CN112006947B

CN112006947B - 一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法

Info

Publication number: CN112006947B
Application number: CN201910452412.1A
Authority: CN
Inventors: 黄洁芳; 毕永贤; 金凤; 陈强; 陈静; 王丽娜; 陈玉燕; 蒋丽刚
Original assignee: Proya Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Proya Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN112006947A

Abstract

本发明涉及一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法，其特征在于：（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗、粉碎、过滤制得巨藻浆料；（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌接种到麦芽汁液体培养基，摇床培养得酵母菌种子液B；（3）接种发酵：将步骤（1）所得巨藻浆料灭菌后装入不锈钢发酵罐，补充碳源、氮源和营养因子，然后将步骤（2）所得酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，发酵36~48 h得混合发酵液；（4）发酵液处理：将混合发酵液依次通过聚丙烯过滤器、膜过滤机进行过滤，即得具有多重护肤功效的海藻发酵液。

Description

一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法。

背景技术

巨藻（MACROCYSTIS PYRIFERA）属于褐藻门海带目巨藻科巨藻属，是一种生活在潮下带的大型海藻，分布于大洋洲和南美洲南部沿海以及北美洲太平洋沿岸有上升冷水流的水域，成熟的巨藻一般长70~80m，最长可达到100m左右。巨藻已经实现人工种植，且生长迅速，在生长初期，每天可以生长20-30cm，生物量蕴藏巨大，且廉价可得，是良好的绿色可再生资源，目前我国山东等地已经引种。巨藻含有丰富活性成分，业已证实其提取物具有保湿舒缓、抗氧化，抗衰老等护肤功效，在欧美国家已成为被广泛认可的护肤品领域功能性原料，如美国雅诗兰黛公司的海蓝之谜系列，就将巨藻提取物作为活性添加成分，应用于其抗皱类护肤品中。巨藻，除了常规可以用于提取碘和甘露醇，海藻酸钠外，还可以提取生物活性成分褐藻多糖硫酸酯，及藻蛋白等大分子物质。目前，获得巨藻提取物的方式，主要还是通过酸、碱性溶液等对巨藻进行水解，然后提取分离，或直接用溶剂浸提，但普遍存在提取率低，成本较高，所获物质成分单一，分子量不可控，批次质量不稳定等问题，且不利于大规模工业化生产。将巨藻中的营养物质高效、稳定、规模化提取，同时最大限度保障其活性不受破坏，成为亟待解决的问题。

微生物发酵是一种反应温和可控、容易放大、安全环保的生物反应过程。通过选择合适的微生物，能在发酵过程中将海藻细胞破壁，充分释放出海藻细胞内的生物活性物质，同时将大分子有机物分解成氨基酸和多肽，大分子多糖降解为小分子多糖，此外，发酵过程中微生物还会产生丰富初级和次级代谢产物。相较于传统的提取方法，采用微生物发酵巨藻的方式，通过对发酵工艺的精准控制，能够更高效、更温和、更稳定地获取生物活性成分。

目前利用微生物发酵茶叶、大豆、人参等植物以获得活性成分的研究较多，且发酵液通常采用高温灭菌法进行除菌，存在活性成分易氧化失活等弊端。现阶段，通过微生物发酵巨藻以获得功能活性成分的研究和文献报道都相对欠缺。因此，如果能通过微生物发酵制备一种具有多重护肤功效的海藻发酵液，则可以加大对海洋生物资源的利用，亦能产生明显经济效益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法，所得海藻发酵液具有保湿、抗皱、皮肤修复等多重护肤功效，同时还具有生物活性高的优点。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种具有多重护肤功效的海藻发酵液，其特征在于：由圆红冬孢酵母菌发酵巨藻浆液而得。

一种具有多重护肤功效的海藻发酵液的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得巨藻小颗粒；将所述巨藻小颗粒与去离子水按质量比1:15~20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 rpm转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的巨藻残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的 HCl水溶液调节pH至4.0~5.2，得巨藻浆料；

（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌（菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32489）接种到麦芽汁液体培养基（购于青岛海博生物科技有限公司，产品代号为HB4176-3），然后置于恒温培养摇床中，在20~23 ^oC、120 ~150 rpm条件下振荡培养72 h；然后按质量比1:100接种于发酵培养液A中，在26~30 ^oC下发酵培养18~24h，测定其OD₆₀₀，然后用无菌去离子水调节其OD₆₀₀至0.5~1.0，得酵母菌种子液B；所述发酵培养液A由以下组分组成：分析纯葡萄糖7.5~12.5 g/L；大豆蛋白胨1.5~2.5 g/L；牛骨蛋白胨1.3~2.1 g/L；分析纯KH₂PO₄ 0.8~1.4 g/L；分析纯Mg₂SO₄·7H₂O 0.4~0.8 g/L，去离子水余量；

（3）接种发酵：将步骤（1）所得巨藻浆料于121 ^oC灭菌15 min，降温至25~28 ^oC装入不锈钢发酵罐，装液量为发酵罐容积的60~63%，于发酵罐中补充碳源、氮源和营养因子，然后将步骤（2）所得酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，接种量为发酵罐容积的3~5%，补充适量无菌去离子水，至发酵罐内液体总体积达到发酵罐容积的75%；通入无菌空气，通气量为15~20 L/min，搅拌转速为50~100 rpm，培养温度为25~28^oC，发酵36~48 h得混合发酵液。

（4）发酵液处理：将步骤（3）所得混合发酵液通过孔径为0.22微米的聚丙烯过滤器除去菌体，然后在室温下通过膜过滤机进行过滤，获得分子量在10000道尔顿以下的滤液，即得具有多重护肤功效的海藻发酵液。

所述麦芽汁液体培养基组成为：麦芽浸粉130 g/L，氯霉素0.1 g/L，蒸馏水余量。

所述聚丙烯过滤器购自杭州科百特过滤器材有限公司，孔径为0.22微米。

所述膜过滤机购自杭州沃腾膜工程有限公司，型号为 WatFlow MF，过滤膜为GE公司ZeeWeed 1500超滤膜。

所述大豆蛋白胨购自安琪酵母股份有限公司，牌号为FP410；所述牛骨蛋白胨购自安琪酵母股份有限公司，牌号为FP328。

本发明步骤（3）中所述碳源为分析纯的棉籽糖、鼠李糖、水苏糖中的一种或它们任意比的混合物，用去离子水稀释为质量分数为10%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的2~3%；所述氮源为分析纯的D-泛醇，用去离子水稀释为质量分数为5%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.5~1.0%；所述营养因子为分析纯的甘油磷脂酰胆碱和分析纯的二甲基砜，分析纯的甘油磷脂酰胆碱用去离子水稀释为质量分数为10%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.5~0.75%，分析纯的二甲基砜用去离子水稀释为质量分数为3%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.2~0.4%。

本发明采用圆红冬孢酵母菌发酵巨藻，圆红冬孢酵母菌是海洋红酵母的一种，其自身代谢过程中能产生纤维素酶，可有效分解巨藻细胞壁结构，有利于巨藻浆料中活性成分的释放。同时发酵过程中还能分泌蛋白酶，将大分子藻蛋白分解成肽类和氨基酸类小分子物质。由于圆红冬孢酵母菌对棉籽糖、鼠李糖、水苏糖这类碳源具有优异的代谢能力，因此在巨藻发酵过程中，这类碳源的加入能够被菌株高效利用，促进其生物量的累积；发酵过程中D-泛醇的加入则能促进发酵液中腺苷、糖原、肌肽的累积；此外，发酵体系中营养因子甘油磷脂酰胆碱和二甲基砜的添加，能够显著提高圆红冬孢酵母菌代谢过程中谷胱甘肽的产量。同时，与传统的植物发酵工艺相比，本发明所述海藻发酵液不需要高温灭菌处理，而采用低温过滤除菌法除去菌体，有效避免发酵液中热不稳定成分的失活。

综上所述，在巨藻发酵过程中，通过控制和优化发酵工艺，可高效诱导圆红冬孢酵母菌在有氧条件下产生谷胱甘肽、腺苷、肌肽等对肌肤有益的代谢产物，同时，发酵后得到的巨藻圆红冬孢酵母菌发酵液含有多种游离氨基酸，小分子糖类，因此具有保湿、修复、抗衰老等多重优异的护肤功效。

实验一：海藻发酵液活性成分定性检测

采用不同方法对海藻发酵液中的成分进行定性分析。结果如下：

1. 采用HPLC-MS方法对实施例3所述海藻发酵液进行检测。采用正离子模式，MRM检测模式，得正离子模式下的MRM质谱图（见图1~图8），根据不同氨基酸具有不同母离子和子离子（见表1），确定海藻发酵液中含有15种氨基酸，分别是酪氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸。

图1为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其1；

图2为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其2；

图3为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其3；

图4为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其4；

图5为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其5；

图6为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其6；

图7为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其7；

图8为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其8。

表1 氨基酸定性依据

2. 采用HPLC-DAD法对实施例3所述海藻发酵液进行检测，得图9所示液相谱图。通过将海藻发酵液中不同物质的保留时间与对照品（图10~图12）进行对比，得海藻发酵液中含有腺苷、肌肽和谷胱甘肽。

图9为实施例3所述海藻发酵液的HPLC-DAD液相谱图；

图10为腺苷对照品HPLC-DAD液相谱图；

图11为肌肽对照品HPLC-DAD液相谱图；

图12为谷胱甘肽对照品HPLC-DAD液相谱图。

3. 采用HPLC-ELSD法对实施例3所述海藻发酵液进行检测，得图13所示液相谱图。通过与对照品的保留时间（见图14）进行对比，得海藻发酵液中含有糖原。

图13为实施例3所述海藻发酵液HPLC-ELSD液相谱图；

图14为糖原对照品HPLC-ELSD液相谱图。

实验二：额外补充碳源、氮源和营养因子对发酵液中活性物含量的影响

将实施例2所得海藻发酵液作为试验组；将与实施例2制备方法一致，但在步骤（3）中未补充添加碳源、氮源和营养因子，所得海藻发酵物为对照组，测试试验组和对照组中各活性成分含量如表2所示。

表2 试验组和对照组海藻发酵液中活性成分含量对比表

	试验组	对照组
			活性物质种类	质量分数（‰）	质量分数（‰）
赖氨酸	0.14	0.06
			组氨酸	0.53	0.13
精氨酸	0.44	0.21
			天冬氨酸	0.02	0.01
苏氨酸	0.15	0.02
			丝氨酸	0.06	0.01
谷氨酸	0.31	0.06
			脯氨酸	0.44	0.18
甘氨酸	0.51	0.31
			丙氨酸	0.46	0.12
缬氨酸	0.02	0.01
			异亮氨酸	0.04	0.02
亮氨酸	0.66	0.24
			酪氨酸	0.03	0.02
苯丙氨酸	0.50	0.15
			谷胱甘肽	0.55	0.08
肌肽	0.12	0.02
			腺苷	0.64	0.11
糖原	0.92	0.16

对比试验组与对照组中各活性成分含量的数据可知，在巨藻发酵过程中，补充加入碳源、氮源和营养因子能够显著促进氨基酸、肌肽、糖原、腺苷、谷胱甘肽等护肤功效成分的积累。其中，氨基酸是皮肤内天然保湿因子的组成成分，具有优异保湿功效；抗氧化成分谷胱甘肽和肌肽能高效清除外界环境刺激诱导形成的自由基，实现抗衰老功效，腺苷和糖原作为肌肤能量因子，能促进受损肌肤修复。

实验三：不同灭菌方式所得海藻发酵液的生物活性对比

以实施例2所得海藻发酵液为试验组；步骤（4）采用115^oC高温灭活30min后所得海藻发酵液，其他步骤与实施例2相同，所得海藻发酵物作为对照组。

通过成纤维细胞增殖试验对试验组和对照组所得海藻发酵液的生物活性进行对比。采用cck-8法，首先将成纤维细胞接种于96孔细胞培养板，接种浓度为3×10³cells/孔，接种后置于37^oC恒温恒湿培养箱中培养24 h，得测试培养基，然后将试验组和对照组的海藻发酵液用测试培养基稀释，得到质量浓度为10%、5%、2.5%、1.25%的待测液，分别作用于细胞表面。样品作用24 h后，加入cck-8试剂检测，待测液浓度与细胞存活率关系如表3所示。

表3待测液浓度与细胞存活率关系表

从表3中可以看出，海藻发酵液作用后的成纤维细胞存活率均大于100%，但试验组细胞存活率明显高于对照组，说明低温过滤除菌方式处理过的海藻发酵液生物活性较高，且具有明显促进成纤维细胞增殖的作用。

实验四：海藻发酵液皮肤修复功效验证

以实施例3所述海藻发酵液作用的细胞为试验组，不加任何药物刺激的细胞为空白对照组。首先在6孔细胞培养板中培养得到单层成纤维细胞，接种浓度为2×10⁵cells/孔，用微量移液器枪头在细胞生长的中央区域划线，清洗并去除划线区域内细胞，观察并拍照留底，然后加入待测样品刺激细胞，连续培养24h，48h，观察划线周边细胞的生长迁移能力并拍照。

图15为试验组培养0h、24h、48h划线周边细胞的生长迁移能力图；

图16为空白对照组培养0h、24h、48h划线周边细胞的生长迁移能力图。

从图15、图16可以看出，试验组24 h后划线区域内细胞密度较空白组明显增大，48h后细胞划痕近乎愈合，说明本专利所述海藻发酵液能明显促进成纤维细胞增殖，具有修复皮肤细胞的功效。

实验五：海藻发酵液改善肌肤屏障与保湿功效测试

依据《化妆品保湿功效评价指南》选取健康志愿者至少30人，测试仪器为德国CK公司Tewameter TM 300和Corneometer CM 825，测试场所保证恒温恒湿，温度20~22 ^oC，相对湿度40~60%。受试者需要使用指定的洁面乳清洗双手前臂内侧，清洁后在受试者双手前臂内侧做好测量区域标记，每个试验区域面积至少3 cm×3 cm。测试前在恒温恒湿房间内静坐至少20 min，暴露前臂，避免碰触。对受试者左右手臂内侧指定区域经表皮水分散失量（TEWL值）及水分含量进行测量和记录。先测量各测试区域的初始值，然后用乳胶指套将实施例2所述海藻发酵液随机均匀涂布于受试区域内，单次涂布量为2 mg/cm²。分别在样品使用后2小时、4小时、8小时对涂抹区域（试验组）和空白对照区域（空白对照组）的TEWL值及水分含量进行测量。测试由同一个测量人员完成。试验组使用实施例2所述海藻发酵液，空白对照组则不涂抹任何产品，实验结果如表4和表5所示。

表4 皮肤TEWL值随时间变化情况

表5皮肤水分含量随时间变化情况

从表4中可看出，使用实施例2所述海藻发酵液2、4、8小时后，测试区域TEWL的差值呈显著性差异（P<0.05），而对照组无显著性差异（P>0.05），说明本发明所述海藻发酵液具有恢复皮肤屏障功能的功效。表5结果则表明，使用发明所述海藻发酵液2、4、8小时后，测试区域角质层水分和含量呈显著性差异（P<0.05），而对照组无显著性差异（P>0.05），表示本发明所述海藻发酵液具有保湿功效。

实验六：海藻发酵液抗衰老功效测试

选择年龄在40~60岁的健康受试者至少30名，受试区域为脸颊，产品涂抹区域和空白区域随机分布在左、右脸颊。样品使用方法为，受试者每天早晚清洁面部后，取一枚硬币大小的海藻发酵液（制备工艺同实施例2），均匀涂抹于产品涂抹区域（试验组），空白区域（空白对照组）不使用任何护肤品。采用德国CK公司的MPA580弹性测试仪，测定产品使用前和使用后不同测试时间点，涂抹区域和空白区域皮肤弹性参数值R2，所得结果见表6。其中，R2值越接近于1，表明皮肤弹性越好。

表6皮肤弹性表征值随时间变化情况

从测试结果可知，连续使用实施例2所述海藻发酵液2周和4周后，皮肤弹性参数R2的差值呈显著性差异（P<0.05），而空白对照组的R2差值无显著性差异（P>0.05），说明本发明所述海藻发酵液具有改善肌肤弹性的抗衰老功效。

综上所述，本发明制备的海藻发酵液具有保湿、抗皱、皮肤修复等多重护肤功效。

说明书附图

图1为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其1；

图2为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其2；

图3为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其3；

图4为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其4；

图5为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其5；

图6为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其6；

图7为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其7；

图8为实施例3所述海藻发酵液正离子模式下的MRM质谱图其8；

图9为实施例3所述海藻发酵液的HPLC-DAD液相谱图；

图10为腺苷对照品HPLC-DAD液相谱图；

图11为肌肽对照品HPLC-DAD液相谱图；

图12为谷胱甘肽对照品HPLC-DAD液相谱图；

图13为实施例3所述海藻发酵液HPLC-ELSD液相谱图；

图14为糖原对照品HPLC-ELSD液相谱图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法，采用以下步骤：

（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得巨藻小颗粒；将所述巨藻小颗粒与去离子水按质量比1:20混合，得混合液；使用德国Miccra DFK-1.0在线均质机，在转速2800 rpm下推动混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的巨藻残渣，将所得物用1.0 mol/L HCl溶液调节pH至4.5，得巨藻浆料；

（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌（菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32489）接种到麦芽汁液体培养基（购于青岛海博生物科技有限公司，产品代号为HB4176-3），然后置于上海一恒 THZ-300C 恒温培养摇床中，20 ^oC、120rpm条件下振荡培养72 h，然后按质量比1:100接种于发酵培养液A中，在30^oC下发酵培养20h，测定OD₆₀₀，然后用无菌去离子水调节OD₆₀₀至0.5，得酵母菌种子液B；所述发酵培养液A组成为：分析纯葡萄糖7.5 g/L；大豆蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP410）2.0 g/L；牛骨蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP328）1.3 g/L；分析纯KH₂PO₄ 1.0 g/L；分析纯Mg₂SO₄·7H₂O 0.8 g/L，去离子水余量；

（3）接种发酵：将步骤（1）制备得到的巨藻浆料于121 ^oC灭菌15 min，降温至26^oC后装入上海保兴生物设备工程有限公司BIOTECH-JS系列不锈钢发酵罐中，装液量为发酵罐容积的60%，于发酵罐中补充碳源、氮源和营养因子；所述碳源为质量分数为10%的分析纯棉籽糖水溶液，添加量为发酵罐容积的2%，所述氮源为质量分数为5%的分析纯D-泛醇水溶液，添加量为发酵罐容积的0.75%；所述营养因子为质量分数为10%的分析纯甘油磷脂酰胆碱水溶液和质量分数为3%的分析纯二甲基砜水溶液，前者添加量为发酵罐容积的0.5%，后者添加量为发酵罐容积的0.2%；然后将步骤（2）制备得到的酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，接种量为发酵罐容积的3%，补充适量无菌去离子水，至发酵罐内液体总体积达到发酵罐容积的75%；发酵过程中，通入无菌空气，在通气量15 L/min，搅拌转速80 rpm，培养温度26^oC条件下发酵36 h，得混合发酵液；

（4）发酵液处理：发酵完成后，将步骤（3）所得混合发酵液通过0.22微米杭州科百特过滤器材有限公司生产的聚丙烯过滤器除去菌体，然后在室温下通过杭州沃腾膜工程有限公司 WatFlow MF中药膜过滤机，使用GE公司ZeeWeed 1500超滤膜，获得分子量为10000道尔顿以下的滤液，所获产物即本发明所述具有多重护肤功效的海藻发酵液。

实施例2：一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法，采用以下步骤：

（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得巨藻小颗粒；将所述巨藻小颗粒与去离子水按质量比1:15混合，得混合液；使用德国Miccra DFK-1.0在线均质机，在转速2800 rpm下推动混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的巨藻残渣，将所得物用1.0 mol/L HCl溶液调节pH至5.2，得巨藻浆料；

（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌（菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32489）接种到麦芽汁液体培养基（购于青岛海博生物科技有限公司，产品代号为HB4176-3），置于上海一恒 THZ-300C 恒温培养摇床中，22 ^oC、150 rpm，振荡培养72 h，然后按质量比1:100接种于发酵培养液A中，在28^oC下发酵培养18 h，测定OD₆₀₀，然后用无菌去离子水调节OD₆₀₀至0.75，得酵母菌种子液B；所述发酵培养液A组成为：分析纯葡萄糖12.5 g/L；大豆蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP410） 1.5 g/L；牛骨蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP328）1.75 g/L；分析纯KH₂PO₄ 1.05 g/L；分析纯Mg₂SO₄·7H₂O 0.6 g/L，去离子水余量；

（3）接种发酵：将步骤（1）制备得到的巨藻浆料于121 ^oC灭菌15 min，降温至25 ^oC后装入上海保兴生物设备工程有限公司BIOTECH-JS系列不锈钢发酵罐中，装液量为发酵罐容积的63%，于发酵罐中补充碳源、氮源和营养因子；所述碳源为质量分数为10%的分析纯棉籽糖和鼠李糖混合物的水溶液，添加量为发酵罐容积的2.75%，所述氮源为质量分数为5%的分析纯D-泛醇水溶液，添加量为发酵罐容积的1.0%；所述营养因子为质量分数为10%的分析纯甘油磷脂酰胆碱水溶液和质量分数为3%的分析纯二甲基砜水溶液，前者添加量为发酵罐容积的0.6%，后者添加量为发酵罐容积的0.3%；然后将步骤（2）制备得到的酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，接种量为发酵罐容积的4%，补充适量无菌去离子水，至发酵罐内液体总体积达到发酵罐容积的75%；发酵过程中，通入无菌空气，在通气量20 L/min，搅拌转速50rpm，培养温度25 ^oC条件下发酵48 h，得混合发酵液；

实施例3：一种具有多重护肤功效的海藻发酵液及其制备方法，采用以下步骤：

（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得巨藻小颗粒；将所述巨藻小颗粒与去离子水按质量比1:18混合，得混合液；使用德国Miccra DFK-1.0在线均质机，在转速2800 rpm下推动混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的巨藻残渣，将所得物用1.0 mol/L HCl溶液调节pH至4.0，得巨藻浆料；

（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌（菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CICC 32489）接种到麦芽汁液体培养基（购于青岛海博生物科技有限公司，产品代号为HB4176-3），置于上海一恒 THZ-300C 恒温培养摇床中，23 ^oC、135 rpm，振荡培养72 h，然后按质量比1:100接种于发酵培养液A中，在26 ^oC下发酵培养24 h，测定OD₆₀₀，然后用无菌去离子水调节OD₆₀₀至1.0，得酵母菌种子液B。所述发酵培养液A组成为：分析纯葡萄糖10 g/L；大豆蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP410）2.5 g/L；牛骨蛋白胨（购自安琪酵母股份有限公司，牌号FP328）2.1 g/L；分析纯KH₂PO₄ 1.4 g/L；分析纯Mg₂SO₄·7H₂O 0.4 g/L，去离子水余量；

（3）接种发酵：将步骤（1）制备得到的巨藻浆料于121 ^oC灭菌15 min，降温至28 ^oC后装入上海保兴生物设备工程有限公司BIOTECH-JS系列不锈钢发酵罐中，装液量为发酵罐容积的61%，于发酵罐中补充碳源、氮源和营养因子；所述碳源为质量分数为10%的分析纯水苏糖的水溶液，添加量为发酵罐容积的3%，所述氮源为质量分数为5%的分析纯D-泛醇水溶液，添加量为发酵罐容积的0.5%；所述营养因子为质量分数为10%的分析纯甘油磷脂酰胆碱水溶液和质量分数为3%的分析纯二甲基砜水溶液，前者添加量为发酵罐容积的0.75%，后者添加量为发酵罐容积的0.4%；然后将步骤（2）制备得到的酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，接种量为发酵罐容积的5%，补充适量无菌去离子水，至发酵罐内液体总体积达到发酵罐容积的75%；发酵过程中，通入无菌空气，在通气量18 L/min，搅拌转速100 rpm，培养温度28 ^oC条件下发酵42 h，得混合发酵液；

Claims

1.一种具有多重护肤功效的海藻发酵液的制备方法，其特征在于采用以下步骤：

（1）巨藻浆料的制备：采摘新鲜成熟的巨藻，冲洗去除其表面杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得巨藻小颗粒；将所述巨藻小颗粒与去离子水按质量比1:15~20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 rpm转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的巨藻残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的 HCl水溶液调节PH至4.0~5.2，得巨藻浆料；

（2）酵母菌种子液的制备：将圆红冬孢酵母菌接种到麦芽汁液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在20~23℃、120 ~150 rpm条件下振荡培养72 h；然后按质量比1:100接种于发酵培养液A中，在26~30 ℃下发酵培养18~24 h，测定其OD₆₀₀，然后用无菌去离子水调节其OD₆₀₀至0.5~1.0，得酵母菌种子液B；所述发酵培养液A由以下组分组成：分析纯葡萄糖7.5~12.5 g/L；大豆蛋白胨1.5~2.5 g/L；牛骨蛋白胨1.3~2.1 g/L；分析纯KH₂PO₄ 0.8~1.4 g/L；分析纯Mg₂SO₄·7H₂O 0.4~0.8 g/L，去离子水余量；

（3）接种发酵：将步骤（1）所得巨藻浆料于121℃灭菌15 min，降温至25~28 ℃装入不锈钢发酵罐，装液量为发酵罐容积的60~63%，于发酵罐中补充碳源、氮源和营养因子，然后将步骤（2）所得酵母菌种子液B接种至巨藻浆料中，接种量为发酵罐容积的3~5%，补充适量无菌去离子水，至发酵罐内液体总体积达到发酵罐容积的75%；通入无菌空气，通气量为15~20L/min，搅拌转速为50~100 rpm，培养温度为25~28℃，发酵36~48 h得混合发酵液；

2.根据权利要求1所述具有多重护肤功效的海藻发酵液的制备方法，其特征在于：所述碳源为分析纯的棉籽糖、鼠李糖、水苏糖中的一种任意比的混合物，用去离子水稀释为质量分数为10%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的2~3%；所述氮源为分析纯的D-泛醇，用去离子水稀释为质量分数为5%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.5~1.0%；所述营养因子为分析纯的甘油磷脂酰胆碱和分析纯的二甲基砜，分析纯的甘油磷脂酰胆碱用去离子水稀释为质量分数为10%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.5~0.75%，分析纯的二甲基砜用去离子水稀释为质量分数为3%的水溶液，然后添加到发酵罐中，添加量为发酵罐容积的0.2~0.4%。