RU2148645C1 - Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы - Google Patents
Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2148645C1 RU2148645C1 RU97104288A RU97104288A RU2148645C1 RU 2148645 C1 RU2148645 C1 RU 2148645C1 RU 97104288 A RU97104288 A RU 97104288A RU 97104288 A RU97104288 A RU 97104288A RU 2148645 C1 RU2148645 C1 RU 2148645C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- lipase
- serratia marcescens
- producer
- biomass
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение может быть использовано в микробиологии, биотехнологии, медицине, косметологии. Штамм Serratia marcescens B-10L - 1 (НИИ ККМ В-687) - продуцент липазы получен из исходного музейного штамма Serratia marcescens В-10 как спонтанный вариант. Длительность культивирования снижена с 24 до 20 ч, выход фермента составляет 800 ед. акт./мг биомассы. Выявление нового штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов - продуцентов липазы, обладает высокой продуктивностью, уменьшает продолжительность культивирования в 2,5 раза. 1 табл.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма - продуцента фермента липазы. Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Они находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Специально очищенные препараты липаз применяют в медицине и научных исследованиях. Поиск новых бактериальных штаммов - продуцентов липазы является актуальной задачей.
Основными продуцентами липаз являются штаммы грибов Aspergillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus, некоторые дрожжи (Candida) [1 - 4]. Известен, например, штамм грибов Fusarium oxysporum - продуцент липазы [1]. Данный штамм выращивают при температуре 30oC в течение 150 - 200 часов на питательной среде, содержащей, г/л:
MgSO4•7H2O - 0,5
KHt2PO4 - 1,0
NaNO3 - 3,0
Пептон - 30,0
Дрожжевой экстракт - 1,0
Оливковое масло - 10,0
Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед. акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6 - 7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).
MgSO4•7H2O - 0,5
KHt2PO4 - 1,0
NaNO3 - 3,0
Пептон - 30,0
Дрожжевой экстракт - 1,0
Оливковое масло - 10,0
Через 150 часов культивирования достигается максимальное накопление в культуральной жидкости специфической липазной активности - 150 ед. акт./мг биомассы (по сухому весу). Недостатком известного штамма является длительность культивирования (6 - 7 суток), сложность питательной среды и трудоемкость процедуры получения культуральной жидкости (освобождение от грибного мицелия).
Использование бактерий - продуцентов липаз обладает сравнению с грибами преимуществом, заключающимся в ускорении процесса культивирования. Это может сделать экономически более выгодным технологический процесс получения липазы. Среди бактерий липазная активность обнаружена у штаммов родов Pseudomonas, Achromobacter, Serratia [5 - 7].
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Serratia marcescens 345 [5], который выращивают при температуре 30oC на питательной среде (pH 7,0), содержащей г/л:
MgSO4•7H2O - 0,1
KH2PO4 - 0,2
Мочевина - 0,1
Отвар соевой муки - 50,0
Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед. акт./мг биомассы по сухому весу). Недостаком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента и высокая длительность культивирования.
MgSO4•7H2O - 0,1
KH2PO4 - 0,2
Мочевина - 0,1
Отвар соевой муки - 50,0
Через 24 часа в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 95 ед. акт./мг биомассы по сухому весу). Недостаком данного штамма является низкая специфическая активность продуцируемого фермента и высокая длительность культивирования.
Технической задачей изобретения является получение нового бактериального штамма, обеспечивающего высокий выход липазы при менее длительном процессе культивирования.
Поставленная цель достигается выявлением и использованием штамма Serratia marcescens B-10 L-1 - продуцента липазы.
Предлагаемый штамм получен из исходного музейного штамма Serratia marcescens B-10 [8] как спонтанный вариант. Он отличается изменением размером колоний на питательном агаре - через 24 часа образует колонии диаметром 1,5 - 2,0 мм бледно-розового цвета. Исходный штамм при росте в этих же условиях дает колонии диаметром 3,5 - 4,0 мм.
Полученный штамм Serratia marcescens B-10 L-1 депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" (пос. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационном номером В-687.
Штамм Serratia marcescens B-10 L-1 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки: клетки палочковидные, прямые, короткие, размером 0,8-3,0х0,6-0,8 мкм, подвижные, одиночные, парные или в цепочках.
Окраска по Граму: отрицательна.
На агаризованных питательных средах через 24 часа роста штамм образует округлые светлорозовые колонии с гладкими краями, диаметром 1,5 - 2,0 мм. Профиль колоний выпуклый.
Физиологические и биохимические признаки: штамм является прототрофом, не требователен к факторам роста, оптимальная температура роста 28-30oC, pH среды 6,0-8,0.
Отношение к углеродам: ферментирует до кислотообразования глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит. Желатину разжижает, крахмал гидролизует, клетчатку не разжижает.
Для культивирования Ser.marc. B-10 L-1 с целью получения липазы применяют питательную среду (pH 7,0) следующего состава, г/л:
MgSO4•7H2O - 0,25
KH2PO4 - 3,0
Na2HPO4•2H2O - 7,0
NHCl4 - 1,0
CaCl2•2H2O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при 28-30oC. Через 10 часов культивирования в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 800 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу).
MgSO4•7H2O - 0,25
KH2PO4 - 3,0
Na2HPO4•2H2O - 7,0
NHCl4 - 1,0
CaCl2•2H2O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Культивирование проводят на качалках со встряхиванием при 28-30oC. Через 10 часов культивирования в культуральной жидкости накапливается максимальное количество липазы со специфической активностью 800 ед.акт./мг биомассы (по сухому весу).
Количество накапливаемой биомассы штамма B-10 L-1 определяют путем подсчета числа жизнеспособных клеток в культуральной жидкости. Для этого определяют титр бактерий в 1 мл культуральной жидкости и пересчитывают его в мг биомассы (по сухому весу), исходя из того, что 109 клеток бактерий весит 0,28 мг [9].
Активность липазы определяют следующим образом. К реакционной смеси, содержащей 4,5 мл 0,05 М фосфатного буфера (pH 8,0) и 5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте приливают 0,5 мл супернатанта культуральной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37oC, после чего добавляют 10 мл смеси этанол:ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1%-ного тимолфталеина, до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но липазу вносят непосредственно перед титрованием. Специфическую активность липазы выражают в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости, в пересчете на количество биомассы, содержащейся в 1 мл культуральной жидкости. Расчет специфической липазной активности (ЛА), в ед.акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле
где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование тест-пробы, мл;
Vk - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование контрольной пробы мл;
K - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (K= 50), мкмоль;
t - время реакции, час;
VE - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;
C - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.
где V - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование тест-пробы, мл;
Vk - количество 0,05 М NaOH, израсходованной на титрование контрольной пробы мл;
K - количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaOH (K= 50), мкмоль;
t - время реакции, час;
VE - объем культуральной жидкости, добавляемой к реакционной смеси, мл;
C - концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.
В таблице представлена зависимость специфической липазной активности от продолжительности выращивания на питательной среде с 5%-ным соевым отваром заявляемого штамма Ser.marc. B-10 L-1 в сравнении с штаммом Ser.marc. 345. Данные по активности штамма Ser.marc. 345 взяты из прототипа [5].
Из таблицы видно, что предлагаемый в качестве продуцента липазы штамм Ser.marc. B-10 L-1, превосходит известный продуцент липазы по уровню специфической липазной активности. Дополнительным преимуществом предлагаемого штамма является сокращение продолжительности выращивания до 10 часов. При этом достигается липазная активность 800 ед.акт./мг, тогда как штамм 345 обеспечивает накопление максимальной липазной активности 95 ед.акт./мг только через 25 часов ращения.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для выделения липазы, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".
Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Культивирование штамма Serratia Marcescens B-10 L-1 проводят на питательной среде (pH 7,0), содержащей, г/л:
MgSO4•7H2O - 0,25
KH2PO4 - 3,0
Na2HPO4•2H2O - 7,0
NHCl4 - 1,0
CaCl2•2H2O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Выращивание проводят со встряхиванием на качалке при температуре 30oC в течение 10 часов. Определяют содержание биомассы, в мг/мл (в сухом весе). После этого отделяют клетки и нерастворимые компоненты центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Культуральную жидкость собирают. Специфическая липазная активность составляет 800 ед.акт./мг.
MgSO4•7H2O - 0,25
KH2PO4 - 3,0
Na2HPO4•2H2O - 7,0
NHCl4 - 1,0
CaCl2•2H2O - 0,02
NaCl - 0,5
Отвар соевой муки - 50,0
Выращивание проводят со встряхиванием на качалке при температуре 30oC в течение 10 часов. Определяют содержание биомассы, в мг/мл (в сухом весе). После этого отделяют клетки и нерастворимые компоненты центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. Культуральную жидкость собирают. Специфическая липазная активность составляет 800 ед.акт./мг.
Таким образом получен штамм, обладающий следующими преимуществами по сравнению с известным штаммом:
- значительно более высокая продуктивность штамма (в 10 раз);
- меньшая продолжительность культивирования (в 2,5 раза).
- значительно более высокая продуктивность штамма (в 10 раз);
- меньшая продолжительность культивирования (в 2,5 раза).
Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов - продуцентов липазы.
Источники информации
1. P.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum//Enzyme and Microbial Technology. 1995. - V. 17. - 832 - 838.
1. P.Rapp. Production, regulation and some properties of lipase activity from Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum//Enzyme and Microbial Technology. 1995. - V. 17. - 832 - 838.
2. Заявка ПНР N 265870 МКИ 4 C 12 N. Способ получения нерастворимых препаратов липазы и эстеразы Mucor racemosus A 37//Опубл. 26.05.88.
3. Заявка Японии N 4-30833 МКИ 5 C 12 N 1/14; 9/12. Способ получения микробной биомассы с высокой липазной активностью //Опубл. 22.05.92.
4. Заявка PCT (WO) N 94/01542 МКИ 5 C 12 N 9/12. Способ очистки двух изоферментных липаз Candida rugosa//Опубл. 02.07.93.
5. Н. А. Башкатова, Л.О. Северина. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens//Микробиология. - 1979.- Т. 68, Вып. 5. - С. 826. - прототип.
6. Международная заявка N 91/00910 МКИ 5 C 12 N 15/55. Мутантные липазы-продуцируемые Pseudomonas//Опубл. 24.01.91.
7. Заявка ЕПВ (WO) N 0528828 МКИ 5 C 12 N 9/20. Щелочные липазы Bacillus, кодирующие их последовательности ДНК и продуцирующие эти липазы бациллы//Опубл. 03.03.93.
8. Каталог культур микроорганизмов. Всероссийская коллекция культур микроорганизмов. Пущино-Москва. 1992. - С.69.
9. Д. Мецлер. Биохимия, т. 1. М.: Мир, 1980, с. 141, 157.
Claims (1)
- Штамм бактерий Serratia marcescens НИИ ККМ В-687-продуцент липазы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU97104288A RU2148645C1 (ru) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU97104288A RU2148645C1 (ru) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97104288A RU97104288A (ru) | 1999-03-20 |
RU2148645C1 true RU2148645C1 (ru) | 2000-05-10 |
Family
ID=20190963
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97104288A RU2148645C1 (ru) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2148645C1 (ru) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392227B (zh) * | 2008-10-23 | 2011-06-01 | 新疆大学 | 一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素 |
RU2500812C1 (ru) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент термостабильной липазы |
CN104278004A (zh) * | 2013-07-12 | 2015-01-14 | 丰益国际有限公司 | 表达脂肪酶的埃希氏菌f6,f6脂肪酶及其生产和应用 |
RU2549681C1 (ru) * | 2014-07-25 | 2015-04-27 | Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт кондитерской промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИКП Россельхозакадемии) | Способ получения питательной среды для определения в кондитерских изделиях микроорганизмов, вырабатывающих липазы |
RU2566561C1 (ru) * | 2014-07-25 | 2015-10-27 | Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт кондитерской промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИКП Россельхозакадемии) | Способ определения в кондитерских изделиях микроорганизмов, вырабатывающих липазы |
RU2575804C1 (ru) * | 2014-09-24 | 2016-02-20 | Людмила Афанасьевна Иванова | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Candida parapsilosis - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ |
CN105524896A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-27 | 苏州开元民生科技股份有限公司 | 粘质沙雷氏菌脂肪酶发酵产酶及其提高酶活的方法 |
-
1997
- 1997-03-12 RU RU97104288A patent/RU2148645C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Башкатова Н.А., Северина Л.О. Влияние условий культивирования на биосинтез липазы у Serratia marcescens, Микробиология, 1979, т. 68, вып. 5, с. 826. * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392227B (zh) * | 2008-10-23 | 2011-06-01 | 新疆大学 | 一种粘质沙雷氏菌及生产的灵菌红素 |
RU2500812C1 (ru) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент термостабильной липазы |
CN104278004A (zh) * | 2013-07-12 | 2015-01-14 | 丰益国际有限公司 | 表达脂肪酶的埃希氏菌f6,f6脂肪酶及其生产和应用 |
RU2549681C1 (ru) * | 2014-07-25 | 2015-04-27 | Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт кондитерской промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИКП Россельхозакадемии) | Способ получения питательной среды для определения в кондитерских изделиях микроорганизмов, вырабатывающих липазы |
RU2566561C1 (ru) * | 2014-07-25 | 2015-10-27 | Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт кондитерской промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИКП Россельхозакадемии) | Способ определения в кондитерских изделиях микроорганизмов, вырабатывающих липазы |
RU2575804C1 (ru) * | 2014-09-24 | 2016-02-20 | Людмила Афанасьевна Иванова | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Candida parapsilosis - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ |
CN105524896A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-04-27 | 苏州开元民生科技股份有限公司 | 粘质沙雷氏菌脂肪酶发酵产酶及其提高酶活的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gaoa et al. | Production, properties and application to nonaqueous enzymatic catalysis of lipase from a newly isolated Pseudomonas strain | |
Pera et al. | Catalytic properties of lipase extracts from Aspergillus niger. | |
Mitsuda et al. | Preparation of an optically pure secondary alcohol of synthetic pyrethroids using microbial lipases | |
RU2148645C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы | |
Fadıloğlu et al. | Lipase production by Rhizopus oryzae growing on different carbon and nitrogen sources | |
US5063160A (en) | Identification, characterization, and method of production of a novel microbial lipase | |
JPS60244295A (ja) | (十)‐トランス‐シクロプロパンカルボン酸の製造方法 | |
FR2487375A1 (fr) | Procede de production de l'enzyme cholesterase et d'hydrolyse des esters de cholesterol d'acides gras en utilisant l'enzyme elle-meme | |
US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
Bapiraju et al. | Sequential parametric optimization of lipase production by a mutant strain Rhizopus sp. BTNT‐2 | |
RU2397247C1 (ru) | Способ биосинтеза липазы | |
Molinari et al. | Microbial catalyzed esterification of primary and secondary alcohols in organic solvent | |
US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
RU2310685C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров | |
RU2308485C1 (ru) | Штамм бактерий serratia species - продуцент липазы | |
Rasheva et al. | Taxonomic investigation of Monascus purpureus 94-25 strain | |
CN116083307B (zh) | 一种生产酯酶和酯类化合物的格氏乳球菌及其应用 | |
JP3514799B2 (ja) | リパーゼ及びこれを産生する微生物 | |
Dart et al. | Enantioselective hydrolysis of racemic methyl jasmonate using microorganisms and isolated enzymes | |
JP2964163B2 (ja) | R(―)―1,3―ブタンジオールの製造法 | |
JPH11253157A (ja) | 新規リパーゼ生産能をもつ細菌、リパーゼ、その製造方法、およびその使用 | |
KR100260837B1 (ko) | 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법 | |
CA2209527A1 (fr) | Procede de preparation de k-carraghenase | |
KR100328111B1 (ko) | 데카르바밀라제의 제조방법 | |
SU1650697A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I |