CN114561438A - 一种糖脂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种糖脂及其制备方法和应用。本发明提供了一种糖脂的制备方法，包括以下步骤：将酵母菌液进行发酵培养，得糖脂；所述发酵培养过程中进行补料。本发明所述方法制备糖脂具有产量大、产率高、质量稳定、能耗低和操作简便的优势。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种糖脂及其制备方法和应用。
背景技术
甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)是一种新兴的具有生物表面活性剂功效的糖脂，目前主要由微生物转化植物油或者葡萄糖等碳源进行转化，用于转化该物质的菌种以担子菌中一些酵母菌为主。
现阶段，研究发现这种糖脂除具备表面活性，同时具有良好的生物学活性，如有文章显示其具有良好的抗菌活力，抑制黑色素细胞生长，并且能够清除自由基、降低SDS引起的皮肤细胞死亡。这预示着其可能是一种潜在的功能性化妆品原料。尽管已经有研究涉及到了甘露糖赤藓糖醇脂小规模发酵，如发明专利201510170977.4及201310540906.8公开了两种摇瓶发酵制甘露糖赤藓糖醇脂的方法，其产出的甘露糖赤藓糖醇脂的量仅分别为62.5g/L及88g/L，产率较低，并且该规模的发酵总量少，不足以为工业化生产提供原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种糖脂及其制备方法和应用。采用本发明所述方法制备糖脂具有产量大、产率高优势，能够工厂化生产糖脂。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种糖脂的制备方法，包括以下步骤：
将酵母菌液进行发酵培养，得糖脂；
所述发酵培养过程中进行补料。
优选的，所述发酵培养时，采用的发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：植物油10％～30％、酵母浸粉0.05％～0.2％、硫酸镁0.02％～0.06％、硝酸钠0.2％～0.8％、磷酸二氢钠0.02％～0.08％、消泡剂0.001％～0.01％和余量水。
优选的，所述补料的方式为分批补料。
优选的，所述补料的时间为发酵48h后，补料的量为酵母菌液的10％～30％；
所述分批补料包括一次补料，分两次补料、分四次补料或分六次补料；所述一次补料的时间优选为发酵培养的第48h；所述分两次补料的时间为发酵培养的第48h和第72h；所述分四次补料的时间为发酵培养第48h、第72h、第96h和第120h；所述分六次补料的时间为发酵培养48h、72h、96h、120h、144h和168h；分批补料时，每次补料的量为酵母菌液体积的5％～10％；
优选的，所述补料时，补充的发酵料包括植物油。
优选的，所述植物油包括橄榄油、豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、蓖麻油、棕榈油、亚麻油、油菜籽油和小麦胚芽油中的一种或几种。
优选的，所述酵母菌包括南极洲假丝酵母。
优选的，所述发酵培养的温度为27.5～28.5℃，时间为5～10d，转速为300～600rpm，通气量为1～1.5vvm。
本发明还提供了一种糖脂，所述糖脂为利用酵母菌液进行发酵培养所得；所述发酵培养过程中进行补料。
本发明还提供了上述技术方案中所述的糖脂在制备日化品中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种糖脂的制备方法，包括以下步骤：将酵母菌液接进行发酵培养，得糖脂；在所述发酵培养过程中补料。本发明所述方法制备糖脂具有产量大、产率高、质量稳定、能耗低和操作简便的优势。本发明实施例结果表明：采用本发明所述制备方法制备糖脂的产量达到110g/L，显著高于相同时间内采用现有技术制备方法制备得到的糖脂产量。因此，本发明所述方法能够用于工厂化生产糖脂。
而且，本发明通过提高底物的总量、设定补料的方式、时间、补料的用量以及发酵培养过程中的条件参数的限定，能够大量富集糖脂，尽可能地扩大了产能，极大地降低了甘露糖赤藓糖醇脂的生产成本，为其工业化生产降低了难度。
另外，利用本发明所述方法制备得到的糖脂来源天然、无刺激性，能够抑制十二烷基硫酸钠(SDS)诱导的3D细胞模型(角质细胞模型)中活性细胞层的损伤，提高皮肤屏障相关蛋白丝聚蛋白(FLG)、角质转谷氨酰胺酶(TGM1)和兜甲蛋白(LOR)蛋白表达。因此，该糖脂具有良好的皮肤屏障保护、提高轻度损伤发束梳理性和顺发功能，可用于日化用品的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同处理组皮肤刺激性试验的组织学观察图(400×)；
图2为不同处理组眼刺激性试验的组织学观察图(400×)；
图3为不同处理组的染色情况，其中第一行为使用H&E染色图，第二行为FLG蛋白的表达情况，第三行为TGM1蛋白的表达情况，第四行为LOR蛋白的表达情况，NC为空白组，MD为模型组，PC为阳性对照组，TA为糖脂组；
图4为使用洗发水前后轻微损伤头发梳理性变化，其中，NC为基质组，PA为样品测试组。
图1和图2中的NC1为阴性对照重复1，NC2为阴性重复2，NC3为阴性重复3，PC1为阳性对照重复1，PC2为阳性对照重复2，PC3为阳性对照重复3，TA1为糖脂重复1，TA2为糖脂重复2，TA3为糖脂重复3。
具体实施方式
如无特殊要求，本发明采用的组分、培养基和试剂均为本领域技术人员常规购买所得即可。
本发明提供了一种糖脂的制备方法，包括以下步骤：
将酵母菌液进行发酵培养，得糖脂；
所述发酵培养过程中进行补料。
本发明将酵母菌液进行发酵培养，得糖脂。在本发明中，所述酵母菌优选包括南极洲假丝酵母(Candida antarctica)，更优选为编号JCM 10317的南极洲假丝酵母(出自：Sugita T.Pseudozyma antarctica genes for ITS1,5.8S rRNA,ITS2,completeandpartial sequence,strain:JCM10317.2002)。本发明对所述南极洲假丝酵母来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可。
在本发明中，所述酵母菌液优选包括二级种子发酵液或三级种子发酵液；所述酵母菌液的制备方法优选包括以下步骤：将发酵菌活化后，进行传代培养，得菌液；将所述菌液进行一级发酵培养，得一级种子发酵液；将所述一级种子发酵液进行二级发酵培养，得二级种子发酵液；将所述二级种子发酵液进行三级发酵培养，得三级种子发酵液。
在本发明中，所述活化时，采用的培养基优选为YM培养基；所述活化培养时，接种量优选为YM培养基体积的5％；所述活化培养的温度优选28℃；所述活化培养的转速优选为200rpm；所述活化培养的时间优选为24h。本发明对所述YM培养基的组分没有特殊要求，采用本领域常规YM培养基即可。
在本发明中，所述传代培养采用的培养基和传代培养的条件参数与前面的活化培养相同。因此，在此不作赘述。
在本发明中，所述一级发酵培养采用的培养基优选为YM培养基；所述一级发酵培养的接种量优选为YM培养基体积的5％；所述一级发酵培养的温度优选为28℃；所述一级发酵培养的时间优选为24h；所述一级发酵培养的pH优选为6.8；所述一级发酵培养的通气量优选为1vvm；所述一级发酵培养的搅拌速度为225rpm。在本发明中，所述二级发酵培养和三级发酵培养采用的培养基和传代培养的条件参数与前面的活化培养相同，在此不作赘述。
在本发明中，所述发酵培养时，采用的发酵培养基优选包括以下质量百分含量的组分：植物油10％～30％、酵母浸粉0.05％～0.2％、硫酸镁0.02％～0.06％、硝酸钠0.2％～0.8％、磷酸二氢钠0.02％～0.08％、消泡剂0.001％～0.01％和余量水。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括10％～30％的植物油，进一步优选为13％～27％，更优选为15％～23％。在本发明中，所述植物油优选包括橄榄油、豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、蓖麻油、棕榈油、亚麻油、油菜籽油和小麦胚芽油种的一种或几种，更优选包括橄榄油或豆油。在本发明中，所述植物油为微生物可以利用的碳源。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括0.05％～0.2％的酵母浸粉，进一步优选为0.08％～0.18％，更优选为0.1％～0.15％。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括0.02％～0.06％的硫酸镁，进一步优选为0.03％～0.05％，更优选为0.035％～0.045％。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括0.2％～0.8％的硝酸钠，进一步优选为0.3％～0.7％，更优选为0.4％～0.6％。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括0.02％～0.08％的磷酸二氢钠，进一步优选为0.03％～0.07％，更优选为0.02％～0.08％。
以质量百分含量计，所述发酵培养基优选包括0.001％～0.01％的消泡剂，进一步优选为0.003％～0.009％，更优选为0.005％～0.007％。
在本发明中，所述发酵培养的方式优选为发酵罐培养；所述发酵培养的温度优选为27.5～28.5℃，更优选为28℃；所述发酵培养的时间优选为5～10d，进一步优选为6～9天，更优选为7～8d；所述发酵培养的转速优选为300～600rpm。在本发明中，所述发酵培养优选在通气状态下进行；所述发酵培养的通气量为1vvm；所述发酵培养的pH优选控制为6.5±0.5。
本发明在所述发酵培养过程中进行补料。在本发明中，所述补料的方式优选分批补料。在本发明中，所述补料的时间为发酵培养的第48h；所述补料的时间优选以酵母菌液放到发酵培养基时开始计时，补料时，补充的发酵料的体积优选为初始发酵培养基体积的10％～30％，进一步优选为11～28％，最优选为13～25％。本发明所述的补料方式可以解决单次补料过多或者过快而导致的菌体生长问题以及克服过多次补料导致的微生物代谢抑制，发酵罐溶氧下降的缺陷，进而达到提高产能的技术效果。
在本发明中，所述补料时，补充的发酵料优选包括植物油。在本发明中，所述植物油优选包括橄榄油、豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、蓖麻油、棕榈油、亚麻油、油菜籽油和小麦胚芽油中的一种或几种，更优选包括橄榄油或豆油。在本发明中，所述无菌植物油的制备方法优选包括以下步骤：对所述植物油进行高压灭菌处理。本发明对所述高压灭菌处理没有特殊限定，采用本领域常规高压灭菌处理方式达到本申请的灭菌效果即可。
在本发明中，所述分批补料优选包括分一次补料、分两次补料、分四次补料或分六次补料。当所述分批补料的方式为一次补料时，所述补料的时间优选为发酵培养的第48h；当所述分批补料的方式为分两次补料时，所述分两次补料的时间优选为发酵培养的第48h和第72h；所述补料的时间优选以酵母菌液放到发酵培养基时开始计时。当所述分批补料的方式为四次补料时，所述分四次补料的时间优选为发酵培养第48h、第72h、第96h和第120h。当所述分批补料的方式为六次补料时，所述分六次补料的时间优选为发酵培养48h、72h、96h、120h、144h和168h。本发明在分批补料时，每次补料时，补充的发酵料的体积优选为初始发酵培养基体积的5％～10％，进一步优选为5％～9％，还优选为5.5％～8.5％，更优选为6％～8％。本发明前文对所述发酵料进行了详细的描述，在此不作赘述。采用本发明所述补料方式能够避免过早的补料造成罐体内溶氧下降、碳源过剩、微生物无法利用的现象，该补料方式可以增加单批次发酵过程中每日的产物转化总量，同时还能增加生产效率。
在本发明中，所述连续发酵过程中，优选在补料结束后继续发酵48h～96h后发酵培养结束，进一步优选50h～90h，更优选60h～80h。
本发明提供了一种糖脂，所述糖脂为利用酵母菌液进行发酵培养所得；所述发酵培养过程中进行补料。本发明所述糖脂的制备方法已经在前文进行了详细的论述，因此，在此不做赘述。本发明所述糖脂为含有甘露糖赤藓糖醇脂等多种糖脂和油、脂的混合物。本发明所述糖脂来源天然、无刺激性，能够抑制十二烷基硫酸钠(SDS)诱导的3D细胞模型(角质细胞模型)中活性细胞层的损伤，提高皮肤屏障相关蛋白丝聚蛋白(FLG)、角质转谷氨酰胺酶(TGM1)和兜甲蛋白(LOR)蛋白表达。因此，该糖脂具有良好的皮肤屏障保护、提高轻度损伤发束梳理性和顺发功能，可用于日化用品的制备。
本发明提供了上述技术方案所述的糖脂制备日化品中的应用，更优选为制备具有皮肤屏障保护功能和/或顺发功效的日化品。在本发明中，所述日化品优选包括洗发水、护发素、面霜、洁面乳、爽肤水、身体乳、精油、面膜、洗面奶和香皂，但不限于上述提及的日化品。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种糖脂及其发酵方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
种子发酵液准备：
1)取低温保种的假丝酵母(JCM 10317)工作种子批，用YM培养基(0.3wt.％酵母粉、0.3wt.％麦芽粉、0.5wt.％蛋白胨)活化，用YM培养基扩增至10mL菌液，温度28℃，摇床转速为200rpm，培养时间为24h，得活化的假丝酵母种子；
2)将1)中活化的假丝酵母种子10mL，接种于装有200mLYM培养基的1L锥形瓶中，接种量为5％。用YM培养基扩增至200mL菌液，此时湿菌重约为160±20g/L，传代培养条件同步骤1)；
3)将步骤2)中所述菌液无菌接种于含有YM培养基的一级种子发酵液罐，接种量为YM培养基体积的5％，在28℃，pH＝6.8的条件下培养24h，通气量约为1vvm，搅拌225rpm，得一级种子发酵液；
4)24h后将一级种子发酵液转入二级种子发酵液罐培养，二级种子发酵液罐培养基为YM培养基，培养条件与一级种子发酵液罐相同，得二级种子发酵液；
5)24h后将二级种子发酵液转入三级种子发酵液罐培养，得三级种子发酵液，三级种子发酵液罐培养基为YM培养基，培养条件与一级种子发酵液罐相同，得三级种子发酵液。
实施例2
在10T发酵罐中加入5T发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.05％，硫酸镁0.02％，硝酸钠0.2％，磷酸二氢钠0.02％，消泡剂0.001％和余量水)，待发酵罐实消后温度降低至28℃时，将250L实施例1培养得到的三级种子发酵液正压移入10吨发酵罐中。
发酵培养的温度控制为28℃，pH控制为6.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵第48h、第72h、第96h、第120h，分别补充相当于初始发酵培养基体积的6％、9％、9％、6％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)；
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂1。
实施例3
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.05％，硫酸镁0.02％，硝酸钠0.2％，磷酸二氢钠0.02％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28℃，pH控制为6.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵第48h、第72h、第96h、第120h，分别补充相当于初始发酵培养基体积的6％、9％、9％、6％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂2。
实施例4
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(豆油30％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.06％，硝酸钠0.8％，磷酸二氢钠0.08％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵第48h向罐内补充相当于初始发酵培养基体积的10％的无菌豆油(121℃、灭菌20min)。
补充无菌豆油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂3。
实施例5
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油12％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为5天。
在发酵过程中，发酵第48h及第72h向罐内分别补充相当于初始发酵培养基体积的6％、9％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂4。
实施例6
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为10天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵48h、72h、96h、120h、144h、168h，每次补料相当于初始发酵培养基体积的5％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂5。
实施例7
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250mL发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为10天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵第48h、第72h、第96h、第120h，分别补充相当于初始发酵培养基体积的6％、9％、9％、6％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵96h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为糖脂6。
对比例1
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油40％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.06％，硝酸钠0.8％，磷酸二氢钠0.08％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵第120h向罐内补充初始发酵培养基体积的10％的无菌豆油(121℃、灭菌20min)。
补充无菌豆油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为对照糖脂1。
对比例2
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为4天。
在发酵培养第48h补充相当于初始发酵培养基体积的5％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为对照糖脂2。
对比例3
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％)的500L发酵罐中发酵培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵第48h、第72h、第96h、第120h，每次补料的量相当于初始发酵培养基体积的10％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵48h后发酵结束，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，得糖脂，记为对照糖脂3。
对比例4
取25L实施例1培养得到的二级种子发酵液转入装有250L发酵培养基(橄榄油10％，酵母浸粉0.1％，硫酸镁0.04％，硝酸钠0.4％，磷酸二氢钠0.04％，消泡剂0.001％和余量水)的500L发酵罐中培养。
发酵培养的温度控制为28±0.5℃，pH控制为6.5±0.5，通气量1vvm，转速150rpm，发酵的总时长为8天。
在发酵过程中，进行分批次补料，补料节点为发酵第第72h、第120h，分别补充相当于初始发酵培养基体积的15％的无菌橄榄油(121℃、灭菌20min)。
最后一次补充无菌橄榄油后，继续发酵12h后，得发酵产物；
发酵结束后将发酵产物经4000～6000×g离心15min，获得对照糖脂4。
实施例7
糖脂中甘露糖赤藓糖醇脂(MELs)含量的HPLC检测
(1)甘露糖赤藓糖醇脂(MELs)标准品制备：
①前处理：将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，分离有机相和水相，合并有机相，旋蒸，得到的MELs用环己烷：甲醇：水＝1:6:3，pH5.5(用3N HCl调节)的溶剂体系萃取3次，水相调节pH 7.0，旋蒸，得到去油脂的混合MELs。
②分离纯化：硅胶柱层析：硅胶60～80目(样品重量3～4倍)干法拌样，硅胶300～400目装柱(样品重量10～20倍)，排抽空气，用二氯甲烷预平衡层析柱。然后用二氯甲烷：丙酮＝5:1(MEL-A)、3:1(MEL-B)、2:1(MEL-C)梯度洗脱得到MEL单体。
③结构鉴定：利用HRESIMS、NMR鉴定获得化合物结构，确认是否为目标产物。
(2)标品、样品处理：分别取MELs标品2mg溶于1mL二氯甲烷：甲醇(v/v＝1:1)中，过0.22μm滤膜，浓度为2.0mg/mL，稀释为500，250μg/mL浓度的标准品待测液，过0.22μm滤膜，4℃保存待测。
取实施例2制备得到的糖脂110mg，溶于1mL氯甲(v/v＝1:1)中，稀释至500μg/mL，过0.22μm滤膜，4℃保存待测。
(3)仪器设备：岛津2030plus高效液相色谱仪，配备四元梯度泵、柱温箱、紫外检测器、蒸发光检测器；
(4)条件：
色谱柱：KromasilC18，4.6×250mm，5μm；柱号：E2717011，流动相：A水－B乙腈；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；蒸发光检测器：增益6；漂移管温度：40℃；压力：350kpa；梯度洗脱：0-10min，B80％；10-15min，B90％：15-23min，B90％；23-25min，B80％；25-35min，B80％。
经检测，实施例2～7和对比例1～4所得糖脂中MELs含量及产量见表1。
表1不同糖脂中MELs的含量、收率统计
由表1记载的可知，过多或过快的补充植物油都会使MELs的含量下降。同时，在最后一次补料后延长48～96h的发酵时间，可以使MELs的含量上升。这表明本发明所述优选的发酵参数，每天MELs产量及其含量均较为优异，在提高总产量的同时，给微生物充分合理时间对橄榄油进行转化、代谢，该发酵工艺提高了MELs的质量，降低了单批次生产成本。
实施例8
皮肤刺激性实验
(1)皮肤模型：12孔人工皮肤模型；培养条件：37℃，5％CO2相对湿度95％；
阳性对照(PC)：5wt.％SDS(十二烷基磺酸钠)；
阴性对照(NC)：超纯水；
测试样本(TA)：实施例2制备得到的糖脂1；
培养液：皮肤模型专用培养液(广东博溪生物科技有限公司)。
(2)实验步骤
1)皮肤模型准备：将预温(37℃)的维持培养液(广东博溪生物科技有限公司)加到12孔培养板，2mL/孔，把皮肤模型转移至维持培养液放入培养箱过夜。
2)待测样品与MTT(3-(4，5－二甲基噻唑－2)-2)反应：向每孔加入2mL 0.3mg/mL的MTT培养液和待测样品10μL，充分混匀，培养箱中37℃孵育3h。
3)加样：取经实施例2处理后的10μL测试样品(NC、PC和TA)，均匀涂抹皮肤模型表面，室温放置15min后，用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)彻底冲洗样品至无残留，然后置于含新鲜维持培养液的孔中进行37℃孵育42h，每个处理重复进行三次。
4)将经实施例3处理后的皮肤模型放入2mL含0.3mg/mL MTT溶液的孔中，并放入培养箱37℃培养3h，MTT反应结束后，用打孔器取下表皮组织，移至2mL EP管中，每管加入500μL盐酸异丙醇，充分混匀后室温避光放置过夜。每管取200μL溶液于96孔板中，在570nm处读取OD值。以盐酸异丙醇为空白对照，NC记为阴性对照组，PC记为阳性对照组，TA记为试验组。
5)将表皮模型置于中性固定液中，室温下至少固定24h，常规包埋，切片，HE染色后，显微镜观察形态。
(3)数据分析
以盐酸异丙醇为空白对照，阴性对照组活性为100％。计算试验组和阳性对照组的组织活性，计算公式如下：
相对组织活性(％)＝(ODTA/PC-ODBLANK)/(ODNC-ODBLANK)×100％；当平均相对组织活性(％)＞50时，为No Category(没有分类)，当平均相对组织活性(％)≤50时，为Categoey1/2。
(4)实验结果
不同糖脂的皮肤刺激性实验结果见表2和图1。
表2不同糖脂皮肤刺激性实验
| 分组 | OD值 | 平均组织相对活率(％) | UN GHS分类 |
| NC | 0.6395±0.0176 | 100.00±2.76 | —— |
| PC | 0.0281±0.0059 | 4.40±0.92 | Categoey1/2 |
| TA | 0.4971±0.0495 | 77.73±7.18 | No Category |
由表2和图1记载的可知，从组织学分析，NC组合TA组的基底层，棘层，颗粒层和角质层基本完好，PC组表皮组织出现凝固和空泡化，细胞结构被破坏。由此可见，采用本发明所述制备方法制备的糖脂无皮肤激性。
实施例9
眼刺激实验
(1)实验材料
1)牛眼：测试当天上午取自广州地区屠宰场，并置于冷HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液，4～8℃)中运往实验室。
2)培养条件：32±1℃。
3)试剂盒对照：
阳性对照组(PC)：无水乙醇；阴性对照组(NC)：超纯水；试验组(TA)：实施例2制备得到的糖脂1。
MEM培养基：含1％新生牛血清的无酚红的MEM培养基和含酚红的MEM培养基。
HBSS：含双抗的HBSS培养基。
荧光素钠溶液：用含有钙离子和镁离子的DPBS缓冲液配制，浓度为4mg/mL。
(2)实验步骤：
1)角膜的制备：选择无损伤的牛眼角膜沿巩膜边缘2～3mm处剪下，将角膜固定在预热的角膜夹持器上，表面朝上，前后室用预热(32℃)的无酚红MEM培养基填满，32℃培养箱中平衡1～2h。
2)测量基础浊度值：平衡结束后将角膜从培养箱中取出，以新鲜无酚红MEM培养基更换前后室的旧培养基，用BASF浊度仪测定所有角膜的基础浊度。
3)加样：移除眼角膜前室液体，于角膜上皮侧加入测试样品0.75mL(NC、PC和TA)，并放置于32℃培养箱中孵育10min。暴露结束后，将眼角膜前室中的测试样品用含酚红MEM培养基至少清洗3次至样品无残留。PC组和NC组采用相同的操作。每个处理重复3次。
4)后孵育：清洗后用新鲜的无酚红MEM培养基填充眼角膜前后室，并置于32℃培养120min。
5)测量暴露后浊度值：以新鲜无酚红MEM培养基更换眼角膜前后室旧培养基，再次用BASF浊度测定仪测定所有角膜的浊度值。
6)渗透性测试：移除前室培养基并加入1mL 4mg/mL荧光素钠溶液，夹持器竖直放回培养箱孵育90min后，收集眼角膜后室中的培养基并转移360μL/孔至96孔板中，在490nm处测定吸光度值。
7)组织学分析：将角膜置于4％多聚甲醛溶液中固定至少24h，常规石蜡切片，HE染色，镜下观察。
(3)数据分析
计算试验组，阳性对照组及阴性对照组相应的浊度变化值和OD值，并通过阴性对照组进行校正。按照以下公式体外评分：
体外评分IVS＝平均校正浊度+15×平均校正OD值；当IVS≤3，为No Category；当3＜IVS≤55，为No stand-alone prediction canbe made；当IVS≤3，为Categoey1。
(4)测试结果
糖脂的眼刺激性实验结果如表3和图2：
表3不同处理的眼刺激性实验结果
由表3和图2记载的可知，从组织学分析，NC组合样品TA组角膜上皮完整，基质排列整齐，出现轻度水肿，内皮层完整。PC组上皮出现凝固和空泡化，基质排列不整齐，水肿较严重，内皮层完整。由此可知，采用本发明所述制备方法制备的糖脂无眼刺激性。
实施例10
取已培养完成的角质细胞模型
3D细胞模型，(广东博溪生物科技有限公司)，分别设置空白组(NC)，模型组(MD)，阳性对照组(PC)和实验组(TA)；
其中，空白组角质细胞模型用维持培养液进行培养；模型组使用终浓度为0.2wt.％SDS的维持培养液进行培养；阳性对照组使用终浓度为0.2wt.％SDS和终浓度为50μM WY14643进行培养；实验组使用终浓度为0.2wt.％SDS和终浓度为20μg/mL的维持培养液进行培养，并添加实施例2中制备的糖脂100μg/mL。
将上述4组均放置在37℃、体积分数为5％的CO2的二氧化碳培养箱中培养24h。
培养结束后，取出角质细胞模型，使用40g/L的多聚甲醛固定30min，PBS清洗1遍，经体积分数50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％、100％乙醇脱水，体积分数50％乙醇－二甲苯、纯二甲苯透明、过夜浸泡在石蜡中，第2天石蜡包埋，切8μm薄片。
取切片使用苏木精－伊红染色，染色完成后用干性树胶封固，显微镜下观察皮肤形态。另取切片，将该切片脱蜡后放于水，加入体积分数为5％山羊血清PBS溶液进行封闭，孵育10min，分别加入FLG(ab234406)、TGM1(ab167657)、LOR(ab176322)一抗，4℃摇床上过夜，转速60～70r/min。第二天弃去一抗，使用TBST洗3次，每次5min，之后加荧光染料FITC，4℃避光孵育1h，TBST洗3次，每次5min；加入DAPI染色5min，再用TBST洗3次，每次5min，在荧光显微镜下观察，结果见图3：结果表明，在加入了SDS刺激之后的角质细胞模型，与空白组相比，出现了表皮模型角质层疏松增厚，活细胞层受损、有空泡出现，出现明显的损伤，FLG、TGM1和LOR蛋白的降低，阳性对照组与模型组相比，模型四层结构边界清晰，活细胞层细胞排列紧凑，角质层疏松增厚现象明显改善，FLG、TGM1和LOR蛋白表达显著上升；TA组的空泡明显减少，活细胞层受损情况有明显改善，FLG、TGM1和LOR蛋白表达显著上升。
实施例11
湿发梳理测试
取测试用标准发束(每束250mm宽、175～200mm长、含捆绑用胶条重3.5～4.0g)若干，分为基质组和样品测试组。其中基质组(NC)：含有护发素基质；样品测试组(PA)：含有0.5wt.％实施例2制备的得到的糖脂的护发素基质。
将测试用发束在温水中浸湿1min，之后在发束上涂抹1毫升10wt.％的SLES(Stepan公司)，并轻轻地揉搓1min以清洗发束，之后温水清洗。从不同的面梳理发束10次以去除缠结物，随后将含有护发素基质及含有0.5wt.％实施例2制备的得到的糖脂的护发素基质分别涂抹于不同的发束，并轻轻按摩1min。
最后将发束固定在MTT175头发测试仪(Dia-Stron Ltd,Andover,UK)进行梳理所用功的检测。结果如图4所示，相比于使用基质组(NC)，的样品测试组(PA)梳理发束时所用功明显更低，这说明本发明所述糖脂能够起到柔顺受损头发的作用。
综上所述，采用本发明所述制备方法糖脂的产量达到110g/L，是相同时间内采用现有技术制备方法制备得到的糖脂产量的2～3倍。而且本发明通过设定补料的方式、时间、补料的用量以及发酵培养过程中的条件参数的限定，能够大量富集糖脂，极大地降低了甘露糖赤藓糖醇脂的生产成本。另外，本发明所述糖脂来源天然、无刺激性，具有良好的皮肤屏障保护、提高轻度损伤发束梳理性和顺发功能，可用于日化用品的制备。
尽管上述实施例对本发明作出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种糖脂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将酵母菌液进行发酵培养，得糖脂；
所述发酵培养过程中进行补料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养时，采用的发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：植物油10％～30％、酵母浸粉0.05％～0.2％、硫酸镁0.02％～0.06％、硝酸钠0.2％～0.8％、磷酸二氢钠0.02％～0.08％、消泡剂0.001％～0.01％和余量水。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述补料的方式为分批补料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述补料的时间为发酵48h后，补料的量为酵母菌液的10％～30％；
所述分批补料包括一次补料、分两次补料、分四次补料或分六次补料；所述一次补料的时间优选为发酵培养的第48h；所述分两次补料的时间为发酵培养的第48h和第72h；所述分四次补料的时间为发酵培养第48h、第72h、第96h和第120h；所述分六次补料的时间为发酵培养48h、72h、96h、120h、144h和168h；分批补料时，每次补料的量为酵母菌液体积的5％～10％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述补料时，补充的发酵料包括植物油。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述植物油包括橄榄油、豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、蓖麻油、棕榈油、亚麻油、油菜籽油和小麦胚芽油中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酵母菌包括南极洲假丝酵母。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为27.5～28.5℃，时间为5～10d，转速为300～600rpm，通气量为1～1.5vvm。
9.一种糖脂，其特征在于，所述糖脂为利用酵母菌液进行发酵培养所得；所述发酵培养过程中进行补料。
10.权利要求9所述的糖脂在制备日化品中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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