CN106982839A - 微生物代谢产物灵菌红素的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微生物代谢产物灵菌红素在毒杀松材线虫中的应用。与现有技术相比，本发明的灵菌红素的新用途，采用不同的溶剂溶解红色素，通过观察灵菌红素在不同溶剂、不同浓度下对松材线虫的毒杀效果，证实粘质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素具有很好的毒杀松材线虫效率，为线虫的生物防治提供了可选择的新的方式。为更好地开发粘质沙雷氏菌的代谢产物灵菌红素的生物活性打下了基础。

Description

微生物代谢产物灵菌红素的新用途

技术领域

本发明属于微生物次级代谢产物应用技术领域，具体涉及灵菌红素的新用途。

背景技术

松树萎蔫病又称松材线虫病，是由松材线虫( Bursaphelenchus xylophilus)引起的松属( Pinus) 树种毁灭性死亡的一种病害。目前，该病在中国、日本、韩国和葡萄牙等国家发生流行，造成大量松树死亡，给国民经济和生态环境造成了严重损害。由于该病的为害特点是病原线虫致病力强，松树寄主死亡速度快，且病害传播蔓延快，因此，防控松材线虫病的难度较大。Matsuura 试验表明，采用丰索磷（fensulfothion）、治线磷（thionazin）、嘧啶－酒石酸（morantel－tartrate）、mesulfenos、carbosulfan、cyanophos、ethiodathion、dioxazenzofos和fenthion等药剂进行树干注射防治松材线虫病有一定的效果。但化学防治存在对环境污染严重、成本高、持效性差等问题，因而利用生物措施防治松材线虫病正日益受到重视。

目前国内外对松材线虫生物防治的主要途径之一是利用食线虫真菌抗生素和植物性杀线虫活性物质来实现。在松材线虫的生物防治中发现较多的为产毒真菌，孙建华等（1994）从99株土壤真菌中发现总状共头酶( Syncephalastrum racemosum)有极强的抗松材线虫活性，其活性成分为该菌的代谢产物，是一种水溶性的中性物质。该菌与松材线虫共培养48h后松材线虫全部死亡。用该菌株(Sr18)的代谢物作用于松材线虫，线虫存活率极低，其代谢产物表现了极强的杀线活性。董锦艳等（2000）报道日本亮耳菌( Lampteromyces japonicus) 对松材线虫有活性，互作8h后其对松材线虫的毒杀效果可达66.6%。宋普球等（2000）研究发现，采自成都郊区土壤的一株链霉菌的代谢物核苷N9705具有广谱抗菌杀虫作用及抗肿瘤、抗病毒活性。松材线虫在核苷N9705培养基上4h内的死亡率达到100%，表现了其对松材线虫的良好活性。近期李国红等报道，一种杀线虫担子菌YL14在12h内对松材线虫的毒杀率达到90%以上。

有关细菌代谢产物杀线活性的报道较少，张立钦等（2011）从土壤中筛选出了4株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），其伴孢晶体对松材线虫具有毒杀作用。日本有学者发现粘质沙雷氏菌（Serrtiama crocescens）对松材线虫的传播媒介松墨天牛(Monochamus alternatus )有寄生致死作用，对有效防控松材线虫具有一定的效果。

灵菌红素是粘质沙雷氏菌（S. marcescens）的红色代谢产物，是一类具有多吡咯环的天然红色素的总称，其分子结构通常都有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构。不同的灵菌红素的化合物具有不同的生物学活性。根据烷基侧链的结构特点可以分为prodigiosin（PG）、undecylprodigiosin（UP）、cylononyl-prodiginine（CPrG）和metacycloprodigiosin（MP）等。一般情况下，PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，灵菌红素具有抗肿瘤、免疫抑制、抗菌性、抗疟疾性等多种生物学活性，但到目前为止，还未见有关于微生物代谢产物灵菌红素杀线虫的报导。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种微生物代谢产物灵菌红素的新用途，具有较好的杀线功能，为线虫的防治提供了新的可选择的方式，满足杀松材线虫的使用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

微生物代谢产物灵菌红素在杀松材线虫中的应用。

所述的应用，所述的灵菌红素制备成溶液后直接使用。

所述的应用，所述的溶液为灵菌红素水溶液、灵菌红素乙醇溶液、灵菌红素二甲亚砜溶液。

含有灵菌红素的粘质沙雷氏菌（S. marcescens）发酵液在毒杀松材线虫中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的微生物代谢产物灵菌红素的新用途，采用不同的溶剂溶解红色素，通过观察灵菌红素在不同溶剂、不同浓度下对线虫的抑制效果，证实灵菌红素具有很好的杀松材线虫效率，为线虫的防治提供了新的可选择的方式。为更好地开发灵菌红素的生物活性打下了基础。

附图说明

图1是灵菌红素溶液图；其中，A是灵菌红素LB溶液，B是灵菌红素乙醇溶液，C是灵菌红素结晶，D是灵菌红素二甲基亚砜溶液，E是灵菌红素水溶液；

图2是松材线虫图；其中，A是成活状态，B是死亡状态；

图3是灵菌红素乙醇溶液和无水乙醇对松材线虫死亡率的影响结果图；

图4是不同量的DMSO对松材线虫死亡率的影响结果图；

图5是灵菌红素二甲基亚砜溶液（30μL）对松材线虫死亡率的影响结果图；

图6灵菌红素LB溶液和LB液体培养基对松材线虫死亡率的影响结果图；

图7是灵菌红素水溶液（30μL）对松材线虫死亡率的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中使用的材料具体如下：

菌种：黏质沙雷氏菌（S. marcescens）NJZT-1为文献[一株耐高温抑菌黏质沙雷氏菌的鉴定及其红色素的初步分离，赵银娟等，安徽农业科学，2013 41（7）:2829-2831]公开的菌株，该菌株保藏于南京林业大学森林病理实验室。

松材线虫：由南京林业大学森林保护系实验室提供。

实施例1

将黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）NJZT-1在LB固体培养基上活化，挑取固体培养基上活化的单菌落接种到种子培养基中28℃、200r/min 恒温培养24h，最后将种子培养基中的菌液按10%接种到LB液体培养基中，继续28℃、200r/min 恒温培养24h，获得黏质沙雷氏菌NJZT-1培养液。

将黏质沙雷氏菌NJZT-1培养液于9000rpm离心15min，取上清液，以此为灵菌红素LB溶液。

向离心剩余物中加入无水乙醇，反复振荡提取，静置10min，再9000rpm离心15min，取上清液，此为未处理过的灵菌红素乙醇溶液。

将未处理过的灵菌红素乙醇溶液装入蒸馏瓶中，旋转蒸发，收集蒸馏瓶灵菌红素乙醇溶液浓缩液，并用冷冻干燥仪冷冻干燥制得灵菌红素结晶。

取已制备的灵菌红素结晶0.01g，溶于1mL二甲基亚砜中得到浓度为10mg/mL的灵菌红素二甲基亚砜溶液。

取少量灵菌红素结晶于1.5mL离心管中，加入1mL无菌水，充分混合后离心，取上清液，即为灵菌红素水溶液。

密封后均用锡纸做遮光处理后放入4℃冰箱保存。

通过离心的方法，得到灵菌红素的LB溶液，如图1A所示；将离心后的菌体，用乙醇溶液震荡洗脱并再次离心后得到灵菌红素的乙醇溶液，如图1B所示；对图1B中收集的产物通过旋转蒸发仪浓缩，得到如图1C所示的晶体；溶解晶体于DMSO溶剂中，得到灵菌红素的DMSO溶液，如图1D所示；图1E中所示的为灵菌红素晶体部分溶于水中离心得到的上清液。

实施例2

将少量松材线虫均匀接种到长满灰葡萄孢菌丝的马铃薯蔗糖琼脂培养基上25℃恒温培养7-10天后，线虫基本食完菌丝。将玻璃漏斗（直径为10~15 cm）置漏斗架上，下面接一段（10cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个止水夹。用十字划线法将培养基从皿中挑出放在过滤纸上，一起放在漏斗中，加入无菌水，无菌水以浸没分离材料为度。8-12小时后，将一支干净的离心管放在橡皮管下方，缓缓打开止水夹，取10-15mL的水样。将取得的水样离心，弃上清液，加入无菌水，再次离心，反复三到四次，即得到较为纯净的线虫悬液。

将得到的松材线虫悬液充分混匀后取2mL于50mL离心管中，加入18mL无菌水，稀释得到浓度约为1500头/mL的松材线虫悬液，将线虫悬液充分混匀后，取500μL的线虫悬液于1.5mL离心管置于室温中备用。

每次取10µL线虫悬液，匀速推动移液枪在玻片上划线，再用显微镜（40X）观察计数线虫总数和成活虫数，从而可知存活率及死亡率。

在载玻片上滴上含有线虫的溶液后，在光学显微镜下检测虫量，可见具有生活力的松材线虫呈弯曲状，并可自由蠕动，如图2A所示；不具生活力的松材线虫呈僵直状，不可自由蠕动，如图2B所示。以此为标准计数虫量并得到松材线虫死亡率。

将实施例1制备的灵菌红素各样品与松材线虫悬液混匀，以相对应的二甲基亚砜、无水乙醇、LB液体培养基和无菌水作对照，并按时间段观察线虫的活动情况以及存活率，以确定灵菌红素对松材线虫的抑制效果。以下操作内容均重复4-5次。

向装有500μL的松材线虫悬液的1.5mL离心管中分别加入灵菌红素乙醇溶液和无水乙醇各30µL，用移液枪反复吹打充分混合。分时间段观察松材线虫活动情况及死亡率。结果发现，如图3所示，灵菌红素乙醇溶液和无水乙醇对松材线虫都有抑制效果，而灵菌红素乙醇溶液对松材线虫的抑制效果不比单独使用无水乙醇的效果好，这说明仅无水乙醇存在便会影响线虫的生长。

分别将10µL、20µL、30µL、40µL、50µL、100µL的二甲基亚砜（DMSO）加入装有500mL的松材线虫悬液的1.5mL离心管，并充分混合。分时间段观察松材线虫活动情况及死亡率。结果如图4所示，表明DMSO的量在30μL以上时，松材线虫有明显活力下降、行动变缓、死亡率升高的现象，即会对松材线虫的活性及成活率造成较大影响；而DMSO的使用量在30μL以内时，松材线虫死亡率在较低范围内波动。因此，一定范围内的DMSO是灵菌红素较为理想的溶剂。

而采用30µL 10mg/mL（终浓度为566μg/mL）灵菌红素二甲基亚砜溶液进行测试时得到如下结果。如图5所示，在6小时后对松材线虫已有明显的抑制效果，死亡率明显高于30µL二甲基亚砜对照。可见，一定量范围内的二甲基亚砜对松材线虫无明显的抑制作用，而灵菌红素的存在是抑制松材线虫活性的主要原因。

向装有500mL的松材线虫悬液的1.5mL离心管中分别加入灵菌红素LB溶液和LB液体培养基各30µL，并充分混合。分时间段观察松材线虫活动情况及死亡率。结果如图6所示，6小时后，不论是加入LB液体培养基还是灵菌红素LB溶液的线虫悬液，死亡率都显著升高，因此直接使用LB作为溶剂不能很好的表现出灵菌红素的活力。

由于松材线虫在无菌水中冷藏保存，无菌水对松材线虫完全不造成抑制，而灵菌红素与无菌水的混合悬液离心后的上清液也呈红色，因此有少量灵菌红素或新颖骨架结构的灵菌红素是能够溶于水中的。以水相的灵菌红素对松材线虫进行了生物活性测试。结果如图7所示，20小时范围内30μL灵菌红素水溶液对比无菌水对松材线虫有抑制效果，约18小时后，灵菌红素水溶液对松材线虫有明显的抑制作用，致死率达50%以上，而20小时后灵菌红素水溶液对松材线虫的致死率接近90%；而无菌水对照组的松材线虫的死亡率稳定在较低水平（20%以内）。因而在水相中的灵菌红素对松材线虫有较为明显的抑制作用。

Claims (4)

1.灵菌红素在毒杀松材线虫中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的灵菌红素制备成溶液后直接使用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的溶液为灵菌红素水溶液、灵菌红素乙醇溶液、灵菌红素二甲亚砜溶液。

4.含有灵菌红素的粘质沙雷氏菌发酵液在毒杀松材线虫中的应用。