiento, isomerización, y otra modificación covalente, incluidos los aceites con perfiles de lípidos que incluyen (a) al menos 4% de C8-C14, (b) al menos 0,3% de C8, (c) al menos 2% de C10; (d) al menos 2% de C12 y (e) al menos 30% de C8-C14.

55 Un diesel tradicional ultra bajo en azufre se puede producir a partir de cualquier forma de biomasa mediante un proceso de dos pasos. Primero, la biomasa se convierte en un gas sintético, una mezcla gaseosa rica en hidrógeno y monóxido de carbono. Entonces el gas sintético se convierte catalíticamente en líquidos. Típicamente, la producción de líquidos se

15 de combustible (FSII). Los antioxidantes previenen el engomado y usualmente se basan en fenoles alquilados, por ejemplo, AO-30, AO-31, o AO-37. Los agentes antiestáticos disipan la electricidad estática y evitan las chispas. El Stadis 450 con ácido dinonilnaftilsulfónico (DINNSA) como principio activo, es un ejemplo. Los inhibidores de la corrosión, por ejemplo, el DCI-4A, se usa para combustibles civiles y militares y el DCI-6A se usa para combustibles militares. Los agentes FSII incluyen, por ejemplo, el Di-EGME.

10 el Jet A y el Jet A-1) tiene una distribución del número de carbonos entre aproximadamente 8 y 16 números de carbono. El combustible de avión de tipo nafta o wide-cut (incluyendo el Jet B) típicamente tiene una distribución del número de carbonos entre aproximadamente 5 y 15 carbonos. Ambos Aeroplanes (Jet A y Jet B) pueden contener un número de aditivos. Los aditivos útiles incluyen, pero sin limitarse a, antioxidantes, agentes antiestáticos, inhibidores de la corrosión, y agentes inhibidores de la congelación del sistema

5 de color claro a pajizo. El combustible más común es un combustible a base de aceite sin plomo/parafina clasificado como Aeroplane A-1, el cual se produce para un conjunto de especificaciones normalizadas a nivel internacional. El combustible de avión es una mezcla de un gran número de diferentes hidrocarburos, posiblemente tanto como mil o más. El intervalo de su tamaño (peso molecular o números de carbono) está limitado por los requerimientos para el producto, por ejemplo, el punto de congelación o el punto de humo. El combustible de avión tipo Kerosone (incluyendo

logra usando la síntesis de Fischer-Tropsch (FT). Esta tecnología se aplica al carbón, gas natural y aceites pesados. Por imagen30La presente divulgación también proporciona métodos para producir combustible de avión.

20 En una realización de la divulgación, un combustible de reactor se produce mediante la mezcla de combustibles de algas con los combustibles de reactor existentes. Los lípidos producidos por los métodos divulgados pueden servir como materia prima para producir combustible de reactor. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método para producir combustible de reactor. En la presente se proporcionan dos métodos para producir combustible de reactor a partir de los lípidos producidos por los métodos divulgados: craqueo catalítico fluido (FCC), e

25 hidrodesoxigenación (HDO).

El craqueo catalítico fluido (FCC) es un método que se usa para producir olefinas, especialmente propileno a partir de fracciones pesadas del crudo. Los lípidos producidos por el método divulgado se pueden convertir en olefinas. El proceso involucra el flujo de los lípidos producidos a través de una zona de FCC y se recoge una corriente del producto compuesto de olefinas, el cual es útil como combustible de reactor. Los lípidos producidos se ponen en contacto con un

30 catalizador de craqueo en condiciones de craqueo para proporcionar una corriente del producto que comprende olefinas e hidrocarburos, útiles como combustible de reactor.

En una realización, el método para producir combustible de reactor comprende (a) cultivar un microorganismo que contiene lípido usando los métodos divulgados en la presente, (b) lisar el microorganismo que contiene lípido para producir un lisado, (c) aislar el lípido a partir del lisado, y (d) tratar la composición lipídica, por medio de lo cual se

35 produce el combustible de reactor. En una realización del método para producir un combustible de reactor, la composición lipídica puede fluir a través de una zona de craqueo catalítico fluido, la cual, en una realización, puede comprender el contacto de la composición lipídica con un catalizador de craqueo en condiciones de craqueo, para proporcionar una corriente del producto que comprende olefinas de C2-C5.

En ciertas realizaciones de este método, puede ser deseable eliminar los contaminantes que pueden estar presentes en

40 la composición lipídica. Por lo tanto, antes de hacer fluir la composición lipídica a través de una zona de craqueo catalítico fluido, la composición lipídica se somete a un tratamiento previo. El tratamiento previo puede incluir poner en contacto la composición lipídica con una resina de intercambio iónico. La resina de intercambio iónico es una resina de intercambio iónico ácida, tal como AmberlystTM-15 y se puede usar como lecho en un reactor a través del cual fluye la composición lipídica, ya sea hacia arriba o hacia abajo. Otros tratamientos previos pueden incluir lavados con ácidos

45 leves por contacto de la composición lipídica con un ácido, tal como el ácido sulfúrico, acético, nítrico o clorhídrico. El contacto se realiza con una solución diluida del ácido, por lo general a temperatura ambiente y a presión atmosférica.

La composición lipídica, opcionalmente sometida a un tratamiento previo, se hace fluir a una zona de FCC, donde los componentes hidrocarburos se craquean a olefinas. El craqueo catalítico se lleva a cabo por el contacto de la composición lipídica en una zona de reacción con un catalizador compuesto de un material particulado finamente 50 dividido. La reacción es de craqueo catalítico, a diferencia del hidrocraqueo, y se lleva a cabo en ausencia de hidrógeno añadido o consumo de hidrógeno. A medida que avanza la reacción de craqueo, cantidades sustanciales de coque se depositan en el catalizador. El catalizador se regenera a altas temperaturas por la quema del coque del catalizador en una zona de regeneración. El catalizador que contiene coque, que se refiere en la presente como "catalizador coquizado", se transporta continuamente desde la zona de reacción a la zona de la regeneración para regenerarse y 55 reemplazarse por un catalizador regenerado esencialmente libre de coque a partir de la zona de regeneración. La fluidización de las partículas del catalizador mediante varias corrientes gaseosas permite el transporte del catalizador entre la zona de reacción y la zona de regeneración. Los métodos para el craqueo de los hidrocarburos, tal como los de la composición lipídica descritos en la presente, en una corriente fluidizada del catalizador, el transporte del catalizador entre las zonas de reacción y regeneración, y la combustión de coque en el regenerador, son bien conocidos por los 60 expertos en la materia de los procesos de FCC. Las aplicaciones del FCC ejemplares y de catalizadores útiles para

15 contacto con el catalizador, la composición lipídica normalmente tendrá una temperatura de aproximadamente 149ºC a aproximadamente 316ºC (300ºF a 600ºF). El catalizador se hace fluir desde un recipiente de mezclado hasta el ascensor, donde entra en contacto con la composición lipídica durante un tiempo de aproximadamente 2 segundos o menos.

10 comprende una zeolita de poro grande, tal como una zeolita tipo Y, un material de alúmina activa, un material aglutinante, que comprende ya sea sílice o alúmina y relleno inerte tal como caolín. En una realización, el craqueo de la composición lipídica de la presente divulgación, se lleva a cabo en la sección del ascensor o, como alternativa, la sección del elevador, de la zona de FCC. La composición lipídica se introduce en el ascensor mediante una boquilla, lo que resulta en la evaporación rápida de la composición lipídica. Antes de ponerse en

Los catalizadores de FCC apropiados generalmente comprenden al menos dos componentes que pueden o no estar en la misma matriz. En algunas realizaciones, ambos componentes se pueden distribuir a través de todo el recipiente de 5 reacción. El primer componente incluye generalmente cualquiera de los catalizadores conocidos que se utilizan en la materia de craqueo catalítico fluidizado, tal como un catalizador de tipo arcilla activo amorfo y/o un tamiz molecular cristalino de alta actividad. Los catalizadores de tamiz molecular pueden preferirse a los catalizadores amorfos, debido a su selectividad muy mejorada para los productos deseados. En algunas realizaciones preferidas, las zeolitas se pueden usar como tamiz molecular en los procesos de FCC. Preferentemente, el componente del primer catalizador

craquear la composición lipídica para producir olefinas C2-C5 se describen en las patentes de los Estados Unidos núms. imagen316,538,169 y 7,288,685.

El catalizador mezclado y los vapores de la composición lipídica reaccionada se descargan entonces desde la parte

20 superior del elevador a través de una conexión de salida, y se separan en una corriente de vapor del producto craqueado como olefinas y una colección de partículas del catalizador cubiertas con cantidades sustanciales de coque que se refiere generalmente como "catalizador coquizado". En un esfuerzo por minimizar el tiempo de contacto de la composición lipídica y el catalizador, que puede promover una conversión adicional de los productos deseados a otros productos no deseados, se puede usar cualquier disposición de separadores, tal como una disposición de brazo en

25 espiral, para eliminar el catalizador coquizado de la corriente del producto rápidamente. El separador, por ejemplo, el separador de brazo en espiral, se sitúa en una porción superior de una cámara con una zona de extracción situada en la porción inferior de la cámara. El catalizador separado por el arreglo del brazo en espiral, gotea en la zona de extracción. La corriente de vapor del producto craqueado que comprende los hidrocarburos craqueados que incluyen olefinas ligeras y algún catalizador, salen de la cámara a través de un conducto que está en comunicación con los ciclones. Los

30 ciclones eliminan los restos de partículas del catalizador de la corriente de vapor del producto para reducir las concentraciones de partículas a niveles muy bajos. La corriente de vapor del producto entonces sale de la parte superior del recipiente de separación. El catalizador, separado por los ciclones, se devuelve al recipiente de separación y luego a la zona de extracción. La zona de extracción elimina los hidrocarburos adsorbidos de la superficie del catalizador por el contacto en contracorriente con el vapor.

35 La baja presión parcial de los hidrocarburos opera a favor de la producción de olefinas ligeras. En consecuencia, la presión del ascensor se establece a aproximadamente de 172 a 241 kPa (25 a 35 psia) con una presión parcial de hidrocarburos de aproximadamente 35 a 172 kPa (5 a 25 psia), con una presión parcial de hidrocarburos preferida de aproximadamente 69 a 138 kPa (10 a 20 psia). Esta presión parcial, relativamente baja para los hidrocarburos, se logra mediante el uso de vapor como un diluyente en la medida en que el diluyente es del 10-55% en peso de la composición

40 lipídica, y preferentemente de aproximadamente el 15% en peso de la composición lipídica. Otros diluyentes, tales como gas seco, se pueden usar para alcanzar presiones parciales de hidrocarburos equivalentes.

La temperatura de la corriente de craqueo en la salida del ascensor será de aproximadamente 510ºC a 621ºC (950ºF a 1150ºF). Sin embargo, las temperaturas de salida del ascensor por encima de 566ºC (1050ºF) producen más gas seco y más olefinas. Mientras que las temperaturas de salida del ascensor por debajo de 566ºC (1050ºF) producen menos

45 etileno y propileno. Por consiguiente, se prefiere para llevar a cabo el proceso de FCC a una temperatura preferida de aproximadamente 566ºC a aproximadamente 630°C, presión preferida de aproximadamente de 138 kPa a aproximadamente 240 kPa (20 a 35 psia). Otra condición para el proceso es la relación del catalizador con respecto a la composición lipídica, la cual puede variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 y preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 15.

50 En una realización del método para producir un combustible de reactor, la composición lipídica se introduce en la sección del elevador de un reactor de FCC. La temperatura en la sección del elevador estará muy caliente y se encuentra en el intervalo de aproximadamente 700°C (1292ºF) a aproximadamente 760°C (1400ºF), con una relación del catalizador con respecto a la composición lipídica de aproximadamente 100 a aproximadamente 150. Se prevé que la introducción de la composición lipídica en la sección del elevador producirá cantidades considerables de propileno y

55 etileno.

En otra realización del método para producir un combustible de reactor con la composición lipídica o los lípidos producidos como se describe en la presente, la estructura de la composición lipídica o de los lípidos se rompe por un proceso conocido como hidrodesoxigenación (HDO). La HDO significa la eliminación de oxígeno por medio de hidrógeno, es decir, el oxígeno se elimina mientras que se rompe la estructura del material. Los dobles enlaces 60 olefínicos se hidrogenan y todos los compuestos de azufre y nitrógeno se eliminan. La eliminación de azufre se llama

15 Típicamente, en la etapa de hidrodesoxigenación, la estructura del componente biológico, tal como la composición lipídica o los lípidos de la presente se descompone, el oxígeno, el nitrógeno, los compuestos de fósforo y de azufre y los hidrocarburos ligeros como gas se eliminan, y los enlaces olefínicos se hidrogenan. En la segunda etapa del proceso, es decir, en la etapa llamada de isomerización, se lleva a cabo la isomerización para la ramificación de la cadena del hidrocarburo y se mejora el rendimiento de la parafina a bajas temperaturas.

10 de cocorriente con gas de hidrógeno a través de una primera zona de hidrogenación, y posteriormente el efluente del hidrocarburo se hidrogena adicionalmente en una segunda zona de hidrogenación, pasando gas de hidrógeno a la segunda zona de hidrogenación como un flujo en contracorriente con respecto al aplicaciones ilustrativas de la HDO y de los catalizadores útiles para craquear la composición lipídica para producir olefinas C2-C5 se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 7,232,935.

5 sola fase o una materia prima de la fuente en dos fases. Después de la HDO/etapa de MDS, la fracción del producto se separa y se pasa a un reactor de isomerización separado. Un reactor de isomerización para material de partida biológico se describe en la literatura (FI 100 248) como un reactor de cocorriente. El proceso para producir un combustible por hidrogenación de una fuente del hidrocarburo, por ejemplo, la composición lipídica o los lípidos de la presente, también se puede realizar pasando la composición lipídica o los lípidos como un flujo

hidrodesulfuración (HDS). El tratamiento previo y la pureza de las materias primas (composición lipídica o lípidos) imagen32contribuyen a la vida útil del catalizador.

20 En la primera etapa, es decir, en la etapa de HDO del proceso de craqueo, el gas de hidrógeno y la composición lipídica

o los lípidos de la presente que deben hidrogenarse, se pasan a un sistema de lecho del catalizador de HDO, ya sea como flujos de cocorriente o contracorriente, dicho sistema de lecho del catalizador que comprende uno o más lechos de catalizador(es), preferentemente de 1-3 lechos de catalizador. La etapa de HDO típicamente funciona de una manera en cocorriente. En el caso de un sistema de lecho del catalizador de HDO, el cual comprende dos o más lechos de 25 catalizadores, uno o más de los lechos pueden funcionar usando el principio de flujo en contracorriente. En la etapa de HDO, la presión varía entre 20 y 150 bar, preferentemente entre 50 y 100 bar, y la temperatura varía entre 200 y 500°C, preferentemente en el intervalo de 300-400°C. En la etapa de HDO, se pueden usar los catalizadores de hidrogenación conocidos que contienen metales del grupo VII y/o VIB del sistema periódico. Preferentemente, los catalizadores de hidrogenación son catalizadores soportados de Pd, Pt, Ni, NiMo o un catalizador CoMo, siendo el soporte alúmina y/o

30 sílice. Típicamente se usan los catalizadores NiMo/Al2O3 y CoMo/Al2O3.

Antes de la etapa de HDO, la composición lipídica o los lípidos en la presente, opcionalmente, se pueden tratar opcionalmente mediante prehidrogenación en condiciones más suaves, evitándose así reacciones secundarias de los dobles enlaces. Dicha prehidrogenación se lleva a cabo en presencia de un catalizador de prehidrogenación a temperaturas de 50 a 400°C y a presiones de hidrógeno de 1 a 200 bar, preferentemente a una temperatura entre 150 y 35 250°C y a una presión de hidrógeno entre 10 y 100 bar. El catalizador puede contener metales del grupo VIII y/o VIB del sistema periódico. Preferentemente, el catalizador de prehidrogenación es un catalizador soportado de Pd, Pt, Ni, NiMo

o un catalizador CoMo, el soporte es alúmina y/o sílice.

Una corriente gaseosa de la etapa de HDO que contiene hidrógeno se enfría y después los compuestos de monóxido de carbono, dióxido de carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, hidrocarburos ligeros gaseosos y otras impurezas se eliminan

40 de la misma. Después de la compresión, el hidrógeno purificado o el hidrógeno reciclado se retornan de vuelta al primer lecho del catalizador y/o entre los lechos de catalizadores para compensar la corriente del gas eliminado. El agua se elimina a partir del líquido condensado. El líquido se pasa al primer lecho del catalizador o entre los lechos de los catalizadores.

Después de la etapa de HDO, el producto se somete a una etapa de isomerización. Es importante para el proceso que

45 las impurezas se eliminen tan completamente como sea posible antes de que los hidrocarburos se pongan en contacto con el catalizador de isomerización. La etapa de isomerización comprende una etapa opcional de separación, en la cual el producto de reacción de la etapa de HDO se puede purificar por separación con vapor de agua o un gas adecuado, tal como hidrocarburos ligeros, nitrógeno o hidrógeno. La etapa opcional de separación se lleva a cabo en forma de contracorriente en una unidad ubicada corriente arriba del catalizador de isomerización, en la cual el gas y el líquido

50 están en contacto uno con el otro, o antes del reactor de isomerización existente en una unidad de separación independiente que utiliza el principio de contracorriente.

Después de la etapa de separación, el gas de hidrógeno y la composición lipídica o los lípidos hidrogenados de la presente, y, opcionalmente, una mezcla de n-parafina, se pasan a una unidad de isomerización reactiva que comprende uno o varios lechos del(de los) catalizador(es). Los lechos de los catalizadores de la etapa de isomerización pueden

55 operar en forma de cocorriente o contracorriente.

Es importante para el proceso que el principio del flujo en contracorriente se aplique en la etapa de isomerización. En la etapa de isomerización, esto se hace llevando a cabo cualquier etapa de separación opcional o la etapa de la reacción de isomerización o ambas en forma de contracorriente. En la etapa isomerización, la presión varía en el intervalo de 20

15 otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un punto de inflamación de al menos 38°C. En otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene una densidad entre 775K/M3 y 840K/M3. composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un punto de congelación que está por debajo de -47°C. En otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible

10 comprende combustible de reactor según la norma ASTM D1655. En algunas realizaciones, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un contenido de azufre que es menor de 10 ppm. En otras realizaciones, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un valor T10 de la curva de destilación de menos de 205°C. En otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un punto de ebullición final (FBP) menor que 300°C. En

5 o Ni y Al2O3 y SiO2. Los catalizadores de isomerización típicos son, por ejemplo, Pt/SAPO-11/Al2O3, Pt/ZSM-22/Al2O3, Pt/ZSM-23/Al2O3 y Pt/SAPO-11/SiO2. La etapa de isomerización y la etapa HDO se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente de presión o en recipientes de presión separados. La prehidrogenación opcional se puede llevar a cabo en un recipiente de presión separado o en el mismo recipiente de presión que las etapas de HDO y de isomerización. De esta manera, en una realización, el producto de uno o más reacciones químicas es una mezcla de alcanos que

150 bar, de preferencia en el intervalo de 20-100 bar, y la temperatura está entre 200 y 500°C, preferentemente entre imagen33

20 de reactor ASTM 1655 tiene una red de calor de combustión que es al menos de 42.8 MJ/K. En otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene un contenido de hidrógeno que es al menos 13.4% en masa. En otra realización, la composición que se ajusta a las especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene una estabilidad térmica, según pruebas realizadas por JFTOT gravimétrica cuantitativa a 260°C, que es inferior a 3 mm de Hg. En otra realización, la composición que se ajusta a las

25 especificaciones del combustible de reactor ASTM 1655 tiene una goma existente que está por debajo de 7 mg/dl.

Por lo tanto, se divulgan una variedad de métodos en los cuales se lleva a cabo la modificación química de los lípidos de las microalgas para producir productos útiles en una variedad de aplicaciones industriales y de otro tipo. Ejemplos de los procesos para la modificación de los aceites producidos por los métodos divulgados en la presente incluyen, pero sin limitarse a, la hidrólisis del aceite, hidroprocesamiento del aceite, y esterificación del aceite. La modificación del aceite 30 de las microalgas produce productos oleoquímicos básicos que pueden modificarse adicionalmente en productos oleoquímicos derivados seleccionados para una función deseada. De una manera similar a la descrita anteriormente en relación con el proceso de producción del combustible, estas modificaciones químicas también se pueden realizar en los aceites generados por los cultivos microbianos descritos en la presente. Los ejemplos de productos oleoquímicos básicos incluyen, pero sin limitarse a, jabones, ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos y glicerol. Los

35 ejemplos de productos oleoquímicos derivados incluyen, pero no limitado a, nitrilos grasos, ésteres, ácidos diméricos, compuestos de amonio cuaternario, surfactantes, alcanolamidas grasas, sulfatos de alcoholes grasos, resinas, emulsificantes, alcoholes grasos, olefinas y alcanos superiores.

La hidrólisis de los constituyentes de los ácidos grasos provenientes de los glicerolípidos producidos por los métodos divulgados, produce ácidos grasos libres que pueden derivatizarse para producir otras sustancias químicas útiles. La 40 hidrólisis se produce en presencia de agua y un catalizador que puede ser un ácido o una base. Los ácidos grasos libres liberados se pueden derivar para producir una variedad de productos, como se divulga en los siguientes documentos: patentes de los Estados Unidos núms. 5,304,664 (Ácidos grasos altamente sulfatados); 7,262,158 (Composiciones de limpieza); 7,115,173 (Composiciones suavizantes de tejidos); 6,342,208 (Emulsiones para el tratamiento de la piel); 7,264,886 (Composiciones repelentes de agua); 6,924,333 (Aditivos de pinturas); 6,596,768 (Alimentos para rumiantes

45 enriquecidos con lípidos); y 6,380,410 (Surfactantes para detergentes y limpiadores).

Con respecto a la hidrólisis, en una realización divulgada, un aceite de triglicéridos primero se hidroliza opcionalmente en un medio líquido tal como agua o hidróxido de sodio, con el objetivo de obtener glicerina y jabones. Existen varios métodos de hidrólisis de los triglicéridos adecuados, que incluyen pero no limitan a, saponificación, hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, hidrólisis enzimática (denominado aquí como fraccionamiento), e hidrólisis usando agua comprimida

50 caliente. Un experto en la materia reconocerá que un aceite de triglicéridos no necesita hidrolizarse con el objetivo de producir un producto oleoquímico; más bien el aceite puede convertirse directamente al producto oleoquímico deseado mediante otro proceso conocido. Por ejemplo, el aceite de triglicéridos puede convertirse directamente en un éster metílico de ácidos grasos por medio de esterificación.

En algunas realizaciones, la hidrólisis catalítica del aceite producido por los métodos divulgados en la presente,

55 mediante el fraccionamiento del aceite en glicerina y ácidos grasos. Como se mencionó anteriormente, los ácidos grasos pueden procesarse después adicionalmente a través de varias otras modificaciones para obtener los derivados oleoquímicos. Por ejemplo, en una realización, los ácidos grasos pueden sufrir una reacción de aminación para producir compuestos de nitrógeno graso. En otra realización, los ácidos grasos pueden sufrir ozonólisis para producir ácidos mono y dibásicos.

60 En otras realizaciones la hidrólisis puede ocurrir a través del fraccionamiento de los aceites producidos en la presente para crear productos oleoquímicos. En algunas realizaciones preferidas divulgadas, un aceite de triglicéridos se puede A modo de ejemplo, la velocidad de reacción puede acelerarse mediante el aumento de la superficie de delimitación de la interfase. Una vez que la reacción se completa, los ácidos grasos libres entonces se separan de la fase orgánica liberada de la enzima, y el residuo que aún contiene ácidos grasos unidos químicamente como glicéridos, se alimenta de nuevo o se recicla y se mezcla con el aceite nuevo o la grasa para someterse al fraccionamiento. De esta manera,

Las reacciones de fraccionamiento enzimático generalmente tienen lugar en la delimitación de las fases entre la fase orgánica y la fase la acuosa, donde la enzima está presente solamente en la delimitación de las fases. Los triglicéridos 10 que se reúnen en la delimitación de las fases entonces contribuyen a o participan en la reacción de fraccionamiento. A medida que avanza la reacción, la densidad de ocupación o concentración de los ácidos grasos, todavía unidos químicamente como glicéridos, en comparación con los ácidos grasos libres, disminuye en la delimitación de las fases, de manera que la reacción es más lenta. En ciertas realizaciones, el fraccionamiento enzimático puede ocurrir a temperatura ambiente. Un experto en la materia conocerá las condiciones adecuadas para el fraccionamiento del aceite

5 biocatalizadores en una mezcla de agua y aceite. El fraccionamiento enzimático fracciona entonces el aceite o la grasa, respectivamente, en glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol puede entonces migrar a la fase del agua, mientras que la fase orgánica se enriquece con los ácidos grasos libres.

fraccionar antes de que se lleven a cabo otros procesos. Un experto en la materia reconocerá que hay muchos imagen34métodos adecuados para el fraccionamiento de los triglicéridos, que incluyen pero no enzimático y el fraccionamiento por presión.

15 en los ácidos grasos deseados.

20 los glicéridos reciclados se someten entonces a un proceso de fraccionamiento enzimático adicional. En algunas realizaciones, los ácidos grasos libres se extraen a partir de un aceite o grasa parcialmente fraccionada de tal manera. De esa forma, si los ácidos grasos unidos químicamente (triglicéridos) se retornan o se retroalimentan en el proceso de fraccionamiento, el consumo de la enzima se puede reducir drásticamente.

El grado de fraccionamiento se determina como la relación entre el valor de la acidez medido dividido por el valor de la

25 acidez teóricamente posible, lo cual se puede calcular para un aceite o grasa determinados. Preferentemente, el valor de la acidez se mide por medio de titulación, de acuerdo con los métodos estándares comunes. Como alternativa, la densidad de la fase acuosa del glicerol se puede tomar como una medida del grado de fraccionamiento.

En una realización, el proceso de fraccionamiento como se describe en la presente, también es adecuado para el fraccionamiento de los mono-, di-y triglicéridos que se encuentran en la llamada pasta de neutralización a partir de los

30 procesos de refinación alcalina de los aceites producidos. De esta manera, la pasta de neutralización puede convertirse cuantitativamente, sin saponificación previa de los aceites neutros, en ácidos grasos. A tal efecto, los ácidos grasos que están químicamente unidos en los jabones se liberan, preferentemente antes del fraccionamiento, a través de una adición de ácido. En ciertas realizaciones, una solución tampón se usa además del agua y la enzima para el proceso de fraccionamiento.

35 En una realización, los aceites producidos de acuerdo con los métodos divulgados en la presente también pueden someterse a saponificación como un método de hidrólisis. Los aceites animales y vegetales se hacen típicamente de triacilgliceroles (TAG), los cuales son ésteres de ácidos grasos con el alcohol trihídrico, glicerol. En una reacción de hidrólisis alcalina, el glicerol en un TAG se elimina, dejando tres aniones ácidos carboxílicos, que se pueden asociar con los cationes de metales alcalinos tales como el sodio o el potasio, para producir sales de ácidos grasos. En este

40 esquema, los constituyentes de los ácidos carboxílicos se disocian de la fracción del glicerol y se reemplazan con grupos hidroxilo. La cantidad de base (por ejemplo, KOH) que se usa en la reacción está determinada por el grado deseado de saponificación. Si el objetivo es, por ejemplo, producir un producto de jabón que comprenda algunos de los aceites originalmente presentes en la composición de TAG, se introduce en la mezcla de reacción una cantidad de base suficiente para convertir todos los TAG en sales de ácidos grasos. Normalmente, esta reacción se lleva a cabo en una

45 solución acuosa y ocurre lentamente, pero se puede acelerar mediante la adición de calor. La precipitación de las sales de ácidos grasos se puede facilitar mediante la adición de sales, tales como los haluros de metales alcalinos solubles en agua (por ejemplo, NaCl o KCl), a la mezcla de reacción. Preferentemente, la base es un hidróxido de metal alcalino, tal como NaOH o KOH. Como alternativa, otras bases, tales como alcanolaminas, incluyendo por ejemplo la trietanolamina y el aminometilpropanol, se pueden usar en el esquema de reacción. En algunos casos, estas alternativas pueden ser

50 preferibles para producir un producto jabonoso claro.

En algunos métodos, la primera etapa de modificación química puede ser el hidroprocesamiento para saturar los dobles enlaces, seguido por la desoxigenación a temperatura elevada en presencia de hidrógeno y un catalizador. En otros métodos, la hidrogenación y la desoxigenación pueden ocurrir en la misma reacción. En aún otros métodos, la desoxigenación ocurre antes de la hidrogenación. La isomerización se puede entonces llevar a cabo opcionalmente,

55 también en presencia de hidrógeno y un catalizador. Finalmente, los gases y los componentes de nafta se pueden eliminar si se desea. Por ejemplo, ver las patentes de los Estados Unidos núms. 5,475,160 (Hidrogenación de triglicéridos); 5,091,116 (Desoxigenación, hidrogenación y eliminación de gas); 6,391,815 (Hidrogenación); y 5,888,947 (Isomerización).

15 La hidrogenación del aceite producido por los métodos descritos en la presente, se puede llevar a cabo en conjunto con uno o más de los métodos y/o materiales proporcionados en la presente, como se indica en los siguientes documentos: patentes de los Estados Unidos núms. 7,288,278 (Aditivos de alimentos o medicamentos); 5,346,724 (Productos para lubricación); 5,475,160 (Alcoholes grasos); 5,091,116 (Aceites comestibles); 6,808,737 (Grasas estructurales para margarina para untar); 5,298,637 (sustitutos de grasas reducidos en calorías); 6,391,815 (Catalizador de hidrogenación y adsorbente de azufre); 5,233,099 y 5,233,100 (Alcoholes grasos); 4,584,139 (Catalizadores de hidrogenación); 6,057,375 (Agentes supresores de espuma); y 7,118,773 (Emulsión comestible para untar).

5 hidrogenación-hidrogenólisis consecutiva, hidrogenólisis-hidrogenación consecutiva, y reacciones de hidrogenaciónhidrogenólisis combinadas, dando como resultado, al menos, la eliminación parcial del oxígeno de los ácidos grasos o de los ésteres de ácidos grasos para producir productos de reacción, tales como alcoholes grasos, que se pueden convertir fácilmente a los productos químicos deseados mediante el procesamiento posterior. realización, un alcohol graso se puede convertir a olefinas mediante la reacción de FCC o a alcanos superiores a través de una reacción de condensación. Una de tales modificaciones químicas es la hidrogenación, la cual es la adición de hidrógeno a los dobles enlaces en los ácidos grasos constituyentes de los glicerolípidos o de los ácidos grasos libres. El proceso de hidrogenación permite la transformación de los aceites líquidos en grasas semisólidas o sólidas, las cuales pueden ser más adecuadas para aplicaciones específicas.

Los aceites triglicéridos se pueden desoxigenar parcial o totalmente. productos deseados, que incluyen pero sin limitarse a, ácidos grasos, alcoholes grasos, polioles, cetonas y aldehídos. imagen35En general, sin estar limitados por ninguna teoría en particular, las reacciones de

Un experto en la materia reconocerá que se pueden usar varios procesos para hidrogenar los carbohidratos. Un método conveniente incluye poner en contacto los carbohidratos con hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador, bajo condiciones suficientes en un reactor de hidrogenación para formar un producto

25 hidrogenado. El catalizador de la hidrogenación generalmente puede incluir Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sean solos o con promotores, tales como W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. Otros materiales catalizadores de la hidrogenación efectivos incluyen tanto el níquel soportado o el rutenio modificado con renio. En una realización, el catalizador de la hidrogenación también incluye cualquiera de los soportes, dependiendo de la funcionalidad deseada del catalizador. Los catalizadores de la hidrogenación se pueden preparar por los métodos conocidos por los expertos en la materia.

En algunas realizaciones, el catalizador de la hidrogenación incluye un catalizador de metal del grupo VIII soportado y un material de esponja de metal (por ejemplo, un catalizador de esponja de níquel). El níquel Raney proporciona un ejemplo de un catalizador de esponja de níquel activado, adecuado para su uso. En otra realización, la reacción de

35 hidrogenación en el método divulgado se lleva a cabo usando un catalizador que comprende un catalizador de níquelrenio o un catalizador de níquel-tungsteno modificado. Un ejemplo de un catalizador adecuado para la reacción de hidrogenación de la invención es un catalizador de níquel-renio soportado en carbono.

En una realización, un catalizador de níquel Raney adecuado se puede preparar mediante el tratamiento de una aleación de cantidades aproximadamente iguales en peso de níquel y aluminio con una solución alcalina acuosa, por ejemplo, que contiene aproximadamente 25% en peso de hidróxido de sodio. El aluminio se disuelve selectivamente por la solución alcalina acuosa, dando como resultado un material en forma de esponja que comprende mayormente níquel con pequeñas cantidades de aluminio. La aleación inicial incluye metales promotores (a saber, molibdeno o cromo) en cantidades tales que aproximadamente del 1 al 2% del peso se mantiene en el catalizador en forma de esponja de níquel. En otra realización, el catalizador de la hidrogenación se prepara usando una solución de nitrosilnitrato de

45 rutenio (III), cloruro de rutenio (III) en agua para impregnar un material de soporte adecuado. La solución entonces se seca para formar un sólido que tiene un contenido de agua de menos de aproximadamente el 1% en peso. El sólido puede entonces reducirse a la presión atmosférica en una corriente de hidrógeno a 300°C (sin calcinarse) o 400°C (calcinado) en un horno rotatorio de bolas durante 4 horas. Después de enfriarse y dar lugar al catalizador inerte con nitrógeno, 5% en volumen del oxígeno en el nitrógeno se pasa sobre el catalizador durante 2 horas.

En ciertas realizaciones, el catalizador descrito incluye un soporte de catalizador. El soporte del catalizador estabiliza y soporta el catalizador. El tipo de soporte del catalizador usado depende del catalizador escogido y de las condiciones de reacción. Los soportes adecuados de este tipo incluyen, pero sin limitarse a, carbono, sílice, sílice-alúmina, zirconio, titania, ceria, vanadio, nitruro, nitruro de boro, heteropoliácidos, hidroxiapatito, óxido de zinc, cromía, zeolita, nanotubos de carbono, fullereno de carbono y cualquier combinación de éstos.

55 Los catalizadores utilizados se pueden preparar por los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los métodos adecuados pueden incluir, pero sin limitarse a, humedecimiento incipiente, impregnación evaporativa, deposición química de vapor, lavado de recubrimiento, técnicas de pulverización catódica, y similares.

Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenación varían en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la materia, con el beneficio de esta divulgación, reconocerá las condiciones de

15 molécula que tiene un peso molecular más pequeño, que puede incluir un número menor de átomos de carbono o de átomos de oxígeno que los carbohidratos de partida. En una realización, los productos de reacción son moléculas más pequeñas que incluyen polioles y alcoholes. Una persona con conocimientos comunes en la materia sería capaz de seleccionar el método apropiado para llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis.

10 esta conversión es a través de una reacción de hidrogenólisis. Varios procesos se hidrogenólisis de los carbohidratos. Un método apropiado incluye poner en contacto un hidrógeno o hidrógeno mezclado con un gas adecuado y un catalizador de hidrogenólisis hidrogenólisis, bajo condiciones suficientes para formar un producto de reacción que comprende moléculas más pequeñas o polioles. Tal como se usa en la presente, el término "moléculas más pequeñas o polioles" incluye cualquier

En algunas realizaciones de la divulgación, es deseable convertir los carbohidratos de partida en una molécula más pequeña que será más fácil de convertirse en los hidrocarburos superiores deseados. Un método conveniente para

5 reciclado, hidrógeno generado in situ, y cualquier combinación de los mismos. término "hidrógeno externo" se refiere al hidrógeno que no se origina de la reacción de la biomasa en sí, sino que se añade al sistema de otra fuente.

reacción adecuadas. En general, la reacción de hidrogenación se lleva a cabo a temperaturas de 80°C a 250°C, y imagen36hidrogenación se lleva a cabo a presiones de 500 kPa a 14 000 kPa.

En algunas realizaciones, un alcohol de azúcar o azúcar de 5 y/o 6 carbonos se puede convertir a propilenglicol,

20 etilenglicol y glicerol con un catalizador de la hidrogenólisis. El catalizador de la hidrogenólisis puede incluir Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, y aleaciones o cualquier combinación de los mismos, ya sean solos o con promotores tales como Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O y aleaciones o cualquier combinación de los mismos. El catalizador de la hidrogenólisis puede incluir también un catalizador de piropolímero carbonoso que contiene metales de transición (por ejemplo, cromo, molibdeno, tungsteno, renio, manganeso, cobre, cadmio) o metales del grupo VIII (por

25 ejemplo, hierro, cobalto, níquel, platino, paladio, rodio, rutenio, iridio y osmio). En ciertas realizaciones, el catalizador de la hidrogenólisis puede incluir cualquiera de los metales anteriores, combinado con un óxido de metal alcalinotérreo o adherido a un soporte catalíticamente activo. En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de hidrogenólisis puede incluir un soporte de catalizador como el descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación.

Las condiciones para llevar a cabo la reacción de hidrogenólisis varían en función del tipo de material de partida y los

30 productos deseados. Un experto en la materia, con beneficio de esta divulgación, reconocerá las condiciones apropiadas a usar para llevar a cabo la reacción. En general, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo a temperaturas de 110°C a 300°C, y preferentemente de 170°C a 220°C, y con más preferencia de 200°C a 225ºC. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a cabo en condiciones básicas, preferentemente a un pH de 8 a 13, y aún con más preferencia a un pH de 10 a 12. En algunas realizaciones, la reacción de hidrogenólisis se lleva a

35 cabo a presiones en un intervalo entre 60 kPa y 16 500 kPa, y preferentemente en un intervalo entre 1700 KPa y 14000 KPa, y aún con más preferencia entre 4800 KPa y 11000 KPa.

El hidrógeno usado en la reacción de hidrogenólisis de la presente divulgación puede incluir hidrógeno externo, hidrógeno reciclado, hidrógeno generado in situ, y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, los productos de reacción mencionados anteriormente pueden convertirse en hidrocarburos

40 superiores a través de una reacción de condensación en un reactor de condensación (que se muestra esquemáticamente como el reactor de condensación 110 en la Figura 1). En tales realizaciones, la condensación de los productos de reacción se produce en presencia de un catalizador capaz de formar hidrocarburos superiores. Aunque sin pretender limitarse por la teoría, se cree que la producción de hidrocarburos superiores ocurre a través de una reacción de adición por pasos, la cual incluye la formación de enlaces carbono-carbono o enlaces carbono-oxígeno.

45 Los productos de reacción resultantes incluyen cualquier número de compuestos que contienen estos residuos, tal como se describe con más detalle a continuación.

En ciertas realizaciones, los catalizadores de condensación adecuados incluyen un catalizador ácido, un catalizador básico, o un catalizador ácido/básico. Como se usa en la presente, el término “catalizador ácido/básico” se refiere a un catalizador que tiene una funcionalidad ácido y una base. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación 50 puede incluir, sin limitarse a, zeolitas, carburos, nitruros, zirconio, alúmina, sílice, aluminosilicatos, fosfatos, óxidos de titanio, óxidos de zinc, óxidos de vanadio, óxidos de lantano, óxidos de itrio, óxidos de escandio, óxidos de magnesio, óxidos de cerio, óxidos báricos, óxidos de calcio, hidróxidos, heteropoliácidos, ácidos inorgánicos, resinas ácidas modificadas, resinas básicas modificadas, y cualquier combinación de éstos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación puede incluir, además, un modificador. Los modificadores adecuados incluyen La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na,

55 K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, y cualquier combinación de éstos. En algunas realizaciones, el catalizador de condensación puede incluir, además, un metal. Los metales adecuados incluyen Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, aleaciones, y cualquier combinación de éstos.

En ciertas realizaciones, el catalizador descrito en la reacción de condensación puede incluir un soporte de catalizador como el descrito anteriormente para la reacción de hidrogenación. En ciertas realizaciones, el catalizador de la

15 que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, alquenos de cadena recta o ramificada que tienen de 4 a 30 átomos de carbono, cicloalcanos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, cicloalquenos que tienen de 5 a 30 átomos de carbono, arilos, arilos fusionados, alcoholes, y cetonas. Los alcanos adecuados incluyen, pero sin limitarse a, butano, pentano, penteno, 2-metilbutano, hexano, hexeno, 2-metilpentano, 3-metilpentano, 2,2-dimetilbutano, 2,3-dimetilbutano, heptano, hepteno, octano, octeno, 2,2,4-trimetilpentano, 2,3-dimetilo hexano, 2,3,4-trimetilpentano, 2,3-dimetilpentano, nonano,

Los alcanos superiores formados por la divulgación incluyen, pero sin limitarse a, alcanos de cadena recta o ramificada

10 realizaciones, la temperatura de la reacción de condensación se encuentra en un preferentemente de 125ºC a 450°C, y con la máxima preferencia de 125ºC a 250°C. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a presiones en un intervalo de 0 kPa a 9000 kPa, y preferentemente en un intervalo entre 0 kPa y 7000 KPa, y aún con la máxima preferencia entre 0 kPa y 5000 KPa.

5 Las condiciones bajo las cuales la reacción de condensación se produce varían en función del tipo de material de partida y los productos deseados. Un experto en la materia, con condiciones apropiadas a usar para llevar a cabo la reacción. En algunas realizaciones, la reacción de condensación se lleva a cabo a una temperatura en la cual la termodinámica de la reacción propuesta sea favorable. La temperatura para la reacción de condensación varía dependiendo del poliol o alcohol de partida específico.

condensación es autosoportado. Tal como se usa en la presente, el término "autosoportado" significa que el catalizador imagen37no necesita de otro material que le sirva de soporte. catalizador de la condensación es sílice.

20 noneno, decano, deceno, undecano, undeceno, dodecano, dodeceno, tridecano, trideceno, tetradecano, tetradeceno, pentadecano, pentadeceno, nonildecano, nonildeceno, eicosano, eicoseno, uneicosano, uneicoseno, doeicosano, doeicoseno, trieicosano, trieicoseno, tetraeicosano, tetraeicoseno, e isómeros de éstos. Algunos de estos productos pueden ser adecuados para usar como combustibles.

En algunas realizaciones, los cicloalcanos y los cicloalquenos son no sustituidos. En otras realizaciones, los

25 cicloalcanos y los cicloalquenos son monosustituidos. En aún otras realizaciones, los cicloalcanos y los cicloalquenos son multisustituidos. En las realizaciones que comprenden los cicloalcanos y cicloalquenos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin limitarse a, un alquil de cadena recta o ramificada que tiene 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena recta o ramificada que tiene 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo, y cualquier combinación de éstos. Los cicloalcanos y cicloalquenos incluyen, pero sin limitarse a, ciclopentano, ciclopenteno, ciciclohexano, ciclohexeno,

30 metil-ciclopentano, metil-ciclopenteno, etil-ciclopentano, etil-ciclopenteno, etil-ciciclohexano, etil-ciclohexeno, isómeros y cualquier combinación de éstos.

En algunas realizaciones, los arilos formados son no sustituidos. En otra realización, los arilos formados son monosustituidos. En las realizaciones que comprenden los arilos sustituidos, el grupo sustituido incluye, sin limitarse a, un alquil de cadena recta o ramificada que tiene 1 a 12 átomos de carbono, un alquileno de cadena recta o ramificada

35 que tiene 1 a 12 átomos de carbono, un fenilo, y cualquier combinación de éstos. Los arilos adecuados incluyen, pero sin limitarse a, benceno, tolueno, xileno, etil benceno, para xileno, meta xileno, y cualquier combinación de éstos.

Los alcoholes producidos de acuerdo con la divulgación tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los alcoholes son cíclicos. En otras realizaciones, los alcoholes son ramificados. En otra realización, los alcoholes son de cadena recta. Los alcoholes adecuados incluyen, pero sin limitarse a, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol,

40 nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptildecanol, octildecanol, nonildecanol, eicosanol, uneicosanol, doeicosanol, trieicosanol, tetraeicosanol, e isómeros de éstos.

Las cetonas producidas de acuerdo con la divulgación tienen de 4 a 30 átomos de carbono. En una realización, las cetonas son cíclicas. En otra realización, las cetonas son ramificadas. En otra realización, las cetonas son de cadena recta. Las cetonas adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona,

45 nonanona, decanona, undecanona, dodecanona, tridecanona, tetradecanona, pentadecanona, hexadecanona, heptildecanona, octildecanona, nonildecanona, eicosanona, uneicosanona, doeicosanona, trieicosanona, tetraeicosanona, e isómero de éstos.

Otra de tales modificaciones químicas es la interesterificación. Los glicerolípidos producidos naturalmente no tienen una distribución uniforme de los constituyentes de los ácidos grasos. En el contexto de los aceites, la interesterificación se 50 refiere al intercambio de radicales acilo entre dos ésteres de diferentes glicerolípidos. El proceso de interesterificación proporciona un mecanismo mediante el cual los constituyentes de los ácidos grasos de una mezcla de glicerolípidos pueden reordenarse para modificar el patrón de distribución. La interesterificación es un proceso químico conocido, y generalmente comprende calentar (a aproximadamente 200°C) una mezcla de aceites por un período de tiempo (por ejemplo, 30 minutos) en presencia de un catalizador, tal como un metal alcalino o metal alcalino alquilado (por ejemplo,

55 metóxido de sodio). Este proceso se puede usar para seleccionar al azar el patrón de distribución de los constituyentes de los ácidos grasos de una mezcla de aceite, o puede dirigirse para producir un patrón de distribución deseado. Este método de modificación química de los lípidos se puede llevar a cabo en los materiales proporcionados en la presente, tal como la biomasa microbiana, con un porcentaje de peso seco de las células como lípidos de al menos el 20%.

15 para productos alimentarios); 5,434,278 (Grasas comestibles para productos alimentarios); 5,268,192 (Productos de nueces bajos en calorías); 5,258,197 (Composiciones comestibles reducidas en calorías); 4,335,156 (Producto de grasa comestible); 7,288,278 (Aditivos de alimentos o medicamentos); 7,115,760 (Proceso de fraccionamiento); 6,808,737 (Grasas estructurales); 5,888,947 (Lubricantes para motor); 5,686,131 (Mezclas de aceites comestibles); y 4,603,188 (Composiciones de uretanos curables). En una realización de conformidad con la divulgación, la transesterificación del aceite, según lo descrito anteriormente, se sigue por la reacción del producto transesterificado con poliol, como se divulgó en la patente de los Estados Unidos núm. 6,465,642, para producir el poliol poliéster de ácido graso. Este proceso de esterificación y separación puede comprender los siguientes pasos: reaccionar un éster de alquilo inferior con el poliol en presencia de jabón; eliminar los restos de jabón de la mezcla de productos; lavar con agua y secar la mezcla de productos para eliminar las impurezas;

5 ácidos grasos en el aceite hayan precipitado, por ejemplo. Un proceso de interesterificación dirigida puede usarse, por ejemplo, para producir un producto con un contenido calórico inferior a través de la sustitución de los ácidos grasos de cadena larga con sus homólogos de cadena más corta. La interesterificación dirigida también se puede usar para producir un producto con una mezcla de grasas que pueden proporcionar las características de fusión deseadas y los rasgos estructurales buscados en los aditivos o productos alimentarios (por ejemplo, la margarina) sin recurrir a la hidrogenación, la cual puede producir isómeros trans no deseados. La interesterificación de aceites producidos por los métodos descritos en la presente se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales, o para producir productos, como se documentos: patente de los Estados Unidos núms. 6,080,853 (Sustitutos de grasas (Estabilizador de mantequilla de maní); 5,391,383 (Atomizador de aceite comestible); 6,022,577 (Grasas comestibles

La interesterificación dirigida, en la cual se busca un patrón de distribución específica de los ácidos grasos, se puede imagen38

25 blanquear la mezcla de productos para su refinación; separar al menos una porción del éster de alquilo inferior sin reaccionar del poliol poliéster de ácido graso en la mezcla de productos; y reciclar el éster de alquilo inferior sin reaccionar separado.

La transesterificación también se puede llevar a cabo en la biomasa microbiana con ésteres de ácidos grasos de cadena corta, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 6,278,006. En general, la transesterificación se puede realizar mediante la adición de un éster de ácido graso de cadena corta a un aceite en presencia de un catalizador adecuado, y calentando la mezcla. En algunas realizaciones, el aceite comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 90% de la mezcla de reacción en peso. En algunas realizaciones, los ésteres de ácidos grasos de cadena corta pueden constituir aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de la mezcla de reacción en peso. Los ejemplos no limitantes de catalizadores incluyen catalizadores básicos, metóxido de sodio, catalizadores ácidos,

35 incluyendo ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico y arcillas acidificadas, ácidos orgánicos tales como ácido metano sulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido toluenosulfónico, y resinas ácidas, tales como Amberlyst 15. Los metales tales como sodio y magnesio, y los hidruros de metales son también catalizadores útiles.

Otra modificación química es la hidroxilación, la cual involucra la adición de agua a un doble enlace lo que resulta en saturación e incorporación de un resto hidroxilo. El proceso de hidroxilación proporciona un mecanismo para la conversión de uno o más constituyentes de los ácidos grasos de un glicerolípido a un ácido graso hidroxilo. La hidroxilación se puede llevar a cabo, por ejemplo, a través del método descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 5,576,027. Los ácidos grasos hidroxilados, incluyendo el aceite de ricino y sus derivados, son útiles como componentes en diversas aplicaciones industriales, incluyendo los aditivos alimentarios, agentes surfactantes, agentes humectantes, pigmentos, agentes antiespumantes, aditivos impermeabilizantes, agentes plastificantes, emulsificantes 45 cosméticos y/o agentes desodorantes, así como en la electrónica, productos farmacéuticos, pinturas, tintas, adhesivos, y lubricantes. Un ejemplo de cómo se puede realizar la hidroxilación de un glicérido es como sigue: la grasa se puede calentar, preferentemente a aproximadamente 30-50°C combinada con heptano y se mantiene a la temperatura durante treinta minutos o más; después se puede agregar ácido acético a la mezcla seguido de una solución acuosa de ácido sulfúrico seguido por una solución acuosa de peróxido de hidrógeno la cual se añade en pequeños incrementos a la mezcla durante una hora; después del peróxido de hidrógeno acuoso, la temperatura puede entonces incrementarse hasta al menos aproximadamente 60°C y sagita al menos durante seis horas; después de la agitación la mezcla se deja reposar y una capa acuosa inferior formada por la reacción puede eliminarse mientras que la capa superior de heptano formada por la reacción se puede lavar con agua caliente a una temperatura de aproximadamente 60°C, la capa de heptano lavada se puede después neutralizar con una solución acuosa de hidróxido de potasio a un pH de

55 aproximadamente 5 a 7 y después se elimina por destilación al vacío; el producto de reacción puede secarse después al vacío a 100°C y el producto seco se desodoriza con vapor en condiciones de vacío y se filtra a aproximadamente 50° a 60°C usando tierra de diatomáceas.

La hidroxilación de los aceites microbianos producidos por los métodos descritos en la presente se puede realizar conjuntamente con uno o varios de los métodos y/o materiales, o para producir los productos como se divulga en los siguientes documentos: patente de los Estados Unidos núm. 6,590,113 (Recubrimientos y tinta basados en aceite); 4,049,724 (Proceso de hidroxilación); 6,113,971 (Mantequilla de aceite de oliva); 4,992,189 (Lubricantes y aditivos de lubricantes); 5,576,027 (Leche hidroxilada); y 6,869,597 (Cosméticos).

La generación de biomasa microbiana oleaginosa para combustibles y productos químicos anteriormente, resulta en la producción de harina de biomasa deslipidada. La harina deslipidada es un subproducto de la preparación de aceite de algas y es útil para la alimentación animal para animales de granja, por ejemplo, rumiantes, aves de corral, cerdos y para la acuicultura. La harina resultante, aunque tiene un contenido reducido de aceites,

10 Otras reacciones químicas que se pueden realizar en los aceites microbianos incluyen reaccionar los triacilgliceroles con un agente de ciclopropanación para aumentar la fluidez y/o estabilidad oxidativa, como se reporta en la patente de los Estados Unidos 6,051,539; fabricar ceras a partir de triacilgliceroles, como se reporta en la patente de los Estados Unidos 6,770,104; y epoxidación de triacilgliceroles, como se reporta en "The effect of fatty acid composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) y en 15 Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004).

5 71(2): 169-174 (1994). Los estólidos son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo sin limitación a las descritas en los siguientes documentos: patentes de los Estados Unidos núms. 7,196,124 (Materiales elastoméricos y recubrimientos de pisos); 5,458,795 (Aceites engrosados para aplicaciones de altas temperaturas); 5,451,332 (Fluidos para aplicaciones industriales); 5,427,704 (Aditivos de combustibles); y 5,380,894 (Lubricantes, grasas, plastificantes, y tintas para impresión).

Los glicerolípidos hidroxilados se pueden convertir en estolides. Los estolides consisten de un glicerolípido en el cual un imagen39constituyente de ácido graso hidroxilado se ha esterificado a

20 todavía contiene proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibra, cenizas, restos de aceite y otros nutrientes adecuados para una alimentación animal. Debido a que las células están predominantemente lisadas por el proceso de separación de los aceites, la harina deslipidada es fácilmente digerible por estos animales. La harina deslipidada opcionalmente se puede combinar con otros ingredientes, tales como granos, en un alimento animal. Debido a que la harina deslipidada tiene una consistencia de polvo, se puede comprimir en gránulos usando un extrusor o extensor u otro tipo de máquina,

25 las cuales se encuentran comercialmente disponibles.

La invención, que se describió en detalle anteriormente, se ejemplifica en los siguientes ejemplos, que se ofrecen para ilustrar pero no para limitar, la invención reivindicada.

VII. EJEMPLOS Ejemplo 1: Métodos para el cultivo de Prototheca

30 Las cepas de Prototheca se cultivaron para lograr un alto porcentaje de aceite por peso seco de células. Las células criopreservadas se descongelaron a temperatura ambiente y 500 µl de células se añadieron a 4.5 ml de medio (4.2 g/l de K2HPO4, 3.1 g/l de NaH2PO4, 0.24 g/l de MgSO4 • 7H2O, 0.25 g/l de ácido cítrico monohidrato, 0.025 g/l de CaCl2 2H2O, 2 g/l de extracto de levadura) más 2% de glucosa y crecieron durante 7 días a 28°C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. El peso seco de las células se determinó por centrifugación de 1 ml de cultivo a 14000 rpm

35 durante 5 min en un tubo Eppendorf pre-pesado. El sobrenadante de cultivo se desechó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 ml de agua desionizada. El cultivo se centrifugó de nuevo, se desechó el sobrenadante, y el sedimento de células se colocó a -80°C hasta que se congeló. Las muestras se liofilizaron después por 24 horas y se calculó el peso seco de las células. Para la determinación de lípidos totales en los cultivos, se retiraron 3 ml de cultivo y se sometieron a análisis mediante el uso de un sistema de Ankom (Ankom Inc., Macedon, NY), según el protocolo del

40 fabricante. Las muestras se sometieron a extracción por solventes con un extractor Amkom XT10 según el protocolo del fabricante. Los lípidos totales se determinaron como la diferencia de masa entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las muestras secas extraídas con disolvente. Las mediciones del porcentaje de aceite del peso seco de las células se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Porcentaje de aceite por peso seco de las células

Especie

Cepa % Aceite

Prototheca stagnora

UTEX 327 13.14

Prototheca moriformis

UTEX 1441 18.02

Prototheca moriformis

UTEX 1435 27.17

45 Se determinó el genotipo de las muestras de microalgas de las cepas que se enumeran en la Tabla 22 mostrada anteriormente. El ADN genómico se aisló a partir de la biomasa de algas de la siguiente manera. Las células de cultivos líquidos (aproximadamente 200 mg) se centrifugaron 5 minutos a 14,000 x g. Las células se resuspendieron después en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14,000 xg y se desechó el sobrenadante. Una sola perla de vidrio de

50 ~ 2 mm de diámetro se añadió a la biomasa y los tubos se colocaron a -80 °C durante al menos 15 minutos. Las muestras se retiraron y se añadieron 150 µl de tampón de molturación (Sarkosil 1%, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, ARNasa A 0.5 µg/µl). Los sedimentos se resuspendieron con una breve agitación, seguido por la adición de 40 µl de NaCl 5M. Las muestras se agitaron brevemente, seguido por la adición de 66 µl de CTAB 5% (bromuro cetil trimetilamonio) y una agitación breve final. Las muestras se incubaron a continuación a

55 65°C durante 10 minutos después de lo cual se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a 12:12:1, seguido por la centrifugación durante 5 minutos a 14,000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía

15 diluido y 3.2 µl dH2O. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo de la siguiente manera: 98°C, 45'', 98°C, 8'', 53 °C, 12'', 72°C, 20'' por 35 ciclos seguidos de 72°C durante 1 min y se mantuvo a 25°C. Para la purificación de los productos de la PCR, se añadieron a cada reacción 20 µl de Tris 10 mM, pH 8.0, seguido por la extracción fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12: 1, la agitación y centrifugación a 14,000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3,000 x g. Los

10 567-588 en el núm. de acceso L43357 del Gen Bank y está altamente conservada en superiores y plastidios de algas. Esto se siguió con la adición de 0.4 µl del CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’ (sec. con núm. de ident.: 10) a la concentración patrón de 10 mM). Esta secuencia del cebador es complementaria a la posición de 1112-1093 en el núm. de acceso L43357 del Gen Bank y es muy conservada en los genomas de plantas superiores y plastidios de algas. A continuación, se añadieron 5 µl del ADN total

8.0. Las reacciones de PCR, de volumen final de 20 µl, se establecieron de la siguiente manera. Diez µl de la mezcla maestra iProof HF 2 x (BIO-RAD) se añadieron a 0.4 µl del cebador SZ02613 (5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’ '(sec. con núm. de ident.: 9) a una concentración patrón de 10 mM). Esta secuencia del cebador corre de la posición

Cinco µl del ADN total de algas, que se preparó como se describió anteriormente, se diluyeron 1:50 en Tris 10 mM, pH

0.7 vol de isopropanol (~ 190 µl), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o toda imagen40

5 EDTA 1 mM (pH 8.0).

20 productos de la PCR purificados posteriormente se clonaron en TOPO en el PCR8/GW/TOPO y los clones positivos se seleccionaron en placas LB /Spec. El ADN del plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones mediante el uso de los cebadores M13 directo e inverso. En total, doce cepas de Prototheca se seleccionaron para tener las secuenciar de ADN de sus ARNr 23S y las secuencias se enumeran en la lista de secuencias. Un resumen de las cepas y los números del listado de secuencia se incluyen a continuación. Las secuencias se analizaron para la divergencia general

25 a partir de la secuencia de la UTEX 1435 (sec. con núm. de ident.: 15). Surgieron dos pares (UTEX 329/UTEX 1533 y UTEX 329/UTEX 1440) como los de máxima divergencia. En ambos casos, el alineamiento de pares resultó en 75.0% de identidad de secuencia por pares. El porcentaje de identidad de secuencia con UTEX 1435 también se incluye a

continuación. Especie

Prototheca kruegani Prototheca wickerhamii Prototheca stagnora Prototheca moriformis Prototheca moriformis

Prototheca wikerhamii Prototheca moriformis Prototheca zopfii Prototheca moriformis

Cepa % identidad nt Sec. con núm

ident

UTEX 329

75.2 sec. con núm

ident.: 11

UTEX 1440

99 sec. con núm

ident.: 12

UTEX 1442

75.7 sec. con núm. ident.:

13

UTEX 288

75.4 sec. con núm

ident.: 14

UTEX 1439; 1441; 1435; 1437

100 sec. con núm

ident.: 15

UTEX 1533

99.8 sec. con núm

ident.: 16

UTEX 1434

75.9 sec. con núm

ident.: 17

UTEX 1438

75.7 sec. con núm

ident.: 18

UTEX 1436

88.9 sec. con núm

ident.: 19

30 Las muestras de lípidos de un subconjunto de las cepas enumeradas anteriormente se analizaron para el perfil lipídico usando HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 9.

Tabla 9. Diversidad de cadenas de lípidos en especies de microalgas

Cepa

C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1

UTEX 327

0 12.01 0 0 50.33 17.14 0 0 0

UTEX 1441

1.41 29.44 0.70 3.05 57.72 12.37 0.97 0.33 0

UTEX

1.09 25.77 0 2.75 54.01 11.90 2.44 0 0

5 imagen41adicional mediante los programas de software PSORT

10

de expresión heteróloga a continuación.

ADNc P.moriformis isopentenil difosfato sintasa PTS

15 P.moriformis delta 12-desaturasa de ácido graso PTS P.moriformis estearoil ACP desaturasa PTS C.protothecoides estearoil ACP desaturasa PTS Cuphea hookeriana acilo graso-ACP tioesterasa (C8-10) Umbellularia californica acil graso-ACP tioesterasa (C12) 20 Cinnamomum camphora acil graso-ACP tioesterasa (C14) sec. con núm. ident.: 133

Ejemplo 2: Cultivo de Prototheca en diversas materias primas

A. Sorgo

Las siguientes cepas demostraron ser capaces de usar el sorgo como única fuente de carbono: las cepas de Prototheca moriformis UTEX 1435, UTEX 1437, UTEX 288, UTEX 1439, UTEX 1441 y UTEX 1434, y la cepa de Prototheca

25 stagnora UTEX 1442. La designación "UTEX" indica el número de cepa de la colección de cultivos de algas de la Universidad de Texas, Universidad del Estado A6700, Austin, Texas 78712-0183.

El sorgo puro se adquirió de Maasdam Sorghum Mills (Lynnville, Iowa) con un perfil de azúcar 21.0% p/p de fructosa, 28.0% p/p de dextrosa, 16.0% p/p de sacarosa y <0.5% p/p de maltosa. Los cultivos se cultivaron en medio líquido que contenía 2%, 5% o 7% (v/v) de sorgo puro (diluido del patrón puro) como la única fuente de carbono y los cultivos se

30 cultivaron heterótrofamente en la oscuridad, con agitación a ~ 350 rpm. Se sacaron muestras de los cultivos a las 24, 40, 48, 67 y 89 horas y el crecimiento se midió mediante el uso de lecturas en un espectrofotómetro a A750. Se observó crecimiento en cada una de las cepas que se probaron como se muestra en las Figuras 1-2

B. Celulosa

El rastrojo de maíz explotado, el Miscanthus, el sorgo forrajero, la pulpa de remolacha y el bagazo de caña de azúcar

35 húmedos, se prepararon por el National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO) mediante la cocción en una solución 1.4% de ácido sulfúrico y desecación de la mezcla resultante. El porcentaje de sólidos se determinó gravimétricamente por secado y fue el siguiente: los sólidos del rastrojo de maíz 25%; los sólidos de Miscanthus 28.7%, los sólidos del sorgo forrajero 26.7%, y los sólidos del bagazo de la caña de azúcar 26%.

Muestras húmedas de 100 gramos los materiales celulósicos explotados (rastrojo de maíz o pasto forrajero) se

40 resuspendieron en agua desionizada hasta un volumen final de 420 ml y el pH se ajustó a 4.8 con NaOH 10N. Para la pulpa de remolacha, 9.8 gramos de los sólidos secos se llevaron a 350 ml con agua desionizada y el pH se ajustó a 4.8 con NaOH 10 N. Para todas las materias primas anteriores, se usó la Accellerase 1000 (Genencor, Nueva York) en una proporción de 0.25 ml de la enzima por gramo de biomasa seca para la sacarificación de los materiales celulósicos. Las muestras se incubaron con agitación (110 rpm) a 50 o C durante 72 horas. El pH de cada una de las muestras se ajustó

45 a 7.0 con NaOH (con cambio de volumen despreciable), se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0.22 µm y se usó en los procesos que se detallan a continuación. Para los procesos de mayor escala, se siguió el mismo procedimiento para la sacarificación, excepto un paso adicional de filtración de flujo tangencial (TFF) o un paso de microfiltración que se llevó a cabo para ayudar en la esterilización por filtración de las materias primas. Una muestra de cada una de las materias primas que se prepararon se reservó para la determinación de la concentración de glucosa y

50 xilosa mediante un sistema que se basa en HPLC/ELSD o un kit que se basa en la hexoquinasa (Sigma). Además, para la pulpa de remolacha, el material se llevó inicialmente a un volumen como con las otras materias primas, el pH se ajustó posteriormente a 4.0 y se realizó un tratamiento con pectinasa a 50 o C durante 24 horas. El pH se ajustó entonces a 4.8 si no se llevaron a cabo los procesos de lavado o 5.3 si se llevaron a cabo los procesos de lavado. La sacarificación enzimática se realizó entonces con el mismo procedimiento que usó para las otras materias primas como

55 se describió anteriormente.

La cepa UTEX 1435 de microalgas Prototheca moriformis se evaluó por su capacidad de crecer en una serie de materias primas celulósicas que se prepararon como se describió anteriormente (el rastrojo de maíz, la pulpa de remolacha, la caña de sorgo, el Miscanthus y el control de glucosa). El cultivo de microalgas creció en las condiciones descritas en el Ejemplo 1 anterior, con excepción de la fuente de carbono. La fuente de carbono fue 4% de glucosa

60 (para las condiciones de control) o 4% de glucosa medida por la glucosa disponible en los materiales celulósicos. El

15 mantener la concentración de glucosa a 20 g/l. El crecimiento se midió en base al peso seco de la célula del cultivo y la productividad de los lípidos se determinó como un porcentaje del peso seco de las células. Los lípidos totales se determinaron gravimétricamente mediante el uso de un sistema de Ankom de hidrólisis ácida/extracción por solvente como se describió en el Ejemplo 1 anterior.

10 glucosa reactivo (condición de 50% del rastrojo de maíz que se suplementó con glucosa a 18 g/l en la Figura 7b), 9 g/l de glucosa de azúcares celulósicos derivados del rastrojo de maíz (50% del rastrojo de maíz, que no se suplementó; glucosa a condición de 9 g/l en la Figura 7b) y un cultivo de control de 42g/l de la glucosa reactivo y 13 g/l de la xilosa reactivo para el control de la osmolaridad. Todos los cultivos se alimentaron con azúcares celulósicos para mantener la concentración de glucosa de 20 g/l, a excepción del cultivo de control, que se alimentó con la glucosa reactiva para

5 En base a los resultados anteriores con los azúcares celulósicos derivados del rastrojo de maíz, también se evaluó la acumulación de lípidos en Prototheca moriformis mediante el uso derivados del rastrojo de maíz y glucosa reactivo como control. Los cultivos crecieron en 18 g/l de glucosa que era completamente de azúcares celulósicos derivados del rastrojo de maíz (condición 100% del rastrojo de maíz en la Figura 7b), 9 g/l de glucosa de azúcares celulósicos derivados del rastrojo de maíz que se suplementó con 9 g/l de

crecimiento se evaluó por las lecturas a A750 y el tiempo de cultivo fue de 168 horas, con lecturas a A750 a las 48, 72, imagen42Prototheca moriformis Miscanthus

Como se puede observar en la Figura 7b, en base a la acumulación de biomasa (medida por el PSC), todas las

20 concentraciones de los celulósicos derivados del rastrojo de maíz superaron (mayor PSC) el medio de control que se alimentó con glucosa sola. La producción de lípidos como porcentaje del PSC se calculó también para todas las condiciones. Además de la acumulación más alta de biomasa que se observó para el crecimiento en el rastrojo de maíz, la acumulación de lípidos también fue mayor en las condiciones de los celulósicos derivados del rastrojo de maíz en comparación con la condición de control de glucosa. Estos datos demostraron que, además de proporcionar azúcares

25 derivados de celulósicos, el rastrojo de maíz proporciona nutrientes adicionales/componentes que contribuyen a una mayor acumulación de biomasa (crecimiento) y un mayor rendimiento del producto.

Debido a que las materias primas celulósicas contienen componentes, además de la glucosa, algunos de estos componentes adicionales se pueden acumular a niveles indeseables en el cultivo, cuando otros azúcares derivados celulósicos se introducen en el cultivo como la principal fuente de carbono (por lo general, pero sin limitarse a, la 30 glucosa) se consumen. Por ejemplo, la xilosa presente en la materia prima de azúcar derivada de celulosa se puede acumular durante el cultivo de alta densidad de microalgas a niveles inhibitorios del crecimiento y la producción del producto final. Para probar los efectos de la acumulación de xilosa durante el cultivo de Prototheca, los cultivos se cultivaron con 4% de glucosa en el medio y se suplementó con 0.10 g/l, 25 g/l, 50 g/l y 100 g/l de xilosa. Después de 6 días de cultivo, se evaluó el crecimiento y la acumulación de lípidos mediante los métodos que se describieron 35 anteriormente. Como se observa en la Figura 7c, sorprendentemente, las mayores concentraciones de xilosa que se probaron no inhibieron la capacidad de la Prototheca moriformis para crecer y acumular lípidos y el cultivo en realidad creció más y acumuló más lípidos en las mayores concentraciones de xilosa. Para explorar este fenómeno, se llevó a cabo un experimento similar con sacarosa, una fuente de carbono, que el tipo salvaje de Prototheca moriformis es incapaz de metabolizar. No se observó impacto positivo con sacarosa, lo que sugiere que el aumento del crecimiento y

40 la acumulación de lípidos que se vio con la xilosa son atribuibles a un mecanismo distinto del estrés osmótico a partir de altas concentraciones de componentes sin metabolizar en el medio y es específico de la xilosa.

Además de los azúcares sin metabolizar, las sales se pueden acumular a niveles inhibitorios como consecuencia de la concentración de azúcares derivados de lignocelulósicos. Debido a la etapa de hidrólisis ácida con H2SO4 durante la preparación típica de materiales celulósicos, seguido de la neutralización del ácido con NaOH, se forma Na2SO4 durante 45 la generación de azúcares lignocelulósicos. Para evaluar el impacto de la concentración de sal en el crecimiento y la producción de lípidos, los cultivos de Prototheca moriformis se cultivaron en concentraciones de Na2SO4 en el intervalo desde 0 hasta 700 mM en medio suplementado con 4% de glucosa. Como se muestra en la Figura 7d, se observó una inhibición significativa del crecimiento, medida por la acumulación de PSC, donde las concentraciones de Na2SO4 estuvieron por encima de 25 mM, específicamente a concentraciones de 80 mM, 240 mM y 700 mM. Además, se evaluó 50 en la misma prueba el impacto del antiespumante P2000. El compuesto antiespumante tuvo un impacto positivo significativo sobre la productividad de la biomasa. La productividad de los lípidos también se evaluó para cada condición, y las concentraciones de Na2SO4 superiores a 80 mM, específicamente 240 mM y 700 mM, inhibieron, mientras que la adición del antiespumante P2000 aumentó significativamente la productividad de los lípidos. Así, en una realización, las etapas de cultivo de los métodos divulgados incluyen el cultivo en medio que contiene un agente

55 antiespumante.

En base a los resultados que se discutieron anteriormente y que se resumen en la Figura 7a, los inhibidores que probablemente estaban presentes en las materias primas de base celulósica exhibieron un crecimiento deficiente. La presente divulgación proporciona los medios de eliminación de tales compuestos mediante el lavado del material con agua caliente (tratamiento hidrotermal). La Figura 8 resume los resultados del crecimiento, medido por A750, mediante 60 el uso del azúcar derivado de materias primas celulósicas con un solo lavado con agua caliente. Las condiciones de cultivo fueron idénticas a las que se usaron en los procesos que se resumen en la Figura 7a. En comparación con los resultados que se muestran en la Figura 7a, después de sólo un lavado con agua caliente, los cultivos de Prototheca Se evaluó el impacto sobre el perfil lipídico de los cultivos de Prototheca moriformis que crecieron en los diversos azúcares derivados de lignocelulósicos con tratamiento hidrotérmico. Los cultivos de Prototheca moriformis se cultivaron 20 en las siguientes materias primas celulósicas que se lavaron 4 veces: el Miscanthus, el bagazo de la caña de azúcar y la caña de sorgo, con los niveles de glucosa que se mantuvieron a 20 g/l a través de la alimentación de los azúcares celulósicos. Al final del cultivo, en la biomasa de microalgas a partir de cada condición se analizó el perfil lipídico mediante el uso de los métodos que se describieron en el Ejemplo 1. Los resultados del análisis del perfil lipídico (que se expresó en % del área) se resumen en la Tabla 10 a continuación. Cada condición se probó por duplicado, y se

15 pueden ser inhibidores del crecimiento de microalgas (como se ve en la Figura 7a) y que el tratamiento hidrotérmico elimina estos compuestos y resulta en el aumento del crecimiento de microalgas, incluso mejor que el crecimiento en las condiciones de control de glucosa (como se ve en la Figura 8).

10 resumen en la Figura 7a. Para evaluar cómo el tratamiento hidrotérmico afectó los niveles de furfurales (FA) y hidroximetilfurfurales (HMF), los sobrenadantes resultantes de uno hasta tres lavados de la biomasa celulósica derivada del bagazo de la caña de azúcar (B), la caña de sorgo (S), el Miscanthus (M) o de la pulpa de remolacha (BP) se evaluaron por HPLC para los FA y los HMF. Como se muestra en la Figura 8, los niveles de AF y HMF disminuyeron de forma significativa con cada etapa de lavado. Este resultado es consistente con la observación de que los FA y los HMF

5 materiales celulósicos sometidos a un lavado de agua caliente exhibieron una mejor productividad de lípidos que el control de glucosa. Un impacto potencial del tratamiento hidrotérmico (lavado con agua caliente) de la biomasa celulósica es la eliminación de furfurales y hidroximetilfurfurales, liberados por la explosión ácida del material. La presencia de furfurales hidroximetilfurfurales puede que contribuyera al crecimiento limitado que se observó en algunos de los procesos que se

moriformis crecieron mejor en todas las materias primas celulósicas que se probaron, específicamente el bagazo de la imagen43caña de azúcar, la caña de sorgo, el Miscanthus

25 incluyeron los resultados de cada uno de los duplicados de las condiciones de prueba. El crecimiento en materias primas celulósicas resultó en una significativa redistribución en el perfil lipídico en comparación con el control de glucosa. Por ejemplo, hubo un aumento significativo de C18:0 % del área en todas las condiciones de materias primas celulósicas en comparación con la condición de control de glucosa.

Tabla 10. Perfil de lípidos de Prototheca moriformis cultivada en azúcares derivadas de glucosa y celulósicas.

glucosa 1 (ctrl)

glucosa 2 (ctrl) bagazo 1 bagazo 2 sorgo 1 sorgo 2 Miscan 1 Miscan 2

C10:0

n.d. n.d. 0.03 0.02 n.d. n.d. n.d. n.d.

C12:0

0.04 0.05 0.04 0.04 0.05 0.04 0.04 0.04

C14:0

1.64 1.64 1.07 1.10 1.17 1.14 1.08 1.12

C14:1

0.03 0.04 0.04 0.04 0.06 0.06 0.03 0.03

C15:0

0.04 0.05 0.07 0.05 0.08 0.08 0.06 0.06

C16:0

26.80 26.81 22.32 22.81 22.09 22.19 23.45 23.62

C16:1

0.75 0.82 1.68 1.70 1.92 2.12 1.38 1.23

C17:0

0.14 0.16 0.28 0.17 0.29 0.27 0.21 0.19

C17:1

0.07 0.06 0.10 0.10 0.13 0.12 0.10 0.09

C18:0

3.56 3.64 15.88 10.40 15.30 12.37 10.15 8.69

C18:1

54.22 54.01 49.87 53.87 49.35 50.80 54.05 55.26

C18:2

11.23 11.11 6.54 7.91 7.47 8.80 7.71 7.88

C18:3 alfa

0.84 0.85 0.39 0.56 0.47 0.53 0.56 0.60

C20:0

0.31 0.30 0.85 0.63 0.76 0.69 0.63 0.56

C20:1

0.15 0.15 0.33 0.28 0.32 0.32 0.27 0.25

C20:3

0.06 0.06 0.13 0.12 0.14 0.12 0.11 0.11

C24:0

0.12 0.12 0.22 0.19 0.22 0.20 0.18 0.15

30 n.d. denota ninguno detectado

La secuencia de azúcar celulósica se generó a partir del rastrojo de maíz explotado, sacarificado mediante el uso de la enzima Accellerase y se concentró por evaporación al vacío. Esta secuencia de azúcar se probó en ensayos de crecimiento de Prototheca moriformis a una concentración de 4% de glucosa. Los resultados de los ensayos de crecimiento mostraron un crecimiento muy pobre y se probó la conductividad de la secuencia del azúcar celulósica 35 (contenido de sal). La conductividad fue muy alta, mucho mayor de 700 mM equivalentes de sodio, un nivel que se mostró que tenía efectos inhibidores del crecimiento como se describió anteriormente y que se muestra en la Figura 7d. Los métodos de la divulgación incluyen métodos en los que se reduce o se elimina la sal de azúcares derivados de lignocelulósicos antes de usar estas materias primas en la producción de aceite de microalgas derivados de lignocelulósicos. Sorprendentemente, sin embargo, no se pueden usar resinas para la desalinización de las secuencias 40 de azúcar concentrado, primero hay que diluir la secuencia de azúcar concentrada. Para demostrar esta realización, los azúcares celulósicos derivados del material de rastrojo de maíz se diluyeron ocho veces antes de eliminar con la resina

imagen44

10 Un proceso que emplea un volumen de lecho: materias primas celulósicas de 1:4 y la re-concentración del material de ocho veces resultaría en una concentración de sodio que está bien dentro del intervalo para la biomasa normal y la acumulación de lípidos. Como alternativa, la desionización o eliminación de sales se puede realizar antes de la sacarificación o después de la sacarificación, pero antes de la concentración de la secuencia de azúcar. Si la

15 eliminación de sal se realiza antes de la concentración de la cadena de azúcar, un paso de dilución de la cadena de azúcar antes de la eliminación de sal, probablemente no sería necesario.

Este ejemplo demuestra la eficacia del lavado del material celulósico explotado para el uso en la producción de aceite celulósico. Como se describió anteriormente, la concentración de azúcares derivados de celulosa sin la eliminación de sales (inherente a la producción de material celulósico explotado y el posterior tratamiento) resultaron en fermentaciones 20 sub-óptimas. Los materiales tratados en el proceso descrito a continuación estaban en el pH apropiado para la posterior sacarificación. Además, la conductividad de este material se redujo significativamente (más de 100 veces) a partir de la materia prima de partida. Por lo tanto, los azúcares concentrados posteriormente que se usaron en fermentaciones, no inhibieron, debido a la presencia excesiva de sales. Una ventaja adicional es vista por la eliminación de furfurales del material celulósico. Cualquier xilosa o glucosa eliminada en la fracción hemicelulósica se puede desechar o

25 preferentemente re-concentrar para su uso en fermentaciones.

El bagazo de la caña de azúcar explotado, húmedo (NREL, Colorado), con una masa inicial de partida de 65 kg de peso húmedo y la conductividad de 15000 µS/cm, pH 2.4 se llevó a 128 kg con agua desionizada y se ajustó el pH a 4.6 con NaOH 10 N, lo que hizo la conductividad resultante de 6800 µS/cm). El porcentaje de sólidos se evaluó mediante el retiro de una alícuota de los materiales en suspensión a una cacerola de aluminio tarada (peso = t), se registró el peso

30 húmedo (peso = w), seguido por el secado durante tres horas a 110°C. Después de secar las muestras se trasladaron a un desecador y se dejaron a temperatura ambiente (25°C) y en ese momento, se volvieron a pesar (peso = d). El porcentaje de sólidos se calculó como: % de sólidos = [(d-t/w-t)] x 100. La conductividad se midió en un medidor de conductividad Thermo Electron Orion 3 Star.

El bagazo de la caña de azúcar se lavó de manera semi-continua mediante la mezcla continua de la pasta de celulosa

35 (porcentaje de sólidos iniciales del 8.2%) a una temperatura de 50°C en un reactor de acero inoxidable (150 l de capacidad). Los celulósicos se descargaron de la vasija del reactor a través de una bomba de carga rotatoria a una velocidad de flujo de 1.9-3.8 kg/min a una centrífuga decantadora Sharples Modelo 660. El permeado líquido se mantuvo en lotes (aprox. 35-175 kg alícuotas, véase la Tabla 12 a continuación) y se retiraron alícuotas homogéneas para la evaluación de los azúcares totales (glucosa y xilosa) y del porcentaje de sólidos como se describió en la Tabla

40 12. La conductividad y el pH del material celulósico se controlaron a través de la adición de agua desionizada y NaOH 10 N, respectivamente. Las muestras de 1-10 en la Tabla 12 representan el permeado que se decantó en la centrífuga, y, como tal, los sólidos y los azúcares presentes en estas fracciones se eliminaron del lavado final de los materiales celulósicos. Un cálculo de balance de masa de sólidos totales comparó los sólidos eliminados menos los sólidos que se perdieron más los sólidos finales para la sacarificación, lo que resultó en una recuperación del 99 % en el proceso

45 anterior. La Figura 8 resume la concentración de los furfurales y los hidroximetilfurfurales (mg/l) en cada una de los 11 permeados de centrífugas que se reunieron y se describieron en la Tabla 12. Estos datos demuestran una eliminación clara de los furfurales y los hidroximetilfurfurales del bagazo de la caña de azúcar.

Tabla 12. Balance de masa para el tratamiento hidrotérmico semi-continuo de bagazo de caña de azúcar.

Muestra

kg (húmedo) kg (seco) pH Conductividad μS/cm total de xilosa eliminada (g) total de glucosa eliminada (g)

1 (material inical)

128 10.50 4.60 6,880 0 0

2

81.8 2.03 3,280 1030.68 286.3

5

10

15

20

25

30

35

40

3

76.5 0.49 2,500 298.35 76.50

4

106 0.41 254.40 63.60

5

173.9 0.30 3.74 1,260 226.07 69.56

6

101.8 0.08 4.40 791 71.26 20.36

7

110.6 0.04 4.86 327 44.24 0

8

77.2 0 0 0

9

108.6 0.02 4.7 221 0 0

10

101.5 0 0 0

11

34.8 0 4.7 146 0 0

Sólidos eliminados (muestras 1-10) que se pierden en el proceso

3.37

Total de xilosa eliminada

1925.00

Total de glucosa eliminada

516.32

Sólidos finales para sacarificación

7.03

En otra demostración de la capacidad de la Prototheca para usar materia prima derivada de celulosa, la Prototheca moriformis (UTEX 1435) se cultivó en biorreactores de tres litros con azúcar derivada de celulosa como materia prima de carbono fijo. El inóculo se preparó a partir de células criopreservadas, las cuales se descongelaron a temperatura ambiente y 1 ml de células se añadió 300 ml del medio de inóculo que se basa en el medio basal de microalgas que se describió en el Ejemplo 1 con 1 g/l (NH4)2SO4, 4 g/l de extracto de levadura y una solución de elementos traza, más 4% de glucosa y se cultivó durante 1 día a 28°C con agitación (200 rpm). Este cultivo se usó para inocular un biorreactor de tres litros que contenía 1l de medio más 0.26 ml del Antiespumante 204 (Sigma, Estados Unidos.). El fermentador se controló a 28°C y el pH se mantuvo en 6.8 por adición de KOH. El oxígeno disuelto se mantuvo a 30% de saturación mediante agitación en cascada y flujo de aire. El cultivo se alimentó con la materia prima de azúcar celulósica a partir del rastrojo de maíz para mantener 0-10 g/l de glucosa. La desalinización de materias primas de azúcar celulósico a menos de 300 mM de sal fue esencial para asegurar un peso de células secas similar y el rendimiento de la acumulación de lípidos en comparación con controles de materia prima del azúcar purificado. La desalinización de la materia prima del azúcar celulósico se realizó mediante los métodos que se describieron anteriormente. Se tomaron muestras del fermentador para supervisar el rendimiento de la fermentación. La acumulación de la masa celular se supervisó por la densidad óptica y el peso seco de las células. Las concentraciones de glucosa, xilosa, amoniaco, potasio, sodio y furfural también se determinaron y se supervisaron a lo largo del curso temporal de la fermentación. La concentración de lípidos se determinó por los métodos gravimétricos que se discutieron anteriormente.

Ejemplo 3: Métodos para la transformación de Prototheca

A. Método general para la transformación biolística de Prototheca

Los transportadores de oro S550d de Seashell Technology se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante. El plásmido linealizado (20 µg) se mezcló con 50 µl de tampón de unión y 60 µl (30 mg) de los transportadores de oro S550d y se incubaron en hielo durante 1 min. El tampón de precipitación (100 µl) se añadió, y la mezcla se incubó en hielo durante otro minuto. Después de agitación, las partículas de ADN recubierto se sedimentaron por rotación a 10,000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf 5415C durante 10 segundos. El precipitado de oro se lavó una vez con 500 µl de etanol frío al 100%, se sedimentó por rotación breve en la microcentrífuga, y se resuspendió con 50 µl de etanol helado. Después de una breve (1-2 seg) sonicación, 10 µl de partículas de ADN recubiertas se trasladaron de inmediato a la membrana transportadora.

Las cepas de Prototheca se cultivaron en medio proteosa (2 g/l de extracto de levadura, NaNO3 2.94 mM, CaCl2 • 2H2O 0.17 mM, MgSO4 • 7H2O 0.3 mM, K2HPO4 0.4 mM, KH2PO4 1.28 mM, NaCl 0.43 mM) en un agitador giratorio hasta alcanzar una densidad celular de 2x106 células/ml. Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril, y se resuspendieron en 50 µl de medio. Se extendieron 1 x 107 células en el tercer centro de una placa con medio no selectivo de proteosa. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de entrega de partículas PDS-1000/He (Bio-Rad). Se usaron los discos de ruptura (1100 y 1350 psi), y las placas se colocaron 9 y 12 cm por debajo del ensamblaje de la pantalla/macro-transportador. A las células se les permitió recuperarse a 25°C durante 1224 h. Tras la recuperación, las células se rasparon de las placas con una espátula de goma, se mezclaron con 100 µl de medio y se dispersaron en las placas que contenían la selección de antibióticos adecuada. Después de 7-10 días de incubación a 25°C, las colonias que representan las células transformadas eran visibles en las placas a partir de los discos de ruptura de 1100 y 1350 psi y a partir de 9 y 12 cm de distancia. Las colonias se recogieron y se aplicaron en forma de puntos en placas de agar selectivo para una segunda ronda de selección.

B. Transformación de Prototheca con el gen de resistencia al G418

15 5’TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGATAGTATCG 3’ (sec. con núm. de ident.:35) Inverso: 5’ CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTC CCATCCCACTACTTCC 3’ (sec. con núm. de ident.:36)

10 la beta-tubulina/5'UTR de C. reinhardtii se obtuvo del plásmido pHyg3 (Berthold y otros, (2002) Protist: 153(4), pp 401412) por la PCR como un fragmento EcoRI-AscI. La nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris se obtuvo a partir de ADN genómico aislado de la cepa UTEX 1803 a través de la PCR mediante el uso de los pares de cebadores siguientes:

5 se seleccionaron para la transformación. A las tres cepas de Prototheca se les determinó el genotipo mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente. Las tres cepas de Prototheca tuvieron secuencias genómicas idénticas del ARNr 23S (sec. con núm. de ident.: 15). Todos los casetes de transformación se clonaron como fragmentos EcoRI-SacI en pUC19. Se usaron técnicas estándar de biología molecular en la construcción de todos los vectores de acuerdo a Sambrook y Russell, 2001. El promotor de

La Prototheca moriformis y otras cepas de Prototheca sensibles al G418 se pueden transformar mediante el uso de los imagen45fosforilación, lo que resulta en la inactivación del G418. Las cepas de Prototheca

Directo:

El promotor/UTR de la glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana se obtuvo a través de la PCR del ADN genómico aislado de la cepa UTEX 1230 a través de la PCR mediante el uso de los pares de cebadores siguientes:

20 Directo: 5’ GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGG GCAGC 3’ (sec. con núm. de ident.:37)

Inverso: 5’ GCATACTAGTGGCGGGACGGAGAGA GGGCG 3’ (sec. con núm. de ident.:38)

La optimización de codón se basó en los codones en la Tabla 1 para la Prototheca moriformis. La secuencia del casete de la neomicina fosfotransferasa en la que no se optimizaron los codones (nptII) se sintetizó como un fragmento AscI-XhoI y se basó en la secuencia con núm. de acceso YP_788126 en el GenBank. El casete nptII con los codones

25 optimizados se basó también en este número de acceso en el Genbank.

Las tres cepas de Prototheca se transformaron mediante el uso de los métodos biolísticos que se describieron anteriormente. Brevemente, las cepas de Prototheca se cultivaron heterofílicamente en medio líquido que contenía 2% de glucosa hasta alcanzar la densidad celular deseada (1x107 células/ml a 5x107 células/ml). Las células se cosecharon, se lavaron una vez con agua destilada estéril y se resuspendieron a 1x108 células/ml. Después, 0.5 ml de células se 30 extendieron en una placa con medio sólido no selectivo y se dejó secar en una campana estéril. Las células se bombardearon con el sistema biolístico de entrega de partículas PDS-1000/He (BioRad). A las células se les permitió recuperarse a 25°C durante 24 horas. Tras la recuperación, las células se retiraron mediante el lavado de las placas con 1 ml de medio estéril y se transfirieron a nuevas placas que contenían 100 mg/ml de G418. Las células se dejaron secar en una campana estéril y se dejó que se formaran colonias en la placa a temperatura ambiente durante un máximo de

35 tres semanas. Las colonias de UTEX 1435, UTEX 1439 y UTEX 1437 se recogieron y se aplicaron en forma de puntos en placas de agar selectivo para una segunda ronda de selección.

Un subconjunto de las colonias que sobrevivieron a una segunda ronda de selección descrita anteriormente, se cultivaron en pequeño volumen y el ADN genómico y el ARN se extrajeron por medio de métodos de biología molecular estándar. Se hizo la transferencia de tipo Southern sobre el ADN genómico extraído de las no transformadas (WT), los 40 transformantes y el ADN del plásmido. El ADN de cada muestra se corrió en geles de agarosa 0.8% después de los siguientes tratamientos: sin digerir (U), digerido con AvrII (A), digerido con NcoI (N), digerido con SacI (S). Los ADN de estos geles se transfirieron a membranas de Nylon + (Amersham). Estas membranas se probaron con un fragmento que corresponde a toda la región de codificación del gen nptII (sonda NeoR). La Figura 4 muestra los mapas de los casetes que se usaron en las transformaciones. La Figura 5 muestra los resultados del análisis de la transferencia de tipo

45 Southern en tres transformantes (todos generados en la cepa UTEX 1435) (1, 2, y 3) que se transformaron ya sea con la beta-tubulina::neo::nit (sec. con núm. de ident.: 39) (los transformantes 1 y 2) o con la glutamato deshidrogenasa:neo:nit (sec. con num. de ident.: 40) (transformante 3). El plásmido de transformación glutamato deshidrogenasa:neo: nit se corrió como un control y se cortó tanto con NcoI y con SacI. La AvrII no cortó en este plásmido. El ADN genómico aislado de la cepa sin transformar UTEX 1435 no mostró hibridación de la sonda NeoR.

50 Las construcciones de transformantes adicionales que contienen la glutamato deshidrogenasa:neo:nit con codón optimizado (sec. con num. de ident.: 41) y la β-tubulina::neo::nit con codón optimizado (sec. con num. de ident.: 42) se recogieron y se analizaron por análisis de transferencia de tipo Southern. Como era de esperar, sólo la digestión con la SacI mostró linealización del ADN de transformación. Estos eventos de transformación son consistentes con los eventos de integración que se producen en forma de oligómeros del plásmido de transformación. Sólo la digestión con las

55 enzimas de restricción que cortan el ADN del plásmido de transformación hace en estas moléculas la disminución del tamaño del plásmido de transformación.

15 neo-transgénicos con codón optimizado y, como era de esperar, en base a la homología de secuencia entre los neo genes que se optimizaron y los que no se optimizaron, mostraron la señal de hibridación significativamente menor. Se extrajo ARN (1 µg) de la cepa de Prototheca UTEX 1435 sin transformar y dos representantes transformantes de UTEX 1435 y se realizó la transcripción inversa mediante el uso de un cebador oligo dT o un cebador específico del gen. Posteriormente estos ADNc (por duplicado) se sometieron a análisis de qPCR en el termociclador ABI Veriti que

Para confirmar aún más la expresión del plásmido de transformación, se realizaron en los transformantes que se seleccionaron el análisis por transferencia de tipo Northern y el análisis por RT-PCR. La extracción de ARN se realizó 10 mediante el uso del reactivo Trizol según las instrucciones del fabricante. El análisis de transferencia de tipo Northern se llevó a cabo de acuerdo con los métodos publicados en Sambrook y Russell, 2001. El ARN total (15 µg) aislado de cinco transformantes UTEX 1435 y UTEX 1435 sin transformar (carriles de control) se separó en gel de agarosa-formaldehído 1% y se transfirió a membrana de nailon. La transferencia se hibridó con la sonda neo sin optimizar, específica para las secuencias transgénicas en los transformantes 1 y 3. Los otros dos ARN transformantes, expresaron la versión de los

5 plásmido de transformación. Este tipo de evento de integación se sabe que ocurre Dictyostelium discoideum (véase, por ejemplo, Kuspa, A. y Loomis, W. (1992) PNAS, 89:8803-8807 y Morio y otros, (1995) J. Plant Res. 108:111-114).

El análisis de transferencia de tipo Southern se realizó también en transformantes generados en la transformación de imagen46las cepas de Prototheca UTEX 1437 y UTEX 1439 con

20 usa la química SYBR-Green de qPCR mediante el uso de los siguientes cebadores (nptII):

Directo: 5’ GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG 3’ (sec. con núm. de ident.: 43)

Inverso: 5’ AGGTCCTCGCCGTCGGGCATG 3’ (sec. con núm. de ident.: 44)

La posible contaminación de ADN genómico se descartó por una muestra de control negativo sin transcriptasa inversa. Los resultados indican que los genes NeoR que se usaron para transformar estas cepas se transcribieron activamente

25 en los transformantes.

C. Transformación de Prototheca con sacarosa invertasa secretada heteróloga

Los siguientes experimentos se realizaron mediante el uso de medio líquido/placas de agar en base al medio basal descrito en Ueno y otros, (2002) J Bioscience and Bioengineering 94(2):160-65, con la adición de trazas de minerales descrita en la patente de Estados Unidos núm. 5,900,370, y el cóctel de vitamina DAS 1x (solución 1000x): tricina: 9g,

30 tiamina HCL: 0.67g, biotina: 0.01g, cianocobalamina (vitamina B12): 0.008g, pantotenato de calcio: 0.02 g y ácido paminobenzoico: 0.04 g).

Dos construcciones de plásmido se ensamblaron mediante el uso de las técnicas estándar de ADN recombinante. Los genes de la sacarosa invertasa de levadura (uno con codones optimizados y uno sin codones optimizados), suc2, estaban bajo el control del promotor de la beta-tubulina de Chlorella reinhardtii/5'UTR y tenía la nitrato reductasa de 35 Chlorella vulgaris 3'UTR. Las secuencias (se incluyeron las secuencias 5'UTR y 3'UTR) para la construcción con codón no optimizado (Crβ-tub::NCO-suc2::CvNitRed), sec. con núm. de ident.: 57, y la construcción con codón optimizado (Crβ-tub::CO-suc2::CvNitRed), sec. con núm. de ident.: 58, se enumeran en el listado de secuencias. La optimización de codones se basó en la Tabla 1 para la Prototheca sp. La Figura 6 muestra un esquema de las dos construcciones con los correspondientes sitios de restricción de clonación y las flechas indican la dirección de la transcripción. La selección

40 se proporcionó por el Neo R (con codón optimizado, Tabla 1).

Preparación del microtransportador ADN/oro: los microtransportadores ADN/oro se prepararon inmediatamente antes de su uso y se almacenaron en hielo hasta que se aplicaron a los macrotransportadores. El ADN del plásmido (en tampón TE) se añadió a 50 µl de tampón de unión. La saturación de las perlas de oro se alcanzó a los 15 µg de ADN del plásmido para 3 mg del transportador de oro. El tampón de unión y el ADN se mezclaron bien a través de la agitación. El 45 ADN y el tampón de unión se deben pre-mezclar antes de la adición de oro para asegurar la unión uniforme del plásmido a las partículas del transportador de oro. Se añadieron 60 µl del transportador de oro S550d (Seashell Technologies, San Diego, CA) a la mezcla ADN/tampón de unión. Para un patrón de oro a 50 mg/ml, la adición de 60 µl resulta en una proporción óptima de 15 µg ADN/3 mg del transportador de oro. La mezcla del transportador de oro/ADN se dejó incubar en hielo durante 1 minuto y entonces se añadieron 100 µl de tampón de precipitación. La mezcla se dejó 50 incubar nuevamente en hielo durante 1 minuto y entonces brevemente se agitó y se centrifugó a 10,000 rpm a temperatura ambiente durante 10 segundos para sedimentar el transportador de oro. Se retiró el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y el sedimento se lavó con 500 µl de etanol 100% helado. Las partículas de oro se resedimentaron por centrifugación de nuevo a 10,000 rpm durante 10 segundos. El etanol se eliminó y se añadieron 50 µl de etanol helado a la mezcla de oro. Inmediatamente antes de aplicar el oro a los macrotransportadores, el oro/etanol se

55 resuspendió con un breve pulso de 1-2 segundos en el nivel 2 en un baño de ultrasonido Misonix mediante el uso de la micro punta. Inmediatamente después de la resuspensión, 10 µl de la dispersión de partículas de oro se trasladaron al macrotransportador y se dejaron secar en una campana estéril.

15 células se resuspendieron mediante el uso de un asa estéril, que se aplicó en un movimiento circular al césped de las células y las células resuspendidas se recogieron con una pipeta estéril. Las células se sembraron a continuación, sobre una placa de agar fresco con 2% de glucosa y 100 mg/ml de G418. La aparición de colonias se produjo 7-12 días después de que se sembraron. Las colonias individuales se recogieron y se cultivaron en medio selectivo con 2% de glucosa y 100 µg/ml de G418. El tipo salvaje (sin transformar) y las células transgénicas se analizaron a continuación

Después de la recuperación de 24 horas, se introdujo 1 ml de medio estéril (sin glucosa) en el césped de células. Las

10 circular para distribuir uniformemente las células a un diámetro de no más de 3 cm. Las células se dejaron secar en las placas en la campana estéril durante aproximadamente 30-40 minutos y entonces se bombardearon a una presión del disco de ruptura de 1350 psi y una placa con el macrotransportador a 6 cm de distancia. Las placas se cubrieron a continuación y se envolvieron con parafilm y se dejaron incubar con poca luz durante 24 horas.

5 en alícuotas en tubos cónicos de 50 ml y se centrifugaron durante 10 minutos a 3500 rpm. Las células se lavaron con medio fresco y se centrifugaron de nuevo durante 10 minutos a 3500 rpm. Las células se resuspendieron a continuación a una densidad de 1.25 x 108 células/ml en medio fresco. En una campana estéril se retiraron 0.4 ml de las células que se prepararon anteriomente y se colocaron directamente en el centro de una placa de agar (sin agente de selección). La placa se agitó suavemente con un nivel de movimiento

Las dos cepas de Prototheca moriformis (UTEX 1435 y 1441) se cultivaron heterotróficamente en medio líquido que imagen47Este cultivo de semillas entonces se diluyó con medio fresco a una densidad de 105 12-15 horas para alcanzar una densidad celular final de aproximadamente 106

20 para la introducción, la integración y la expresión exitosa del transgén.

El ADN genómico de Prototheca moriformis UTEX 1435 y 1441 transformadas y sus contrapartes de tipo salvaje (sin transformar) se aislaron mediante el uso de métodos estándar. Brevemente, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga de mesa estándar Eppendorf (modelo 5418) y se congelaron rápidamente antes de la extracción de ADN. Los sedimentos de células se lisaron mediante la adición de 200 µl de tampón de lisis (Tris HCl 25 100 mM, pH 8.0, lauril sarcosina 1%, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, sacarosa 0.25 M, ARNasa A 0.5 mg/ml) por cada 100 -200 mg de células (peso húmedo) y agitación durante 30-60 segundos. El bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) y el NaCl se llevaron a 1% y 1 M, respectivamente, y los extractos de células se incubaron a 60-65°C durante 10 minutos. Posteriormente, los extractos se aclararon por centrifugación a 14,000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante resultante se extrajo con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Las muestras se

30 centrifugaron a continuación durante 5 minutos a 14,000 rpm y la fase acuosa se eliminó. El ADN se precipitó con 0.7 volúmenes de isopropanol. El ADN se granuló a través de centrifugación a 14,000 rpm durante 10 minutos y se lavó dos veces con etanol al 80%, y una vez con etanol. Después del secado, el ADN se resuspendió en Tris HCl 10 mM, pH 8.0 y se determinaron las concentraciones de ADN mediante el uso del ensayo de cuantificación de la fluorescencia PicoGreen (Molecular Probes).

35 El ARN de Prototheca moriformis UTEX 1435 y 1441 transformadas y sus contrapartes de tipo salvaje (sin transformar) se aislaron mediante el uso de métodos estándar. Brevemente, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 14,000 rpm en una centrífuga de mesa estándar Eppendorf (modelo 5418) y se congelaron rápidamente antes de la extracción del ARN. Los sedimentos de células se lisaron mediante la adición de 1 ml del reactivo Trizol (Sigma) por cada 100 mg de células (peso húmedo) y mediante agitación durante 1-2 minutos. Las muestras se incubaron a temperatura

40 ambiente durante 5 minutos y posteriormente ajustaron con 200 µl de cloroformo por 1 ml del reactivo Trizol. Después de amplia agitación, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos y entonces se sometieron a centrifugación a 14,000 rpm durante 15 minutos en una microcentrífuga de mesa refrigerada. La partición del ARN en la fase acuosa superior se retiró y se precipitó por la adición de isopropanol (500 µl por 1 ml del reactivo Trizol). El ARN se recogió por centrifugación durante 10 minutos y el sedimento resultante se lavó dos veces con 1 ml de etanol al 80%, se

45 secó, y se resuspendió en agua libre de ARNasa. La concentración de ARN se estimó mediante el ensayo de cuantificación de fluorescencia RiboGreen (Molecular Probes).

La expresión del gen de la neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia al antibiótico G418 y la levadura invertasa se probaron en las Prototheca moriformis no transformadas UTEX 1435 y 1441 y los transformantes T98 (UTEX 1435 transformante) y T97 (UTEX 1441 transformante) mediante el uso del análisis por PCR cuantitativa en 50 transcripción inversa (RT-PCR cuantitativa). 20 ng de ARN total (aislado como se describió anteriormente) se sometieron a una etapa de análisis de RT-PCR cuantitativa mediante el uso del kit de RT-PCR iScript SYBR Green (BioRad Laboratories) y pares de cebadores dirigidos al gen de resistencia a la neomicina (cebador directo 5’CCGCCGTGCTGGACGTGGTG 3’ y el cebador inverso 5’ GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT 3’, sec. con núm. de ident.: 65 y 66, respectivamente) y los transcritos de suc2 de invertasa (cebador directo 5’

55 CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC 3’ y cebador inverso 5’ GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT 3’, sec. con num. de ident.: 67 y 68, respectivamente). Los transcritos de la beta tubulina endógena sirvieron como control interno positivo para la amplificación por PCR y como referencia de normalización para estimar los niveles relativos de transcripción.

Ambas construcciones con codón optimizado y sin codón optimizado se transformaron en las células de Prototheca moriformis UTEX 1435 y 1441 como se describió anteriormente. Inicialmente, los transformantes se obtuvieron con las 60 dos construcciones y la presencia del transgén se comprobó mediante el análisis de transferencia de tipo Southern seguido por RT-PCR para confirmar la presencia del ADN y el ARNm del transgén. Para el análisis de transferencia de Para el ensayo de la invertasa, las células (T98 y T97) se cultivaron en placas que contenían 2% de sacarosa, se rasparon y se probó la actividad de la invertasa. Se mezclaron 10 µl de las células tomadas por raspado con 40 µl de NaOAc 50mM pH 5.1. Se añadieron a la mezcla de las células 12.5 µl de sacarosa 0.5 M y se incubaron a 37°C durante 20 10-30 minutos. Para detener la reacción se añadieron 75 µl de K2HPO4 0.2 M. Para el ensayo de la glucosa liberada, se añadieron 500 µl del reactivo reconstituido (glucosa oxidasa/peroxidasa + o-dianisidina) de Sigma (kit de prueba GAGO20) a cada tubo y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Una curva de glucosa estándar se creó también en este momento (intervalo: 25 µl a 0.3 µl de glucosa). Después de la incubación, se añadieron 500 µl de HCl 6N a detener la reacción y desarrollar el color. Las muestras se leyeron a 540 nm. La cantidad de glucosa liberada se calculó a partir de

15 muestreo directo y la cuantificación de azúcares en los sobrenadantes de cultivo después de 48 horas de crecimiento en el medio líquido que contenía 2% de sacarosa como única fuente de carbono.

Para confirmar que los transformantes expresaban una proteína invertasa activa, los transformantes se sembraron en placas de sacarosa. Los transformantes que contenían el casete de codón no optimizado no crecieron en las placas que 10 contenían sacarosa, lo que indicaba que, si bien los genes y el ARNm que codifica la proteína suc2 estaban presentes, la proteína o bien (1) no se tradujo, o (2) se tradujo, pero no se acumuló a niveles suficientes para permitir el crecimiento en la sacarosa como única fuente de carbono. Los transformantes con el casete de codón optimizado crecieron en las placas que contenían sacarosa. Para evaluar los niveles de la invertasa que expresaban estos transformantes, dos clones (T98 y T97) se sometieron a un ensayo de la invertasa de todas las células raspadas del medio sólido y el

5 construcciones ya sea con codón optimizado y sin codón optimizado, mostraron la presencia del casete de la invertasa, mientras que el control no transformado fue negativo. El ARNm de la invertasa se detectó también en transformantes con las construcciones ya sea con codón optimizado y sin codón optimizado.

tipo Southern, el ADN genómico aislado como se describió anteriormente se sometió a electroforesis en geles de imagen48Cloning; A Laboratory Manual, 2da

25 la curva estándar de glucosa mediante la fórmula y = mx+c, donde y es la lectura de 540 nm, y x son los µg de glucosa. El peso de glucosa se convirtió en moles de glucosa, y dada la relación equimolar entre moles de sacarosa hidrolizada a los moles de glucosa generada, los datos se expresaron como nmoles de sacarosa hidrolizada por unidad de tiempo. El ensayo mostró que tanto los clones T98 y T97 hidrolizaron la sacarosa, lo que indicó que las células produjeron y secretaron una invertasa de sacarosa funcional.

30 Para el análisis de azúcar en los medios de cultivo líquido después de 48 horas de crecimiento de las algas, las células T97 y T98 se cultivaron en medio que contenía 2% de sacarosa durante 48 horas y los medios de cultivo se procesaron para el análisis de azúcar. Los caldos de cultivo de cada transformante (y el control negativo de células sin transformar) se centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante resultante se retiró y se sometió a HPLC/ELSD (detección de dispersión de la luz por evaporación). La cantidad de azúcar en cada muestra se determinó mediante el

35 uso de estándares externos y el análisis de regresión de línea. Los niveles de sacarosa en el medio de cultivo de los transformantes fueron muy bajos (menos de 1.2 g/l, y en la mayoría de los casos 0 g/l). En los controles negativos, los niveles de sacarosa se mantuvieron altos, aproximadamente a 19 g/l después de 48 horas de crecimiento.

Estos resultados fueron consistentes con los resultados de actividad de la invertasa, y en conjunto, indicaron que los transformantes con codones optimizados, T97 y T98, secretaron una sacarosa invertasa activa que les permitió a las

40 microalgas usar la sacarosa como única fuente de carbono, en contraste con (1) los transformantes sin codones optimizados y (2) las microalgas no transformadas de tipo salvaje, las cuales no pudieron usar sacarosa como única fuente de carbono en el medio de cultivo.

Las cepas de Prototheca moriformis, T98 y T97, que expresaban un transgén de sacarosa invertasa segregada (suc2), funcional se probaron para el crecimiento y la producción de lípidos mediante el uso de la sacarosa como única fuente

45 de carbono.

Las cepas T98 y T97, de tipo salvaje (sin transformar), se cultivaron en medios de cultivo (como se describe anteriormente) que contenían 4% de glucosa o 4% de sacarosa como única fuente de carbono en condiciones heterótrofas durante aproximadamente unos 6 días. El crecimiento, según lo determinado por las lecturas de densidad óptica A750 que se tomaron de las cuatro muestras cada 24 horas y el peso seco de las células de los cultivos y los

50 perfiles de lípidos se determinaron después de 6 días de crecimiento. Las lecturas de densidad óptica de las cepas transgénicas que crecieron tanto en las condiciones de glucosa y de sacarosa fueron comparables al crecimiento de las cepas de tipo salvaje en las condiciones de glucosa. Estos resultados indican que las cepas transgénicas crecieron en glucosa o sacarosa como única fuente de carbono a una velocidad igual a las cepas del tipo salvaje en condiciones de glucosa. Las cepas de tipo salvaje, sin transformar, no crecieron en la condición de sacarosa sola.

55 Se analizó el perfil lipídico en la biomasa de la cepa de tipo salvaje que creció en glucosa y de la cepa T98 que creció en sacarosa. Las muestras de lípidos se prepararon a partir de la biomasa seca (liofilizada) mediante el uso de un sistema de hidrólisis ácida (Ankom Technology, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las determinaciones del perfil lipídico se realizaron como se describió en el Ejemplo 4. El perfil lipídico de la cepa de Prototheca moriformis sin transformar UTEX 1435, que creció en glucosa como única fuente de carbono y dos cepas

60 colonal T98 (UTEX 1435 transformada con un transgén de sacarosa invertasa), que crecieron en sacarosa como única fuente de carbono, se describen en la Tabla 13 (tipo salvaje UTEX 1435 y clon 8 y el clon 11 de T98 a continuación. El lípido C:19:0 se usó como un control de calibración interna. Tabla 13. Perfil lipídico de UTEX 1435 tipo salvaje y los clones de UTEX 1435 con el transgén suc2.

Nombre

tipo salvaje (% área -ISTD) T98 clon 11 (% área -ISTD) T98 clon 8 (% área -ISTD)

C 12:0

0.05 0.05 0.05

C 14:0

1.66 1.51 1.48

C 14:1

0.04 ND ND

C 15:0

0.05 0.05 0.04

C 16:0

27.27 26.39 26.50

C 16:1

0.86 0.80 0.84

C 17:0

0.15 0.18 0.14

C 17:1

0.05 0.07 0.05

C 18:0

3.35 4.37 4.50

C 18:1

53.05 54.48 54.50

C 18:2

11.79 10.33 10.24

C 19:0 (ISTD)

- - --

C 18:3 alfa

0.90 0.84 0.81

C 20:0

0.32 0.40 0.38

C 20:1

0.10 0.13 0.12

C 20:1

0.04 0.05 0.04

C 22:0

0.12 0.16 0.12

C 20:3

0.07 0.08 0.07

C 24:0

0.12 0.11 0.10

nd -denota ninguno detectado

Tabla 14. Análisis de carotenoide, clorofila, tocoferol/esteroles y tocotrienol en aceite extraido de Prototheca moriformis (UTEX 1435).

imagen49

El aceite extraído de Prototheca moriformis UTEX 1435 de tipo salvaje (a través de extracción con disolventes o mediante el uso de una prensa expulsora (ver métodos en el Ejemplo 44 anterior) se analizó para los carotenoides, la clorofila, los tocoferoles, otros esteroles y tocotrienoles. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 14.

Aceite prensado (mcg/ml)

Aceite extraído del solvente (mcg/ml)

cis-Luteína

0.041 0.042

trans-Luteína

0.140 0.112

trans-Zeaxantina

0.045 0.039

cis-Zeaxantina

0.007 0.013

t-alfa-Critoxantina

0.007 0.010

t-beta-Critoxantina

0.009 0.010

t-alfa-Caroteno

0.003 0.001

c-alfa-Caroteno

ninguno detectado ninguno detectado

t-beta-Caroteno

0.010 0.009

9-cis-beta-Caroteno

0.004 0.002

Licopeno

ninguno detectado ninguno detectado

Total de Carotenoides

0.267 0.238

Clorofila

<0.01 mg/kg <0.01 mg/kg

Tocoferoles y Esteroles

Aceite prensado (mg/100g)

Aceite extraido del solvente (mg/100g)

gamma Tocoferol

0.49 0.49

Campesterol

6.09 6.05

Estigmasterol

47.6 47.8

Beta-sitosterol

11.6 11.5

Otros esteroless

445 446

Tocotrienoles

Aceite prensado (mg/g)

Aceite extraido del solvente (mg/g)

alfa Tocotrienol

0.26 0.26

beta Tocotrienol

< 0.01 < 0.01

gamma Tocotrienol

0.10 0.10

detal Tocotrienol

< 0.01 < 0.01

Total de Tocotrienoles

0.36 0.36

10 de la placa. El crecimiento se vio tanto con el tipo salvaje como con las células de Prototheca moriformis que contenían el transgen. La Prototheca moriformis de tipo salvaje no demostró capacidad de crecer en sacarosa, por lo tanto, este resultado muestra que a diferencia de la resistencia a los antibióticos, el uso de la selección con sacarosa/invertasa no es por células autónomas. Es muy probable que los transformantes secretaran suficiente sacarosa invertasa en la placa/medio para apoyar el crecimiento del tipo salvaje mientras que la sacarosa se hidrolizara en fructosa y glucosa.

La capacidad de usar sacarosa como única fuente de carbono como el factor de selección de los clones que contenían imagen50la construcción del transgén suc2 positivo para el gen suc25 clon que expresaba el transgén suc2 en la mitad de la placa y la Prototheca moriformis

15 Ejemplo 4: Prototheca recombinante con los genes TE exógenos Como se describió anteriormente, las cepas de Prototheca se pueden transformar con genes exógenos. La Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó, mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente, ya sea con el gene de la tioesterasa C12 de Umbellularia californica o con el gen de la tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora (ambas con codones optimizados de acuerdo a la Tabla 1). Cada una de las construcciones de la transformación

20 contenían un promotor de glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana/región 5'UTR (sec. con núm. de ident.: 69) para dirigir la expresión del transgén de la tioesterasa. Las regiones de codificación de los transgenes de las tioesterasas, la tioesterasa C12 de Umbellularia californica (sec. con num. de ident.: 70) o la tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora (sec. con num. de ident.: 71), cada uno con la secuencia dirigida a plastidio putativa nativa. Inmediatamente después de la secuencia codificante de la tioesterasa está la secuencia codificante para una etiqueta

25 3x FLAG en c-terminal (sec. con núm. de ident.: 72), seguida de la 3'UTR de la nitrato reductasa de Chlorella vulgaris (sec. con num. de ident.: 73). Un diagrama de las construcciones de las tioesterasas que se usaron en las transformaciones de la Prototheca moriformis se muestra en la Figura 9.

La preparación del ADN, el microtransportador de oro, y las células Prototheca moriformis (UTEX 1435) se realizó mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente en el Ejemplo 3. Las microalgas se bombardearon

30 con la mezcla de ADN con el microtransportador de oro y se sembraron en las placas de selección que contenían 2% de glucosa y 100μg/ml de G418. A las colonias se les permitió el desarrollo de 7 a 12 días y las colonias se recogieron de cada placa de transformación para la detección de la incorporación de la construcción de ADN mediante el uso de ensayos de transferencia del tipo Southern y la expresión de las construcciones de tioesterasa se detectó mediante el uso de la RT-PCR.

35 Los clones positivos se recogieron tanto de las placas de transformación de la tioesterasa C12 y C14 y se detectó la incorporación de la construcción mediante ensayos de transferencia de tipo Southern. Los ensayos de transferencia de tipo Southern se llevaron a cabo mediante el uso de métodos estándar (y se describieron anteriormente en el Ejemplo 3), mediante el uso de una sonda c optimizada, que se basó en la secuencia en sec. con núm. de ident.: 70 y sec. con núm. de ident.: 71. El ADN del plásmido de transformación se corrió como un control positivo. Fuera de los clones que

40 resultaron positivos para la incorporación de la construcción, un subgrupo se seleccionó para el análisis por PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-PCR cuantitativa) para la expresión de la tioesterasa C12 y la tioesterasa C14.

El aislamiento del ARN se realizó mediante el uso de los métodos que se describieron en el Ejemplo 3 anterior y se realizaron las RT-PCR cuantitativa de los clones positivos mediante el uso de 20 ng de ARN total de cada clon, se usó el par de cebadores que se describen a continuación y el kit de RT-PCR iScript SYBR Green (Bio-Rad Laboratories)

45 según el protocolo del fabricante. El ARN total de Prototheca moriformis de tipo salvaje (no transformado) se incluyó como control negativo. La expresión del ARNm se expresó como las veces de expresión relativa (RFE) en comparación con el control negativo. Los cebadores que se usaron en las detecciones RT-PCR cuantitativa de C12 de transformación de la tioesterasa fueron:

U. californica cebadores PCR de tioesterasa C12:

50 Directo: 5’ CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3’ (sec. con núm. ident.: 74)

Inverso: 5’ AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3’ (sec. con núm. ident.: 75)

Los cebadores que se usaron en la detección RT-PCR cuantitativa de la transformación de tioesterasa C14 fueron:

Cinnamomum camphora cebadores de PCR tioesterasa C14: Directo: 5’ TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3’ (sec. con núm. ident.: 76)

Inverso: 5’ CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3’ (sec. con núm. ident.: 77)

Se seleccionó un subconjunto de los clones positivos de cada transformación (como los que se detectaron en los ensayos de transferencia de tipo Southern y RT-PCR cuantitativa) y se cultivaron en condiciones abundantes de 10 nitrógeno y se analizó la producción y el perfil lipídico totales. Se prepararon muestras de los lípidos a partir de la biomasa seca de cada clon. Se resuspendieron 20-40 mg de biomasa seca de cada clon transgénico en 2 ml de H2SO4 3% en MeOH, y se añadieron 200 µl de tolueno que contenía una cantidad apropiada de un patrón interno adecuado (C19:0). La mezcla se sometió a sonicación brevemente para dispersar la biomasa, entonces, se calentó a 65-70°C durante dos horas. Se añadieron 2 ml de heptano para extraer los ésteres metílicos de ácidos grasos, seguido por la 15 adición de 2 ml de K2CO3 (ac) 6% para neutralizar el ácido. La mezcla se agitó vigorosamente, y una parte de la capa superior se transfirió a un frasco que contenía Na2SO4 (anhidro) para el análisis por cromatografía gaseosa mediante el uso del método estándar FAME GC/FID (cromatografía gaseosa de éster metílico de ácidos grasos con detección de ionización de llama). El perfil lipídico (se expresó como % del área) de los clones positivos en comparación con el control negativo de tipo salvaje se resume en las Tablas 15 y 16 a continuación. Como se muestra en la Tabla 15, las

5 negativo. Se observaron resultados similares con la expresión de la tioesterasa C14 en los clones positivos con un aumento de RFE de aproximadamente 60 veces a más de 1200 veces mayor expresión en comparación con el control negativo.

La RT-PCR cuantitativa para la expresión de la tioesterasa C12 resultó en los clones positivos que mostraron un imagen51

20 veces de incremento de la producción de C12 en los transformantes C12 estuvo en el intervalo de aproximadamente un aumento de 5 veces (clon C12-5) a un aumento de más de 11 veces (clon C12-1). Las veces de incremento de la producción de C14 en los transformantes C14 estuvo en el intervalo de aproximadamente un aumento de 1.5 veces a aproximadamente un aumento de 2.5 veces.

Tabla 15. Sumario del perfil lipídico total de transformantes de tioesterasa C12 Prototheca moriformis.

Tipo salvaje

C12-1 C12-2 C12-3 C12-4 C12-5 C12-6 C12-7 C12-8

C6:0

0.03 ND ND ND ND ND ND ND ND

C8:0

0.11 0.09 ND 0.11 ND ND ND ND ND

C10:0

ND ND ND 0.01 0.01 ND ND 0.01 ND

C12:0

0.09 1.04 0.27 0.72 0.71 0.50 0.67 0.61 0.92

C14:0

2.77 2.68 2.84 2.68 2.65 2.79 2.73 2.56 2.69

C14:1

0.01 ND ND 0.02 ND ND ND 0.01 ND

C15:0

0.30 0.09 0.10 0.54 0.19 0.09 0.13 0.97 0.09

C15:1

0.05 ND ND 0.02 ND ND ND ND ND

C16:0

24.13 23.12 24.06 22.91 22.85 23.61 23.14 21.90 23.18

C16:1

0.57 0.62 0.10 0.52 0.69 0.63 0.69 0.49 0.63

C17:0

0.47 0.24 0.27 1.02 0.36 0.17 0.26 2.21 0.19

C17:1

0.08 ND 0.09 0.27 0.10 0.05 0.09 0.80 0.05

C18:0

ND ND 2.14 1.75 2.23 2.16 2.38 1.62 2.47

C18:1

22.10 23.15 24.61 21.90 23.52 19.30 22.95 20.22 22.85

C18:1

ND 0.33 0.24 ND ND 0.09 0.09 ND 0.11

C18:2

37.16 34.71 35.29 35.44 35.24 36.29 35.54 36.01 35.31

C18:3 alfa

11.68 11.29 9.26 11.62 10.76 13.61 10.64 11.97 10.81

C20:0

0.15 0.16 0.19 0.16 0.16 0.14 0.18 0.14 0.18

C20:1

0.22 0.17 0.19 0.20 0.21 0.19 0.21 0.20 0.21

C20:2

0.05 ND 0.04 0.05 0.05 0.05 0.04 0.05 0.04

C22:0

ND ND ND 0.01 ND ND ND 0.02 ND

C22:1

ND ND ND ND ND 0.01 ND 0.01 ND

C20:3

0.05 ND 0.07 0.06 0.06 0.10 0.07 0.05 0.06

C20:4

ND ND ND ND ND 0.02 ND ND ND

C24:0

ND ND 0.24 0.01 0.20 0.19 0.19 0.14 0.20

Tabla 16. Sumario del perfil lipídico total de transformantes de tioesterasa C14 Prototheca moriformis.

Tipo salvaje

C14-1 C14-2 C14-3 C14-4 C14-5 C14-6 C14-7

C6:0

0.03 ND ND ND ND ND ND ND

C8:0

0.11 ND ND ND ND ND ND ND

C10:0

ND 0.01 ND 0.01 ND 0.01 ND ND

imagen52

Los experimentos que se describieron anteriormente indican la transformación exitosa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) con las construcciones de los transgenes de dos tioesterasas diferentes (C12 y C14), que implicaron no sólo la expresión exitosa del transgén, sino también la correcta dirección de la proteína expresada a plastidios y un efecto 5 funcional (el cambio esperado en el perfil lipídico) como resultado de la transformación. El mismo experimento de transformación se realizó mediante el uso de una construcción de expresión que contenía (según la Tabla 1) la región de codificación con codones optimizados de la tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana con la secuencia dirigida a los plastidio, nativa, (sec. con num. de ident.: 78) que no produjo ningún cambio en el perfil de lípidos. Si bien la introducción del transgén C8-10 de Cuphea hookeriana en Prototheca moriformis (UTEX 1435) fue un éxito y se

10 confirmó mediante análisis de transferencia de tipo Southern, ningún cambio en la producción de ácidos grasos C10 o C8 se detectó en los transformantes en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Ejemplo 5: Generación de la cepa de Prototheca moriformis con TE de plantas exógenas con secuencias

dirigidas a plastidios de algas

Con el fin de investigar si el uso de las secuencias dirigidas a los cloroplastos/plastidios de algas mejorarían la

15 expresión de la tioesterasa de cadena mediana (C8-C14) y la posterior producción de lípidos de cadena mediana de Prototheca moriformis (UTEX 1435), varias secuencias dirigidas a plastidios de algas putativas, se clonaron a partir de Chlorella protothecoides y Prototheca moriformis. Las construcciones de tioesterasa que se basaban en la tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana, la tioesterasa C12 de Umbellularia californica y la tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora se hicieron mediante el uso del promotor de la glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokiniana/5'UTR y

20 una nitrato reductasa de Chlorella vulgaris 3'UTR. Las secuencias codificantes de la tioesterasa se modificaron mediante la eliminación de las secuencias dirigidas a plastidios, nativas y su reemplazo con secuencias dirigidas a plastidios de los genomas de Chlorella protothecoides y de Prototheca moriformis. Las construcciones de expresión de tioesterasa y sus correspondientes números de identificación de secuencia se enumeran a continuación. Cada plásmido de transformación contenía también una construcción de resistencia a Neo que era idéntico a los que se describieron en

25 el Ejemplo 3 anterior. Además, otro promotor derivado de algas, el promotor de la β-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii, se probó también conjuntamente con las construcciones de tioesterasa. La secuencia dirigida al plastido, "nativa", se refiere a la secuencia dirigida a plastidio de tioesterasa de plantas superiores. Un resumen de las construcciones usadas en estos experimentos se proporciona a continuación:

Construcción Promotor/5’UTR sec. dirigida a Gen 3’UTR sec. con núm. Numbre plastidio ident...

Construcción 1

C. sorokiniana C.protothecoide Cuphea C. vulgaris sec. con núm.

glutamato

s hookeriana nitrato ident.: 79

deshidrogenasa

estearoil ACP C8-10 TE reductase

desaturasa

Construcción 2

C. sorokiniana P. moriformis Cuphea C. vulgaris sec. con núm.

glutamato

delta 12 graso hookeriana nitrato ident.: 80

deshidrogenasa

ácido C8-10 TE reductase

desaturasa

Construcción 3

C. sorokiniana P. moriformis Cuphea C. vulgaris sec. con núm.

glutamato Isopentenil hookeriana nitrato deshidrogenasa difosfato C8-10 TE reductase sintasa

Construcción 4 C. sorokiniana P. moriformis Umbellularia C. vulgaris glutamato Isopentenil califórnica C12 nitrato deshidrogenasa difosfato TE reductase

sintasa

Construcción 5 C. sorokiniana P. moriformis Umbellularia C. vulgaris glutamato estearoil ACP califórnica C12 nitrato deshidrogenasa desaturasa TE reductase

Construcción 6 C. sorokiniana C.protothecoide Umbellularia C. vulgaris glutamato s califórnica C12 nitrato deshidrogenasa estearoil ACP TE reductase

desaturasa

Construcción 7 C. sorokiniana P. moriformis Umbellularia C. vulgaris glutamato delta 12 graso califórnica C12 nitrato deshidrogenasa ácido TE reductase

desaturasa

Construcción 8 C. sorokiniana C.protothecoide Cinnamomum C. vulgaris glutamato s camphora nitrato deshidrogenasa estearoil ACP C14 TE reductase

imagen53

desaturasa

Construcción 9 Chlamydomonas Native Cuphea C. vulgaris sec. con núm. reinhardtii β-hookeriana nitrato ident.: 113 tubulina C8-10 TE reductase

Construcción Chlamydomonas P. moriformis Cuphea C. vulgaris sec. con núm. 10 reinhardtii β-Isopentenil hookeriana nitrato ident.: 114 tubulina difosfato C8-10 TE reductase

sintasa Construcción Chlamydomonas P. moriformis Cuphea C. vulgaris sec. con núm. 11 reinhardtii β-delta 12 graso hookeriana nitrato ident.: 115

tubulina ácido C8-10 TE reductase

desaturasa Construcción Chlamydomonas C.protothecoide Cuphea C. vulgaris sec. con núm. 12 reinhardtii β-s hookeriana nitrato ident.: 116

tubulina estearoil ACP C8-10 TE reductase

desaturasa Construcción Chlamydomonas P. moriformis Cuphea C. vulgaris sec. con núm. 13 reinhardtii β-estearoil ACP hookeriana nitrato ident.: 117

tubulina desaturasa C8-10 TE reductase Construcción Chlamydomonas Native Umbellularia C. vulgaris sec. con núm. 14 reinhardtii β-califórnica C12 nitrato ident.: 118

tubulina TE reductase Construcción Chlamydomonas P. moriformis Umbellularia C. vulgaris sec. con núm. 15 reinhardtii β-Isopentenil califórnica C12 nitrato ident.: 119

tubulina difosfato TE reductase

sintasa Construcción Chlamydomonas P. moriformis Umbellularia C. vulgaris sec. con núm. 16 reinhardtii β-delta 12 graso califórnica C12 nitrato ident.: 120

tubulina ácido TE reductase

desaturasa Construcción Chlamydomonas C.protothecoide Umbellularia C. vulgaris sec. con núm. 17 reinhardtii β-s califórnica C12 nitrato ident.: 121

tubulina estearoil ACP TE reductase

desaturasa Construcción Chlamydomonas P. moriformis Umbellularia C. vulgaris sec. con núm. 18 reinhardtii β-estearoil ACP califórnica C12 nitrato ident.: 122

tubulina desaturasa TE reductase Construcción Chlamydomonas Native Cinnamomum C. vulgaris sec. con núm. 19 reinhardtii β-camphora nitrato ident.: 123

tubulina C14 TE reductase Construcción Chlamydomonas P. moriformis Cinnamomum C. vulgaris sec. con núm. 20 reinhardtii β-Isopentenil camphora nitrato ident.: 124

tubulina difosfato C14 TE reductase sintasa Construcción Chlamydomonas P. moriformis Cinnamomum C. vulgaris sec. con núm.

10 ácidos grasos correspondientes al transgén de la tioesterasa se compararon con los niveles del tipo salvaje, y con los clones transformados con una tioesterasa con la secuencia dirigida a plastidio, nativa.

Cada construcción se transformó en Prototheca moriformis (UTEX 1435) y la selección se realizó con G418 mediante el imagen54uso de los métodos que se describieron en el Ejemplo 4 anterior. 5 transferencia de tipo Southern.

Como se mencionó en el Ejemplo 4, los clones transformados con la construcción de la tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana con la secuencia dirigida a plastidio, nativa, tenían el mismo nivel de ácidos grasos C8 y C10 que el tipo salvaje. Los clones transformados con la construcción de la tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana (Construcción 115 3) con secuencias dirigidas a plastidios de algas tenían un aumento de más de 10 veces en los ácidos grasos C10 para la Construcción 3 y un aumento de mas de 40 veces en los ácidos grasos C10 de las Construcciones 1 y 2 (en comparación con el tipo salvaje). Los clones transformados con las construcciones de la tioesterasa C12 de Umbellularia californica con la secuencia dirigida a los plastidio nativa, tuvo un aumento moderado de 6-8 veces en los niveles de ácidos grasos C12 en comparación con el tipo salvaje. Los clones transformados con las construcciones de 20 la tioesterasa C12 de Umbellularia californica con las construcciones dirigidas a plastidios de algas (Construcciones 4-7) tuvieron un aumento de más de 80 veces en el nivel del ácido graso C12 para la Construcción 4, aproximadamente un aumento de 20 veces en el nivel de ácido graso C12 para la Construcción 6, aproximadamente un aumento de 10 veces en el nivel de ácido graso C12 para la Construcción 7 y aproximadamente un aumento de 3 veces en el nivel de ácido graso C12 para la Construcción 5 (todos en comparación con el tipo salvaje). Los clones transformados con la 25 tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora, ya sea con la secuencia dirigida a plastidio nativa o la Construcción 8 (con la secuencia dirigida a plastidio de la estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides) tuvieron un aumento de aproximadamente 2-3 veces en los niveles de ácidos grasos C14 en comparación con el tipo salvaje. En general, los clones transformados con las construcciones de la tioesterasa con una secuencia dirigida a los plastidio de algas tuvieron un aumento de veces más alto en los correspondientes niveles de longitud de cadena de los ácidos grasos, que

30 cuando se usó la secuencia dirigida nativa de plantas superiores.

A. El promotor de la β-tubulina de Clamydomonas reinhartii

La expresión adicional de las construcciones de la tioesterasa heteróloga se elaboraron mediante el uso del promotor de la β-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii en lugar del promotor de la glutamato deshidrogenasa de C. sorokinana. Los elementos de la construcción y la secuencia de las construcciones de expresión se enumeraron anteriormente. 35 Cada construcción se transformó en las células huésped Prototheca moriformis UTEX 1435 mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente. Los perfiles de lípidos se generaron a partir de un subconjunto de los clones positivos para cada construcción con el fin de evaluar el éxito y la productividad de cada construcción. Los perfiles de lípidos comparan los niveles de ácidos grasos (expresados en % del área) con las células huésped de tipo salvaje. La columna "media" representa el promedio numérico del subconjunto de los clones positivos. La columna

40 "muestra" representa el mejor clon positivo que se examinó (el mejor se definió como la muestra que produce el mayor cambio en % del área de la producción del ácido graso de la correspondiente longitud de cadena). La columna "bajoalto" representa el más bajo % de área y el más alto % área de los ácidos grasos de los clones que se examinaron. Los perfiles de lípidos resultantes de las Construcciones 9-23 se resumen a continuación.

21

Construcción 22

Construcción 23

reinhardtii βtubulina

Chlamydomonas reinhardtii βtubulina

Chlamydomonas reinhardtii βtubulina

delta 12 graso camphora nitrato ácido C14 TE reductase desaturasa

C.protothecoide Cinnamomum C. vulgaris s camphora nitrato estearoil ACP C14 TE reductase desaturasa

P. moriformis Cinnamomum C. vulgaris estearoil ACP camphora nitrato desaturasa C14 TE reductase

Construcción 9. Cuphea hookeriana C8-10 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 8:0

0 0.05 0.30 0-0.29

C 10:0

0.01 0.63 2.19 0-2.19

C 12:0

0.03 0.06 0.10 0-0.10

C 14:0

1.40 1.50 1.41 1.363.59

C 16:0

24.01 24.96 24.20

C 16:1

0.67 0.80 0.85

C 17:0

0 0.16 0.16

C 17:1

0 0.91 0

C 18:0

4.15 17.52 3.19

C 18:1

55.83 44.81 57.54

C 18:2

10.14 7.58 8.83

C 18:3α

0.93 0.68 0.76

C 20:0

0.33 0.21 0.29

C 24:0

0 0.05 0.11

Construcción 10. Cuphea hookeriana C8-10 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 8:0

0 0.01 0.02 0-0.03

C 10:0

0 0.16 0.35 0-0.35

C 12:0

0.04 0.05 0.07 0-0.07

C 14:0

1.13 1.62 1.81 0-0.05

C 14:1

0 0.04 0.04

C 15:0

0.06 0.05 0.05

C 16:0

19.94 26.42 28.08

C 16:1

0.84 0.96 0.96

C 17:0

0.19 0.14 0.13

C 17:1

0.10 0.06 0.05

C 18:0

2.68 3.62 3.43

C 18:1

63.96 54.90 53.91

C 18:2

9.62 9.83 9.11

C18:3 γ

0 0.01 0

C 18:3α

0.63 0.79 0.73

C 20:0

0.26 0.35 0.33

C 20:1

0.06 0.08 0.09

C 20:1

0.08 0.06 0.07

C 22:0

0 0.08 0.09

C 24:0

0.13 0.13 0.11

imagen55

Construcción 11. Cuphea hookeriana C8-10 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 8:0

0 0.82 1.57 0-1.87

C 10:0

0 3.86 6.76 0-6.76

C 12:0

0.04 0.13 0.20 0.030.20

C 14:0

1.13 1.80 1.98 1.642.05

C 14:1

0 0.04 0.04

C 15:0

0.06 0.06 0.06

C 16:0

19.94 25.60 25.44

C 16:1

0.84 1.01 1.02

C 17:0

0.19 0.13 0.11

C 17:1

0.10 0.06 0.05

C 18:0

2.68 2.98 2.38

C 18:1

63.96 51.59 48.85

C 18:2

9.62 9.85 9.62

C18:3 γ

0 0.01 0

C 18:3α

0.63 0.91 0.92

C 20:0

0.26 0.29 0.26

C 20:1

0.06 0.06 0

C 20:1

0.08 0.06 0.03

C 22:0

0 0.08 0.08

C 24:0

0.13 0.06 0

Construcción 12. Cuphea hookeriana C8-10 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 8:0

0 0.31 0.85 0-0.85

C 10:0

0 2.16 4.35 0.204.35

C 12:0

0.04 0.10 0.15 0-0.18

C 14:0

1.13 1.96 1.82 1.662.97

C 14:1

0 0.03 0.04

C 15:0

0.06 0.07 0.07

C 16:0

19.94 26.08 25.00

C 16:1

0.84 1.04 0.88

C 17:0

0.19 0.16 0.16

C 17:1

0.10 0.05 0.07

C 18:0

2.68 3.02 3.19

C 18:1

63.96 51.08 52.15

C 18:2

9.62 11.44 9.47

C18:3 γ

0 0.01 0

C 18:3α

0.63 0.98 0.90

C 20:0

0.26 0.30 0.28

C 20:1

0.06 0.06 0.05

C 20:1

0.08 0.04 0

C 22:0

0 0.07 0

C 24:0

0.13 0.05 0

imagen56

Construción14. Umbellularia californica C12 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.01 0.02 0.03 0.020.03

C 12:0

0.03 2.62 3.91 0.043.91

C 14:0

1.40 1.99 2.11 1.832.19

C 16:0

24.01 27.64 27.01

C 16:1

0.67 0.92 0.92

C 18:0

4.15 2.99 2.87

C 18:1

55.83 53.22 52.89

C 18:2

10.14 8.68 8.41

C 18:3α

0.93 0.78 0.74

C 20:0

0.33 0.29 0.27

Construcción 15. Umbellularia californica C12 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0 0.05 0.08 0-0.08

C 12:0

0.04 8.12 12.80 4.3512.80

C 13:0

0 0.02 0.03 0-0.03

C 14:0

1.13 2.67 3.02 2.183.37

C 14:1

0 0.04 0.03 0.030.10

C 15:0

0.06 0.07 0.06

C 16:0

19.94 25.26 23.15

C 16:1

0.84 0.99 0.86

C 17:0

0.19 0.14 0.14

C 17:1

0.10 0.05 0.05

C 18:0

2.68 2.59 2.84

C 18:1

63.96 46.91 44.93

C 18:2

9.62 10.59 10.01

C 18:3α

0.63 0.92 0.83

C 20:0

0.26 0.27 0.24

C 20:1

0.06 0.06 0.06

C 20:1

0.08 0.05 0.04

C 22:0

0 0.07 0.09

C 24:0

0.13 0.13 0.12

Construcción 16. Umbellularia californica C12 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0 0.03 0.04 0.020.04

C 12:0

0.04 2.43 5.32 0.985.32

C 13:0

0 0.01 0.02 0-0.02

C 14:0

1.13 1.77 1.93 1.621.93

C 14:1

0 0.03 0.02 0.020.04

C 15:0

0.06 0.06 0.05

C 16:0

19.94 24.89 22.29

C 16:1

0.84 0.91 0.82

C 17:0

0.19 0.16 0.15

C 17:1

0.10 0.06 0.06

C 18:0

2.68 3.81 3.67

C 18:1

63.96 53.19 52.82

C 18:2

9.62 10.38 10.57

C 18:3α

0.63 0.80 0.77

C 20:0

0.26 0.35 0.32

C 20:1

0.06 0.06 0.07

C 20:1

0.08 0.07 0.08

C 22:0

0 0.08 0.07

C 24:0

0.13 0.15 0.14

imagen57

Construcción 17. Umbellularia californica C12 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0 0.04 0.07 0.030.08

C 12:0

0.04 7.02 14.11 4.3214.11

C 13:0

0 0.03 0.04 0.010.04

C 14:0

1.13 2.25 3.01 1.953.01

C 14:1

0 0.03 0.03 0.020.03

C 15:0

0.06 0.06 0.06

C 16:0

19.94 23.20 21.46

C 16:1

0.84 0.82 0.77

C 17:0

0.19 0.15 0.14

C 17:1

0.10 0.06 0.06

C 18:0

2.68 3.47 2.93

C 18:1

63.96 50.30 45.17

C 18:2

9.62 10.33 9.98

C18:3 γ

0 0.01 0

C 18:3α

0.63 0.84 0.86

C 20:0

0.26 0.32 0.27

C 20:1

0.06 0.07 0.06

C 20:1

0.08 0.06 0.06

C 22:0

0 0.08 0.09

C 24:0

0.13 0.14 0.13

Construcción 18. Umbellularia californica C12 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0 0.03 0.05 0.010.05

C 12:0

0.04 5.06 7.77 0.377.77

C 13:0

0 0.02 0 0-0.03

C 14:0

1.13 2.11 2.39 1.822.39

C 14:1

0 0.03 0.03 0.020.05

C 15:0

0.06 0.06 0.06

C 16:0

19.94 24.60 23.95

C 16:1

0.84 0.86 0.83

C 17:0

0.19 0.15 0.14

C 17:1

0.10 0.06 0.05

C 18:0

2.68 3.31 2.96

C 18:1

63.96 51.26 49.70

C 18:2

9.62 10.18 10.02

C18:3 γ

0 0.01 0.02

C 18:3α

0.63 0.86 0.86

C 20:0

0.26 0.32 0.29

C 20:1

0.06 0.05 0.05

C 20:1

0.08 0.07 0.04

C 22:0

0 0.08 0.08

C 24:0

0.13 0.13 0.13

imagen58

Construcción 19. Cinnamomum camphora C14 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.02 0.01 0.01 0.010.02

C 12:0

0.05 0.27 0.40 0.080.41

C 14:0

1.52 4.47 5.81 2.105.81

C 16:0

25.16 28.14 28.55

C 16:1

0.72 0.84 0.82

C 18:0

3.70 3.17 2.87

C 18:1

54.28 51.89 51.01

C 18:2

12.24 9.36 8.62

C 18:3α

0.87 0.74 0.75

C 20:0

0.33 0.33 0.31

Construcción 20. Cinnamomum camphora C14 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.01 0.01 0.02 0.010.02

C 12:0

0.03 0.39 0.65 0.080.65

C 13:0

0 0.01 0.01 0.010.02

C 14:0

1.40 5.61 8.4 2.1-8.4

C 14:1

0 0.03 0.03 0.02

0.03

C 15:0

0 0.06 0.07

C 16:0

24.01 25.93 25.57

C 16:1

0.67 0.75 0.71

C 17:0

0 0.13 0.12

C 17:1

0 0.05 0.05

C 18:0

4.15 3.30 3.23

C 18:1

55.83 51.00 48.48

C 18:2

10.14 10.38 10.35

C 18:3α

0.93 0.91 0.88

C 20:0

0.33 0.35 0.32

C 20:1

0 0.08 0.08

C 20:1

0 0.07 0.07

C 22:0

0 0.08 0.08

C 24:0

0 0.14 0.13

Construcción 21. Cinnamomum camphora C14 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.01 0.01 0.01 0-0.01

C 12:0

0.03 0.10 0.27 0.040.27

C 14:0

1.40 2.28 4.40 1.474.40

C 16:0

24.01 26.10 26.38

C 16:1

0.67 0.79 0.73

C 17:0

0 0.15 0.16

C 17:1

0 0.06 0.06

C 18:0

4.15 3.59 3.51

C 18:1

55.83 53.53 50.86

C 18:2

10.14 10.83 11.11

C 18:3α

0.93 0.97 0.87

C 20:0

0.33 0.36 0.37

C 20:1

0 0.09 0.08

C 20:1

0 0.07 0.07

C 22:0

0 0.09 0.09

imagen59

Construcción 22. Cinnamomum camphora C14 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.01 0.02 0.02 0.020.02

C 12:0

0.03 1.22 1.83 0.591.83

C 13:0

0 0.02 0.03 0.010.03

C 14:0

1.40 12.77 17.33 7.9717.33

C 14:1

0 0.02 0.02 0.020.04

C 15:0

0 0.07 0.08

C 16:0

24.01 24.79 24.22

C 16:1

0.67 0.64 0.58

C 17:0

0 0.11 0.10

C 17:1

0 0.04 0.04

C 18:0

4.15 2.85 2.75

C 18:1

55.83 45.16 41.23

C 18:2

10.14 9.96 9.65

C 18:3α

0.93 0.91 0.85

C 20:0

0.33 0.30 0.30

C 20:1

0 0.07 0.06

C 20:1

0 0.06 0.05

C 22:0

0 0.08 0.08

Construcción 23. Cinnamomum camphora C14 TE

Ácido graso

tipo salvaje Promedio Muestra bajo/alto

C 10:0

0.01 0.01 0.02 0-0.02

C 12:0

0.05 0.57 1.08 0.161.08

C 13:0

0 0.02 0.02 0-0.02

C 14:0

1.45 7.18 11.24 2.9611.24

C 14:1

0.02 0.03 0.03 0.020.03

C 15:0

0.06 0.07 0.07

C 16:0

24.13 25.78 25.21

C 16:1

0.77 0.72 0.66

C 17:0

0.19 0.13 0.11

C 17:1

0.08 0.05 0.04

C 18:0

3.53 3.35 3.12

C 18:1

56.15 49.65 46.35

C 18:2

11.26 10.17 9.72

C 18:3α

0.84 0.95 0.83

C 20:0

0.32 0.34 0.32

C 20:1

0.09 0.08 0.09

C 20:1

0.07 0.05 0.06

C 22:0

0.07 0.08 0.08

C 24:0

0.13 0.13 0.12

imagen60

5

10

15

20

25

30

Las Construcciones 9-13 eran vectores de expresión que contenían la construcción de la tioesterasa C8-10 de Cuphea hookeriana. Como se puede observar en los resúmenes de los datos anteriores, los mejores resultados se vieron con la Construcción 11, con la muestra de ácido graso C8 que fue 1.57 % del área (en comparación con el 0 en el tipo salvaje) y el ácido graso C10 que fue 6.76 % del área (en comparación con el 0 en el tipo salvaje). También hubo un aumento moderado de los ácidos grasos C12 (un aumento de aproximadamente 2-5 veces). Si bien la secuencia dirigida a los plastidio nativa, no produjo cambio bajo el control del promotor de la glutamato deshidrogenasa de C.sorokinana, la misma construcción de expresión conducida por el promotor de la β-tubulina de C.reinhardtii produjo cambios significativos en los ácidos grasos C8-10 en la célula huésped. Esta es una prueba más de la idiosincrasia de la expresión heteróloga de tioesterasas en especies de Prototheca. Todos los clones que contenían la construcción de la tioesterasa C8-10 con el promotor de la β-tubulina de C.reinhardtii tuvieron mayores aumentos en los ácidos grasos C810 que los clones que contenían la construcción de la tioesterasa C8-10 con el promotor de la glutamato deshidrogenasa de C.sorokinana. Los datos del perfil lipídico para la Construcción 13 no se obtuvieron y, por tanto, no se incluyeron anteriormente.

Las Construcciones 14-18 eran vectores de expresión que contenían la construcción de la tioesterasa C12 de Umbellularia californica. Como se puede observar en los resúmenes de los datos anteriores, los mejores resultados se observaron con la Construccion 15 (la secuencia dirigida a plastidio de la isopentenil difosfato sintasa de P.moriformis) y la 17 (la secuencia dirigida a plastidio de la estearoil ACP desaturasa de C.protothecoides). El mayor cambio en la producción del ácido graso C12 se vio con la Construcción 17, con niveles de ácidos grasos C12 de hasta 14.11% del área, en comparación con el 0.04% del área en el tipo salvaje. También se observaron cambios moderados (aproximadamente de 2 veces) con los niveles de ácidos grasos C14. En comparación con la misma construcción con el promotor de la glutamato deshidrogenasa de la C.sorokinana, las mismas tendencias fueron ciertas con el promotor de la β-tubulina de C.reinhardtii – las secuencias dirigidas a plastidios de, la estearoil ACP desaturasa de C.protothecoides y la isopentenil difosfato sintasa de P.moriformis produjeron el mayor cambio en los niveles de ácidos grasos C12 con ambos promotores.

Las Construcciones 19-23 eran vectores de expresión que contenían la construcción de la tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora. Como se puede observar en los resúmenes de los datos anteriores, los mejores resultados se vieron con la Construcción 22 y la Construcción 23. El mayor cambio en la producción del ácido graso C14 se vio con la Construcción 22 y con niveles del ácido graso C14 de hasta el 17.35 % del área (cuando los valores de C140 y C141 se combinan), en comparación con el 1.40 % en el tipo salvaje. Los cambios en los ácidos grasos C12 también se observaron (5-60 veces). En comparación con la misma construcción con el promotor de la glutamato deshidrogenasa de C.sorokinana, las mismas tendencias fueron ciertas con el promotor de la β-tubulina –las secuencias dirigidas a

plastidios de la estearoil ACP desaturasa de C.protothecoides y la estearoil ACP desaturasa de P.moriformis produjeron el mayor cambio en los niveles de ácidos grasos C14 con ambos promotores. En consonancia construcciones de expresión de tioesterasa, la construcción con el promotor de la β-tubulina de C.reinhardtii produjo los mayores cambios en los niveles de ácidos grasos C8-14 que el de la glutamato deshidrogenasa de C.sorokiniana. Dos clones positivos de la Construcción 22 se seleccionaron y se cultivaron bajo alta presión selectiva (50 mg/l de G418). Después de 6 días de cultivo, los clones se cosecharon y se determinó el perfil lipídico mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente. Los datos del perfil lipídico se resumen a continuación y se expresaron en % del área.

imagen61

Construcción 22 clones + 50mg/l G418

Ácido graso

Construcción 22 A Construcción 22 B

C 12:0

3.21 3.37

C 14:0

27.55 26.99

C 16:0

25.68 24.37

C 16:1

0.99 0.92

C 18:0

1.37 1.23

C 18:1

28.35 31.07

C 18:2

11.73 11.05

C 18:3α

0.92 0.81

C 20:0

0.16 0.17

10 Ambos clones, cuando se cultivaron a presión selectiva alta, constante, produjeron un aumento en la cantidad de los ácidos grasos C14 y C12, aproximadamente el doble de los niveles que se observaron con la Construcción 22 anterior. Estos clones produjeron más de 30% del área de los ácidos grasos C12-14, en comparación con el 1.5 % del área de los ácidos grasos C12-14 que se vio en las células de tipo salvaje.

Ejemplo 6: Expresión heteróloga de la tioesterasa de Cuphea palustris y de Ulmus americanca en Prototheca

15 Dado el éxito de la expresión heteróloga de las tioesterasas en las especies de Prototheca, que se describió anteriormente, se construyeron y se describen a continuación casetes de expresión que contenían las secuencias que codifican las acil graso ACP tioesterasas con codones optimizados (según la Tabla 1) de Cuphea palustris y Ulmus americana.

Construcción Nombre

Promotor/5’UTR Sec. dirigida a Plastidio Gen 3’UTR sec. con núm. ident..

Construcción 27

C.reinhardtii βtubulina C.protothecoides estearoil ACP desaturasa Cuphea palustris tioesterasa C. vulgaris nitrato reductasa sec. con núm. ident.: 107

20 La Ulmus americana (secuencia codificante con codón optimizado) se puede insertar en el casete de expresión. La secuencia codificante con codones optimizados sin la secuencia dirigida a los plastidio nativa, para la tioesterasa de Ulmus americana se muestra como sec. con núm. de ident.: 108 y se puede fundir cualquier secuencia dirigida a plastidio que se desee y el elemento de expresión (es decir, el promotor/5'UTR y 3'UTR)

Estos casetes de expresión se pueden transformar en las especies de Prototheca mediante el uso de los métodos que

25 se describieron anteriormente. Los clones positivos se pueden detectar con la inclusión de un gen de resistencia a los antibióticos (por ejemplo, el neoR) en la construcción de expresión y detectarlo en las placas/medio que contienen el G418. Los clones positivos se pueden confirmar mediante uso de los ensayos de transferencia de tipo Southern con sondas específicas para la región que codifica la tioesterasa heteróloga y la construcción de expresión también se puede confirmar mediante el uso de la RT-PCR y cebadores específicos para la región que codifica la tioesterasa

30 heteróloga. La confirmación secundaria de los clones positivos se puede lograr mediante la búsqueda de cambios en los niveles de ácidos grasos en el perfil lipídico de la célula huésped. Como se vio en los ejemplos anteriores, la expresión de la tioesterasa heteróloga en las especies de Prototheca puede ser idiosincrásica a la tioesterasa particular. Los elementos promotor y secuencias dirigidas a plastidios (y otros elementos de regulación de la expresión) se pueden intercambiar hasta que la expresión de la tioesterasa (y el consiguiente aumento en el ácido graso correspondiente)

35 alcance el nivel deseado.

Ejemplo 7: Transformantes dobles -expresión simultánea de dos proteínas heterólogas

La cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente con una construcción de expresión que contenía el gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura que codifica la forma secretada de la invertasa de S. cerevisiae. La expresión exitosa de este gen y la 40 orientación al periplasma resultó en la capacidad de la célula huésped para crecer (y utilizar) la sacarosa como única fuente de carbono en condiciones heterótrofas (como se demostró en el Ejemplo 3 anterior). El segundo conjunto de genes que se expresaron son las tioesterasas que son responsables de la escisión del grupo acil de la proteína transportadora de acil. Específicamente, las tioesterasas de Cuphea hookeriana (preferentemente una tioesterasa C810), de Umbellularia californica (preferentemente una tioesterasa C12) y de Cinnamomum camphora (preferentemente una tioesterasa C14). Estos casetes de expresión de tioesterasas se clonaron como fusiones con las secuencias dirigidas a plastidios de microalgas N-terminales, ya sea de Prototheca moriformis o de Chlorella protothecoides, que se 5 demostró (en los ejemplos anteriores) ser más óptima que las secuencias dirigidas a plastidios, nativas de plantas superiores. La expresión exitosa de los genes de la tioesterasa y la orientación a plastidios resultó en cambios medibles en el perfil de ácidos grasos en la célula huésped. Estos cambios en los perfiles son consistentes con la especificidad enzimática o preferencia de cada tioesterasa. A continuación se muestra un resumen de construcciones de doble expresión que se ensamblaron y se transformaron en Prototheca moriformis (UTEX 1435). Cada construcción contenía 10 el gen suc2 de levadura bajo el control del promotor de la β-tubulina de C. reinhardtii /5'UTR y contenía la nitrato reductasa 3'UTR de C. vulgaris y una tioesterasa de planta superior con una secuencia dirigida a plastidio de microalgas en sustitución de la secuencia nativa bajo el control de la glutamato deshidrogenasa 5'UTR de C. sorokinana y contenía la nitrato reductasa 3'UTR de C. vulgaris. A continuación se muestra un resumen de la parte de la tioesterasa de las construcciones que se ensamblaron y se transformaron en Prototheca moriformis (UTEX 1435). El casete entero de

15 doble expresión con el gen suc2 y el gen de la tioesterasa se enumera en la lista de identificación de secuencias.

imagen62

Las construcciones similares de doble expresión con los casetes de la tioesterasa que se describieron en el Ejemplo 5 (por ejemplo, bajo el control de un promotor diferente, tal como el promotor de la β-tubulina/5'UTR de C. reinhardtii) también se pueden generar mediante el uso de métodos estándar de biología molecular y los métodos que se describen

20 en la presente.

Los clones positivos que contienen cada una de las construcciones de expresión se examinaron mediante el uso de su capacidad de crecer en placas que contenían sacarosa, donde la sacarosa es la única fuente de carbono, como factor de selección. Un subconjunto de estos clones positivos de cada construcción de transformación se seleccionó y la presencia de la construcción de expresión se confirmó mediante ensayos de transferencia de tipo Southern. La función 25 de la sacarosa invertasa de levadura también se confirmó mediante un ensayo de hidrólisis de la sacarosa. Los clones positivos se seleccionaron y se cultivaron en medios que contenían sacarosa como única fuente de carbono a una concentración inicial de 40 g/l. También se incluyó un control negativo de Prototheca moriformis (UTEX 1435) de tipo salvaje que se cultivó en medio que contenía glucosa como única fuente de carbono a la misma concentración de partida de 40 g/l. La utilización de la sacarosa se midió a través del curso del experimento por mediciones del nivel de

30 sacarosa en el medio, mediante el uso de un analizador bioquímico YSI 2700 con una membrana específica de sacarosa. Después de seis días de cultivo, los cultivos se cosecharon y se procesaron para el perfil lipídico, mediante el uso de los mismos métodos que se describieron anteriormente. Los resultados del perfil lipídico se resumen a continuación en la Tabla 17 y se muestran en % del área.

Tabla 17. Perfiles lipídicos de transformantes dobles con suc2 sacarosa invertasa y tioesterasa.

Ácido graso

PP C24 A C24 B C24 c C25 A C25 B C25 c C26 A C26 B C26 c

C 10:0

0.01 0.03 0.04 0.08 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.0

C 12:0

0.04 0.04 0.04 0.04 0.28 0.40 0.10 0.04 0.04 0.13

C 14:0

1.6 1.55 1.53 1.56 1.59 1.59 1.60 1.65 1.56 2.69

C 14:1

0.03 0.03 0.03 0.02 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03

C 15:0

0.04 0.03 0.03 0.04 0.04 0.03 0.03 0.03 0.03 0.04

C 16:0

29.2 29.1 29.0 28.6 28.9 28.6 29.0 28.8 29.5 27.5

C 16:1

0.86 0.80 0.79 0.82 0.77 0.81 0.82 0.79 0.79 0.86

C 17:0

0.1 0.08 0.08 0.09 0.09 0.08 0.09 0.08 0.08 0.09

C 17:1

0.04 0.03 0.03 0.04 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.04

C 18:0

3.26 3.33 3.37 3.27 3.36 3.28 3.18 3.33 3.36 3.03

C 18:1

54.5 53.9 54.1 53.9 53.5 53.7 53.5 54.2 53.9 52.7

C 18:2

8.72 9.35 9.22 9.45 9.68 9.65 9.87 9.31 9.06 10.8

imagen63

Todos los clones positivos seleccionados para el ensayo de la utilización de sacarosa hidrolizaron la sacarosa en el medio y al final del período de 6 días de cultivo, no había niveles medibles de sacarosa en el medio. Estos datos, además del uso exitoso de la sacarosa como una herramienta de selección de los clones positivos, indican que el gen suc2 de la sacarosa invertasa exógena de levaduras se orientó correctamente y se expresó en los transformantes.

5 Como se mostró en la Tabla 17 anterior, los clones que expresaban la Construcción 24 (la tioesterasa C8-10) tuvieron un aumento medible en ácidos grasos C10 (tan alto como un aumento de ocho veces). Asimismo hubo aumentos medibles en los clones que expresaban la Construcción 25 (la tioesterasa C12) y la Construcción 26 (la tioesterasa C14) en los correspondientes ácidos grasos de cadena mediana. En conjunto, los datos muestran la expresión simultánea exitosa en Prototheca moriformis de dos proteínas recombinantes (por ejemplo, la sacarosa invertasa y una acil ACP tioesterasa de ácidos grasos), los cuales confieren cambios fenotípicos útiles y cuantificables en el organismo huésped.

Ejemplo 8: Efectos del glicerol en la producción de ácidos grasos C10-C14 en transformantes de la tioesterasa C14

Los clones de todas las transformaciones de tioesterasas se seleccionaron y se evaluaron adicionalmente. Un clon que expresaba la Construcción 8 (C14 TE de Cinnamomum camphora) se cultivó heterotróficamente mediante el uso de

15 distintas fuentes de carbono: sólo glucosa, sólo fructosa y sólo glicerol. La condición de sólo glucosa resultó en mayor crecimiento celular y producción de lípidos totales, en comparación con las condiciones de sólo fructosa y sólo glicerol. Sin embargo, la proporción de ácidos grasos C12-14 que se produjeron en la condición de sólo glicerol fue dos veces mayor que la que se alcanzó en la condición de sólo glucosa.

Ejemplo 9: Expresión de la invertasa de Arabidopsis thaliana en Protoheca moriformis

La cepa de microalga Prototheca moriformis (UTEX 1435) se transformó mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente, con una construcción de expresión que contenía una invertasa de Arabidopsis thaliana asociada a la pared celular con codón optimizado (según la Tabla 1). La secuencia de la invertasa de Arabidoposis se modificó para incluir el N-terminal de 39 aminoácidos de la levadura invertasa (proteína suc2) para garantizar la eficiente dirección al RE y en última instancia al periplasma. Para ayudar a la detección, se añadió un epítopo FLAG al C-terminal 25 de la proteína recombinante. El transgén se clonó en un vector de expresión con una región promotor/5'UTR de la glutamato deshidrogenasa de Chlorella sorokinianna y una región nitrato reductasa 3'UTR de Chlorella vulgaris. La secuencia de ADN de este casete del transgén se muestra como sec. con núm. de ident.: 89 y la secuencia de aminoácidos traducida se muestra como sec. con núm. de ident: 90. Los clones positivos se examinaron y seleccionaron mediante el uso de placas/medio que contenían sacarosa. Un subconjunto de los clones positivos se confirmó por la presencia del transgén y la expresión de la invertasa mediante el análisis de transferencia de tipo Southern y Western para la invertasa con la etiqueta FLAG. A partir de este examen, se seleccionaron 10 clones positivos por la productividad de lípidos y las pruebas de la utilización de sacarosa. Los 10 clones se cultivaron en un medio que contenía sacarosa como única fuente de carbono y se incluyó también un control positivo del transformante de invertasa suc2. El control negativo, Prototheca moriformis de tipo salvaje también se cultivó pero en un medio que contenía

35 glucosa. Después de seis días, las células se cosecharon y se secaron y se determinó el porcentaje total de lípidos por peso seco de células. Los medios también se analizaron para el consumo total de sacarosa.

Los diez clones positivos hidrolizaron la sacarosa, sin embargo, la mayoría de los clones crecieron aproximadamente la mitad, ya sea el tipo salvaje o el control positivo del transformante de levadura invertasa suc2 según se determinó por el peso seco de las células al final del experimento. Del mismo modo, los diez clones positivos produjeron aproximadamente la mitad del total de lípidos tanto cuando se comparó con el tipo salvaje o con el transformante del control positivo. Estos datos demuestran el éxito de la expresión heteróloga de diversas sacarosas invertasas en

Prototheca.

Ejemplo 10: Expresión heteróloga de la levadura invertasa (suc2) en Prototheca krugani, Prototheca stagnora y

Prototheca zopfii

45 Para probar la aplicabilidad general de los métodos de transformación para su uso en las especies del género Prototheca, otras tres especies de Prototheca se seleccionaron: Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) y Prototheca zopfii (UTEX 1438). Estas tres cepas se cultivaron en los medios y las condiciones que se describieron en el Ejemplo 1 y sus perfiles de lípidos se determinaron mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente. Un resumen de los perfiles de lípidos de las tres cepas de Prototheca se resume a continuación en % del área.

Ácido graso

P. krugani (UTEX 329) P. stagnora (UTEX 1442) P. zopfii (UTEX 1438)

C 10:0

0.0 0.0 0.0

C 10:1

0.0 0.0 0.0

C 12:0

1.5 0.8 2.1

C 14:0

1.2 0.9 1.7

C 16

15.1 17.1 19.7

C 18:0

3.3 4.1 5.4

C 18:1

66.0 61.5 53.8

C 18:2

12.9 15.6 17.3

Estas tres cepas se transformaron con un casete de expresión de una levadura invertasa (suc2) (sec. con núm. de imagen64levadura invertasa (suc2) se demostró anteriormente en el Ejemplo 3 que funcionaba en subconjunto de los clones positivos para cada especie de Prototheca para el análisis de la hidrólisis de sacarosa y la productividad de los lípidos. glucosa. de las tres especies hidrolizaron la sacarosa, los transformantes de Prototheca stagnora y la sacarosa más eficientemente que la Prototheca kruganigénero Prototheca.

Ejemplo 11: Promotores y genes derivados de algas para su uso en microalgas

A. Secuencias de promotores y 5'UTR de Chlorella protothecoides

Una genoteca de ADNc se generó a partir de Chlorella protothecoides (UTEX 250) que creció mixotroficamente mediante el uso de técnicas estándar. En base a las secuencias de ADNc, los cebadores se diseñaron en ciertos genes domésticos conocidos, para "caminar" corriente arriba de las regiones de codificación mediante el uso del kit de ADN Walking de Seegene (Rockville, MD). Las secuencias aisladas incluyen una actina (sec. con núm. de ident.: 31) y el promotor del factor de elongación-1a (EF1a) (sec. con núm. de ident.: 32)/UTR, los cuales contienen intrones (como se muestra en minúscula) y exones (mayúsculas en cursiva ) y el sitio de inicio previsto (en negrita) y dos elementos de la beta-tubulina, promotor/UTR: La isoforma A (sec. con núm. de ident.: 33) y la isoforma B (sec. con núm. de ident.: 34).

B. Enzimas de la biosíntesis de lípidos y las secuencias dirigidas a los plastidios de C. protothecoides

 Chlorella protothecoides (UTEX 250) se clonaron mediante el uso de los mismos métodos que se describieron anteriormente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una acil ACP desaturasa (sec. con núm. de ident.: 45 y 46) y dos geranil geranil difosfato sintasas (sec. con núm. de ident.: 47-50) se incluyen en la lista de secuencias a continuación. Además, tres ADNc con la secuencia señal putativa dirigida a los plastidios se clonaron también. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (sec. con núm. de ident.: 51 y 52), una proteína compleja de desprendimiento de oxígeno OEE33 (sec. con núm. de ident.: 53 y 54) y una proteasa Clp (sec. con núm. de ident.: 55 y 56) se incluyeron en la lista de secuencias a continuación. La secuencia putativa dirigida a plastidio se subrayó, tanto en la secuencia de nucleótidos como de aminoácidos. Las secuencias dirigidas a plastidios se pueden usar para dirigir los productos de los transgenes a los plastidios de los microbios, tales como las enzimas de modificación de lípidos.

Ejemplo 12: 5'UTR/promotores de Prototheca moriformis que son sensibles al nitrógeno

Una genoteca de ADNc se generó a partir Prototheca moriformis (UTEX 1435) mediante el uso de técnicas estándar. Las células de Prototheca moriformis se cultivaron durante 48 horas en condiciones abundantes de nitrógeno. Entonces un inóculo de 5% (v/v) se transfirió a bajo nitrógeno y las células se cosecharon cada 24 horas durante siete días. Después de aproximadamente 24 horas en cultivo, el suministro de nitrógeno en el medio se agotó por completo. Las muestras que se recolectaron se congelaron de inmediato mediante el uso de hielo seco e isopropanol. El ARN total se aisló posteriormente de las muestras de sedimento de células congeladas y una porción de cada muestra se mantuvo en reserva para los estudios de RT-PCR. El resto del ARN total que se cosechó de las muestras se sometió a la selección de poliA. Cantidades equimolares de ARN seleccionado de poliA de cada condición se agruparon entonces, y se usaron para generar una genoteca de ADNc en el vector pcDNA 3.0 (Invitrogen). Se seleccionaron al azar alrededor de 1200 clones de la genoteca de ADNc resultante que se agruparon y se sometieron a secuenciación en ambas cadenas. Aproximadamente 68 ADNc diferentes se seleccionaron entre las 1200 secuencias y se usaron para diseñar los cebadores específicos del ADNc para su uso en estudios de RT-PCR en tiempo real.

El ARN que se aisló de las muestras de sedimentos de células que se reservaron, se usó como sustrato en los estudios de RT-PCR en tiempo real que usaron el conjunto de cebadores específicos del ADNc que se generaron anteriormente. Esta reserva de ARN se convirtió en ADNc y se usó como sustrato para la RT-PCR para cada uno del conjunto de 68 cebadores específicos del gen. El ciclo umbral o los números CT se usaron para indicar la relativa abundancia de transcripción de cada uno de los 68 ADNc dentro de cada muestra de ARN que se colectó a lo largo del tiempo. Los ADNc que mostraron un aumento significativo (más de tres veces) entre las condiciones de abundante de nitrógeno y nitrógeno empobrecido se identificaron como posibles genes cuya expresión se reguló de forma ascendente por el

Como un primer examen, uno de los promotores putativos, el 5'UTR/promotor aislado de Aat2 (transportador de amonio, sec. con núm. de ident.: 99), se clonó en la construcción de la tioesterasa C14 de Cinnamomum camphora con el 15 péptido de tránsito de la estearoil ACP desaturasa de Chlorella protothecoides que se describió en el Ejemplo 5 anterior, se sustituyó el promotor de la glutamato deshidrogenasa de C.sorokinana. Esta construcción se mostró como la sec. con núm. de ident.: 112. Para probar el promotor putativo, la construcción de tioesterasa se transformó en las células de Prototheca moriformis para confirmar la real actividad del promotor por la detección de un aumento de los ácidos grasos C14/C12 bajo condiciones de bajo/sin nitrógeno, mediante el uso de los métodos que se describieron anteriormente. Las

10 presencia de los promotores/5'UTR se confirmó posteriormente y se clonó mediante la amplificación por PCR del ADN genómico. Los extremos 5' individuales del ADNc se usaron para diseñar los cebadores 3' y los extremos 5' de los ensamblajes de los cóntigos 454 se usaron para diseñar los cebadores 5' específicos de genes.

Con el fin de identificar las secuencias putativas de los promotores/5'UTR del ADNc cuya expresión se reguló de forma ascendente durante el agotamiento/limitación de nitrógeno, el ADN total se aisló de Prototheca moriformis (UTEX 1435) 5 que crecieron en condiciones abundantes de nitrógeno y se sometieron entonces a secuenciación mediante el uso de la tecnología de secuenciación 454 (Roche). Los ADNc marcados como que se regulan de forma ascendente según los resultados de RT-PCR anteriores, se compararon mediante el uso de BLAST contra los cóntigos ensamblados que provenían de lecturas de la secuenciación 454 del genoma. Los extremos 5' del ADNc se correlacionaron con cóntigos específicos, y de ser posible, más de 500bp del flanco 5' de ADN se usó para identificar promotores/UTR putativos. La

agotamiento de nitrógeno. Como se discutió en la especificación, el agotamiento/la limitación de nitrógeno, se conoce imagen65que es un inductor de la lipogénesis en microorganismos oleaginosos.

20 pruebas similares para los promotores putativos que se regulan con nitrógeno que se aíslan a partir de la detección del ADNc/genoma, se pueden hacer mediante el uso de los mismos métodos.

Otros 5’UTR/promotores regulados por nitrógeno putativos que se aislaron a partir de la detección del ADNc/genoma fueron:

5’UTR/promotor sec. con núm. ident. veces de aumento

5’UTR/promotor FatB/A sec. con núm. ident.: 91 n/a 5’UTR/promotor NRAMP transportadora de metales sec. con núm. ident.: 92 9.65 5’UTR/promotor de la proteína Flap Flagelar asociada sec. con núm. ident.: 93 4.92 5’UTR/promotor de sulfito reductasa SulfRed sec. con núm. ident.: 94 10.91 5’UTR/promotor del transportador de azúcar SugT sec. con núm. ident.: 95 17.35 5’UTR/promotor del transportador de amonio 03 Amt03 sec. con núm. ident.: 96 10.1 5’UTR/promotor del transportador de amonio 02 Amt02 sec. con núm. ident.: 97 10.76 5’UTR/promotor del transportador de aminoácido 01 Aat01 sec. con núm. ident.: 98 6.21 5’UTR/promotor del transportador de aminoácido 02 Aat02 sec. con núm. ident.: 99 6.5 5’UTR/promotor del transportador de aminoácido 03 Aat03 sec. con núm. ident.: 100 7.87 5’UTR/promotor del transportador de aminoácido 04 Aat04 sec. con núm. ident.: 101 10.95 5’UTR/promotor del transportador de aminoácido 05 Aat05 sec. con núm. ident.: 102 6.71

25 Las veces de incremento se refiere a las veces de incremento en abundancia de ADNc después de 24 horas de cultivo en medio bajo en nitrógeno.

Ejemplo 13: Recombinación homóloga en las especies de Prototheca

La recombinación homóloga de transgenes tiene varias ventajas sobre los métodos de transformación que se

30 describieron en los ejemplos anteriores. En primer lugar, la introducción de transgenes, sin recombinación homóloga puede ser impredecible, porque no hay control sobre el número de copias del plásmido que se introduce en la célula. Además, la introducción de transgenes, sin recombinación homóloga puede ser inestable debido a que el plásmido puede permanecer episomal y se pierde en las divisiones celulares posteriores. Otra de las ventajas de la recombinación homóloga es la capacidad de "desactivación" de genes dianas, de introducir epítopo etiquetas, cambiar

35 promotores de genes endógenos y otro tipo de modificaciones de genes diana (por ejemplo, la introducción de mutaciones puntuales.

Se construyeron dos vectores con una región específica del genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435), que se designó KE858. La KE858 es un fragmento genómico 1.3 kb que abarca parte de la región que codifica para una proteína que comparte homología con el ARN de transferencia (ARNt) de la familia de proteínas. La transferencia de

40 tipo Southern demostró que la secuencia KE858 estaba presente en una sola copia en el genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). El primer tipo de vector que se construyó, designado SZ725 (sec. con núm. de ident.: 103), consistía en el fragmento de 1.3 kb KE858 completo, clonado en un esqueleto del vector pUC19 que también contenía el gen optimizado (suc2) de la levadura invertasa que se usó en el Ejemplo 3 anterior. El fragmento KE858 contenía un sitio único SnaB1 que no aparecía en ningún otro lugar de la construcción diana. El segundo tipo de vector que se

45 construyó, designado SZ726 (sec. con núm. de ident.: 126), consistió en la secuencia KE858 que se interrumpió por la inserción del gen de la levadura invertasa (suc2) en el sitio SnaB1 dentro de la secuencia genómica KE858. El fragmento total de ADN que contiene las secuencias KE858 que flanquean el gen de levadura invertasa se puede escindir del esqueleto del vector mediante digestión con EcoRI, que corta en cada extremo de la región KE858.

La expresión de sacarosa invertasa y la estabilidad del transgén se evaluaron por el crecimiento de los transformantes por más de 15 generaciones en ausencia de la selección. Los cuatro transformantes SZ725 y los diez transformantes SZ276 que dieron positivo para el transgén por transferencia de tipo Southern se individuales de cada uno de los transformantes se cultivaron en serie: en primer lugar sin selección en medio con glucosa y luego con la selección de los medios que contenían sacarosa como la única fuente de carbono. Los diez transformantes SZ276 (100%) mantuvieron su capacidad de crecer en sacarosa al cabo de 15 generaciones, mientras que aproximadamente 97% de los transformantes SZ725 conservaron su capacidad de crecer en sacarosa al cabo de 15 generaciones. Los transgenes que se introdujeron por un evento de cruce doble (vector SZ726) tienen una estabilidad muy alta durante el doblaje de las generaciones. En cambio, los transgenes que se introdujeron por un evento de un solo cruce (vector SZ725) pueden dar lugar a cierta inestabilidad durante el doblaje de las generaciones porque se introdujeron copias en tándem de los transgenes, las regiones homólogas repetidas que flanquean los transgenes se pueden recombinar y eliminar del ADN transgénico que se encontraba entre ellos.

Ambos vectores se usaron para dirigir la recombinación homóloga del gen (suc2) de la levadura invertasa en la región imagen66KE858 correspondiente del genoma de Prototheca moriformis digeridos se introdujeron entonces en los cultivos de Prototheca moriformis levadura invertasa y la región KE858 correspondiente del genoma.

Estos experimentos demuestran el uso exitoso de la recombinación homóloga para generar transformantes de Prototheca que contengan un gen heterólogo de la sacarosa invertasa que esté integrado de forma estable en los cromosomas nucleares del organismo. El éxito de la recombinación homóloga permite otras alteraciones genómicas en Prototheca, incluidas las supresiones de genes, las mutaciones puntuales y el epítopo etiquetado de un producto génico deseado. Estos experimentos demuestran también el primer sistema documentado para la recombinación homóloga en el genoma nuclear de un microalga eucariota.

A. Uso de la recombinación homóloga para la desactivación de un gen endógeno de Prototheca moriformis

En la detección en el ADNc/ genoma de Prototheca moriformis que se describió en el Ejemplo 11 anterior, se identificó el ADNc de una estearoil ACP desaturasa endógena (SAPD). Las enzimas estearoil ACP desaturasas forman parte de la vía de síntesis de los lípidos y tienen la función de introducir dobles enlaces en las cadenas de acil graso. En algunos casos, puede ser una ventaja desactivar o reducir la expresión de enzimas de la ruta de los lípidos con el fin de modificar un perfil de ácidos grasos. Una construcción de recombinación homóloga se creó para evaluar si la expresión de una enzima endógena estearoil ACP desaturasa se podía reducir (o desactivar) y si se podía observar la correspondiente reducción de los ácidos grasos insaturados en el perfil lipídico de la célula huésped. Una secuencia codificante de aproximadamente 1.5kb de un gen de estearoil ACP desaturasa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) se identificó y se clonó (sec. con núm. de ident.: 104). La construcción de recombinación homóloga se construyó mediante el uso de 0.5kb de la secuencia codificante de SAPD en el extremo 5' (sitio de dirección 5'), seguida del promotor de la β-tublina de Chlamydomonas reinhardtii que conducía un gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura con codón optimizado, con 3'UTR de Chlorella vulgaris. El resto (~ 1 kb) de la secuencia codificante de la SAPD de Prototheca moriformis se insertó entonces, después de la 3'UTR de C.vulgaris para conformar el sitio diana 3'. La secuencia de este casete de recombinación homóloga se muestra en la sec. con núm. de ident.: 105. Como se observó anteriormente, la tasa de éxito para la integración del casete de recombinación homóloga en el genoma nuclear se puede aumentar mediante la linealización del casete y dejar los extremos expuestos antes de la transformación de la microalga. El casete de recombinación homóloga dirigida a una enzima SAPD endógena en Prototheca moriformis se lineanlizó y luego se transformó en la célula huésped (Prototheca moriformis, UTEX 1435). Una integración exitosa eliminaría del genoma huésped la región de codificación de la enzima SAPD endógena a través de un evento de doble recombinación recíproca, mientras que la expresión del nuevo gen suc2  tubulina de C.reinhardtii. Los clones resultantes se pueden examinar mediante el uso placas/medios que contengan sacarosa como única fuente de carbono. Los clones que contengan una integración exitosa del casete de recombinación homóloga tendrán la capacidad de crecer en sacarosa como única fuente de carbono y los cambios en la saturación global de los ácidos grasos en el perfil lipídico servirá como factor de confirmación secundaria. Además, los ensayos de transferencia de tipo Southern que usen una sonda específica para el gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura y la RT-PCR también podrán confirmar la presencia y expresión del gen de la invertasa en los clones positivos. Como alternativa, la misma construcción sin el promotor de la β-tubulina se puede usar para cortar la región de codificación de la enzima SAPD endógena. En este caso, el gen suc2 de la sacarosa invertasa de levadura recién incorporado, será regulado por el promotor de la SAPD endógena/5'UTR.

Ejemplo 14: Producción de combustible

15 tambor. La biomasa de algas secas se lisó y el aceite se extrajo por medio de una prensa expulsora como se describió en el Ejemplo 44 anterior. El aceite residual de la biomasa presionada entonces se extrajo mediante el disolventes de éter de petróleo. El éter de petróleo residual se evaporó de la comida deslipidada mediante el uso de un rotoevaporador (Buchi Labortechnik AG, Suiza). El análisis de la composición de glicosil (monosacáridos) se realizó entonces, en la comida deslipidada mediante el uso de la combinación de la cromatografía de gases

La Prototheca moriformis (UTEX 1435) se cultivó en condiciones y medio nutriente (con 4% de glucosa) como se describió en el Ejemplo 45 anterior. La biomasa de microalgas se cosechó a continuación, y se secó con un secador de

B. Composición de los monosacáridos de la biomasa de Prototheca moriformis deslipidada

10 encima de 50% del peso seco de las células de aceite no requiere el uso de una presión auxiliar, como el pasto forrajero para liberar el aceite.

La biomasa de microalgas que contenía 38% de aceite por PSC se secó con un secador de tambor lo que resultó en un contenido de humedad resultante de 5-5.5%. La biomasa se introdujo en una prensa francesa L250. Se introdujeron a 5 través de la prensa 30.4 kg (67 lbs.) de la biomasa y no se recuperó aceite. La misma biomasa microbiana seca se combinó con distintos porcentajes de pasto forrajero como una presión auxiliar que se introdujo a través de la prensa. La combinación de la biomasa microbiana seca y el 20% p/p del pasto forrajero produjo el mejor porcentaje de rendimiento de aceite en general. Las tortas de prensado se sometieron entonces a extracción con hexano y el rendimiento final de la condición de 20% de pasto forrajero fue de 61.6% del aceite total disponible (calculado por peso). La biomasa por

A. Extracción del aceite de microalgas, mediante el uso de una prensa expulsora y una presión auxiliar imagen67

20 espectrometría de masas (GC/MS) del per-O-trimetilsili (TMS) derivado de los monosacáridos metil glucósidos producidos a partir de la muestra por metanólisis ácida. Una muestra de comida deslipidada se sometió a metanólisis en HCl 1M en metanol a 80°C durante aproximadamente 20 horas, seguida de una nueva N-acetilación con piridina y anhídrido acético en metanol (para la detección de azúcares amino). Las muestras se sometieron entonces a per Otrimetilsililación por el tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos (ver métodos en Merkle y Poppe (1994)

25 Methods Enzymol. 230: 1-15 y York y otros, (1985) Methods Enzymol. 118:3-40). El análisis GC/MS de los glucósidos de metilo TMS se llevó a cabo en un sistema HP 6890 GC conectado a un MSD 5975b, mediante el uso de una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30m x 0.25 mm de DI). Los monosacáridos se identificaron por sus tiempos de retención con respecto a los estándares, y el carácter de estos carbohidratos es autenticado por sus espectros de masas. Se añadieron 20 microgramos por muestra de inositol a la muestra antes de la derivatización como un estándar

30 interno. El perfil de monosacárido de la biomasa de Prototheca moriformis deslipidada (UTEX 1435) se resume en la Tabla 18 a continuación. El porcentaje de carbohidratos totales de la muestra se calculó en 28.7%.

Tabla 18. Análisis de la composición de monosacárido (glicosilo) de la biomasa deslipidada (UTEX 1435) de Prototheca moriformis.

Masa (μg)

% Molar (del total de carbohidrato)

Arabinosa

0.6 1.2

Xilosa

n.d. n.d.

Ácido galacturónico (GalUA)

n.d. n.d.

Manosa

6.9 11.9

Galactosa

14.5 25.2

Glucosa

35.5 61.7

N acetil galactosamina (GalNAc)

n.d. n.d.

N acetil glucosamina (GlcNAc)

n.d. n.d.

Heptosa

n.d. n.d.

ácido 3 deoxi--2-manno-2 octulsónico (KDO)

n.d. n.d.

Suma

57 100

n.d. = ninguno detectado

35 El contenido de carbohidratos y monosacáridos de la composición de la comida deslipidada lo hace adecuado para uso como alimento para animales o como parte de una formulación de piensos para animales. Así, en un aspecto, la presente divulgación proporciona comida deslipidada que tiene el contenido de los productos establecidos en la tabla anterior.

C. Producción de biodiesel a partir de aceite de Prototheca

40 El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, que se produjo de acuerdo a los métodos que se describieron anteriormente, se sometió a transesterificación para producir ésteres metílicos de ácidos grasos. Los resultados se muestran a continuación:

El perfil lipídico del aceite fue: C10:0 0.02

45 C12:0 0.06 C14:0 1.81

C14.1 0.07 C16:0 24.53 C16:1 1.22 C18:0 2.34

5 C18:1 59.21 C18:2 8.91 C18:3 0.28 C20:0 0.23 C20:1 0.10

10 C20:1 0.08 C21:0 0.02 C22:0 0.06 C24:0 0.10

15 Tabla 19. Perfil de biodiesel del aceite de triglicérido de Prototheca moriformis.

imagen68

Método

Prueba Resultado Unidades

ASTM D1160

Destilación de productos de petróleo a presión reducida IBP 248 °C

AET @ 5% Recuperación

336 °C

AET @ 10% Recuperación

338 °C

AET @ 20% Recuperación

339 °C

AET @ 30% Recuperación

340 °C

AET @ 40% Recuperación

342 °C

AET @ 50% Recuperación

344 °C

AET @ 60% Recuperación

345 °C

AET @ 70% Recuperación

347 °C

AET @ 80% Recuperación

349 °C

AET @ 90% Recuperación

351 °C

AET @ 95% Recuperación

353 °C

FBP

362 °C

% Recuperado

98.5 %

% Pérdidas

1.5 %

% Residuo

0.0 %

Volumen de la trampa para frío

0.0 ml

IBP

248 °C

EN 14112

Determinación de la estabilidad de oxidación (prueba de oxidación acelerada) Estabilidad de oxidación >12 h

Temp. de operación (usualmente 110 grados C)

110 °C

ASTM D4052

Densidad de líquidos por medidor de densidad digital peso API @ 60°F 29.5 °API

ASTM D 6890

Determinación de retardo en la ignición (ID) y número de cetano derivado (DCN) Número de cetano derivado (DCN) > 61.0

El perfil lipídico del biodiesel fue muy similar al perfil lipídico del aceite como materia prima. Los demás aceites que proporcionaron los métodos y las composiciones divulgadas se pueden someter a transesterificación para producir biodiesel con los perfiles de lípidos, que incluyen (a) al menos 4% C8-C14, (b) al menos 0.3% C8; (c) al menos 2% C10,

5 (d) al menos 2% C12 y (3) al menos 30% C8-C14.

La filtrabilidad por inmersión en frío por el método ASTM D6751 A1 de producción de biodiesel, fue de 120 segundos para un volumen de 300 ml. Esta prueba consiste en la filtración de 300 ml de B100, refrigerados a 40°F durante 16 horas, se dejó calentar a temperatura ambiente, y se filtró al vacío con fibra de vidrio de 0.7 micras con soporte de acero inoxidable. Los aceites divulgados se pueden transesterificar para generar biodiesel con un tiempo de inmersión en frío

10 de menos de 120 segundos, menos de 100 segundos y menos de 90 segundos.

D. La producción de diesel renovable

El aceite desgomado de Prototheca moriformis UTEX 1435, elaborado de acuerdo a los métodos que se describieron anteriormente y que tenía el mismo perfil lipídico que el aceite usado para producir biodiesel en el Ejemplo X anterior, se sometió a la transesterificación para producir diesel renovable.

15 El aceite primero se trató con hidrógeno para eliminar el oxígeno y el esqueleto de glicerol, lo que produjo n-parafinas. Las n-parafinas se sometieron entonces a craqueo e isomerización. El cromatograma del material se muestra en la Figura 13. El material se sometió entonces a filtración en frío, que eliminó aproximadamente 5% del material C18. Tras la filtración en frío el volumen total de material se redujo a punto de inflamación y se evaluó el punto de inflamación, la distribución de la destilación ASTM D-86, el punto de turbidez y viscosidad. El punto de inflamación fue de 63°C, la

20 viscosidad fue de 2.86 cSt (centistokes), el punto de turbidez fue de 4°C. Los valores de la destilación ASTM D86 se muetran en la Tabla 20:

Tabla 20. Lecturas en °C:

VolumenTemperatura IBP 173 5 217.4 10 242.1 15 255.8 20 265.6 30 277.3 40 283.5 50 286.6 60 289.4 70 290.9 80 294.3 90 300 95 307.7 FBP 331.5

La T10-T90 del material producido fue 57.9°C. Los métodos de tratamiento con hidrógeno, la isomerización, y otra imagen69(tales como la filtración en frío) divulgados en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovables con otros intervalos T90-T10, tales como, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 65°C mediante el uso de los aceites triglicéridos que se producen de acuerdo con los métodos divulgados en la presente.

La T10 del material producido fue 242.1 °C. Los métodos de tratamiento con hidrógeno, la isomerización, y otra modificación covalente de los aceites divulgados en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) que se divulgan en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovables con otros valores de T10, tales como T10 entre 180 y 295, entre 190 y 270, entre 210 y 250, entre 225 y 245, y al menos 290.

La T90 del material que se produjo fue de 300 °C. Los métodos de tratamiento con hidrógeno, la isomerización, y otra modificación covalente de los aceites divulgados en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) que se divulgan en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovables con otros valores de T90, tales como T90 entre 280 y 380, entre 290 y 360, entre 300 y 350, entre 310 y 340, y al menos 290.

La FBP del material producido fue de 300°C. Los métodos de tratamiento con hidrógeno, la isomerización, y otra modificación covalente de los aceites que se divulgan en la presente, así como los métodos de destilación y fraccionamiento (como la filtración en frío) que se divulgan en la presente, se pueden emplear para generar composiciones de diesel renovables con otros valores FBP, tales como FBP entre 290 y 400, entre 300 y 385, entre 310 y 370, entre 315 y 360, y al menos 300.

Los demás aceites que se proporcionan en la presente se pueden someter a combinaciones de tratamiento con hidrógeno, isomerización, y otras modificaciones covalentes, que incluyen los aceites con los perfiles de lípidos, (a) al menos 4% C8-C14, (b) al menos el 0.3% C8, (c) al menos 2% C10; (d) al menos 2% C12, y (3) al menos 30% C8-C14.

Ejemplo 15: Utilización de sacarosa por la Chlorella luteoviridis

A. Crecimiento de la SAG 2214 en glucosa y sacarosa

La SAG 2214 (designada como Chlorella luteoviridis) se probó para el crecimiento en la oscuridad en medios que contenían glucosa o sacarosa. Los cultivos líquidos heterótrofos se iniciaron mediante el uso de un inóculo de un frasco congelado en medio ya sea que contenía 4% de glucosa o 4% de sacarosa como única fuente de carbono. Los cultivos se cultivaron en la oscuridad, con agitación a 200 rpm. Se tomaron muestras de los cultivos en los puntos de tiempo 0, 24, 48 y 72 horas y el crecimiento se midió por la absorbancia relativa a 750nm (UV Mini1240, Shimadzu). La SAG 2214 creció igual de bien en la glucosa como en la sacarosa, lo que muestra que esta microalga puede utilizar la sacarosa tan eficazmente como la glucosa como única fuente de carbono. El resultado de este experimento se representa gráficamente en la Figura 3.

B. Productividad de lípidos y el perfil de ácidos grasos de la SAG 2214

La cepa de microalgas SAG 2214 se cultivó en un medio líquido que contenía glucosa o sacarosa como única fuente de carbono en condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 32 anterior. Después de 7 días, las células se cosecharon para el cálculo del peso seco de las células. Las células se centrifugaron y se liofilizaron durante 24 horas. Los sedimentos de células secas se pesaron y se calculó el peso seco de células por litro. Las células para el análisis de los lípidos también se cosecharon y se centrifugaron a 4000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se desechó el sobrenadante y las muestras se procesaron para el análisis de los lípidos y el perfil de ácidos grasos mediante el uso de los procedimientos estándar de cromatografía de gas (GC/FID). Los resultados se resumen a continuación en la Tablas 21 y 22.

Tabla 21. Productividad de lípidos y PSC para SAG 2214.

Muestra

Lípido (g/l) PSC (g/l) % lípido PSC

SAG 2214 glucosa

2.43 5.73 42.44%

SAG 2214

0.91 2.00 45.56%

sacarosa

Tabla 22. Perfil de ácido graso para SAG 2214.

Ácido graso

Porcentaje (p/p)

C:16:0

21

C:18:1

38

C:18:2

41

imagen70

5 C. Comparación genómica de la SAG 2214 con otras cepas de Chlorella luteoviridis La cepa de microalgas SAG 2214 resultó ser de interés general debido a su capacidad de crecer en sacarosa como fuente de carbono (se ilustró anteriormente). Además de las características de crecimiento de esta cepa, sus relaciones taxonómicas con otras especies de microalgas también fueron de interés. Designada por la colección del SAG como una cepa de Chlorella luteoviridis, el gen ARNr 23S de la SAG 2214 se secuenció y se comparó con la secuencia ARNr

10 23S del genoma de otras nueve cepas también identificadas por las colecciones SAG y UTEX como la Chlorella luteoviridis. Estas cepas fueron UTEX 21, 22, 28, 257 y 258, y las cepas del SAG 2133, 2196, 2198 y 2203. Los métodos para determinar el genotipo del ADN que se usaron, fueron los mismos métodos que se describieron anteriormente en el Ejemplo 1. Las alineaciones de las secuencias y los árboles sin raíces se generaron mediante el uso del software de análisis de ADN Geneious. De las nueve cepas a las que se le determinó el genotipo, UTEX 21, 22, 28 y

15 257 tuvieron idénticas secuencias de ADN del ARNr 23S (sec. con núm. de ident.: 106). Las otras cinco cepas de Chlorella luteoviridis tuvieron secuencias de ARNr 23S que fueron altamente homólogas a UTEX 21, 22, 28 y 257.

La secuencia del gen ARNr 23S de la SAG 2214 (sec. con núm. de ident.: 30) es decididamente diferente del de las otras nueve cepas C. luteoviridis, éste tiene una gran inserción que no se encontró en las otras cepas. Un análisis más detallado de esta secuencia del gen ARNr 23S que usó el BLAST indicó que compartía la mayor homología con los 20 miembros del género Leptosira y Trebouxia (miembros de la porción ficobionte de los líquenes). Estos resultados indican que la SAG 2214 no puede ser una cepa de Chlorella luteoviridis según la clasificación de la colección de cepas, pero comparten la identidad de nucleótidos de ARNr 23S de manera significativa con las algas simbiontes que se encontraron en líquenes. El análisis genómico junto con las características de crecimiento indicó que la SAG 2214 puede ser una fuente de genes y proteínas implicadas en el metabolismo de la sacarosa, así como en la señalización y

25 el tránsito de los péptidos responsables de la correcta localización de tales enzimas. La SAG 2214 y otras cepas con un alto grado de similitud genómica también pueden ser cepas útiles para la producción de aceite mediante el uso de la sacarosa como fuente de carbono fijo.

A pesar de que esta invención se describió en relación con realizaciones específicas de ésta, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Las publicaciones mencionadas en este documento se citan con el fin de describir 30 y divulgar los reactivos, metodologías y conceptos que se pueden usar en relación con la presente invención. Nada en la presente se debe interpretar como una admisión de que estas referencias son materia anterior en relación con las invenciones descritas en la presente. La solicitud provisional de Estados Unidos núm. 60/941,581, presentada el 1 de junio de 2007, titulada "Producción de hidrocarburos en microorganismos"; la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 60/959174, presentada el 10 de julio de 2007, titulada "Producción de hidrocarburos en microorganismos"; la 35 solicitud provisional de Estados Unidos núm. 60/968, 291, presentada el 27 de agosto de 2007, titulada "Producción de hidrocarburos en microorganismos"; la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/024, 069 presentada el 28 de enero de 2008, titulada "Producción de hidrocarburos en microorganismos"; la solicitud PCT núm. PCT/US08/65563, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "La producción de aceite en microorganismos"; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 12/131,783, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Uso de material celulósico para el cultivo 40 de microorganismos"; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 12/131,773, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Diesel y combustible de avión renovables de origen microbiano"; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 12/131,793, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Utilización de sacarosa como materia prima para la fabricación de combustible a base de aceite"; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 12/131,766, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Utilización del glicerol como materia prima para la fabricación del combustible a base de 45 aceite"; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 12/131,804, presentada el 2 de junio de 2008, titulada "Modificación de la ruta de los lípidos en microorganismos oleginosos."; la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 61/118,590, presentada el 28 de noviembre de 2008, titulada "Producción de aceite en microorganismos”; la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/118,994, presentada 1 de diciembre de 2008, titulada "Producción de

aceite en microorganismos"; la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 61/174,357, presentada el 3 de abril de 2009, titulada "Producción de aceite en microorganismos"; la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm. 61/219,525, presentada el 23 de junio de 2009, titulada "Producción de aceite en microorganismos", y la solicitud PCT núm. __________ [[Expediente núm. 026172-005020PC], presentada el 30 de noviembre de 2009, titulada "Fabricación de aceites específicos en microorganismos heterótrofos recombinantes".

imagen71

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES
2. 5. La célula de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde la célula es Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora, o Prototheca zopfii.

   10 4. La célula de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde la célula tiene una secuencia ARNr 23S con al menos 75% de identidad de nucleótido para una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 11-19.
3. 3. La célula de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el promotor es regulado de forma ascendente al menos 3 veces en una célula del género Prototheca cuando el ambiente extracelular cambia de contener al menos 5mM nitrógeno a no contener nitrógeno, por ejemplo en donde la secuencia de nucleótidos del promotor comprende un segmento de 50 o más nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de las sec. con núm. ident.: 91-102.
4. 2. La célula de conformidad con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos del promotor es 5 endógena a una especie del género Prototheca.

   1. Una célula del género Prototheca que comprende un gen exógeno donde dicho gen exógeno está en unión imagen1operativa con un promotor y codifica una sacarosa invertasa.
5. 6. La célula de la reivindicación 5, en donde la célula es Prototheca moriformis.

   15 7. El uso de las células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para producir un lípido, opcionalmente en donde el lípido se utiliza además para la producción de un aceite, combustible o producto óleo químico.

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