CN110859836B - 灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用，涉及生物医药领域。本发明通过生物工程技术制得灵菌红素，并使用显微镜观察细胞形态变化，cck‑8法测定细胞活性变化，观察灵菌红素对淋巴管肌瘤病细胞Tsc2null增殖的抑制作用，发现，24h之内，灵菌红素对Tsc2null的抑制效果明显高于Tsc2wt，2h之内，Tsc2null的细胞活性均和灵菌红素的浓度呈反比，灵菌红素浓度越高，细胞活性越低，灵菌红素对淋巴管肌瘤病细胞的增殖具有显著的抑制作用，可见，灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞的增殖抑制剂或抗淋巴管肌瘤病细胞的增殖药物中即将具有广泛的应用。

Description

灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用。
背景技术
淋巴管肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis,LAM)是一种以弥漫性肺部囊性病变为主的罕见疾病，主要发生在育龄期女性，病理以平滑肌样细胞异常增殖浸润为主要特征。LAM临床表现多样，除了肺内特征性囊性病变之外，亦可累及肾脏、淋巴管及淋巴结、脾脏、肝脏等诸多脏器。研究显示LAM源于患者体内TSC1/TSC2基因突变，其中又以TSC2突变更为常见。TSC为肿瘤抑制基因，TSC-LAM患者先天带有一个位点TSC基因的突变，出生后再次获得第二个位点TSC基因突变而发病。2个等位TSC(特别是TSC2)基因全部失活后，失去抑制作用，进而下游mTOR通路异常激活，刺激LAM细胞异常生长、增殖以及迁移、转移，造成肺内及肺外器官系统的结构破坏和功能障碍。
灵菌红素(Prodigiosin)是一类发现于多种细菌、放线菌的红色抗生素，其骨架特征是含有一个三吡咯环的大共轭体系，具有抗癌、抗真菌、抗细菌、抗原虫以及免疫抑制等多种活性。近年来灵菌红素的抗肿瘤活性尤其受到人们的关注，美国国立癌症研究所(NSI)Melvin等人发现灵菌红素在平均IC50为2.1μmol/L时对57种不同的人癌细胞有抗性作用，同时还发现能诱导细胞的凋亡。目前，灵菌红素对LAM病细胞Tsc2null的增殖的抑制作用尚未研究。
发明内容
针对技术的不足，本发明的目的是提供灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用，灵菌红素对LAM病细胞Tsc2null的增殖的抑制效果显著。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞增殖抑制剂中的应用。
进一步的，淋巴管肌瘤病细胞为Tsc2null细胞。
进一步的，抑制剂中灵红菌素的浓度为0.01-100μmol/L。
灵菌红素在制备抑制淋巴管肌瘤病细胞增殖的药物中的应用。
进一步的，灵菌红素的制备方法为：将粘质沙雷氏菌培养液离心，分离上清液和沉淀；下层沉淀用甲醇浸提，离心分离获得红色素；利用旋转蒸发仪旋蒸，得到深紫红色素甲醇溶液，经C18反相半制备HPLC复纯化，最终得色素溶于无水乙醇，真空低温高速冻干。
有益效果：本发明通过生物工程技术制得灵菌红素，并使用显微镜观察细胞形态变化，cck-8法测定细胞活性变化，观察灵菌红素对LAM病细胞Tsc2null增殖的抑制作用，发现：24h之内，灵菌红素对Tsc2null的抑制效果明显高于Tsc2wt，2h之内，Tsc2null的细胞活性均和灵菌红素的浓度呈反比，灵菌红素浓度越高，细胞活性越低，对淋巴管肌瘤病细胞的增殖具有显著的抑制作用，可见，灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病细胞的增殖抑制剂或抗淋巴管肌瘤病细胞的增殖药物中即将具有广泛的应用。
附图说明
图1是24h不同浓度的灵菌红素对Tsc2null细胞的抑制效果图；
图2是48h不同浓度的灵菌红素对Tsc2null细胞的抑制效果图；
图3是72h不同浓度的灵菌红素对Tsc2null细胞的抑制效果图；
图4是24h不同浓度的灵菌红素对Tsc2wt细胞的抑制效果图；
图5是48h不同浓度的灵菌红素对Tsc2wt细胞的抑制效果图；
图6是72h不同浓度的灵菌红素对Tsc2wt细胞的抑制效果图；
图7是CCK-8法测定经过不同处理后的Tsc2null细胞的吸光值图；
图8是CCK-8法测定经过不同处理后的Tsc2wt细胞的吸光值图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
1)灵菌红素的分离纯化和制备
从甘油保存管中挑取一环黏质沙雷氏菌(S.marcescens)NJZT-1，使用平板划线法将其涂布于LB固体培养基上进行活化，26℃恒温箱中培养3天。挑取活化的粘质沙雷氏菌单菌落转接至另一块固体培养基上，26℃恒温箱中培养3天。2-3次重复转接，得纯培养物。从固体培养基上挑取一环培养物，接种于液体培养基中，26℃、180r/min振荡培养3天。将培养液离心，分离上清液和沉淀；下层沉淀中用甲醇浸提，9000r/min离心10min，分离获得红色素。利用旋转蒸发仪旋蒸，得到深紫红色素甲醇溶液。后经C18反相半制备HPLC复纯化，最终得色素溶于无水乙醇，真空低温高速冻干，避光-20℃储存。
2)细胞培养
Tsc2 null(突变型)/Tsc2 WildType(野生型)细胞在DMEM基础培养基(10％FBS、1％青霉素-链霉素双抗)进行培养(DMEM培养基、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司)，用0.25％的胰蛋白酶消化传代，细胞的培养条件为5％CO2培养箱(SANYO)，37℃培养。
3)CCK-8法细胞毒性分析
将在对数生长期的细胞接种于96孔培养板，每孔100μL的细胞悬液，置于5％CO2培养箱，37℃培养24h。分别加入0.01-100μmol/L不同浓度的灵菌红素处理，每组浓度平行6孔，两组对照组分别加入等量的无水乙醇和DMEM基础培养基，培养72h后每孔加入10μLCCK-8试剂(CCK-8试剂盒购自南京建成生物工程研究所)，培养箱孵育1h，以450nm波长处测定吸光度。
如图1-6所示，分别于24h，48h，72h使用倒置相差显微镜(Leica公司)观察不同浓度的灵菌红素对Tsc2null细胞和Tsc2wt细胞的抑制效果。随着灵菌红素浓度的升高，对Tsc2null细胞和Tsc2wt细胞的抑制效果也升高。同时，灵菌红素的溶剂无水乙醇对Tsc2null细胞和Tsc2wt细胞也有一定的抑制作用。
CCK-8法测定经过不同处理后的Tsc2null细胞的吸光值，如图7所示：24h后，各处理均对Tsc2null细胞产生不同程度的抑制，DMSO作为灵菌红素的备选溶剂，其对Tsc2null细胞的抑制效果强于无水乙醇；48h后，不同浓度的灵菌红素对Tsc2null细胞的抑制效果达到一半以上；72h后，灵菌红素对Tsc2null细胞的抑制效果趋于平稳。
CCK-8法测定经过不同处理后的Tsc2wt细胞的吸光值，如图8所示：24h后，各处理对Tsc2wt细胞没有产生明显的抑制，DMSO作为灵菌红素的备选溶剂对Tsc2wt细胞的抑制效果强于无水乙醇；48h后，不同浓度的灵菌红素对Tsc2wt细胞的抑制效果达到一半以上；72h后，灵菌红素对Tsc2wt细胞的抑制效果仍有上升。
综上所述，24h之内，灵菌红素对Tsc2null的抑制效果明显高于Tsc2wt。以1μmol/L为例，灵菌红素对Tsc2null的抑制效果是Tsc2wt细胞的2.1倍。24h之后，灵菌红素对两种细胞均有不同程度的抑制，抑制效果明显，两种细胞之间的差异较小。72h之内，Tsc2null和Tsc2wt细胞活性均和灵菌红素的浓度呈反比，灵菌红素浓度越高，细胞活性越低。从显微镜下观察细胞形态可以发现，灵菌红素浓度越高，贴壁的细胞越少，细胞变圆死亡数量增加。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.灵菌红素在制备淋巴管肌瘤病Tsc2null细胞增殖抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂中，灵红菌素的浓度为0.01-100μmol/L。
3.灵菌红素在制备抑制淋巴管肌瘤病Tsc2null细胞增殖的药物中的应用。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述灵菌红素的制备方法为：将粘质沙雷氏菌培养液离心，分离上清液和沉淀；下层沉淀用甲醇浸提，离心分离获得红色素；利用旋转蒸发仪旋蒸，得到深紫红色素甲醇溶液，经C18反相半制备HPLC复纯化，最终得色素溶于无水乙醇，真空低温高速冻干，制得灵菌红素纯品。
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