CN103387529A

CN103387529A - 抗tmv的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN103387529A
Application number: CN2013103237495A
Authority: CN
Inventors: 杨金广; 王凤龙; 毕建华; 张长华; 李锡宏; 欧阳明安; 申莉莉; 钱玉梅; 战徊旭
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Institute of Tobacco Research, Academy of Sciences, Chinese Academy of Agriculture; Yunnan Aromatic Tobacco Co ltd
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: CN103387529B

Abstract

本发明涉及一种抗TMV的三吡咯环类化合物，以及该化合物的制备方法和用途。本发明化合物是生物制剂，且是专门针对TMV开发的生防制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于农产品的无公害生产；本发明化合物不仅可以使TMV钝化，使TMV失去侵染活性，而且还可以诱导寄主产生系统抗性，缓解和减弱感染TMV的植株症状的表现和发生，对TMV的防效可以达到70％以上。

Description

抗TMV的三吡咯环类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及植物病毒无公害技术领域，尤其涉及一种抗TMV的三吡咯环类化合物，及其制备方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染引起的植物病毒病是我国农作物上危害最为严重的病害之一，TMV病毒抗逆性强，传播途径简单，寄主范围广泛，严重影响着多种作物的生长，造成了严重的损失。长期以来，生产上防治病毒病以化学防治为主，虽然许多抗病毒化学药剂开始进入实用化阶段，但防治效果十分有限。

TMV具有广泛的寄主范围，可侵染30个种199种植物，在我国农业种植区均有严重发生和危害。TMV毒力和抗逆性都很强，含病毒的新鲜汁液稀释到100万倍仍有致病力，在汁液中病毒的钝化温度为93℃、10min或75℃、40d；干病叶120℃处理30min仍有侵染活力，因此TMV是典型的积年流行病害，在连作田块发病一般称逐年加重趋势。TMV自然种群结构较为复杂，不同生态区域存在复杂的株系分化，株系类型繁多，而不同株系在先后侵入植株时往往存在交叉保护作用。侵染茄科作物后，最显著的症状是形成黄绿相间的斑驳花叶，病叶边缘有时向背面卷曲。此病自苗床至大田整个生育期均可连续发生，严重影响了多数茄科作物的产量和质量。

目前生产上，除种植抗病品种外，尚无有效的抗病毒剂对TMV侵染流行和危害进行控制，仅有通过提前预防减轻其危害。而Mulvania于1926年就发现被细菌污染的植物病毒汁液很快丧失侵染活力，因此利用拮抗细菌来抑制植物病毒的侵染是植物病毒病防治的有效策略之一。微生物之间的拮抗作用在自然界中普遍存在，是生物农药研制的依据。微生物源抗病毒物质以细菌及其代谢产物、真菌及其代谢产物、放线菌及其代谢产物为主。微生物代谢产生的有抗病毒作用的活性物质，具有活性强、安全高效的优点。从微生物资源中筛选，经分离后获得多糖、蛋白类、核酸类、小分子等抗植物病毒物质，已经成为研究的热点，有的已经形成产品，在农业生产中发挥重要作用，尤其是抗病毒型农用抗生素的研制已取得了突破性进展，如宁南霉素是一种胞嘧啶核苷肽型抗生素，具有广谱和高效的抑制作用，并且低毒、低残留等优点。1995年向固西等从诺尔斯链霉菌西昌变种(s.nourseivar.xiehangensis)的发酵液中提取的胞嘧啶核苷肽型抗生素一宁南霉素(ningnanmyein)，对TMV的复制有抑制作用，防效在65％以上，已形成2％宁南霉素水剂，1997年获得了临时登记图。2001年我国又新增了嗜肤霉素，用于植物病毒病害防治的新型农用抗生素。

随着全球食品安全生产的日益重视，随着人们对食品安全的日益关注和重视，随着农业集约化和现代化发展，化学农药残留和生态环境污染问题的日益严重，生物农药越来越受到重视，并成为综合防治的主要部分。生物农药选择性强，对人畜安全；无污染，对生态环境安全；效果好，防治期更长；种类繁多，开发利用途径多。具有诱导烟草抗性的生物及化学激发子制剂农药是基于诱导增强植物抗病性、抗逆性而研制的新型农药，产品安全无毒，不会引起植物的抗性，对植物有显著抗病增产作用，同时能提高作物的品质，生产上可以减少或不使用化学农药，生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，具有非常广阔的市场前景和良好的市场竞争能力，具有较好的综合效益。具有诱导抗性的生物及化学激发子生物农药将成为21世纪农业可持续发展的重要内容，具有十分广阔的应用前景。

目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas、Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质，大致包括以下几类：细菌素(bacteriocins)、荧光素(fluorescein)、土壤杆菌素(agrocin)、酚类物质、多肽类抗生素(polypeptides)、蛋白质类等，在植物病害生物防治中起着关键的作用。由生防细菌产生的拮抗物质种类多，作用范围广谱，同一种拮抗物质可以由多种细菌菌株产生，而同一种细菌菌株也可以产生多种不同结构的拮抗物质。

目前生物农药的研发已经在原有微生物制剂开发的基础上，向新功能、分子设计或重组生物农药方向发展。微生物源农药是利用微生物或其代谢物作为防治农业有害物质的生物制剂，主要包括微生物杀菌剂、微生物杀虫剂和微生物除草剂。微生物杀虫剂包括昆虫病原细菌、昆虫病毒、昆虫真菌、昆虫病原线虫和微孢子虫。微生物除草剂我国首次将真菌用于杂草生物防治的研究是1963年利用炭疽病“鲁保一号”防治大豆菟丝子，1966年以后生物除草剂“鲁保一号”推广到全国20多个省、市、自治区，防治效果稳定在80％以上。在活体微生物除草剂中，以真菌所占比重最大，真菌除草剂的研究和开发最为活跃。美国成功开发了用于防治水稻、麦类等作物菌期杂草的盘长孢状刺盘孢；日本烟草株式会社开发的黑腐病菌，用于防治草坪内的杂草早熟禾及剪股颖，但目前尚无规模应用。农用抗生素主要指用于防治病、虫、草等有害生物的微生物代谢产物，可分为抗菌素、杀虫素和杀草素。开发抗植物病毒病的农用抗生素：农用抗生素因其具有内吸活性强、安全、低毒、高效、速效等诸多优点，成为各国研究的热点，谁首先开发成功，谁就掌握了市场的主动权。因此，开发抗病毒型农用抗生素己迫在眉睫。从植物中获取天然抗病毒物质：目前已从中草药中开发出若干行之有效的抗病毒制剂，并且在筛选模式上也有所突破。进一步的研究和开发将会给病毒病的防治带来新的生机。开发复配制剂：多种抗病毒型生物农药之间或生物农药与化学农药之间进行复配，以期能达到好的防治效果。

研究已有的抗病毒型农用抗生素作用机理，明确其作用位点、作用时间，为进一步开发更为高效的新型抗病毒型生物农药提供理论依据和研究手段。了解拮抗菌的抗病毒机理是增强拮抗菌生防效力和确定拮抗菌筛选标准的重要前提，拮抗菌对植物病毒主要有3种作用机制：即体外钝化作用、抑制作用(包括抑制侵染和抑制增殖)、诱导抗性，其中以体外钝化作用最为显著。

由于TMV是典型的单链RNA病毒，是细胞内转性寄生生物，其RNA具有侵染性。一旦侵入植物细胞，生产上没有有效的防治措施和防治药剂进行防治。当前主要是通过种植抗病品种、无毒育苗和切断传播途径等措施进行防治，由于TMV自然种群数量巨大，并且具有很强的抗逆性和侵染力，因此，导致常规防治方法效果不佳，防治成本较高。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种抗TMV的三吡咯环类化合物，对TMV的钝化能力和抑制效果均表现良好，能够显著控制TMV在农作物，特别是蔬菜作物中的传播危害。

还提供了上述化合物的制备方法，以粘质沙雷氏菌2A2发酵分离纯化即可获得，操作简单。还提供了上述化合物在抗TMV上的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种抗TMV的三吡咯环类化合物，其结构式如下所示：

一种如上所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将粘质沙雷氏菌2A2在LB培养液28～33℃180～220rpm振荡，避光培养40～56h，用1～3％的酸化乙醇处理发酵液，然后5000～7000rpm离心5～10min；红色上清液用水和氯仿1～1.3∶1配制的萃取剂进行萃取，将氯仿层分离并旋转蒸发，得暗红色浸膏；

(2)、将步骤(1)得到的暗红色浸膏用甲醇溶解，过滤，采用硅胶柱层析，以200目～300目硅胶为吸附剂，用体积比5～3∶1的石油醚∶丙酮洗脱，收集紫红色产品。

一种如上所述化合物在抗TMV病毒方面的应用。

进一步地，所述化合物对TMV病毒粒体具有破碎作用。

进一步地，所述化合物诱导烟草对TMV的抗性。

与现有技术相比，本发明具有的优点：本发明化合物是生物制剂，且是专门针对TMV开发的生防制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于农产品的无公害生产；本发明化合物不仅可以使TMV钝化，使TMV失去侵染活性，而且还可以诱导寄主产生系统抗性，缓解和减弱感染TMV的植株症状的表现和发生，对TMV的防效可以达到70％以上。

附图说明

图1-1和图1-2分别为不同浓度的NMR检测图谱；

图2-1为电子显微镜下未处理的TMV病毒粒体的形态；

图2-2为电子显微镜下本发明化合物处理后的TMV病毒粒体的形态；

图3是不同处理下PR基因的表达量；

图4是不同处理下叶片TMV的积累量。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)2A2，该菌株于2011年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC N0.5230，该菌株是发明人所在实验室从青岛即墨茄科作物根际土壤中筛选到一株可以产生红色色素的细菌菌株。

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)2A2中提取抗TMV的三吡咯环类化合物的过程如下：

(1)次生代谢物的粗提

20L粘质沙雷氏菌2A2在LB培养液【LB培养液：在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g；摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min】28℃180rpm振荡，避光培养48h，用1％的酸化乙醇处理发酵液，然后5000rpm离心10min，上清液经氯仿萃取分离，旋转蒸发得到30g暗红色浸膏；浸膏不溶于水，易溶于甲醇、氯仿等极性较强的有机溶剂。

(2)次生代谢物的分离纯化

将发酵液粗提得到的20g次生代谢物粗提物，经甲醇溶解过滤，过滤掉不溶性的糖类等物质，得到15g混合样品。以200目-300目硅胶为吸附剂，用氯仿∶丙酮(体积比5∶1和3∶1)和氯仿∶甲醇(体积比5∶1和3∶1)各1500mL梯度洗脱，分部收集，通过TLC分析确定不同的展开剂，然后采用薄层硅胶柱分离纯化得到三种主要的次生代谢物，各物理性质及对应展开剂如表1所示。

表1粘质沙雷氏菌发酵液分离纯化得到的三种主要次生代谢物物理特征

(3)三种次生代谢物质对TMV的抑制率

用甲醇溶解三种次生代谢物，浓度为10μg/mL，通过局部枯斑法测三种次生代谢物对TMV的抑制率(表2)，发现编号为BJH-2的次生代谢物对TMV具有显著抑制作用，达到99％。

表2不同次生代谢物对TMV的抑制率

(4)次生代谢物的成分结构分析

将BJH-2次生代谢物用甲醇溶解，经核磁共振(NMR)分析【核磁共振测定采用VarianA-400MHz核磁共振仪，内标为TMS】，得到图谱(图1-1和图1-2)，经解谱得到其结构式如下所示，该物质具有三吡咯环结构，确定BJH-2物质为灵菌红素。

(5)灵菌红素对TMV粒体形态的影响

灵菌红素溶液(10μg/mL)与提纯的TMV病毒(1ng/mL)按照1∶1的浓度混合，室温静置30min后，接种三生烟-NN右半叶；于100nm的电镜下观察，对照处理的TMV病毒粒体为直杆状结构，如图2-1所示，长约300nm～480nm，直径约15nm，排列紧密，整齐规则。而经过灵菌红素处理的TMV病毒粒体大部分破碎成短小片段，如图2-2所示，排列杂乱无章，数量明显减少。由此可见，灵菌红素对TMV病毒粒体结构的破坏作用非常显著。

上述生物制剂灵菌红素在防治TMV病害的应用方法为：将灵菌红素稀释终浓度为10μg/L后，在苗期剪叶前、移栽前均匀喷施使用；移栽后，在发病前或出现零星病株时，用10μg/L灵菌红素，进行喷施，连续使用2～3次，每次间隔7～10d。喷施时，喷头应从下向上进行喷施，保证整株植物叶片均匀保持水膜。

(6)灵菌红素对寄主系统抗性和寄主体内TMV复制增值的影响

根据烟草PR基因家族基因序列、TMV基因组序列，分别设计PR1、PR2、PR4和PR5、18S rRNA和TMV的特异性引物，对不同基因的cDNA进行5倍浓度的稀释，连续稀释6个梯度，通过ABI7500自带的SDS分析软件分析，获得各基因的标准曲线和方程式(见表3)，结果表明，通过上述特异性引物荧光定量PCR检测，具有较好的特异性、灵敏性，各基因表达量与初始模板量表现出较好的线性关系，可以用于目的基因的相对定量分析。

表3标准曲线方程

利用SDS软件对数据进行分析，统计各基因的Ct值，利用标准曲线方程计算CO值，得到PR基因的相对CO值，计算得到不同处理叶片PR基因表达量，结果用SAS软件进行方差分析，形成相对表达量分析(如图3 所示)。结果清晰表明用灵菌红素诱导过的烟株，三个处理均不同程度地烟株PR基因的表达量上调。处理I、处理II和处理IIIPR1基因表达量分别比对照处理高出71.08％、61.52％、242.76％，接毒后喷施灵菌红素与对照显著差异，宁南霉素处理则高出106.03％；PR2基因表达量分别比对照处理高出84.41％、188.12％、148.78％，灵菌红素与病毒同时接种以及接毒后喷施灵菌红素均与对照显著差异，宁南霉素处理则高出201.68％；PR4基因表达量分别比对照高出106.31％、118.92％、76.58％，先喷施灵菌红素后接毒和灵菌红素与病毒同时接种均与对照显著差异，宁南霉素处理高出64.86％；PR5基因表达量分别比对照高出85.50％、34.69％、150.81％，接毒后喷施灵菌红素与对照显著差异，宁南霉素处理则低于对照10％。可见，灵菌红素可诱导烟草的抗性基因表达，提高烟株对TMV的系统抗性。

数据用SAS进行方差分析，制成柱状图。从图4可看出，TMV接种后7d，无论先灵菌红素处理后TMV接种，还是先TMV接种后灵菌红素处理，或者灵菌红素处理与TMV接种同步进行，烟株内TMV含量与空白对照相比均非常低，显著差异。其中，在接种TMV之前24h喷施灵菌红素的处理中，烟株中几乎检测不到TMV RNA的存在，可见，灵菌红素可完全预防TMV侵染；而灵菌红素与TMV同时接种，以及接种TMV后24h喷施灵菌红素，烟株体内TMV含量也非常低，分别是对照的1.86％和0.53％，宁南霉素处理后的TMV含量是1.62％，可见，灵菌红素对TMV的钝化效果和抑制效果非常明显。由此证明，灵菌红素对TMV侵染具有较好的预防和钝化作用，总体防治效果高于宁南霉素。

(7)灵菌红素对烟草TMV病害的大田防治效果研究

①试验地概况

试验示范区选在中国农业科学院烟草研究所即墨试验场进行，示范区面积6.67hm2，试验区面积500m2。试验地为潮土，pH值7.5，有机质中等，田间无草，肥力均匀，烟草长势均匀一致，管理水平较好，密度1000株/667m2，田间湿度适中，灌溉方便。试验示范区栽培及水肥管理等条件均匀一致。施药前20d、施药期间及调查期间，试验示范区内未进行其它病虫害防治。

②试验设计

小区试验设6个处理：灵菌红素在浓度分别为10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL进行喷施处理，8％宁南霉素可湿性粉剂800倍稀释液喷施为阳性对照，喷施清水作为空白对照。各处理4次重复，共计24个小区。小区面积20m2，各小区平均25株烟。小区随机排列，小区间设保护行，试验地周围设保护区。从团棵期开始采用喷雾法喷施叶面，每7d喷施一次，共喷施3次，施药器械为背负式喷雾器，施药期间田间管理正常。

③田间调查方法

采取全群调查方法，待施药完毕，烟株进入成熟期后，调查发病率和病级，依据《烟草病害分级标准》进行分级，以病情指数计算相对防效，调查分级标准。

0级：全株无病；

1级：心叶脉明或轻微花叶，病株无明显矮化；

3级：1/3叶片花叶但不变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；

5级：1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或病株矮化为正常株高的2/3～3/4。

7级：1/2～2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2～2/3。

9级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，或病株矮化为正常株高的1/2以上。

所得数据使用SAS软件进行统计分析。

④灵菌红素对TMV的田间防治效果

经灵菌红素和常规药剂8％宁南霉素处理的烟株，烟草TMV病情指数比清水对照显著降低。其中，宁南霉素的防治效果为60.37％；灵菌红素10μg/mL稀释液防治效果最好，高达88.20％；其次是1μg/mL稀释液，防治效果为80.89％；而0.1μg/mL和0.01μg/mL稀释液防治效果分别为71.27％和70.70％，均高于宁南霉素，与100倍和400倍稀释液防治效果差异显著(表3)。

表4灵菌红素对TMV的田间防治效果

注：表中数据为平均值±标准差。数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。

本发明与现有TMV防治技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明是专门针对TMV开发的生防制剂，由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于农产品的无公害生产；本发明不仅可以使TMV钝化，使TMV失去侵染活性，而且还可以诱导寄主产生系统抗性，缓解和减弱感染TMV的植株症状的表现和发生，兼具治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗TMV的三吡咯环类化合物，其结构式如下所示：

2.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

3.一种如权利要求1所述化合物在抗TMV病毒方面的应用。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述化合物对TMV病毒粒体具有破碎作用。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于：所述化合物诱导烟草对TMV的抗性。