CN111411090A - 一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用，其特征在于：采用以下步骤：A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗、粉碎、过网，制得得条斑紫菜浆料；B、制备NB液体培养基；C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，得枯草芽孢杆菌种子液；D、一次发酵：发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；E、二次发酵：得第三条斑紫菜发酵液；F、分离提纯：将步骤F所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器和蛋白液相系统，分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。本发明制备的耐高温超氧化歧化酶80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，具有耐高温，稳定性好的优点，添加到化妆品中具有抗衰老作用。

Description

一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法及其应用。
背景技术
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员之一，广泛分布在微生物、植物和动物体内。它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。由于人的皮肤直接与氧气接触，活性氧类自由基堆积或清除产生障碍都会引起细胞损伤以及色素沉着，导致皮肤衰老和损伤。通过补充外源SOD，可起到抗氧化、祛色斑的作用，有利于延缓皮肤衰老。因此，SOD可广泛应用于抗衰老护肤类产品中，应用前景广阔。但目前，由于商品化的SOD热稳定性差，易失活，极大限制其功能的正常发挥，导致市场需求受到影响。此外，市场上流通的SOD大多来源于动物血液，容易受到污染，产生细菌内毒素，从而引发热源性问题，且生产量小，成本高。而微生物发酵则是一种反应温和可控、容易放大、安全环保的生物反应过程。通过选择合适的微生物，能在发酵过程中将海藻细胞破壁，充分释放出细胞内的生物活性物质。
条斑紫菜（P. yezoensis Ueda）是一种具有很高科学研究价值的经济海藻，具有独特的生物学特性。条斑紫菜为潮间带大型藻类，生长在潮间带的岩石上。由于其生存环境的特殊性，随着潮汐作用，周期性的经历海水和空气两种截然相反环境条件的变化，面临失水、高渗、强光和营养限制等逆境胁迫，体内形成了与环境相适应的独特代谢途径和抗氧化酶系。SOD作为抗氧化酶系统成员之一，在抵御外界逆境胁迫中有相当重要的作用。该酶活性的高低与生物抗逆性和抗辐射能力有关。然而，目前为止海藻液的提取多是基于酸、碱法，该方法不仅提取率低，更重要的是酸碱的使用会带来一系列污废处理的问题，提高成本的同时对环境污染破坏严重。此外，考虑到基因工程成本高、操作复杂，以及其安全性有待考究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种利用条斑紫菜发酵制备耐高温超氧化歧化酶的方法，以及该耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用。本发明具有发酵工艺简单，无需进行细胞破壁，产量高，且制备得到的SOD纯度高、耐高温、活性高，同时还具有保湿、抗皱、皮肤修复等多重护肤功效。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30 min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD600，当所述种子液的OD600达到1.0后停止发酵；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在30-37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70-75%。先采用波长为254 nm、功率为20-50 W的紫外灯，辐照10-30min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为50-500 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照10-30min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵36-48 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，罐中搅拌转速为50-100 RPM，培养温度为30-37℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在8-12℃环境下静置15-60 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 kDa的聚醚砜（PES）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。
所述耐高温超氧化歧化酶的活性大于5700 U/mg，纯度大于96%，所述百分比为质量百分比。
所述耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用，可以作为活性物添加到化妆品中，起到清除自由基、抗氧化、抗衰老的作用。
所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的使用，添加量优选为质量百分比0.05%-5%，更有选为3%。
本发明在分离提纯过程中运用的膜分离器采用100 kDa再生纤维素（RC）膜和50kDa的聚醚砜（PES）膜对耐高温超氧化歧化酶进行分离纯化。同时，本发明采用的膜分离器还可以连接AKTAPrime Plus蛋白液相系统（GE Healthcare, U.S.A.），膜分离器与蛋白液相系统中的置换泵相连，可以保证超滤过程中流速恒定。分离过程中，溶液pH值、溶液离子强度、跨膜压（TMP）及滤出液中的蛋白质情况，可由蛋白液相系统的pH计、电导率仪、压力传感器和紫外检测仪进行实时的在线监测。
本发明在UV-γ辐照联用下发酵得到的条斑紫菜发酵液中SOD活性不低于7000 U/mg，分离提纯后的耐高温超氧化歧化酶活性不低于5700 U/mg，纯度不低于96%。制备所得耐高温超氧化歧化酶在80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，在100℃放置30 min后，酶活性剩余仍在63%以上，在pH 4.0-8.0之间均表现稳定。
综上所述，本发明采用的条斑紫菜在失水、高渗、强光和营养限制等逆境胁迫亦可以生长，说明该藻类的抗氧化酶体系在抵御外界逆境胁迫中发挥了重要的作用。通过微生物发酵制备的条斑紫菜发酵液，可制得高纯度、高活性、耐高温的超氧化歧化酶，且工艺简单，无需进行细胞破壁，生产成本低，可直接应用于化妆品，抗衰老功效显著。
实验一：UV-γ辐照辐射对条斑紫菜发酵液中SOD活性的影响
本发明按实施例1步骤（4）中所述的辐照条件，采用邻苯三酚自氧化法测定酶的活性，考察了紫外辐照和γ辐照对步骤（4）所得第三条斑紫菜发酵液耐高温超氧化歧化酶活性的影响。结果见图1、图2和表1，分别经过紫外和γ辐照诱变后，第三条斑紫菜发酵液耐高温超氧化歧化酶活性先上升，后下降，这说明适当的辐照诱变能在一定程度上刺激条斑紫菜发酵液抗氧化酶体系的保护作用和辐照后的修复效益。此外，由表1数据可知，紫外和γ辐照诱变均能提高耐高温超氧化歧化酶的活性，UV-γ辐照联用诱导效果最佳，与对照组相比，酶活性提高率可达66.15%。
表1 耐高温超氧化歧化酶活性与紫外辐照及γ辐照处理的关系表
Figure 949073DEST_PATH_IMAGE001
实验二：分离纯化获得的耐高温超氧化歧化酶耐高温性能和最适pH值范围
将实施例1发酵所得酶液分别在60-120℃和pH 3.0-10.0范围下放置30 min，然后采用邻苯三酚自氧化法测定酶的活性，结果见图3和图4。从图3可以看出，60-90℃范围内耐高温超氧化歧化酶活性相对较稳定，80℃时达到最大值，80-90℃时酶活力几乎没有损失，100℃放置30 min酶活性剩余仍在63%以上。结果表明，本发明制备的耐高温超氧化歧化酶可耐高温。由图4可以看出，在pH 3.0-10.0之间，耐高温超氧化歧化酶活性在pH 5.0时达到最高，当pH在4.0-8.0之间时，酶活性均比较稳定。
实验三：制备所得耐高温超氧化歧化酶的抗衰老功效测试
将实施例1分离提纯得到的耐高温超氧化歧化酶以添加量3%（质量百分比）应用至化妆品精华液中，考察其抗衰老功效。具体操作如下：选择年龄在40~60岁的健康受试者40名，受试区域为脸颊，产品涂抹区域和空白区域随机分布在左、右脸颊。样品使用方法为，受试者每天早晚清洁面部后，取一枚硬币大小的添加了耐高温超氧化歧化酶的化妆品精华液，均匀涂抹于产品涂抹区域（试验组），空白区域（空白对照组）使用未添加耐高温超氧化歧化酶的化妆品精华液。采用德国CK公司的MPA580弹性测试仪，测定产品使用前和使用后不同测试时间点，涂抹区域和空白区域皮肤弹性参数值R2，所得结果见表2。其中，R2值越接近于1，表明皮肤弹性越好。
表2 皮肤弹性表征值随时间变化情况
Figure 728811DEST_PATH_IMAGE002
从测试结果可知，连续使用含耐高温超氧化歧化酶的化妆品精华液2周和4周后，皮肤弹性参数R2的差值呈显著性差异（P<0.05），而空白对照组的R2差值无显著性差异（P>0.05），说明本发明所制备的耐高温超氧化歧化酶具有改善肌肤弹性的抗衰老功效。
本发明通过微生物发酵条斑紫菜，再通过控制发酵过程中的辐照条件制备海藻发酵液，最后从紫菜发酵液中分离提纯出高活性的耐高温超氧化歧化酶，既可以加大对海洋生物资源的利用，亦能产生明显的经济效益。所得耐高温超氧化歧化酶在80℃和90℃时酶活力稳定、无损失，在100℃放置30 min后，酶活性剩余仍在63%以上，在pH 4.0-8.0之间均表现稳定；具有耐高温，稳定性好的优点。添加到化妆品中具有抗衰老作用。
附图说明
图1为耐高温超氧化歧化酶活性与紫外灯功率的关系示意图；
图2为耐高温超氧化歧化酶活性与γ辐照剂量的关系示意图；
图3为温度对耐高温超氧化歧化酶活性的影响示意图；
图4为pH值对耐高温超氧化歧化酶活性的影响；
图5为耐高温超氧化歧化酶的SDS-PAGE电泳图。
注：图5中 M为标准蛋白；I为条斑紫菜发酵液；II为纯化后的酶液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至5.0，于80℃灭菌30 min，降温至28℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在32℃、120 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30℃、145 RPM条件下振荡培养30 h，得枯草芽孢杆菌种子液，测定其OD600，种子液的OD600为1.0；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在32℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的75%。先采用波长为254 nm、功率为20 W的紫外灯，辐照20 min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为200 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照20min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵40 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，罐中搅拌转速为100 RPM，培养温度为32℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在12℃环境下静置50 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 kDa的聚醚砜（PES）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。
如图5所示，通过SDS-PAGE电泳分析确定产物为所需要的耐高温超氧化歧化酶，所得耐高温超氧化歧化酶的活性为7019.32 U/mg，纯度97.6%。
实施例2：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：16混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.2，于80℃灭菌30 min，降温至图4为pH值对耐高温超氧化歧化酶活性的影响；
图5为耐高温超氧化歧化酶的SDS-PAGE电泳图。
注：图5中 M为标准蛋白；I为条斑紫菜发酵液；II为纯化后的酶液。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至5.0，于80℃灭菌30 min，降温至28℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在32℃、120 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30℃、145 RPM条件下振荡培养30 h，得枯草芽孢杆菌种子液，测定其OD600，种子液的OD600为1.0；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在32℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的75%。先采用波长为254 nm、功率为20 W的紫外灯，辐照20 min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为200 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照20min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵40 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，罐中搅拌转速为100 RPM，培养温度为32℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在12℃环境下静置50 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 kDa的聚醚砜（PES）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。
如图5所示，通过SDS-PAGE电泳分析确定产物为所需要的耐高温超氧化歧化酶，所得耐高温超氧化歧化酶的活性为7019.32 U/mg，纯度97.6%。
实施例2：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：16混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.2，于80℃灭菌30 min，降温至
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70%。先采用波长为254 nm、功率为50 W的紫外灯，辐照10 min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为100 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照10min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵36 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，罐中搅拌转速为50 RPM，培养温度为30℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在10℃环境下静置45 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 kDa的聚醚砜（PES）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。通过SDS-PAGE电泳分析确定产物为所需要的SOD，所得耐高温超氧化歧化酶的活性为6773.81U/mg，纯度97.1%。
实施例4：一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：16混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.5，于80℃灭菌30 min，降温至25℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在37℃、125 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在37℃、125 RPM条件下振荡培养48 h，得枯草芽孢杆菌种子液，测定其OD600，种子液的OD600为1.5；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70%。先采用波长为254 nm、功率为50 W的紫外灯，辐照30 min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为300 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照10min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵40 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15 L/min，罐中搅拌转速为80 RPM，培养温度为37℃；发酵结束后，将所得第二条斑紫菜发酵液在10℃环境下静置60 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤E所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 kDa的聚醚砜（PES）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。
通过SDS-PAGE电泳分析确定产物为所需要的SOD，所得耐高温超氧化歧化酶的活性为6577.91 U/mg，纯度97.5%。

Claims (6)

1.一种耐高温超氧化歧化酶的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
A、条斑紫菜浆料的制备：采摘新鲜成熟的条斑紫菜，冲洗去除其表面沙粒等杂质，用秸秆粉碎机切碎，过10目筛网，得到条斑紫菜小颗粒；将所述条斑紫菜小颗粒与去离子水按质量比1：15-20混合，得混合液；使用在线均质机，在2800 RPM转速下推动所述混合液通过100目不锈钢筛网，弃去未通过筛网的紫菜残渣，将所得滤液用1.0 mol/L浓度的HCl水溶液调节pH至4.0-5.2，于80℃灭菌30 min，降温至25-28℃，得条斑紫菜浆料；
B、制备NB液体培养基：称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖20 g，混合后加入1 L的水，加热搅拌至均匀；冷却至室温，调节pH值至7.0-7.2，然后121℃灭菌15 min，得NB液体培养基；
C、枯草芽孢杆菌种子液的制备：将枯草芽孢杆菌接种到NB液体培养基，然后置于恒温培养摇床中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24 h；再按照体积比1:100接种于NB液体培养基中，在30-37℃、120-150 RPM条件下振荡培养24-48h，得枯草芽孢杆菌种子液，期间测定其OD600，当所述种子液的OD600达到1.0后停止发酵；
D、一次发酵：将步骤A所得的条斑紫菜浆料和步骤C所得的枯草芽孢杆菌种子液以质量比9：1的比例混合装入不锈钢发酵罐中进行发酵，发酵为期3天，期间温度保持在30-37℃的环境条件，且持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，发酵完成后即得到第一条斑紫菜发酵液；
E、二次发酵：将步骤D得到的第一条斑紫菜发酵液装入10 L光发酵罐中进行二次发酵，装液量为发酵罐容积的70-75%。
2.先采用波长为254 nm、功率为20-50 W的紫外灯，辐照10-30 min，然后使用60Co源进行γ辐照，辐照剂量为50-500 Gy，辐照剂量率为15 Gy/min，辐照10-30min，辐照过程中持续搅拌；辐照结束继续发酵36-48 h，得第二条斑紫菜发酵液；整个发酵过程中，持续通入无菌空气，通气量为15-20 L/min，罐中搅拌转速为50-100 RPM，培养温度为30-37℃；发酵结束后，将所的第二条斑紫菜发酵液在8-12℃环境下静置15-60 d，固液分离，收集液相组分，通过膜过滤机进行过滤，得第三条斑紫菜发酵液；
F、SOD的分离提纯：将步骤F所得第三条斑紫菜发酵液加入膜分离器和蛋白液相系统，所述膜分离器的分离条件为：100 kDa再生纤维素（RC）膜，50 mM的磷酸钠缓冲溶液，搅拌速率900 RPM，流速为13.3 L/m2h；所述蛋白液相系统采用50 kDa的聚醚砜（PES）膜；分离纯化完成，得耐高温超氧化歧化酶。
3.根据权利要求1所述的条斑紫菜发酵制备耐高温超氧化歧化酶的方法，其特征在于：所述耐高温超氧化歧化酶的活性大于5700 U/mg，纯度大于96%，所述百分比为质量百分比。
4.权利要求1所述耐高温超氧化歧化酶在化妆品中的应用。
5.权利要求3所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的应用，添加量为质量百分比0.05%-5%。
6.权利要求5所述耐高温超氧化歧化酶在化妆水、护肤霜、护肤精华液中的应用，添加量为质量百分比3%。
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