CN113755544B - 一种裂褶菌发酵物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种裂褶菌发酵物的制备方法、由该方法制备得到的裂褶菌发酵物、含有该裂褶菌发酵物(含裂褶菌素)的皮肤用化妆品、以及该裂褶菌发酵物在制备药物或皮肤用化妆品中的用途。其中该裂褶菌发酵物的制备方法包括如下步骤：种子活化、种子液制备、深层发酵、粗多糖提取、去蛋白、纯化、精制。通过本发明的制备方法得到的裂褶菌发酵物，具有吸收速度快、稳定性高的良好技术效果。

Description

一种裂褶菌发酵物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种裂褶菌发酵物，其制备方法，以及该裂褶菌发酵物的用途。

背景技术

裂裥菌素（Sizofiran或Schizophyllan），又称为西佐喃、裂裥多糖或裂褶多糖，是由裂褶菌（ Schizophyllum commune）子实体经提取或液体深层发酵产生的一种中性多糖，其分子结构式如下所示：

。

裂裥菌素是以葡萄糖为单一组分的β-(1-3)-D葡聚糖，其中每三个葡萄糖分子上链接有一个β-(1-6)葡萄糖苷分支（参见郑必胜等，羧甲基裂褶多糖的制备及其保湿活性研究，现代食品科技，2017，第33卷第8期，第254页）。裂裥菌素独特的三螺旋结构和恰当的分支度（0.33），使它在调节皮肤免疫、促进皮肤细胞增殖、胶原蛋白合成、延缓衰老、清除自由基、对抗紫外线、晒后修复、抗炎方面均有很好的作用，加之其天然水溶，来源安全，非常适合在化妆品和皮肤病上的应用。裂裥菌素的护肤作用，具体表现为保湿、抗氧化之功效，因而可用于改善皮肤润泽度，并延缓皮肤衰老（参见张琪等，裂褶多糖保湿功效评价，中国食品学报，2015年，第15卷第3期，第223-227页）。

裂裥菌素的制备主要有两种途径，一是从野生或人工栽培的子实体中提取获得，二是从发酵培养的发酵液或菌丝体中提取获得。但从途径一的子实体中难以大量提取裂裥菌素，因为野生菌的子实体产量低二人工栽培的裂褶菌周期长且效率低下。在发酵培养中又可分为液体发酵法和固体发酵法，其中液体发酵发的生产周期短、产量大、易于大规模工业生产，而固体发酵虽然具有设备简单、培养基成本低、能耗低等优点，但存在发酵周期长的缺点。因此，液体发酵仍然是生产裂裥菌素的主要途径。

液体发酵的产物经过提取后将得到裂裥菌素的粗多糖，再经过纯化后可得到高品质的裂褶菌发酵物。作为生物制品，发酵和提取裂裥菌素的方法将会影响所得产品的吸收速度、稳定性等性质。如何加快化妆品中裂裥菌素组合物的吸收速度，提高裂裥菌素的稳定性，成为本领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

本发明涉及一种裂褶菌发酵物的制备方法，包括如下步骤：

（1）种子活化：取裂褶菌（ Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种接入PDA培养基，在25-30℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；

（2）种子液制备：将所述活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在25-30℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液；

（3）深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量5-10重量%，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖12-18重量%、酵母粉7-8重量%、蛋白胨5-7重量%、KH₂PO₄ 0.5-1.0重量%和MgSO₄·7H₂O 0.2-0.6重量%；

（4）粗多糖提取：将步骤（3）得到的发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在60-70℃下搅拌3-5小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩至原体积的1/2至1/3，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液；

（5）去蛋白：将步骤（4）得到的粗多糖提取液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3-5次，得到去蛋白的粗多糖提取液；

（6）纯化：将步骤（5）得到的去蛋白的粗多糖提取液使用孔径为50-100 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并经过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；

（7）精制：将步骤（6）得到的初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚-硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。

为了进一步实现本发明的目的，优选地，步骤（1）中所述的裂褶菌（ Schizophyllum  commune Fr.）为保藏编号为CFCC NO.6812、CFCC NO.83457、ACCC NO.50875的裂褶菌。这些裂褶菌均为可商业购买的菌种，例如可购于中国林业微生物菌种保藏管理中心或者中国农业微生物菌种保藏管理中心。

优选地，步骤（3）中的深层发酵过程依次经历如下四个阶段：

阶段一为开始发酵的0-1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为40%-45%，调节pH为4.5-5的范围；

阶段二为开始发酵的1-2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为36-40%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为12-18重量%，调节pH为5-6的范围；

阶段三为开始发酵的3-5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为15-20%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为15-18重量%，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L-谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5-5的范围；

阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为15-20%，调节pH为5-5.5的范围。

优选地，步骤（5）中酶解所用的酶为胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，其比例为1:4，添加量为0.02-0.05重量%。

优选地，本发明的裂褶菌发酵物中含有裂裥菌素。

在本发明中，将裂褶菌发酵物中的裂裥菌素作为指标来评价本发明裂褶菌发酵物的品质和效果。

本发明还提供一种由本发明的方法制备的裂褶菌发酵物。

本发明还提供一种皮肤用化妆品，其中含有本发明的裂褶菌发酵物，并且化妆品的剂型为水剂、喷雾、面膜、精华、原液、凝胶等。

相对于现有技术而言，本发明制备所得的裂褶菌发酵物具有如下良好的技术效果：（1）适用于皮肤时的吸收快，更适合作为护肤用品的原料。（2）稳定性更高，适合长时间保存。

实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例

种子活化：取裂褶菌（ Schizophyllum commune Fr.）菌种CFCC NO.6812（购于中国林业微生物菌种保藏管理中心）斜面菌种接入PDA培养基，在25℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；其中PDA培养基采用本领域常规方法配制，具体为去皮马铃薯250g煮汁过滤，葡萄糖20 g，琼脂18 g，维生素B1 0.01 g、MgSO₄ 0.2 g、KH₂PO₄ 1.0 g、加水至1000 mL，高压蒸汽灭菌25分钟。

种子液制备：将活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在25℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液。

深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量5重量％，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖12重量％、酵母粉7重量％、蛋白胨5％重量％、KH₂PO₄ 0.5重量％和MgSO₄·7H₂O 0.2重量％。发酵的具体过程可分为四个阶段：阶段一为开始发酵的0-1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为40%，调节pH为4.5-5的范围；阶段二为开始发酵的1-2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为36%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为12重量％，调节pH为5-6的范围；阶段三为开始发酵的3-5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为15%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量％时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为15重量％，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L-谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5-5的范围；阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为15%，调节pH为5-5.5的范围。深层发酵后得到发酵菌丝体。

粗多糖提取：将得到的发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在60℃下搅拌3小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩至原体积的1/2，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液。

去蛋白：将得到的粗多糖提取液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3次，得到去蛋白的粗多糖提取液；酶解所用的酶为胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，其比例为1:4，添加量为0.02重量%。

纯化：将得到的去蛋白的粗多糖提取液使用孔径为50 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并经过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；

精制：将得到的初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚-硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。

所制得的裂褶菌发酵物呈白色粒状，其分子量为1260kDa，水溶性良好。

实施例

种子活化：取裂褶菌（ Schizophyllum commune Fr.）菌种CFCC NO.83457（购于中国林业微生物菌种保藏管理中心）斜面菌种接入PDA培养基，在30℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；其中PDA培养基采用本领域常规方法配制，具体为去皮马铃薯250g煮汁过滤，葡萄糖20 g，琼脂18 g，维生素B1 0.01 g、MgSO₄ 0.2 g、KH₂PO₄ 1.0 g、加水至1000mL，高压蒸汽灭菌25分钟。

种子液制备：将活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在30℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液。

深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量10重量％，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖18重量％、酵母粉8重量％、蛋白胨7％重量％、KH₂PO₄ 1.0重量％和MgSO₄·7H₂O 0.6重量％。发酵的具体过程可分为四个阶段：阶段一为开始发酵的0-1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为45%，调节pH为4.5-5的范围；阶段二为开始发酵的1-2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为40%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为18重量％，调节pH为5-6的范围；阶段三为开始发酵的3-5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为20%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量％时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为18重量％，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L-谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5-5的范围；阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为20%，调节pH为5-5.5的范围。深层发酵后得到发酵菌丝体。

粗多糖提取：将得到的发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在70℃下搅拌3小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩至原体积的1/3，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液。

去蛋白：将得到的粗多糖提取液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3次，得到去蛋白的粗多糖提取液；酶解所用的酶为胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，其比例为1:4，添加量为0.05重量%。

纯化：将得到的去蛋白的粗多糖提取液使用孔径为100 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并经过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；

精制：将得到的初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚-硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。

所制得的裂褶菌发酵物呈白色粒状，其分子量为1350kDa，水溶性良好。

实施例

种子活化：取裂褶菌（ Schizophyllum commune Fr.）菌种ACCC NO.50875（购于中国农业微生物菌种保藏管理中心）斜面菌种接入PDA培养基，在27℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；其中PDA培养基采用本领域常规方法配制，具体为去皮马铃薯250g煮汁过滤，葡萄糖20 g，琼脂18 g，维生素B1 0.01 g、MgSO₄ 0.2 g、KH₂PO₄ 1.0 g、加水至1000mL，高压蒸汽灭菌25分钟。

种子液制备：将活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在27℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液。

深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量8重量％，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖15重量％、酵母粉8重量％、蛋白胨5％重量％、KH₂PO₄ 0.8重量％和MgSO₄·7H₂O 0.4重量％。发酵的具体过程可分为四个阶段：阶段一为开始发酵的0-1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为40%，调节pH为4.5-5的范围；阶段二为开始发酵的1-2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为40%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为16重量％，调节pH为5-6的范围；阶段三为开始发酵的3-5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为18%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量％时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为16重量％，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L-谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5-5的范围；阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为16%，调节pH为5-5.5的范围。深层发酵后得到发酵菌丝体。

粗多糖提取：将得到的发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在65℃下搅拌4小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩至原体积的1/2，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液。

去蛋白：将得到的粗多糖提取液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3次，得到去蛋白的粗多糖提取液；酶解所用的酶为胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，其比例为1:4，添加量为0.05重量%。

纯化：将得到的去蛋白的粗多糖提取液使用孔径为50 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并经过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；

精制：将得到的初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚-硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物。

所制得的裂褶菌发酵物呈白色粒状，其分子量为990kDa，水溶性良好。

实施例

将本发明实施例1-3制得的裂褶菌发酵物通过下述方法制备为用于皮肤的保湿喷雾剂，检测其中裂裥菌素的吸收速度。出于对照的目的，根据中国专利公开文献CN107557407A的实施例1、2、3制备得到裂褶多糖，分别记载为对比实施例A1、A2、A3，并同样作为裂裥菌素的发酵物通过下列方法制备为用于皮肤的保湿喷雾剂。

实施例4-1 裂褶菌发酵物保湿喷雾剂的制备

分别取10重量份的本发明实施例1-3制得的裂褶菌发酵物以及对比实施例A1、A2、A3的裂褶多糖与10重量份的卵磷脂、3重量份的胆固醇、60重量份的去离子水共同置于茄形瓶中混合，在60℃和-0.05MPa下蒸发直至在瓶壁上形成膜，再将20重量份的丙三醇滴加到茄形瓶中，与瓶壁上的膜在60℃下进行水浴孵化1小时，结束后将瓶中产物转移至锥形瓶中，通入氮气，在10000 rpm下高速均质20分钟，将均质后的溶液通过0.20μm的微孔滤膜中过滤，过滤后得到的裂褶菌发酵物脂质体混悬液。取50重量份的裂褶菌发酵物脂质体混悬液、15重量份的棕榈酸、15重量份的芦荟油、5重量份的硬脂醇聚醚-2、15重量份的1,2-丙二醇、0.3重量份的甘油单月桂酸酯、0.3重量份的香精，5重量份的去离子水，将棕榈酸、芦荟油、硬脂醇聚醚-2在80℃熔融得油相，将裂褶菌发酵物脂质体混悬液和1,2-丙二醇混合并加热至90℃形成水相，并将水相在20MPa进行均质，均质5分钟后加入油相，继续均质5分钟，得到乳化体系，冷却至室温后，在500W下进行超声15分钟，超声后加入甘油单月桂酸酯和香精，在800 rpm转速下搅拌2h，搅拌后装入150mL喷雾瓶中即制得用于皮肤的保湿喷雾剂。

实施例4-2 裂褶菌发酵物吸收速度的测试

受试者为3名20-30岁女性，不同实施例/对比实施例在施用于同一受试者时彼此间隔两天，同一受试者由同一测量人员完成。将按照如上方法制备得到的保湿喷雾剂的喷雾口距离脸部标记区域20厘米，稍仰头承接雾液，喷完后轻轻拍打2分钟。喷完5分钟后用乳胶指套包覆手指尖并在喷施部位以同样力度来回擦拭5次后，将乳胶指套投入装有20mL去离子水的试管中并超声10分钟后取出，用苯酚-硫酸法检测去离子水中裂裥菌素的浓度，结果记录为C_5min。

基准浓度的测试：按同样方法喷涂两部相同区域，喷完后立即用乳胶指套包覆手指尖并在喷施部位以同样力度来回擦拭5次，并以相同方法检测裂裥菌素的浓度，结果记录为C_初始。

将实施例/对比实施例的C_5min和C_初始的比值作为表征裂裥菌素吸收速度的指标。实验结果如下表1所示。

从上述测试可以看出，实施例1-3的裂褶菌发酵物的保湿喷雾剂在施用后5分钟在皮肤表面残余的量明显低于对比实施例A1-A3的结果，表明本发明的裂褶菌发酵物的吸收速度明显较快。

实施例4-3 裂褶菌发酵物稳定性的测试

以实施例4-1的方法分别制备保湿喷雾剂，在室温下放置6个月后，按照实施例4-2的同样方法测试喷完5分钟后裂裥菌素的浓度,结果记录为C_6mon-5min。将各受试者的结果与其在实施例4-2中的测试结果（C_5min）的比值作为裂裥菌素稳定性的检测指标（即同一喷雾剂放置6个月后与新制备时的对比结果）。实验结果如下表2所示。

从上述结果可以看出，在放置6个月之后，由实施例1-3的裂褶菌发酵物制备的保湿喷雾剂比起对比实施例A1-A3的结果更接近于刚制备时的水平（C_6mon-5min/C_5min的值越接近1，表明其稳定性越强）。

从上述实施例可以看出，根据本发明方法制备的裂褶菌发酵物所制备的皮肤用化妆品的能够达到吸收速度快、稳定性高的优良技术效果。

显而易见的是，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (1)

1.一种裂褶菌发酵物的制备方法，包括如下步骤：

（1）种子活化：取裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）斜面菌种接入PDA培养基，在25-30℃下培养至布满斜面，得到活化的斜面种子；

（2）种子液制备：将所述活化的斜面种子从斜面培养基接入含液体培养基的锥形瓶中，在25-30℃下以200rpm的速度搅拌，培养5天后得到发酵种子液；

（3）深层发酵：将所述发酵种子液接入含有培养基的发酵罐中进行深层发酵，其中接种量5-10重量%，静置培养6天，得到裂褶菌的发酵菌丝体；其中所用的培养基为：葡萄糖12-18重量%、酵母粉7-8重量%、蛋白胨5-7重量%、KH₂PO₄ 0.5-1.0重量%和MgSO₄·7H₂O 0.2-0.6重量%；

（4）粗多糖提取：将步骤（3）得到的所述发酵菌丝体采用胶体磨粉碎，并且加入蒸馏水形成粗多糖料液，在60-70℃下搅拌3-5小时，离心除杂，将得到的提取液浓缩至原体积的1/2至1/3，再加入无水乙醇沉淀，将沉淀用蒸馏水复溶，得到粗多糖提取液；

（5）去蛋白：将步骤（4）得到的所述粗多糖提取液酶解，然后灭活酶后离心除去变性蛋白和酶，将离心的上清液再用有机溶剂洗涤，静置分层除去下层有机相和中间的蛋白层，重复该过程3-5次，得到去蛋白的粗多糖提取液；

（6）纯化：将步骤（5）得到的所述去蛋白的粗多糖提取液使用孔径为50-100 kDa的超滤膜过滤，收集滤液并经过真空冷冻干燥后得到初级纯化产物；

（7）精制：将步骤（6）得到的所述初级纯化产物再次用去离子水溶解，将所得溶液用DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，将收集的洗脱液经凝胶过滤层析，并用苯酚-硫酸法检测多糖，经真空冷冻干燥得到精制的裂褶菌发酵物；

其中，步骤（1）中所述的裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.）为保藏编号为CFCCNO.6812或CFCC NO.83457或ACCC NO.50875的裂褶菌；

其中，步骤（5）中所述的酶解所用的酶为胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的混合物，所述胰蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶的比例为1:4，所述酶的添加量为0.02-0.05重量%；并且

其中，步骤（3）中所述的深层发酵过程依次经历如下四个阶段：

阶段一为开始发酵的0-1天，发酵条件控制为搅拌速度500rpm，通气量0.5 vvm，温度30℃，溶氧量D0控制为40%-45%，调节pH为4.5-5的范围；

阶段二为开始发酵的1-2天，发酵条件控制为搅拌速度450rpm，通气量1.0 vvm，温度27℃，溶氧量D0控制为36-40%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于10重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为12-18重量%，调节pH为5-6的范围；

阶段三为开始发酵的3-5天，发酵条件控制为搅拌速度600rpm，通气量1.5 vvm，温度40℃，溶氧量D0控制为15-20%，并且检测葡萄糖的含量，当葡萄糖含量低于12重量%时，向发酵罐中流加葡萄糖至含量为15-18重量%，同时以液体形式流加如下浓度的物质：1 mg/L的硫胺素、0.3 mg/L的甘氨酸、0.6 mg/L的L-谷氨酸、0.05 g/L的柠檬酸、0.20 mg/L的肉豆蔻烯酸、0.30 mg/L的月桂酸，调节pH为4.5-5的范围；

阶段四为开始发酵的第6天，发酵条件控制为搅拌速度为450rpm，通气量0.5 vvm，温度32℃，溶氧量D0控制为15-20%，调节pH为5-5.5的范围。