CN111990404B - 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途 - Google Patents

灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111990404B
CN111990404B CN202010608056.0A CN202010608056A CN111990404B CN 111990404 B CN111990404 B CN 111990404B CN 202010608056 A CN202010608056 A CN 202010608056A CN 111990404 B CN111990404 B CN 111990404B
Authority
CN
China
Prior art keywords
prodigiosin
pvy
host
virus
hsp70
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010608056.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111990404A (zh
Inventor
杨金广
王凤龙
徐翔
李莹
宋丽云
申莉莉
雷强
冯长春
李斌
王勇
刘东阳
江连强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Tobacco Research Institute of CAAS
China National Tobacco Corp Sichuan Branch
Original Assignee
SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Tobacco Research Institute of CAAS
China National Tobacco Corp Sichuan Branch
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH, Tobacco Research Institute of CAAS, China National Tobacco Corp Sichuan Branch filed Critical SICHUAN TOBACCO Corp LIANGSHANZHOU BRANCH
Priority to CN202010608056.0A priority Critical patent/CN111990404B/zh
Priority to US16/948,646 priority patent/US11375718B2/en
Publication of CN111990404A publication Critical patent/CN111990404A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111990404B publication Critical patent/CN111990404B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • A01N43/36—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom five-membered rings

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于微生物次级代谢产物应用技术领域，具体涉及一种灵菌红素在抗马铃薯Y病毒中的新用途。所述灵菌红素在制备防控马铃薯Y病毒药物中的应用。防控马铃薯Y病毒药物为含有灵菌红素的液态或固态制剂。明确了PVY在侵染寄主过程中，通过招募宿主因子Hsp70来促进自身的复制侵染，实现病毒的侵染和传播，Hsp70对植物病毒的侵染复制具有重要作用。基于以上研究结果，进一步明确了灵菌红素处理可显著提升植物寄主的泛素化水平，促进寄主HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性，实现抗病毒特征。

Description

灵菌红素在抗马铃薯Y病毒的新用途
技术领域
本发明属于微生物次级代谢产物应用技术领域，具体涉及一种灵菌红素在抗马铃薯Y病毒PVY中的新用途。
背景技术
作为植物病毒最大的植物组，马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是严重危害茄科作物的一种病毒。
马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)寄主范围广，且广泛分布于世界各地，有逐年加重的趋势。被PVY侵染的植株的产量和质量均有所下降，造成巨大的经济损失。
PVY是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表种。Potyvirus作为最大的植物病毒属，约有200个确定种和暂定种，且已知的植物病毒中有超过30％的病毒属于Potyvirus，包括PVY、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，Tu MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、李痘病毒(Plum pox virus，PPV)等许多在农业上有重要意义的病毒。
PVY最早是在马铃薯上发现的，可侵染多种植物，特别是茄科植物，其次还有藜科和豆科植物。寄主范围的广泛为PVY的流行创造了有力的条件，使之成为危害烟草、马铃薯等作物的最普遍、最具破坏性的的病毒。感染PVY的植株往往会呈现出花叶、明脉、矮化、叶片变形、坏果等症状。据统计，PVY能使马铃薯减产高达90％。PVY能系统性侵染烟草，感染不同株系的PVY后，烟草会产生不同的症状，根据症状特点将其分为三种类型：花叶症、脉坏死症、点刻条斑症，对应着也将PVY划分为普通株系(PVY0)、脉坏死株系(PVYN)、点条斑株系(PVYC)。
灵菌红素类化合物(Prodigiosins，PGs)是含有灵菌红素(Prodigiosin，PG)三吡咯骨架的一类化合物，具有广泛的生物活性，如抗细菌、免疫抑制、抗肿瘤、抗病毒等。1978年Fullan N P等报道了PG体内抗肿瘤作用。此后PG及其衍生物在抗肿瘤研究方面的应用受到持续关注。代表性化合物包括UP、GX15－070、mcPG等。其中，GX15－070是目前唯一进入Ⅲ期临床试验的PGs，有望成为新型抗癌药物。但高剂量引起的神经毒性一定程度限制了其临床上的独立用药。此外，PGs在食品、医药等行业都有潜在的应用价值。
申请号201310323749.5，发明名称为《抗TMV的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途》，在该发明专利中公开了一种是专门针对TMV的灵菌红素制剂；该化合物不仅可以使TMV钝化，使TMV失去侵染活性，而且还可以诱导寄主产生系统抗性，缓解和减弱感染TMV的植株症状的表现和发生，对TMV的防效可以达到70％以上。但是现有文献还未报到过灵菌红素能够抗PVY病毒，且抗植物病毒机理不清楚。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种灵菌红素在抗马铃薯Y病毒PVY中的新用途。
本发明由如下技术方案实现的：一种灵菌红素在抗马铃薯Y病毒PVY中的新用途。
所述灵菌红素在制备防控马铃薯Y病毒PVY药物中的应用。
所述灵菌红素为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen)的次生代谢产物。
所述防控马铃薯Y病毒PVY药物为含有灵菌红素的液态或固态制剂。
优选：所述防控马铃薯Y病毒药物为含有灵菌红素的液态制剂，灵菌红素的浓度为0.05μg/L，按15L/亩均匀喷施于感染马铃薯Y病毒的植株叶面。
所述灵菌红素处理感染马铃薯Y病毒PVY的植株，促进寄主植株HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性。
本发明所述灵菌红素为申请号为201310323749.5、发明名称为《抗TMV的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途》中所获得的灵菌红素。
本发明通过以灵菌红素、PVY和烟草为主要研究材料，通过非标定量技术、高效液相色谱分级技术、泛素化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对烟草叶片中定量蛋白组及泛素化非标定量组学进行了研究，通过蛋白组及泛素化组联合分析发现Heat shock 70kDa protein在灵菌红素S3处理后蛋白水平显著下调，相反该蛋白的泛素化水平显著上调。暗示Hsp70的泛素化修饰在灵菌红素S3诱导抗性作用机制中扮演一个重要的角色。利用Western blot技术验证该组学数据的真实性，结果显示灵菌红素S3处理本氏烟后整体泛素化水平上升，同时寄主中Hsp70蛋白水平发生下降，这与组学分析结果一致，表明组学数据是可信的，并且灵菌红素S3处理植株抑制寄主体内Hsp70蛋白的表达。
通过qRT-PCR、Western blot等技术分析PVY侵染对Hsp70的影响，结果显示PVY侵染会引起寄主中Hsp70 mRNA及蛋白水平的上调。进一步利用病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、瞬时过表达等方法证明Hsp70对植物生长发育中具有重要作用，并且Hsp70在PVY侵染复制过程中具有重要的作用。
利用泛素化抑制剂MG-132抑制寄主体内的泛素化修饰，探究泛素化在灵菌红素抗病毒病的作用机制中的作用，结果显示灵菌红素诱导抗性是通过抑制Hsp70蛋白的表达来达到抗病毒效果。抑制宿主泛素化修饰水平则抑制Hsp70介导的灵菌红素抗病毒抗性，说明Hsp70的泛素化修饰可能在灵菌红素S3抗病毒抗性作用机制中起重要作用。
本发明明确了PVY在侵染寄主过程中，通过招募宿主因子Hsp70来促进自身的复制侵染，实现病毒的侵染和传播，Hsp70对植物病毒的侵染复制具有重要作用。基于以上研究结果，进一步明确了灵菌红素处理可显著提升植物寄主的泛素化水平，促进寄主HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性，实现抗病毒特征。
附图说明
图1为灵菌红素处理烟草对PVY和TMV侵染复制抑制反应实验图；图中：由左到右依次为PVY侵染烟草对照组、灵菌红素S3与PVY侵染烟草处理组、TMV侵染烟草对照组、灵菌红素S3与TMV侵染烟草处理组；
图2为灵菌红素S3对烟草寄主蛋白泛素化水平与HSP70蛋白表达量的调控作用；
图3为PVY侵染烟草对寄主HSP70蛋白表达变化的影响；
图4为沉默NbHsp70基因后沉默效率及植株表型，注：误差线表示三组生物学重复的正负标准差，每组生物学重复至少统计20株本氏烟。采用t-检验计算相对于阴性对照的差异显著性；**，p<0.01；
图5为绿色荧光蛋白GFP标记的PVY在NbHsc70-2沉默组和对照组中累积量比较，误差线表示三组生物学重复的正负标准差，每组生物学重复至少统计20株本氏烟。采用t-检验计算相对于阴性对照的差异显著性。**，p<0.01；
图6为沉默NbHsc70-2基因对PVY积累的影响；误差线表示三组生物学重复的正负标准差，每组生物学重复至少统计20株本氏烟。采用t-检验计算相对于阴性对照的差异显著性。***，p<0.001；
图7为过表达NbHsc70-2基因对PVY积累的影响，误差线表示三组生物学重复的正负标准差，每组生物学重复至少统计20株本氏烟。采用t-检验计算相对于阴性对照的差异显著性。**，p<0.01；
图8为灵菌红素S3处理烟株对寄主HSP70蛋白表达变化的影响；
图9为抑制寄主泛素化可显著降低灵菌红素S3对Hsp蛋白的泛素化水平。
具体实施方式
在前期的工作中从山西烟草根际土壤中分离得到一株对TMV及PVY具有诱导抗性的细菌，经16S rRNA及Biolog MicroPlate鉴定为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen)，通过分离、鉴定和病毒生物学测定，从黏质沙雷氏菌发酵液中分离了一种S3物质具有三吡咯环结构的次生代谢物质，该物质对寄主植物诱导抗性具有决定性作用。为进一步明确其作用机理，通过蛋白质组学及泛素化组学联合分析筛选出Hsp70蛋白，并推测该蛋白的泛素化修饰在灵菌红素S3抗病毒诱导抗性作用机制中可能起重要作用，本研究希望通过多种生物化学与分子生物学方法，进一步揭示宿主Hsp70蛋白的泛素化修饰在灵菌红素S3诱导抗性中的作用机理，主要研究结果如下：
(1)灵菌红素是一种细菌来源的三吡咯环类此生代谢物，具有天然免疫激活效果，通过浸润处理，对TMV及PVY的诱导抗性作用可达到100％。以灵菌红素、PVY和烟草为主要研究材料，通过非标定量技术、高效液相色谱分级技术、泛素化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对烟草叶片中定量蛋白组及泛素化非标定量组学进行了研究，通过蛋白组及泛素化组联合分析发现Heat shock 70kDaprotein在灵菌红素S3处理后蛋白水平显著下调，相反该蛋白的泛素化水平显著上调。暗示Hsp70的泛素化修饰在灵菌红素S3诱导抗性作用机制中扮演一个重要的角色。利用Westernblot技术验证该组学数据的真实性，结果显示灵菌红素S3处理本氏烟后整体泛素化水平上升，同时寄主中Hsp70蛋白水平发生下降，这与组学分析结果一致，表明组学数据是可信的，并且灵菌红素S3处理植株抑制寄主体内Hsp70蛋白的表达。
(2)通过qRT-PCR、Western blot等技术分析PVY侵染对Hsp70的影响，结果显示PVY侵染会引起寄主中Hsp70 mRNA及蛋白水平的上调。进一步利用病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、瞬时过表达等方法证明Hsp70对植物生长发育中具有重要作用，并且Hsp70在PVY侵染复制过程中具有重要的作用。
(3)利用泛素化抑制剂MG-132抑制寄主体内的泛素化修饰，探究泛素化在灵菌红素S3抗病毒病的作用机制中的作用，结果显示灵菌红素S3诱导抗性是通过抑制Hsp70蛋白的表达来达到抗病毒效果。抑制宿主泛素化修饰水平则抑制Hsp70介导的灵菌红素S3抗病毒抗性，说明Hsp70的泛素化修饰可能在灵菌红素S3抗病毒抗性作用机制中起重要作用。
根据上述结果得出结论：本研究明确了PVY在侵染寄主过程中，通过招募宿主因子Hsp70来促进自身的复制侵染，实现病毒的侵染和传播，Hsp70对植物病毒的侵染复制具有重要作用。基于以上研究结果，我们进一步明确了灵菌红素S3处理可显著提升植物寄主的泛素化水平，促进寄主HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性，实现抗病毒特征。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：灵菌红素诱导烟草转录组学和蛋白组学的分析
本实验所用植物材料为普通烟NC89(Nicotiana.tabacum cv.NC89)，由本实验室留种繁殖，培养于温室中。实验植物培养条件：光照16h，温度25±1℃，光照强度2000lux，相对湿度60％；黑暗时长8h，温度25±1℃，相对湿度60％。所用营养基质由山东省寿光市沃德营养土加工厂生产，植物生长期间无需额外施肥。TMV和PVY毒源为中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心保存，并于温室中栽培的普通烟草NC89上繁殖保存。灵菌红素S3系中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心自粘质沙雷氏菌发酵液中分离纯化获得。
实验结果：
1、灵菌红素的生物活性：如图1所示，0.05μg/L灵菌红素按照15L/亩均匀喷施烟草叶面48h后，分别接种TMV和PVY，接种后14d分别观察TMV和PVY的病毒生物学特征，结果表明灵菌红素能够诱导寄主产生系统抗性，抑制TMV和PVY在寄主内侵染复制，减弱其病毒特异性症状，提高了寄主的抗病能力；利用灵菌红素(0.05μg/L)处理烟草后，发现处理后植株对病毒的抵抗力显著增强，处理7d后接种TMV及PVY，植株的病毒病症状不明显，对照组则出现明显的花叶，叶片畸形。这表明灵菌红素S3处理提高植株对TMV及PVY病毒病的抗性。
实施例2：灵菌红素诱导烟草蛋白组学和泛素化组学分析：为进一步了解灵菌红素诱导植株获得系统性抗性的作用机制，以灵菌红素处理的本氏烟为目标材料，选取了灵菌红素防治PVY最佳反应时间点，通过非标定量技术、高效液相色谱分级技术、泛素化肽段的富集技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合，对烟草叶片中定量蛋白组及泛素化非标定量组学进行研究。
蛋白提取。将叶片样品从－80℃取出，至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末；加入粉末4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％TritonX-100，10mMDTT，1％蛋白酶抑制剂和50μM PR-619)，超声裂解；离心(4℃，20000g)10min，小心吸取取上清，加入终浓度为20％的三氯乙酸；4℃静置2h；离心(4℃，20000g)3min，弃上清。沉淀用预冷的丙酮洗涤三次；沉淀复溶(8M尿素)，测定蛋白浓度。
蛋白酶解。向蛋白溶液中加入DTT至终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺，室温避光孵育15min。以胰酶：蛋白＝1:50的质量比例加入胰酶，37℃酶解过夜。再以胰酶：蛋白＝1:100的质量比例加入胰酶，继续酶解4h。
HPLC分级。将酶解后的溶液用色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)进行高pH反向HPLC分级。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min分离60个组分，随后合并为4个组分，合并后的组分真空冷冻干燥后进行后续操作。
HPLC-MS分析。冷冻干燥后的组分用HPLC-MS分析：流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液；流动相B设置：0-42min，5％～25％B；42-52min，25％～38％B；52-56min，38％～80％B；56-60min，80％B；流速维持在350nL/min。
数据库搜索。二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索。将半胱氨酸烷基化设置为固定修饰，可变修饰为甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙酰化。数据分析。通过GO富集、KEGG pathway对差异基因和蛋白进行分析。
如图2所示，研究结果显示蛋白组中共鉴定到6122个蛋白，其中S3处理与对照比较组中有223个蛋白表达发生上调，186个蛋白表达发生下调(p<0.05)；而泛素化组中共鉴定到位于1110个蛋白上的2031个泛素化位点，其中S3处理与对照比较组中有33个位点的修饰水平发生上调，21个位点的修饰水平发生下调(p<0.05)。通过蛋白组及泛素化组联合分析发现Heat shock 70kDa protein在S3处理后蛋白水平显著下调，相反该蛋白的泛素化水平显著上调。
热激蛋白(HSP)是植物细胞内重要的分子伴侣，该蛋白在进化上高度保守，Hsp70在受环境因素胁迫时诱导表达，以应付外界恶劣环境条件的威胁；并广泛分布于原核及真核生物细胞中，是维持生命活动的重要功能蛋白，具有多项生物学功能：协助新生蛋白的折叠，参与细胞内蛋白质的转运，参与免疫复合物的行程和分解及降解冗余蛋白。多项研究显示，Hsp70蛋白家族在多种病毒复制中发挥重要作用，其中Hsp70蛋白是番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)复制复合体(Virus replication complex，VRC)的一种永久组成成分已通过蛋白质组学分析证明。因此我们怀疑在黏质沙雷氏菌S3诱导植株获得对病毒病的抗性过程中，Hsp70扮演了一个非常重要的角色，更深入猜想这种抗性的获得可能是由于S3处理植株后引起寄主Hsp70蛋白发生泛素化而导致的。
实施例3：灵菌红素处理对泛素化修饰及宿主因子Hsp70蛋白的影响：为了进一步确认灵菌红素处理植株后泛素化及Hsp70蛋白的表达水平的变化，我们利用Western blot技术从蛋白水平上检测灵菌红素S3处理本氏烟后Hsp70蛋白水平及整体泛素化水平的变化。
结果如图8所示，显示灵菌红素S3处理本氏烟后整体泛素化水平上升，其中灵菌红素S3处理组Ub泛素化蛋白；同时寄主中Hsp70蛋白水平发生下降。这与组学分析结果一致，表明组学数据是可信的，并且灵菌红素S3处理植株抑制寄主体内Hsp70蛋白的表达。灵菌红素处理烟草可显著提升寄主蛋白泛素化，灵菌红素S3处理烟株可显著降低Hsp70蛋白表达量。
实施例4：Hsp70蛋白在马铃薯Y病毒侵染过程中的作用
供试植物材料为本氏烟，本氏烟种子点播于混合土中(土壤：草炭＝1：1)，于25℃人工气候室中培养，光周期为14h光照/10h黑暗，相对湿度为70％，试验采用5—6叶期烟苗。PVY毒源为中国农业科学院烟草研究所保存的N株系。取1g PVY野生型毒源植株的叶片，放入提前灭菌消毒的研钵中，加入40mL PBS缓冲液，研磨成浆并用纱布过滤除去叶片残渣获得悬浮液以备用；浸润PVY病毒汁液于本氏烟烟苗(4周)的第3-4片真叶，每片叶200μL。PVY-GFP属于PVY坏死株系(PVYN)的侵染性克隆，是通过无义突变在PVY侵染性克隆的P1与HC-pro间插入一个SacⅡ限制性内切酶酶切位点，并在该酶切位点中插入表达了外源绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒，该病毒能系统侵染本氏烟，病毒扩增至植株非接种部位而呈现荧光。
激光共聚焦显微镜观察NbHsc70-2亚细胞定位。根据NbHsc70-2序列设计不含有终止密码子的带XbaI/KpnI酶切位点的特异性引物NbHsc70-2-XbaI F/KpnI R(表1)，并以本氏烟cDNA为模板进行PCR扩增，利用In-Fusion技术(TaKaRa)将产物与Fu46载体相连，构建NbHsc70-2::RFP融合基因，再利用LR同源重组技术(Invitrogen)将融合基因连接到pEarleyGate100载体，最终得到pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP载体；将含有pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP载体和pEarleyGate100::RFP载体的LBA4404农杆菌(OD600＝0.8)浸润本氏烟下表皮，培养于25℃人工气候室中，光周期为14h光照/10h黑暗，相对湿度为70％，72h后制片置于激光共聚焦显微镜(SP8，Leica)下观察明、暗视野下的表达情况。
NbHsc70-2瞬时过表达载体的构建。根据NbHsc70-2基因序列设计含有AhdI酶切位点的特异性引物NbHsc70-2-AhdI F/R(表1)，并以本氏烟cDNA为模板进行PCR扩增，利用In-Fusion技术(TaKaRa)将产物与GWC载体相连，构建GWC::NbHsc70-2入门载体，再利用LR同源重组原理(Invitrogen)将入门载体连接到pEarleyGate100载体，最终得到pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2表达载体；提前24h给本氏烟浸润PVY病汁液，将含有pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2表达载体和pEarleyGate100::GWC载体的LBA4404农杆菌(OD600＝0.8)浸润本氏烟下表皮，48h后开始采样检测PVY CP基因积累量。
qRT-PCR与统计分析。根据不同样品中特定基因的基因序列设计各基因的荧光定量检测引物(表1)，同时设置Actin作为内参。分别提取各取样时间点的处理组及对照组材料的总RNA(TaKaRa)，反转录成cDNA(Vazyme)。以cDNA为模板，按照ChamQTM Universal
Figure BDA0002559868150000091
qPCR Master Mix(Vazyme)试剂盒说明书进行操作，在Applied Biosystems7500real-time PCR机型上进行扩增。反应体系：10μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix，0.4μL Primer1(10μmol·L-1)，0.4μL Primer2(10μmol·L-1)，2μL cDNA，补蒸馏水至总体积20μL。反应程序：95℃30s；95℃5s；60℃30s；40循环；95℃15s；60℃1min，95℃15s。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算[17-18]，使用7500Software v2.3进行数据统计分析并使用GraphPad Prism6.0绘图。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
结果与分析：
1、PVY侵染引起Hsp70 mRNA及蛋白水平的上调
为了研究宿主Hsp70是否受PVY侵染的影响，我们利用实验室保存的PVY N株系毒源摩擦接种本氏烟，收集PVY侵染1d、3d、5d、7d的接种叶，进行qRT-PCR分析。实验结果如图3所示，显示，PVY侵染本氏烟3d后Hsp70 mRNA水平急剧增加，5d，7d较3d已有下降，但始终比对照组高。表明PVY侵染能引起寄主体内Hsp70 mRNA水平的升高。
选取PVY侵染本氏烟3d时的样品，进一步利用Western blot技术从蛋白水平分析PVY侵染后对Hsp70蛋白的影响。实验结果显示PVY处理本氏烟3d后Hsp70蛋白水平上调。与RNA水平的检测结果一致。综上结果表明，PVY侵染会引起寄主中Hsp70 mRNA及蛋白水平的上调。PVY病毒侵染寄主可显著提升HSP70的表达量
实施例5：沉默NbHsp70对PVY复制的影响：为了进一步研究Hsp70蛋白在PVY侵染本氏烟中的功能，我们利用病毒诱导的基因沉默技术构建VIGS沉默体系下调本氏烟中NbHsp70基因的含量，分析寄主中NbHsp70基因的含量降低后对PVY侵染本氏烟的影响。农杆菌浸润本氏烟草7d后，沉默效率为67.50±0.29％(n＝30)(图4)。从图4可以看出沉默NbHsp70导致植株皱缩及矮化，暗示Hsp70蛋白可能参与调节植株生长发育。
植物材料与激光共聚焦显微镜观察同实施例4。NbHsc70-2沉默载体的构建。根据NbHsc70-2基因序列，用Premier 5.0设计一对含有限制性核酸内切酶EcoRI、KpnI的特异性引物RNAi NbHsc70-2 F/R(表1)，PCR扩增大小为350bp目的沉默片段，利用In-Fusion技术(TaKaRa)将产物与pTRV2载体相连，构建pTRV::NbHsc70-2重组载体；将含有pTRV::NbHsc70-2载体、pTRV::PDS及pTRV00空载体的LBA4404农杆菌(OD600＝0.8)浸润本氏烟下表皮，7d后检测沉默效率，进行后续试验。
TRV浸润寄主植株7d后，将病毒PVY-GFP接种于TRV浸润叶的上面第3片叶，接种7d后，在手提式紫外灯下观察本氏烟中的绿色荧光情况；在TRV对照组中PVY-GFP系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象，而NbHsp70沉默组中无明显绿色荧光出现(图5)，荧光点数约是对照组的0.28倍。这表明，宿主植物中NbHsp70的mRNA含量降低，导致PVY-GFP系统性侵染受到抑制。
为了进一步明确下调NbHsp70基因表达后抑制PVY侵染本氏烟，浸润接种pTRV：：NbHsp70 7d后接种野生型病毒PVYN，从RNA和蛋白水平检测病毒的相对累积量。
从图5可以看出沉默组与对照组的PVY CP基因表达量都呈现上升趋势，但沉默组的上升趋势较对照组慢；在沉默组上接种PVY后1d，CP基因表达量较对照组已有下降；3d沉默组中的表达量是对照组的0.14倍；5d沉默组中的表达量是对照组的0.00004倍。这表明，沉默NbHsp70基因后，显著延缓植株内PVY CP基因的mRNA积累。
进一步利用Western blot技术从蛋白水平分析沉默组与对照组叶片中病毒CP蛋白积累量，从图5可以看出沉默组经PVY处理1d、3d、5d后CP蛋白灰度值分别为55.90、66.912、68.186；对照组的CP蛋白灰度值分别为120.24、156.22、174.35。沉默组中的CP蛋白含量明显少于对照，与RNA水平的检测结果一致。综上结果表明，下调寄主中NbHsp70的含量能够抑制PVY的侵染复制。
实施例6：NbHsp70过表达对PVY的复制的影响：为了进一步确定Hsp70蛋白在PVY侵染寄主过程中的作用，我们通过LR反应，将构建好的pGWC-NbHsp70与pEarleyGate100重组，构建NbHsp70瞬时表达载体，以表达载体pEarleyGate100在本氏烟中过量表达NbHsp70，提高寄主中NbHsp70含量，分析PVY侵染植株后RNA和蛋白水平上的病毒累积量。
如图7左侧图所示，从图可以看出经过表达载体处理48h后，过表达组的PVY CP基因表达量较对照组已有上升，过表达组中的表达量是对照组的2.31倍；处理72h后过表达组中的PVY CP表达量是对照组的2.56倍。这表明，过表达寄主中NbHsp70基因的含量能显著增加植株内PVY CP基因的积累。
进一步利用Western blot从蛋白水平分析过表达组与对照组叶片中病毒CP蛋白积累量，如图7右侧图所示，从图可以看出经过表达载体处理48h、72h后CP蛋白灰度值分别为172.29、181.17；对照组的CP蛋白灰度值分别为26.95、91.14。过表达组中的CP蛋白含量明显高于对照，与RNA水平的检测结果一致。这些结果表明，上调寄主中NbHsp70的含量能够促进PVY的侵染复制。
实施例7：Hsp70及其泛素化修饰在灵菌红素诱导抗性中的作用
植物材料与激光共聚焦显微镜观察同实施例3和4。
结果：
1、Hsp70在灵菌红素S3抗病毒病作用机制中的作用：前面我们研究了灵菌红素S3处理植株之后引起了Hsp70蛋白的降低，而Hsp70蛋白也参与了PVY病毒的侵染过程，并没有证实Hsp70蛋白在灵菌红素S3抗病毒机制中起到关键性作用。因此，我们利用Western Blot技术检测灵菌红素S3处理本氏烟3d后再接种PVY病毒3d后，植株中Hsp70蛋白的含量。结果显示处理组植株内Hsp70蛋白含量明显少于对照组。这表明，在灵菌红素S3抗病毒病的作用机制中，通过抑制Hsp70蛋白的表达来达到抗病毒效果。
2、泛素化修饰在灵菌红素S3抗病毒病作用机制中的作用：MG-132是一种多肽醛，也是有效的，可逆的，可透过细胞的蛋白酶体抑制剂，IC50值为100nM，有效地阻断了26S蛋白酶体复合物的蛋白水解活性。也就是一种用于抑制泛素化修饰的一种化学试剂，已广泛用于泛素化修饰的功能研究。
Western Blot分析显示，MG-132处理的经灵菌红素S3诱导本氏烟样品中Hsp70蛋白含量明显增多，表明MG-132处理可以抑制灵菌红素S3诱导的Hsp70蛋白下调。
为了进一步分析泛素化修饰在灵菌红素S3抗病毒机制中的作用，我们使用MG-132提前处理本氏烟，2h后，0.05μg/L灵菌红素按照15L/亩均匀喷施烟草叶面，30min后接种TMV、PVY病毒，采集病毒接种后1d、2d、3d的样品，进行Western Blot分析。实验结果如图9所示，结果表明，与对照组相比，MG-132处理的经灵菌红素S3诱导并接PVY病毒1d的样品中，Hsp70蛋白的积累量显著增多。这表明，，抑制寄主泛素化可显著降低灵菌红素S3对Hsp蛋白的泛素化水平，抑制宿主泛素化修饰水平则抑制Hsp70介导的灵菌红素S3抗病毒抗性，说明Hsp70的泛素化修饰可能在灵菌红素S3抗病毒抗性作用机制中起重要作用。

Claims (6)

1.一种灵菌红素在抗马铃薯Y病毒PVY中的新用途。
2.根据权利要求1所述的新用途，其特征在于：所述灵菌红素在制备防控马铃薯Y病毒药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的新用途，其特征在于：所述灵菌红素为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescen)的次生代谢产物。
4.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于：所述防控马铃薯Y病毒药物为含有灵菌红素的液态或固态制剂。
5.根据权利要求4所述的新用途，其特征在于：所述防控马铃薯Y病毒药物为含有灵菌红素的液态制剂，灵菌红素的浓度为0.05μg/L，按15L/亩均匀喷施于感染马铃薯Y病毒的植株叶面。
6.根据权利要求5所述的新用途，其特征在于：所述灵菌红素处理感染马铃薯Y病毒的植株，促进寄主植株HSP70蛋白发生泛素化，降解或抑制Hsp70蛋白的表达，激活寄主植物天然免疫活性，诱导植物寄主产生系统抗性。
CN202010608056.0A 2020-06-29 2020-06-29 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途 Active CN111990404B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010608056.0A CN111990404B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途
US16/948,646 US11375718B2 (en) 2020-06-29 2020-09-25 Use of prodigiosin in resisting potyvirus

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010608056.0A CN111990404B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111990404A CN111990404A (zh) 2020-11-27
CN111990404B true CN111990404B (zh) 2021-06-25

Family

ID=73466755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010608056.0A Active CN111990404B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US11375718B2 (zh)
CN (1) CN111990404B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111548977B (zh) * 2020-05-09 2022-05-24 江南大学 一株粘质沙雷氏菌工程菌及其在生产灵菌红素中的应用
CN111990404B (zh) * 2020-06-29 2021-06-25 中国农业科学院烟草研究所 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途
CN113170792A (zh) * 2021-04-29 2021-07-27 黑龙江省大地丰农业科技开发有限公司 纳米化灵菌红素制剂的制备及其在蔬菜经济作物病毒病防治中的应用
CN116814491B (zh) * 2023-06-29 2024-01-26 四川农业大学 一种沙雷氏菌myh_7及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53124684A (en) * 1977-04-08 1978-10-31 Kirin Brewery Production of prodigiosin
CN103387529A (zh) * 2013-07-30 2013-11-13 中国农业科学院烟草研究所 抗tmv的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途
CN103690534A (zh) * 2013-12-04 2014-04-02 西南大学 灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用
CN106982839A (zh) * 2017-06-09 2017-07-28 南京林业大学 微生物代谢产物灵菌红素的新用途
CN111990404A (zh) * 2020-06-29 2020-11-27 中国农业科学院烟草研究所 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS53124684A (en) * 1977-04-08 1978-10-31 Kirin Brewery Production of prodigiosin
CN103387529A (zh) * 2013-07-30 2013-11-13 中国农业科学院烟草研究所 抗tmv的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途
CN103690534A (zh) * 2013-12-04 2014-04-02 西南大学 灵菌红素在防控家蚕核型多角体病毒病中的应用
CN106982839A (zh) * 2017-06-09 2017-07-28 南京林业大学 微生物代谢产物灵菌红素的新用途
CN111990404A (zh) * 2020-06-29 2020-11-27 中国农业科学院烟草研究所 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN111990404A (zh) 2020-11-27
US11375718B2 (en) 2022-07-05
US20210400965A1 (en) 2021-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111990404B (zh) 灵菌红素在抗马铃薯y病毒的新用途
Zhang et al. Biogenesis, function, and applications of virus-derived small RNAs in plants
Chen et al. SCR 96, a small cysteine‐rich secretory protein of P hytophthora cactorum, can trigger cell death in the Solanaceae and is important for pathogenicity and oxidative stress tolerance
Xia et al. Global transcriptomic changes induced by infection of cucumber (Cucumis sativus L.) with mild and severe variants of hop stunt viroid
Rodio et al. A viroid RNA with a specific structural motif inhibits chloroplast development
Macfarlane Tobraviruses—plant pathogens and tools for biotechnology
Breia et al. VvSWEET7 is a mono-and disaccharide transporter up-regulated in response to Botrytis cinerea infection in grape berries
Chauhan et al. A systematic review of conventional and advanced approaches for the control of plant viruses
Leibman et al. Differential expression of cucumber RNA‐dependent RNA polymerase 1 genes during antiviral defence and resistance
Andika et al. Interplays between soil-borne plant viruses and RNA silencing-mediated antiviral defense in roots
Tabein et al. The induction of an effective dsRNA-mediated resistance against tomato spotted wilt virus by exogenous application of double-stranded RNA largely depends on the selection of the viral RNA target region
Wang et al. Barley stripe mosaic virus γb protein disrupts chloroplast antioxidant defenses to optimize viral replication
Lan et al. Cucumber mosaic virus infection modulated the phytochemical contents of Passiflora edulis
Cascardo et al. Function and diversity of P0 proteins among cotton leafroll dwarf virus isolates
Liu et al. Characterization of virus-derived small interfering RNAs in Apple stem grooving virus-infected in vitro-cultured Pyrus pyrifolia shoot tips in response to high temperature treatment
Nilsson et al. Acylated monogalactosyl diacylglycerol: prevalence in the plant kingdom and identification of an enzyme catalyzing galactolipid head group acylation in Arabidopsis thaliana
Obrępalska‐Stęplowska et al. How can plant virus satellite RNAs alter the effects of plant virus infection? A study of the changes in the Nicotiana benthamiana proteome after infection by Peanut stunt virus in the presence or absence of its satellite RNA
Huang et al. Comparative proteomic analysis provides novel insight into the interaction between resistant vs susceptible tomato cultivars and TYLCV infection
Huang et al. Development and application of an efficient virus-induced gene silencing system in Nicotiana tabacum using geminivirus alphasatellite
Li et al. Different virus-derived siRNAs profiles between leaves and fruits in cucumber green mottle mosaic virus-infected Lagenaria siceraria plants
CN103724408A (zh) 来源于辣椒疫霉的效应子蛋白及其编码基因与应用
Xu et al. Improved pathogenicity of a beet black scorch virus variant by low temperature and co-infection with its satellite RNA
Thakur et al. Engineering resistance to Alternaria cyamopsidis by RNAi mediated gene silencing of chitin synthase export chaperone CHS7 in guar
Kuo et al. Argonaute 5 family proteins play crucial roles in the defence against Cymbidium mosaic virus and Odontoglossum ringspot virus in Phalaenopsis aphrodite subsp. formosan a
Zhang et al. Wheat yellow mosaic virus NIb targets TaVTC2 to elicit broad‐spectrum pathogen resistance in wheat

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant