CN116875505A - 一种解淀粉芽孢杆菌mmb-02及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌MMB‑02及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用，本发明的解淀粉芽孢杆菌MMB‑02和/或其发酵液对紫菜孢子具有良好破壁作用。作为发酵菌发酵条斑紫菜可以有效提高蛋白质提取率，同时增加紫菜孢子的破壁率并增强粗多肽的抗氧化活性，进而制备紫菜抗氧化多肽，可以提高条斑紫菜酱的市场应用价值，同时可以解决紫菜资源浪费的问题，丰富其产品形式，具有较好经济价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种基于解淀粉芽孢杆菌及其在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用。
背景技术
紫菜(Porphyra yezoensis)属红藻纲，红毛菜科，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，具有很高的营养价值，是一种质优价廉、营养丰富、味道鲜美的海洋绿色食品。除食用外，紫菜还可入药，现代医学证明紫菜具有降血脂作用，并可治疗由胃酸或胃蛋白酶作用引起的消化性胃溃疡疾病，除此之外，研究表明紫菜特有的藻胆蛋白是生物活性肽的理想蛋白源，紫菜多肽具有降血压、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、抗菌等生理功能。条斑紫菜(Porphyra yezoensis,P.yezoensis)是紫菜的代表性物种之一，具有特殊的挥发性风味，是我国沿海地区栽培的主要品种，具有药食两用的特点，是我国最重要的经济型藻类之一。
紫菜含有丰富的营养物质，由于细胞壁的构成，简单的加工方式无法将其过厚的细胞壁裂解限制其中的营养物质的释放，而其中的蛋白质也不易被人体吸收利用，造成了很大的资源浪费。现代研究表明，食品被发酵的本质是由于微生物分解代谢其中的营养物质得到新的次生代谢物质和转化物质赋予发酵食品独特的风味和营养。利用安全的微生物菌体分泌的酶和菌体内的生理过程使得发酵底物的物化性质发生未知的变化，得到全新的产物。因此，可以采用发酵的方式对紫菜这种富含优质蛋白质的藻类进行破壁处理，利用微生物发酵紫菜，微生物在生长过程中利用其中的蛋白质，不仅能将紫菜的细胞壁充分裂解，更能分解代谢其中的大分子蛋白质和藻类多糖等，产生短肽物质、氨基酸衍生物及脂肪酸衍生物等各种此生代谢物质。
目前对紫菜的发酵工艺研究报道较少，传统的真菌发酵食品多采用米曲霉、黑曲霉、根霉、酵母等。紫菜中蛋白质含量丰富，解淀粉芽孢杆菌发酵过程中这些蛋白质会被降解成氨基酸和多肽物质，部分氨基酸会继续降解生成酮类和醛类物质，对发酵紫菜酱的水解度等起到重要作用，同时，微生物发酵相较于传统破壁方式如珠磨法、超声波等能明显提高细胞壁破裂，因此，通过解淀粉芽孢杆菌发酵条斑紫菜制备抗氧化多肽，可以为改进条斑紫菜加工方法和提高紫菜活性物质利用相关产业的经济效益提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MMB-02，发现解淀粉芽孢杆菌发酵具有分解代谢发酵紫菜的协促进作用，经混料设计和遗传算法精准找出最优的发酵条件参数组合优化后明显提高了蛋白质提取率，增加了紫菜孢子的破壁率。本发明所要解决的另一个技术问题是解淀粉芽孢杆菌MMB-02在发酵条斑紫菜制备抗氧化肽的应用，产生游离氨基酸态氮并增强粗多肽的抗氧化活性，为食品发酵优化提供了新思路。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的：一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MMB-02的筛选，所述解淀粉芽孢杆菌MMB-02于2023年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.27399。
所述解淀粉芽孢杆菌MMB-02和/或其发酵液对紫菜孢子具有良好破壁作用。
一种解淀粉芽孢杆菌MMB-02的培养方法，如下步骤：
制备LB固体培养基，将从连云港海泥获取的解淀粉芽孢杆菌MMB-02接种至LB培养基中，解淀粉芽孢杆菌MMB-02在37℃摇床培养48小时，培养结束后在LB培养基平板上划线获取单菌落，保藏备用。
解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，包括以下步骤：
(1)以连云港黄海海泥为试验原料，在LB液体培养基中培养24小时，并在LB固体培养基平板中划线获取单菌落，共筛选出18株菌株，从中选用3株解淀粉芽孢杆菌，分别命名为MMB-02，B-1，ZXC-1，进行发酵条斑紫菜；
(2)将条斑紫菜放入超微粉碎机中粉碎成细粉，称取干燥的条斑紫菜粉末并加入蒸馏水配置成酱糊状，条斑紫菜与加入蒸馏水的质量比为2:3，搅拌均匀后高压灭菌；
(3)将解淀粉芽孢杆菌MMB-02接种到LB液体培养基，传代2次后，培养至对数期，离心弃上清，收集沉淀，沉淀使用无菌水清洗后，调节OD600值，OD600值为0.6-0.7，向冷却至室温后紫菜酱中添加菌液进行发酵；
(4)将发酵后紫菜通过水提酸沉法制备抗氧化肽。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌MMB-02(Bacillus amyloliquefaciens)发酵条斑紫菜制作抗氧化多肽，并通过混料设计和遗传算法进一步优化发酵条件，精准找出最优的发酵条件参数组合，发现通过遗传算法后得出各项指标的预测值与实验值基本一致，证明优化后能明显提高蛋白质提取率，增加紫菜孢子的破壁率，产生游离氨基酸态氮并增强粗多肽的抗氧化活性，同时也确定解淀粉芽孢杆菌发酵具有分解代谢发酵底物的促进作用。增加解淀粉芽孢杆菌MMB-02应用于食品中的潜力，大大提高了条斑紫菜的经济价值和社会价值，值得推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为解淀粉芽孢杆菌MMB-02的菌落形态。
图2为解淀粉芽孢杆菌MMB-02的系统发育树图。
图3为解淀粉芽孢杆菌MMB-02的不同时间下的OD值。
图4为解淀粉芽孢杆菌MMB-02的不同时间下的pH值。
图5为不同时间下三株菌落的活菌数变化。
图6为不同时间下三株菌落的pH值。
图7为三株菌落的蛋白质提取率图。
图8为三种菌落的水解度图。
图9为在不同时间内三株菌落的总抗氧化活性图。
图10为三种菌落的破壁率图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创作性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护的范围。
实施例：
S以连云港黄海海泥为试验原料：
S1：在LB液体培养基中温度设为37℃、培养24h，并在LB固体培养基平板中划线获取单菌落，共筛选出18株菌株。从中选用3株解淀粉芽孢杆菌(分别命名为MMB-02，B-1，ZXC-1)进行发酵条斑紫菜；
S2：将条斑紫菜放入超微粉碎机中粉碎成细粉，称取干燥的条斑紫菜粉末并加入蒸馏水配置成酱糊状，按照条斑紫菜粉末与蒸馏水质量比2:3混合，进行搅拌均匀，在121℃下高压灭菌30分钟；
S3：将三株解淀粉芽孢杆菌接种到LB液体培养基，传代2次后，培养至对数期，离心弃上清，收集沉淀，沉淀使用无菌水OD600清洗后，调节OD600值为0.6-0.7，向冷却至室温后紫菜酱中添加酱料总量3％的菌液，在温度37℃、静止发酵72小时。
如图5，解淀粉芽孢杆菌ZXC-1、MMB-02、B-1在0～12h时在紫菜中快速生长，24h时，活菌数均达到最高，之后进入快速下降阶段，发酵结束时，除对照组外，ZXC-1菌株的活菌数最低。
如图6，解淀粉芽孢杆菌ZXC-1、MMB-02、B-1在整个发酵过程中pH均呈现上升状态，其中解淀粉芽孢杆菌B-1在24～72h时，pH值增长速度最快，发酵结束时，pH值达8.9±0.10，而对照组pH值出现缓慢降低状态。
如图7，解淀粉芽孢杆菌ZXC-1、MMB-02、B-1发酵后的紫菜蛋白质提取率均高于对照组，且MMB-02组的蛋白质提取率稍高于B-1和ZXC-1组。
如图8，解淀粉芽孢杆菌MMB-02的水解度较B-1和ZXC-1组最高，达36.61％。
如图9，发酵24和72h时，解淀粉芽孢杆菌ZXC-1、MMB-02、和B-1的粗多肽抗氧化活性均明显强于对照组，但发酵48h时，MMB-02和B-1组与对照组基本相同，并略高于ZXC-1组，总体来看，发酵72h时，粗多肽的抗氧化活性最强，且与同种菌其他组相比MMB-02组抗氧化活性最强。
如图10，解淀粉芽孢杆菌MMB-02的破壁率明显高于ZXC-1和B-1，达41.91％±0.11。
以上实验数据，得出解淀粉芽孢杆菌MMB-02对紫菜发酵物破壁率大于B-1和ZXC-1，S3步骤中解淀粉芽孢杆菌MMB-02对紫菜发酵物蛋白质提取率大于B-1和ZXC-1，S3步骤中解淀粉芽孢杆菌MMB-02对紫菜发酵物抗氧化活性大于B-1和ZXC-1。
上所述，仅为本发明的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MMB-02，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌MMB-02于2023年05月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27399。
2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌MMB-02，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵得到发酵液；所述解淀粉芽孢杆菌MMB-02和/或其发酵液对条斑紫菜孢子具有良好破壁作用。
3.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌MMB-02的培养方法，如下步骤：
制备LB固体培养基，将从连云港海泥获取的解淀粉芽孢杆菌MMB-02接种至LB培养基中，解淀粉芽孢杆菌MMB-02在37℃摇床培养48小时，培养结束后在LB培养基平板上划线获取单菌落，保藏备用。
4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，包括以下步骤：
(1)以连云港黄海海泥为试验原料，在LB液体培养基中培养24小时，并在LB固体培养基平板中划线获取单菌落，共筛选出18株菌株，从中选用3株解淀粉芽孢杆菌，分别命名为MMB-02，B-1，ZXC-1，进行发酵条斑紫菜；
(2)将条斑紫菜放入超微粉碎机中粉碎成细粉，称取干燥的条斑紫菜粉末并加入蒸馏水配置成酱糊状，条斑紫菜与加入蒸馏水的质量比为2:3，搅拌均匀后高压灭菌；
(3)将解淀粉芽孢杆菌MMB-02接种到LB液体培养基，传代2次后，培养至对数期，离心弃上清，收集沉淀，沉淀使用无菌水清洗后，调节OD600值，OD600值为0.6-0.7，向冷却至室温后紫菜酱中添加菌液进行发酵；
(4)将发酵后紫菜通过水提酸沉法制备抗氧化肽。
5.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤(1)培养条件设置在37℃，180rpm摇瓶振荡培养；步骤(1)中灭菌条件为121℃下高压灭菌30min。
6.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤(3)中添加菌液的量为酱料总量3％；发酵温度设置在37℃，静止发酵72小时。
7.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤(4)中水提温度设置在30℃，搅拌浸提24小时。
8.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤(4)中酸沉采用0.1mol/I HCI调节pH值至4.2。
9.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：步骤(4)中经酸沉样品置于4℃冰箱静置沉淀4小时。
10.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌MMB-02发酵制备紫菜抗氧化肽的方法，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌MMB-02对紫菜发酵物破壁率、水解度、蛋白质提取率和抗氧化活性均大于B-1和ZXC-1的紫菜发酵物破壁率、水解度、蛋白质提取率和抗氧化活性。
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