CN101392227B

CN101392227B - 一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素

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Publication number: CN101392227B
Application number: CN200810072975XA
Authority: CN
Inventors: 阿依努尔·阿不都热合曼; 古丽祖热·佐努尼; 吾甫尔·米吉提
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2008-10-23
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2011-06-01
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: CN101392227A

Abstract

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCC.No.2593及产生的灵菌红素。该菌株生长温度为28℃-38℃，pH值为5-9，发酵采用LB液体培养基，500mL三角瓶，内装培养液200mL，1125×121Pa灭菌20min在37℃条件150r/min摇培5d后，装入无水乙醇，在摇床振动20min，静置10min，并以4000r/min离心10min去杂，经无水乙醇抽提，产生灵菌红素沙雷氏菌株色素产量为7.85g/L，其灵菌红素最大吸收峰入m为533.8nm，热稳定性较好。获得灵菌红素可作为抗肿瘤药物、食品和化妆品等领域具有重要的应用前景。

Description

一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素

发明领域

本发明涉及微生物发酵及其产物酶领域。具体的说，本发明涉及一种可产生灵菌红素的内生菌及其制备产生灵菌红素的技术领域。

背景技术

色素可分为天然色素和人工合成色素两类，其在食品和化妆品生产中的应用非常广泛。随着医学毒理和生物学研究的不断深入，发现允许使用的人工合成色素中，大多数种类对人体有不同程度的伤害，尤其是致癌，致畸，致突变，已引起人们的高度重视。为此，天然色素已逐渐在取代合成色素。因动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等因素的影响，原料不足，从中提取的色素价格昂贵，应用受到局限，而利用微生物资源生产天然色素，克服以动植物为原料生产天然色素的诸多缺点，并且易于工业化。因此，采用微生物生产天然色素将逐渐成为天然色素来源的发展方向。

灵菌红素(Prodigiosin，PG)是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素，通常都有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，是一些放线菌、沙雷氏菌及其他细菌的次级代谢产物，具有免疫抑制、抗细菌、抗真菌和抗疟疾等多种生物活性。最近研究表明灵菌红素有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性，因而成为研究热点。

灵菌红素属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶；该色素对温度稳定，但受pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大，分子式为C₂₀H₂₅N₃₀；灵菌红素具有强烈的细胞溶解酶活性，能杀灭引起赤潮的浮游藻类，灵菌红素有望通过毒性实验和环境影响检测，成为治理赤潮的产品。

现研究发现，灵菌红素以其独特的结构，具有毗咯亚甲基骨架、特异的活性，而在癌症治疗上具有很大的药用潜力。微生物发酵生产领域内灵菌红素属天然色素，可大量用于食品工业。但灵菌红素作用机理还不十分清楚，现研究主要集中在灵菌红素诱导肿瘤细胞凋亡的作用上。总之，灵菌红素作为一种新研究的抗肿瘤活性物质，具有很好的开发成抗癌新药的潜力。

对灵菌红素性质的研究国内已有多篇文献报道，但这些产灵菌红素的细菌多自海水或土壤中分离，而对内生菌类产生灵菌红素的系统研究却未见报道。

发明内容

针对目前国内外内生菌类特别是块根芍药内生菌类灵菌红素的系统研究未见报道，通过对药用植物内生菌的多样性研究，可以找到产生与宿主相同、相似甚至全新结构活性成分的菌株具有重要意义。本发明通过对新疆药用植物块根芍药内生菌进行筛选分离鉴定，获得了一批能产生灵菌红素的菌株，并对该菌株的获得高效的生物活性物质和天然色素奠定了菌种基础，该菌珠产生的灵菌红素可作为抗肿瘤药物和抗生素资源，其安全性高，热稳定性强，具有较好的研究前景。

本发明的技术方案：本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从新疆典型的新疆药用植物块根芍药样本中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批内生菌菌株，并从中分离筛选出产灵菌红素产生菌株，编号为tarbaghatay-ab-6，从而提供了一株产灵菌红素的产生菌，其具有生产灵菌红素的优良特性，经微生物学分类与鉴定，属于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

本发明具体提供了一种粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、其产生的灵菌红素及其制备工艺。该粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)代谢产生的色素在酸性条件下呈现红色，碱性条件下显示黄色，在酸性条件下较稳定，热稳定性较好，不同浓度的蔗糖、亚硫酸钠和苯甲酸钠溶液对其稳定性影响不大，该色素溶于乙醇、甲醇、丙酮，不溶于水。按照光谱特性、pH值及溶解性，确定该天然色素为灵菌红素(prodigiosin)。

本发明提供的一种产生灵菌红素沙雷氏菌株，命名为tarbaghatay-ab-6，其能够产生稳定而明显的灵菌红素。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2008年7月14日，保藏号是CGMCC.No2593。经微生物学鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。该菌株大小为0.8-0.9um×1.2-1.3um，短杆状，革兰氏阴性细菌，无芽孢，有荚膜，无鞭毛，无运动。菌落呈圆形，光滑，湿润，表面隆起呈金属光泽，边缘不整齐，有轻微异味，菌落呈紫红色，色素不扩散到培养基中。该菌株产红色代谢产物，生长快，代谢产物产量高，无毒性；该菌株兼性好氧，可氧化发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、海藻糖，不能够氧化发酵鼠李糖，能够氧化发酵山梨醇、甘露醇、肌醇，氧化酶阴性，淀粉酶阴性，可利用柠檬酸盐，不能还原硝酸盐，不能够产H₂S，VP阳性，精氨酸水解酶阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，尿素分解阴性，鸟氨酸脱羧酶阳性，可液化明胶。28℃～38℃为该菌株最适生长温度，最适生长pH值为pH5-9，培养基NaCl的浓度不高于4％时均可以生长。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual ofSystematic Bacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对tarbaghatay-ab-6菌株进行形态学测定，生理生化检测确定tarbaghatay-ab-6菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中的成员。该菌株经16S rDNA分析及G+Cmol％含量测定，都表明tarbaghatay-ab-6菌为粘质沙雷氏菌属中的成员，属粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

本发明建立菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

一.菌种筛选：通过对块根芍药的内生菌进行分离，并对所分离的块根芍药内生菌进行筛选并对分离获得的内生细菌进行显微形态特征的观察，依据经典形态学方法，合并表型相同的菌株，筛选分离表型不同的菌株，并获得产灵菌红素的菌株。

二.菌种鉴定

A.生理生化检测

依据《伯杰氏细菌分类鉴定手册》(7^thedition)和东秀株编著的《常见细菌分类鉴定手册》中的方法进行发酵类型、代谢底物、营养依赖型等方面的检测。

B.G+Cmol％含量测定

用高效反相液相色谱仪来测定该菌株基因组的G+Cmol％含量，具体方法参照林万明的《细菌分子遗传学分类鉴定法》。本发明粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCC No.2593的G+Cmol％含量为57.8mol％，将其最终鉴定为粘质沙雷氏菌。该菌株的获得为开发出廉价、高效的生物活性物质和天然色素奠定了菌种基础，有较好的研究前景。

C.16SrRNA序列分析

模版：采用CTAB法所提取的菌株基因组DNA为模板。

引物：16SrDNA的PCR引物为L：5′CGGACGGGTGAGTAATGTCT3′；

R：5′CTTCTTTTGCAACCCACTCC′；

用Blastn比较菌株16SrDNA与GenBank中已登录的序列，调出与菌株16SrDNA同源并且已经鉴定的菌种的16SrDNA序列，并进行比对。同时根据从GeneBank中调出的已经鉴定的tarbaghatay-ab-6，高度相似的细菌菌种的16SrDNA构建系统进化树。经比对，该菌株与Serratia.spPSGB18的同源性为99％。从系统进化树中可以发现该菌株与Serratia spPSGB18的相关性为87％。系统进化树参见附图1所示。

通过以上的生理生化检测、G+C含量测定，16SrRNA同源分析结果都可以表明tarbaghatay-ab-6菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中的成员，从而可以精确的将本发明的tarbaghatay-ab-6菌株分类为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，也建立了分类鉴定微生物的一种可靠、准确的途径。

三.菌种保藏：真空冷冻干燥或石蜡油保存。无菌条件下将100％石蜡油加入试管斜面上，使石蜡油液面超出培养基斜面，完全隔绝空气对菌种的影响，将菌种保存于-70℃的超低温冰箱中。

四.菌种活化：从石蜡油中取一菌种移植块，接种到MEA培养基上，在20～25℃下培养1天左右，再转接到一新鲜MEA培养基上，连续活化数次，就可进行菌株其它实验的测定。

五.菌种复壮：首先按上述步骤的活化菌种，然后在筛选培养基中接种活化好的菌并进行培养，选取优良菌株接种于斜面培养基上培养，并将此菌株作为生产菌株使用。

本发明还具体提供一种灵菌红素的制备方法，其包括：

(一)对粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CGMCC No.2593进行菌种活化培养步骤；

(二)利用如上步骤获得的活化菌种进行发酵步骤；

(三)发酵后的纯化提取步骤。

具体的，本发明还提供了一种产生的灵菌红素的方法，其特征在于将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为生产菌株，经发酵培养，提取及纯化红色代谢产物的过程，具体步骤如下：

1、菌种发酵：发酵采用LB液体培养基；500mL三角瓶，内装培养液200mL，1125×121Pa灭菌20min在37℃条件150r/min摇培5d。

2、灵菌红素的提取：发酵液中等量装入无水乙醇，在摇床振动20min，静置10min，并以4000r/min离心10min去杂，得红色上清液，残渣继续用无水乙醇反复抽提3次。将收集到的红色上清液混合，经旋转蒸发器浓缩，得红色黏稠粗制品。

本发明具体提供沙雷氏菌产生灵菌红素的最佳发酵条件，优化该菌株的发酵工艺，提高菌株的色素产量，为色素的分离纯化作好准备。通过对菌株合成色素发酵工艺的研究，分别选择MEA培养基，LB培养基，PDA培养基，YM培养基为基础培养基，得到了发酵培养基配方，其最佳的发酵培养基配方按重量比计为氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母精浸粉0.5％。

本发明通过所得到色素的理化性质及结构的鉴定试验可以证明得到的红色素是灵菌红素。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

本发明提供的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CGMCC No.2593菌株的色素产量为7.85g/L；

本发明产生的灵菌红素最大吸收峰入m为533.8nm，pH值3-7时保持较稳定的玫瑰红色，pH值>8时，变成黄色，在酸性条件下较稳定，对光的稳定性不好。热稳定性较好。(h＝0时，吸光度为0.27)蔗糖的存在对该色素的稳定性无影响。苯甲酸钠对该色素溶液的稳定性无影响。

附图说明：

图1所示为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CGMCC No.2593菌株系统进化树。

图2所示为标准碱基溶液分离图谱。

图3所示为菌株碱基分离图。

图4所示为色素醇溶液的紫外吸收光谱。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则按100kg重量为基准，％皆指重量百分比。

实施例一：产灵菌红素菌株的筛选

本发明首次对块根芍药的内生菌进行分离，并对所分离的11株块根芍药内生菌进行筛选获得产灵菌红素的菌株，具体步骤如下：

称取块根芍药样品2组，每组两份各7g，先用封口膜密封材料两端(因块根芍药为中空植株)再用清水冲洗3分钟。用碾碎法在超净台中用无菌水冲洗4次，1％升汞处理13s，无菌水冲洗4次，在250ml的三角瓶每次用无菌水100ml以上，在不断的摇动下漂洗5min，用次氯酸钠漂洗13分钟，再用无菌水冲洗5次，最后加入6ml无菌蒸馏水进行研碎，经三层无菌纱布过滤，收集滤汁，将滤汁分别涂于LB、PDA、MEA、YM培养基平板上，分别把LB培养基置于37℃，其它培养基置28℃温箱，待平板有菌落出现后，平板划线纯化，直至得到单菌落，斜面保存备用。经多次反复试验，其最佳的发酵培养基配方按重量比计为氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母精浸粉0.5％。

对分离获得的内生细菌进行显微形态特征的观察，依据经典形态学方法，合并表型相同的菌株，筛选分离表型不同的菌株，并获得产灵菌红素的菌株。

实施例二、产灵菌红素菌株的鉴定

1、形态结构和培养特性观察

该菌株个体形态特征、菌落形态特征、运动性和生理生化特征观察测定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌鉴定手册》进行。

1.1形态结构观察

分离所得的细菌在LB培养平板中于28℃下培养LB培养基上培养1～3d后，观察其菌落形态：针头、圆形、不规则形、丝形和分枝状；菌落的边缘整齐、波纹状、裂刻状、丝状和卷发状；菌落的高度扁平、隆起、凸起、中央凸起或下凹，进行芽孢染色、革兰氏染色和菌体形态观察，分别按菌落形态、颜色、菌体形态、芽孢有无和革兰氏染色分组，编菌株号，用常规的细菌鉴定方法将每一细菌菌株鉴定到属。

1.2培养特性观察

细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落。不同微生物在培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。细菌的培养特征包括以下内容：

①在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；

②在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等；

③半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。

菌落及菌体形态观察而得该菌株大小为0.8-0.9um×1.2-1.3um，短杆状，革兰氏阴性细菌，无芽孢，有荚膜，无鞭毛，无运动。菌落呈圆形，光滑，湿润，表面隆起呈金属光泽，边缘不整齐，菌落呈紫红色，色素不扩散到培养基中。

2、生理生化试验

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。依据《伯杰氏细菌分类鉴定手册》(7^thedition)和东秀株编著的《常见细菌分类鉴定手册》中的方法进行发酵类型、代谢底物、营养依赖型等方面的检测。该菌株主要生理生化特征如表1

表1：菌株主要生理生化特征

菌株特征 S.marcescens
	V-P + +氧化酶 - -接触酶 + +明胶液化 + +鸟氨酸脱羧酶 + +精氨酸水解酶 - -赖氨酸脱羧酶 + +Tween80 + +甘露醇 + +麦芽糖 + +丙二酸 - -吲哚产生 - -葡萄糖 + +蔗糖 + +L-阿拉伯糖 + +鼠李糖 - -肌醇 + +山梨醇 + +淀粉酶 - -硝酸盐还原 + +

3、菌株16SrDNA序列的PCR与测序

模版：采用CTAB法所提取的菌株基因组DNA为模板。

引物：16SrDNA的PCR引物为L：5′CGGACGGGTGAGTAATGTCT3′；

R：5′CTTCTTTTGCAACCCACTCC′；

用Blastn比较菌株16SrDNA与GenBank中已登录的序列，调出与菌株16SrDNA同源并且已经鉴定的菌种的16SrDNA序列，并进行比对。同时根据从GeneBank中调出的已经鉴定的与tarbaghatay-ab-6，高度相似的细菌菌种的16SrDNA构建系统进化树。提交NCBI注册，并经进行比对，结果显示该菌株与Serratia.spPSGB18的同源性为99％。该菌株与相关菌株的系统进化树分析，从系统进化树中可以发现该菌株与Serratia spPSGB18的相关性为87％。参见附图1

4、产灵菌红素菌株G+Cmol％测定

用高效反相液相色谱仪来测定该菌株基因组的G+Cmol％含量。高效液相色谱仪为日本岛津LC-6AD高效液相色谱仪，岛津SPD-10Avp紫外检测器，Class-VP数据处理工作站，KromasilC18柱(5μm，250mmx4.6mmi.d)，流速1ml/min，检测波长260nm。移动相为10％甲醇，90％20mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH＝5.6)。

DNA水解：加入60μL高氯酸，溶解基因组后，转入1.5ml的EP管，封口膜封口，沸水浴水解DNA，时间为1h，加无菌双蒸水300μl到EP管，离心取上清。4℃冰箱保存备用。

标准碱基的配置：

分别准确称取四种核酸碱基(AMRESCO，sangon分装)，加数滴磷酸溶解后，加入移动相定容至10mL，各碱基浓度分别为2.779、2.870、4.520及3.256mmol/L。各取200μL配成混合液，并加入移动相定容至1ml，在混合液中，标准溶液的配制中各碱基浓度见表2。

表2：标准溶液的配制中各碱基浓度

碱基的K值的计算：

取5μL混合液上柱，即可获得标准溶液的色谱分离图谱。根据各标准碱基的进样量和标准图谱峰面积可计算出各种碱基的K值(单位面积的毫克分子数)。

计算公式：碱基K值＝毫克分子数/碱基峰面积。

G+Cmol％含量的计算：

样品中各碱基的毫摩尔数就可以依据四种碱基的峰面积和标准碱基的K值得出。计算公式：碱基的毫摩尔数＝碱基峰面积×标准碱基K值。

G+Cmol％＝G+C/A+T+G+C＝2C/2T+2C＝C/T+C

加入5μL标准碱基混合液，测定K值，加5μL样品处理液，测定样品中基因组的G+Cmol％含量。

细菌DNA纯度检查结果：对提取DNA样品的纯度进行检测，DNA样品的吸光度比值为A_260nm：A_280nm＝1.87，符合DNA纯品的吸光度比值A_260nm：A_280nm＝1.8。采用高效反相液相色谱来测定G+Cmol％含量：从标准碱基混合液的柱色谱分离图谱，参见附图2，表明各峰分离效果良好，其检出时间、峰型和峰面积稳定。根据各碱基的进样量及标准图谱峰面积计算各种碱基的K值(单位面积的毫克分子数)。

计算公式：碱基K值＝毫摩尔分子数/碱基峰面积

由碱基的毫摩尔数，可以得到菌株tarbaghatay-ab-6基因组DNA的G+Cmol％，参见附图3，测得菌株tarbaghatay-ab-6的G+Cmol％为57.8mol％，跟粘质沙雷氏菌的DNA G+Cmol％相同。产灵菌红素的该菌株16S rRNA经序列分析表明，该菌与沙雷氏菌属的相似性为87％，初步鉴定为沙雷氏菌属；进一步通过形态学、生化特征和(G+C)mol％含量，将其最终鉴定为粘质沙雷氏菌。该菌株的获得为开发出廉价、高效的生物活性物质和天然色素奠定了菌种基础，有较好的研究前景。

实施例三、菌株红色素的提取及其结构鉴定

1、色素的提取

提取采用以下两种方法：

(1)发酵液中等量装入无水乙醇，在摇床振动20min，静置10min，并以4000r/min离心10min去杂，得红色上清液，残渣继续用无水乙醇反复抽提3次。将收集到的红色上清液混合，经旋转蒸发器浓缩，得红色黏稠粗制品。

(2)在MEA固体培养基上培养2天后，以4000r/min离心5min，往沉淀加无水乙醇使色素溶解在其中，以4000r/min离心5min，取上清经旋转蒸发器浓缩，使其烘干。用乙酸乙酯溶解，用饱和NaCl溶卒取两次后，使其烘干。

2、薄层层析

薄层层析采用的是硅胶薄层层析，展开剂用石油醚：乙酸乙酯按5:1，刮板收集Rf为0.6的红色区带，用甲醇溶解。通过过虑将组分从硅胶粉中洗脱下来后使其蒸干，然后用HNMR分析。

3、色素的理化性质

3.1色素的光谱特性

取红色黏稠液用体积浓度95％乙醇稀释至体积浓度0.1％，测定其在可见光及紫外光范围内的吸光度A值。该色素的最大吸收峰入m为533.8nm。参见附图4PERKIN-ELMER型紫外可见分光光度计(λ17UV/VIS)，(PERKIN-ELMERLAMBDA17UV/VIS SPECTROPHOTOMETER)。

3.2不同pH值下色素的颜色

取一定量的色素乙醇溶液，分别用0.1mol/L的盐酸和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值。

表3.1不同pH值下色素溶液的颜色

pH	2 3 4 5 6 7 8 9以上
		颜色	玫瑰红玫瑰红玫瑰红玫瑰红玫瑰红玫瑰红菊黄色黄色

pH值3—7时保持较稳定的玫瑰红色，pH值>8时，变成黄色，在酸性条件下较稳定。

3.3色素的光稳定性

用体积浓度95％的乙醇将所提取色素配成体积浓度0.1％和体积浓度0.2％的溶液，在自然光下分别放置0h、12h、24h、48h、72h、96h，在入max下测定其吸光度A值。

由表3.2可知，该红色素经自然光照射96h后，其吸光度值A几乎为零，说明该色素对光的稳定性不好。

表3.2色素的光稳定性

时间	体积浓度0.10％ 0.20％
		024487296	0.035 0.0450.01 0.010.005 0.0060.004 0.0060.008 0.01

3.4色素的热稳定性

取该色素乙醇溶液在20℃、40℃、70℃下分别加热20min、35min、50min、65min，冷却后用721型分光光度计测定最大吸收峰下色素溶液的吸光度A值。

由表4色素的热稳定性可以看出，该色素随着加热时间的延长和温度的提高，其吸光度值变化不大，说明该色素的热稳定性较好。(h＝0时，吸光度为0.27)

表4

时间h	水浴温度20℃ 40℃ 70℃
		20355065	0.29 0.263 0.280.29 0.273 0.30.29 0.26 0.30.29 0.283 0.31

3.5蔗糖对色素的影响

取10mL色素实验溶液，分别加入不等量的蔗糖，配成蔗糖质量浓度分别为3.0g/100mL、6.0g/100mL、10.0g/100mL、16.0g/100mL的色素溶液。用721紫外分光光度计测定在室温下放置48h后的最大吸收峰下色素的吸光度A值。由表5中看出，蔗糖的存在对该色素的稳定性无影响。

表5：蔗糖溶液对色素的影响

3.6苯甲酸钠对色素的影响

取10mL色素试验溶液，分别加入苯甲酸钠，配制成质量浓度分别是0、0.1g/100mL和1g/100mL的溶液，在入max下用721型紫外分光光度计测定其在室温下放置0h、24h、48h、72h时的吸光度A值。由表6可知，苯甲酸钠对该色素溶液的稳定性无影响。

表6：苯甲酸钠对色素稳定性的影响

时间h	苯甲酸钠质量浓度g/100mL0.10 1.00
		0244872	0.265 0.2650.238 0.5130.263 0.460.265 0.47

3.7还原剂对色素的影响

取5份色素溶液各10mL，分别加入Na₂SO₄，0.0mg、0.2mg、2.0mg、5.0mg，配成不同质量浓度的色素溶液，用721紫外分光光度计测定其放置0h、24h、50h、74h、96h、120h后在入max下测定其吸光度A值。由表7可知，该色素溶液随还原剂质量浓度增加，放置时间的延长，其吸光度值和色素溶液颜色变化较明显，这说明该色素的耐还原性较差。

表7：还原剂对色素稳定性的影响

时间h	Na₂SO₄加入量0 0.2mg 2mg 5mg

024487296120

0.28 0.283 0.34 0.270.28 0.09 0.22 0.2160.28 0.085 0.18 0.150.28 0.075 0.183 0.0880.28 0.07 0.13 0.110.28 0.09 0.125 0.18

3.8氧化剂对色素的影响

取5份色素溶液各10mL，分别加入质量分数30％的双氧水0.0mL、0.15mL、0.5mL、2.0mL在室温下放置0h、2h、12h、20h、48h、96h后，用721紫外分光光度计测定该色素在入max下的吸光度A值。由表8可知，这说明该色素的耐氧化性较差。

表8：氧化剂对色素的影响

时间	氧化剂加入量0 0.15ml 0.5ml 2ml
		0h24h48h72h96h	0.28 0.3 0.41 0.350.28 0.29 0.37 0.280.28 0.22 0.22 0.180.28 0.163 0.14 0.1430.28 0.135 0.115 0.1

4.色素的毒性测试

色素的毒性测试方法分为灌胃和腹腔注射两种，处理后观察动物的急性毒性反应和死亡的动物数量。

4.1小鼠急性毒性实验：

取小鼠20只，雌雄各半，随机分为2组，即阴性对照组(10只)和实验组(10只)，雌雄各半。以400g/kg剂量给实验组腹腔注射，记录小鼠的毒性反应及死亡情况。小鼠在腹腔注射色素后，第1天注射后，动物出现少动、不进食症状，约2-3h恢复正常。连续观察14d，未见动物发生中毒症状和死亡。处死动物后，肉眼观察及镜下组织形态学观察心、肝、脾、肺、肾等脏器，均未发现异常病变。此时小鼠给药量即最大给药量达到400g/kg。动物毒性试验结果表明，大剂量的色素对小鼠没有任何作用，色素没有急性毒性。

4.2小鼠长期毒性实验：

取小鼠12只，雌雄各半，随机分为2组，即阴性对照组(8只)和实验组(4只)，雌雄各半。禁水不禁食16h后，实验组以每天1mg/ml浓度，按140g/kg剂量灌胃。阴性对照组则给蒸馏水。实验期间每天观察小鼠一般状态如进食，行为活动，粪便等。给药期满2个月后，每组随机各剖杀4只动物，雌雄各半，剖取动物心、肝、肾、脾、肺、等脏器，进行肉眼及镜下组织形态学观察。小鼠1天口服最大给药为140g/kg。观察2个月未见动物发生中毒症状和死亡，处死动物后肉眼观察及镜下组织形态学观察心、肝、脾、肺、肾等脏器，均未发现异常病变，说明该色素对主要器官组织无明显毒性，表明该色素在临床用药或者食品和化妆品生产范围内应用是比较安全的。

该色素在酸性条件下呈现红色，碱性条件下显示黄色，在酸性条件下较稳定，热稳定性较好，不同浓度的蔗糖、亚硫酸钠和苯甲酸钠溶液对其稳定性影响不大，但对光、氧化、还原剂其稳定性较差。应进一步研究如何提高其稳定性。该色素溶于乙醇、甲醇、丙酮，不溶于水。按照光谱特性、pH值及溶解性，初步确定该天然色素为灵菌红素(prodigiosin)。该色素为一种不定型的红色固体；mp168-170℃，H-NMR(CDC13，400M)数据显示：7.28(brs，H-2)，6.95(brs，H-10)，6.98(d，J＝3.7Hz，H-4)，6.72(s，H-12)，6.39(dd，j＝3.8，2.4Hz，H-3)，6.11(s，h-7)，4.04(s，21-OCH3)，2.54(s，15-CH3)，2.42(m，H-16)，0.89(t，20-CH3)；该色素HNMR图谱与灵菌红素基本一致，故确定该色素为灵菌红素(4-methoxy-S-[(5-methyl-4-pentyl-2H-pyrrol-2-yliden)methyl]-2，2′-bi-1H-pyrrole)。

灵菌红素作为一种新研究的抗肿瘤活性物质，具有很好的开发成抗癌新药的潜力。菌珠产生的灵菌红素可作为抗肿瘤药物和抗生素资源，其安全性高，热稳定性强，也可考虑用于食品和化妆品生产。

实施例四、发酵条件对菌株合成色素的影响

4.1产色素最佳培养基的选择

用LB，MEA，PDA培养基培养两天观察色素的合成情况。结果表明LB培养基最适合色素的合成，LB液体培养基里加少量精氨酸时，菌株能够稳定的产生红色素。

4.2培养基初始pH值的影响

采用LB作为发酵培养基，将初始pH值分别调为5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0接种后振荡培养2d，检测其发酵液的色素含量。结果表明，初始pH值在6.5时，最利于菌株合成色素。

4.3温度的影响

温度对菌株的生长和活性物质的合成起着重要的作用。采用6个不同的培养温度即：26℃，28℃，29℃，32℃，38℃，测试不同的培养温度下菌株合成色素的情况。以最佳发酵培养基作为发酵培养基，在20℃-35℃之间分别取4个温度点进行实验，结果在35℃下色素含量最高。

4.4装液量的影响

装液量是反映发酵液菌体需氧状况的一个间接指标。保持其他培养条件不变，以最佳发酵培养基作为发酵培养基，pH值调至6.5。在500mL的三角瓶中分别装入50mL，100mL，150mL，200mL，250mL，振荡培养后检测活性。结果装液量在150mL时，色素合成量最高。

通过以上实验得到了菌株合成色素的最佳发酵培养基配方按重量比计为氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母精浸粉0.5％。最佳培养条件：35℃，pH6.5-7.0，180r/min振荡培养，150ml(500ml三角瓶中)，培养时间为2d。

Claims

1.一种产生灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)CGMCC.No.2593。

2.一种灵菌红素的制备方法，将提供的生产菌株经发酵培养，提取及纯化红色代谢产物的过程，其特征在于，具体步骤如下：

(二)利用如上步骤获得的活化菌种进行发酵：发酵采用LB液体培养基，500mL三角瓶，内装培养液200mL，1125×121Pa灭菌20min在37℃条件150r/min摇培5d；

(三)发酵后的纯化提取步骤：发酵液中等量装入无水乙醇，在摇床振动20min，静置10min，并以4000r/min离心10min去杂，得红色上清液，残渣继续用无水乙醇反复抽提3次，将收集到的红色上清液混合，经旋转蒸发器浓缩，得红色黏稠粗制品。

3.按照权利要求2所述的灵菌红素的制备方法，其特征在于，所述的发酵中培养基配方按重量比计为氯化钠1％，蛋白胨1％，酵母精浸粉0.5％。

4.按照权利要求2所述的灵菌红素的制备方法，其特征在于，所述的发酵工艺中，该菌株生长pH值为pH5-9，培养基NaCl的浓度不高于4％。