CN113549589B

CN113549589B - 一种刺激真核藻类多糖的方法

Info

Publication number: CN113549589B
Application number: CN202110938125.9A
Authority: CN
Inventors: 钟玉鸣; 刘晖; 王琴; 柳建良
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2021-08-16
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2041-08-16
Also published as: CN113549589A

Abstract

本发明提供了一种刺激真核藻类多糖的方法。本发明提供的方法通过特定的培养基对真核藻类进行培养，使其体内多糖得到加强和提高，其次由改性四氧化三铁填料刺激并负载真核藻类，使其胞外多糖的生产得到提高，从而可以提高真核藻类的内源多糖(体内多糖)和外源多糖(胞外多糖)的累积，使真核藻类的多糖产量更高，以充分发挥多糖的各方面作用，提高真核藻类的资源化应用。

Description

一种刺激真核藻类多糖的方法

技术领域

本发明属于农业领域，更具体地，本发明涉及一种刺激真核藻类内源多糖的方法，以及一种刺激真核藻类外源多糖的方法。

背景技术

以小球藻为代表的微藻属于绿藻门绿球藻目卵囊藻科，是普生性的单细胞绿藻，富含多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等多种营养物质，对污染物质能起到净化、转化的作用的同时，于医学、食品等领域均存在着不容忽视的能力。近年来有研究学者发现，胞外多糖，具有高硫酸盐水平，有消炎、抗肿瘤、抗菌、免疫调节等功能。在呼吸系统疾病中能起到扩张支气管、镇咳和抗凝血的作用，能预防慢性气管炎症；一些小球藻的胞外多糖还对结肠癌细胞有抑制作用；对细菌起抑制生物膜形成的作用，阻止病原体的黏附。多糖的药用价值带来了多糖保健品和多糖药物等产品的面世，但由于多糖的结构等研究是棘手难题，一直没有广泛应用至市场。

小球藻胞外多糖和多糖的组成糖相似，主要为鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，但功能却有差异。多糖的抗氧化性、营养与其他功能特性，具有高的应用潜力。小球藻是容易获得的物种，且有繁殖能力强的特点，因此如何提高胞外多糖产量，是提高小球藻资源化应用的是一个关键点。

发明内容

本发明提供了一种刺激真核藻类内源多糖的方法，以及一种刺激真核藻类外源多糖的方法，促进了真核藻类内源多糖和外源多糖的累积。

首先，本发明提供了一种刺激真核藻类内源多糖的方法，其包括如下步骤：

(11)将所述真核藻类接种至培养基A中进行光培养；

(12)当COD和TN降解率分别达到70％和80％以上时，将所述真核藻类转接至培养基B中进行暗培养；

其中，每升所述培养基A的组分为：硝酸钠0.24～0.48g，磷酸氢二钾0.05g，七水硫酸镁0.1g，水合氯化钙0.05g，乙酸钠1～2g，余量为水；

每升所述培养基B的组分为：硝酸钠0.24～0.48g，磷酸氢二钾0.05g，七水硫酸镁0.1g，水合氯化钙0.05g，乙酸钠0.5～0.8g，余量为水；

所述暗培养加入了添加剂，以所述培养基B为基准，所述添加剂由甘油5～10g，环糊精2～4g，甘氨酸1～2g，聚乙烯醇0.5～0.8g组成。

优选地，步骤(11)中，所述真核藻类接种至所述培养基A中时，所述真核藻类与所述培养基A的质量比为(3～10):100。

优选地，所述光培养和所述暗培养的条件均是25～35℃，130～160rpm，培养时间为24h。

优选地，步骤(12)中，所述暗培养加入了所述添加剂时，是在超声频率45～65KHz、超声波功率为150W下处理10～20min。

优选地，步骤(12)中，所述暗培养中，所述真核藻类细胞浓度为10⁷～10⁸个/ml。

其次，本发明还提供了一种刺激真核藻类外源多糖的方法，其包括如下步骤：

(21)提供本发明上述刺激真核藻类内源多糖的方法得到的真核藻类；

(22)将所述真核藻类接种于改性四氧化三铁填料中进行培养，当所述改性四氧化三铁填料附上的叶绿素a达到0.5～1mg/g填料时，培养完毕，得到培养后的填料；

(23)将所述培养后的填料接种于培养基C中，并引入食品废水进行培养；

其中，所述改性四氧化三铁填料的改性方法是：将四氧化三铁粉碎成100目的颗粒，然后以1:100的重量比浸泡于1M的稀盐酸中20～30min后，洗净至中性；然后与乙酸钠和柠檬酸钠的混合液混合搅拌进行改性，直至上清液pH为中性；

每升所述培养基C的组分为：硝酸钠0.24～0.48g，磷酸氢二钾0.05g，七水硫酸镁0.1g，水合氯化钙0.05g，乙酸钠0.5～0.8g。

优选地，步骤(22)中，所述真核藻类接种于改性四氧化三铁填料中进行培养时，所述改性四氧化三铁填料与所述真核藻类的比例为1:100(g/ml)；所述培养时在150～200rpm、24h光照条件下培养3～5天。

优选地，步骤(23)中，以每升体积所述培养基C的重量为基准，所述培养后的填料接种重量为10％，引入所述食品废水进行培养分为三个阶段：

第一阶段是培养初期，所述食品废水的体积与所述培养基C的体积比为(20～30):100混合后进行培养；

第二阶段是当COD和TN降解率分别达到60-70％和75-80％以上，所述食品废水的体积与所述培养基C的体积比为(50～60):100混合后进行培养；

第三阶段是当COD和TN降解率分别达到70-75％和80-85％以上，以所述食品废水进行培养。

优选地，所述乙酸钠和柠檬酸钠的混合液中，所述乙酸钠与所述柠檬酸钠的质量比为1:2。

优选地，所述混合搅拌进行改性的步骤中，所述搅拌转速为150～200rpm，搅拌时间为10～20min。

本发明提供的方法中，一方面，通过特定的培养基对真核藻类进行培养，使其体内多糖得到加强和提高，其次由改性四氧化三铁填料刺激并负载真核藻类，使其胞外多糖的生产得到提高，从而可以提高真核藻类的内源多糖(体内多糖)和外源多糖(胞外多糖)的累积，使真核藻类的多糖产量更高，以充分发挥多糖的各方面作用，提高真核藻类的资源化应用。另一方面，本发明提供的方法是通过引入食品废水对真核藻类进行培养，将废水中大量的有机物、含氮化物和、氨基酸等污染物进行转化，实现变废为宝，将废水高价值化利用，达到较低成本下转化污染物。

附图说明

图1为本发明实施例1中，小球藻培养7天后的叶绿素a含量；

图2为本发明实施例1中，小球藻用培养基A培养14天后体内多糖的含量；

图3为本发明实施例1中，小球藻用培养基B培养14天后体内多糖的含量；

图4为本发明实施例2中，改性四氧化三铁填料上叶绿素a的变化；

图5为本发明实施例2中，改性四氧化三铁填料所负载的小球藻的LB多糖含量；

图6为本发明实施例2中，改性四氧化三铁填料所负载的小球藻的TB多糖含量。

具体实施方式

通过以下参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。

实验例1刺激真核藻类内源多糖的方法

1.购买小球藻，取适量处于休眠状态的小球藻，于无菌操作下分别接种至培养基A(实验组)和BG111培养基(对照组)中，小球藻与培养基的质量比为1:10。在25℃，160r/min，光照下培养24h。

培养基A的成分如下：

2.将步骤(1)培养完的实验组小球藻和对照组小球藻置于恒温摇床内，待小球藻生长至对数生长期。每周测定COD与TN，当COD与TN降解率分别达到70％与80％以上，将实验组小球藻转接至培养基B中培养，对照组小球藻继续以BG111培养基培养，培养条件为暗培养：25℃，160r/min，24h不光照。同时，在实验组小球藻暗培养时，还利用甘油、甘氨酸为碳源(添加剂)，提高体内多糖的累积(发酵)。其中，以培养基B为基准，添加剂由甘油5g/L，环糊精4g/L，甘氨酸1g/L，聚乙烯醇0.5g/L组成。

培养基B的成分如下：

名称：培养基B	浓度
		NaNO3	0.48g/L
K2HPO4	0.05g/L
		MgSO4·7H2O	0.1g/L
CaCl2·H2O	0.05g/L
		乙酸钠	0.8g/L
自来水	余量

分别测定步骤(1)所得小球藻的叶绿素a和实验组/对照组小球藻的体内多糖，结果如图1和图2所示。测定步骤(2)所得实验组和对照组小球藻的体内多糖，结果如图3所示。通过图2可以看出，经过光培养，实验组小球藻的体内多糖含量稍微高于对照组；经过暗培养，实验组小球藻的体内多糖已经得到大幅度的累积，显著高于对照组。

实施例2刺激真核藻类外源多糖的方法

1.将四氧化三铁填料，粉碎成100目的颗粒，洗净。然后利用1M的稀盐酸，按照四氧化三铁填料：稀盐酸＝1：100的比例进行浸泡，浸泡时间30min。然后洗净至中性；

2.将步骤(1)所得四氧化三铁填料置于乙酸钠与柠檬酸钠混合溶液(即改性剂，乙酸钠与柠檬酸钠按质量比1：2粉末配置，每升2g乙酸钠，4g柠檬酸钠)进行改性。四氧化三铁与混合溶液按照质量比1g：100ml的比例进行改性，将负电荷接入四氧化三铁。改性时采用搅拌160rpm，时间为20min。然后去除改性剂，洗至上清液中性pH＝7，得到改性四氧化三铁填料。

3.将实施例1暗培养所得实验组小球藻接种至步骤(2)所得改性四氧化三铁填料。首先，按照质量比每100ml小球藻混合1g填料(接种时细胞浓度10⁷-10⁸个/ml)，150～200r/min，24h光照下培养3-5天，使小球藻附着于填料上。沉淀或磁性收集填料后，测定叶绿素a，如图4所示，第一天填料附上的叶绿素a达到0.5-1mg/g填料，第3天达到12-14mg/g，显示小球藻已经附着于填料上，得到培养好的填料(负载有小球藻)。

4.将培养好的填料放入反应器中，按每升体积(培养基C)接入10％质量的填料进行培养，培养分为三个阶段。第一阶段，将味精厂废水引入反应器，味精厂废水的体积与培养基C的体积比为30:100混合后进行培养，24h光照培养7天。每周测定COD与TN、TP。

培养基C的成分如下：

名称：培养基C	浓度
		NaNO3	0.24g/L
K2HPO4	0.05g/L
		MgSO4·7H2O	0.1g/L
CaCl2·H2O	0.05g/L
		乙酸钠	0.8g/L

5.第二阶段：当COD、TN与TP降解率分别达到70％与70％、80％以上，以味精厂废水的体积与培养基C的体积比为60:100混合后进行培养，每周测定COD与TN、TP。

6.当COD、TN与TP降解率分别达到70％-80％与70％-85％、80％以上，以味精厂废水进行培养。

同时，本实施例2也设置了对照组，其步骤与上述实施例2的步骤基本相同，不同之处在于步骤(3)的培养基C替换成BG111培养基。

对实施例2培养得到的实验组小球藻和对照组小球藻的LB多糖以及TB多糖进行检测，结果如图5和图6所示。可以看出，本发明提供的方法可以使小球藻的LB和TB得到大幅度的累积，比对照组高40～50％。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一种刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(11)将所述小球藻接种至培养基A中进行光培养；

(12)当COD和TN降解率分别达到70％和80％以上时，将所述小球藻转接至培养基B中进行暗培养；

所述暗培养加入了添加剂，以所述培养基B为基准，所述添加剂由甘油5～10g，环糊精2～4g，甘氨酸1～2g，聚乙烯醇0.5～0.8g组成；

(21)将上述培养的小球藻接种于改性四氧化三铁填料中进行培养，当所述改性四氧化三铁填料附上的叶绿素a达到0.5～1mg/g填料时，培养完毕，得到培养后的填料；

(22)将所述培养后的填料接种于培养基C中，并引入食品废水进行培养；

每升所述培养基C的组分为：硝酸钠0.24～0.48g，磷酸氢二钾0.05g，七水硫酸镁0.1g，水合氯化钙0.05g，乙酸钠0.5～0.8g；

步骤(21)中，所述改性四氧化三铁填料与所述小球藻的比例为1:100g/ml；所述培养是在150～200rpm、24h光照条件下培养3～5天；

所述乙酸钠和柠檬酸钠的混合液中，所述乙酸钠与所述柠檬酸钠的质量比为1:2。

2.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，步骤(11)中，所述小球藻接种至所述培养基A中时，所述小球藻与所述培养基A的质量比为(3～10):100。

3.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，所述光培养和所述暗培养的条件均是25～35℃，130～160rpm，培养时间为24h。

4.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，步骤(12)中，所述暗培养加入了所述添加剂时，是在超声频率45～65KHz、超声波功率为150W下处理10～20min。

5.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，步骤(12)中，所述暗培养中，所述小球藻细胞浓度为10⁷～10⁸个/ml。

6.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，步骤(22)中，以每升体积所述培养基C的重量为基准，所述培养后的填料接种重量为10％，引入所述食品废水进行培养分为三个阶段：

7.根据权利要求1所述的刺激小球藻产生多糖的方法，其特征在于，所述混合搅拌进行改性的步骤中，所述搅拌转速为150～200rpm，搅拌时间为10～20min。