CN103865855A

CN103865855A - 枯草芽孢杆菌菌株及其应用

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Publication number: CN103865855A
Application number: CN201410111740.2A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 刘强; 黄和; 江凌
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-25
Also published as: CN103865855B

Abstract

一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO：M2014003。该菌株由分离于胜利油田污染土壤中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株诱变选育得到，能够快速利用仅以甘油为唯一碳源的培养基高产脂肽类生物表面活性剂surfactin。以粗甘油为底物，经该菌发酵转化、离心除菌、酸沉淀、冷冻干燥、甲醇萃取可得surfactin纯品。

Description

枯草芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），特别涉及利用该菌株转化甘油发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法。

背景技术

脂肽是由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链组成的一类化合物。其含有7-10个氨基酸组成的肽链和β-羟基脂肪酸链或β-胺基脂肪酸链,其中脂肪酸链上的羟基或胺基与肽链氨基酸上的羧基结合形成内酯键或酰胺键，使肽链闭合形成环状脂肽。由于脂肽具有特殊的化学组成与两亲型分子结构，因此在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有广阔的应用前景，成为研究的热点。

1968年，Arima等首次发现枯草芽胞杆菌能产生脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素(surfactin)。此后，研究人员通过不同的分离技术和结构鉴定手段，发现了多种脂肽表面活性剂Surfactin的结构类似物。研究表明,自被发现以来，表面活性素的表面活性一直最强，是迄今报道的效果最好的生物表面活性剂之一（食品工业科技，2008,29(11):296-298）。

脂肽类表面活性剂主要是通过微生物发酵方法制备，其生产菌一般是革兰氏阳性芽孢杆菌。一般的脂肽类表面活性剂产生菌的产量较低，其产量均小于1.0g/L，少的甚至在0.1g/L以下，要能达到有较好的利用价值，通常需要对产生菌进行高产突变株的诱变选育和发酵工艺优化，目前，国内外研究者在诱变育种、培养基优化及发酵调控等方面开展了大量研究。

为降低其生产成本，科学工作者尝试了多种廉价发酵原料，目前，发酵生产Surfactin报道的碳源有葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜、大豆油、甘露醇、甘油等。在上述发酵原料中，甘油作为原料尤其引人注意。在生物柴油的生产过程中，每生产1吨生物柴油就会副产100kg甘油。同时生物柴油产业得到了各国政策上的支持，随着生物柴油产业的大力发展已出现甘油过剩现象，副产甘油价格低廉，是极具应用前景的发酵原料。

许多科技工作者尝试了使用甘油生产表面活性剂，Nitschke等（Nitschke M, Costa SGVA, Contiero J. Rhamnolipid surfactants: an update on the general aspects of these remarkable biomolecules. BiotechnolProg ,2005,21:1593–600.）发现铜绿假单胞菌可以利用甘油作为唯一碳源合成鼠李糖脂，但是产量比使用疏水性碳源低。Rahman等（Rahman KSM, Rahman TJ, McClean S, Marchant R, Bannat IM. Rhamnolipidbiosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnol. Prog ,2002,18:1277–81）发现铜绿假单胞菌DS10-129可利用唯一碳源甘油合成鼠李糖脂，浓度为1.77g/L，远低于使用油脂作为底物合成鼠李糖脂的产量。Reis 等人尝试了包括甘油在内的蔗糖、糖蜜多种廉价原料，认为蔗糖为最佳发酵底物，甘油在其考察体系中不是最佳原料。现有surfactin发酵体系中，存在发酵迟滞期长，发酵周期长，产量低（泡沫中surfactin浓度仅230mg/L）等不足，难以进行工业应用。

微生物对甘油的摄取和代谢机制已有所解析。甘油和其他无电荷小分子一样，可以通过被动扩散通过细胞质膜进入细胞；但是细胞在低浓度时，会限制被动扩散中对细胞生长不利的物质吸收，甘油即属于这一类物质。一些可以利用甘油的菌体，在细胞膜中存在甘油协助蛋白（Glycerol facilitator, GlpF）协助甘油进入细胞。甘油进入胞内后，有两条代谢途径，一是通过甘油激酶（Glycerol kinase，GlpK）催化转化为甘油-3-磷酸进入EMP途径，另一条是通过甘油脱氢酶（Glycerol dehydrogenase）催化转化为3-羟基丙醛，再转化为1,3-丙二醇。但是，大部分微生物不具有三种关键酶或酶活较低，无法正常代谢甘油。另外，不经过处理的生物柴油副产物粗甘油中甘油含量只有40~50%，甲醇和脂肪酸皂的含量高达30~40%，另外一些游离碱、盐对微生物生长都具有明显抑制作用。

综上，获得能够代谢利用粗甘油并高产surfactin的菌株成为其工业化应用的关键点。

发明内容

针对现有枯草芽孢杆菌菌株不能利用甘油，特别是生物柴油副产物粗甘油生产脂肽类生物表面活性剂surfactin的缺陷，因此，本发明从胜利油田污染土壤中分离纯化出一株代谢生产脂肽类生物表面活性剂的枯草芽孢杆菌，经过常压室温等离子体（ARTP）诱变筛选，得到可以利用甘油作为唯一碳源代谢产生脂肽类生物表面活性剂surfactin的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的技术目的之一为提供一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO：M2014003，该菌可利用甘油作为唯一碳源且可利用粗甘油作为发酵碳源生产脂肽类生物表面活性剂surfactin。

本发明的另一技术目的之一为提供一种生产脂肽类生物表面活性剂的方法，在生产过程中，需要使用Bacillus subtilis G-34菌株。

为了达到发明目的，本发明的技术方案为：

一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO：M2014003。

生产脂肽类表面活性剂的方法，利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34）菌株进行发酵得到脂肽类表面活性剂产品，其特征在于，菌株可利用甘油作为唯一碳源的培养基。

本发明所述的方法，其特征在于，发酵过程的具体步骤为：

a）取诱变后筛选获得的原始菌株，使用LB斜面培养基进行活化；

b）取步骤a获得的菌体接种于种子培养基中，种子培养条件为30~45℃、pH 7.0~8.0，培养时间为12-24h;

c）按照2%-10%（v/v）的接种量将步骤b获得菌体接种于发酵培养基中，培养条件为30~45℃、pH 7.0~8.0，培养条时间为36-48h;

本发明所述的方法，其特征在于，所述种子培养基或发酵培养基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源，含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、氨水、尿素中的一种或几种做为氮源；并且含有、无机盐、氨基酸、微量元素。

对于本发明的中的培养基，应理解为含有葡萄糖等单糖的常规复杂培养基，以及含有各种氮元素的培养基均可作为该菌的培养基发酵生产脂肽类生物表面活性剂surfactin的培养基。

本发明所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵。

本发明所述的方法，，其特征在于，所述培养基包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、锰、镁、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙在内的多种微量元素。

对上述培养基中各种营养成分，应理解为常规碳源、氮源、无机盐、微量元素以及其他成分的组合可以满足枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34发酵生产脂肽类生物表面活性剂对营养的需求。通过对培养基进行优化，可以进一步提升脂肽类生物表面活性剂surfactin的产量。优选甘油或葡萄糖分别与酵母粉或蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸铜进行组合。

各营养成分的含量也会影响产物的产量，优选甘油浓度10-40 g/L进行发酵。

本发明所述的方法，其特征在于，所述甘油除来源于化学法合成甘油外，还包括化学法、生物法或超临界法生产生物柴油生产过程中的粗甘油。

由于本发明通过诱变育种对产脂肽表面活性剂菌株的甘油代谢能力进行了强化，获得了能利用甘油高产脂肽表面活性剂的菌株，所以可以有效利用化学法或者生物酶法生物柴油生产过程中产生的粗甘油。

本发明所述的菌株在发酵制备脂肽类表面活性剂中的应用。

本发明的有益效果在于：通过诱变育种对产脂肽表面活性剂菌株的甘油代谢能力进行了强化，获得了能利用甘油高产脂肽表面活性剂的菌株，该工艺具有原料廉价、发酵周期短、产量高等有益效果。

附图说明

图1是实施例2中脂肽类生物表面活性剂的类—surfactin的红外图。

图2是枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34）发酵生产生物表面活性剂情况。

图3-a、图3-b、图3-c、图3-d是枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34）产脂肽类生物表面活性剂的表面活性性能。

其中，图3-a是临界胶束浓度（CMC）的测量；图3-b是温度对表面活性的影响；图3-c是酸碱度对表面活性的影响；图3-d是水体矿化度对表面活性的影响。

本发明所涉及的生物材料，其分类命名为枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址是中国. 武汉. 武汉大学），保藏登记号为CCTCC NO：M2014003。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明获得枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34）的方法。

包括以下步骤：

1）通过富集培养基获得在石油污染土壤中有生物表面活性菌株。

取胜利油田石油污染土壤样品，处理土壤样品接种于富集培养基获得富集培养液。利用生物表而活性剂能够溶血的特性，将富集培养液用划线和涂布分离方法接种于血平板上，37℃培养24-48h，获得溶血圈大且透明的单个菌落。

富集培养基配方为：葡萄糖20 g/L，硫酸铵1 g/L，硝酸钠2 g/L，硫酸镁0.3 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，磷酸氢二钠4 g/L，酵母粉2 g/L。

血平板培养基配方为：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉1 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂粉23 g/L，绵羊血 8%（v/v）。

2）鉴定菌株种属并进行实验室保藏。

挑取溶血圈最大的单菌落，经过划线传代纯化培养后，对菌株进行16S rDNA鉴定，鉴定结果显示菌株为枯草孢杆菌Bacillus subtilis ，对其命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 602，并在实验室用甘油管保藏法进行原始菌株的冻藏。

3）对Bacillus subtilis 602菌株进行ARTP诱变筛选，获得能够将甘油作为唯一碳源的菌株。

常压室温等离子体方法（ARTP）诱变的条件为：氦气作为工作气体，在电源输入功率为100 W、工作气流量为10 L/min、等离子体发射源与样品之间距离为2 mm的条件下进行ARTP诱变，诱变处理时间为180秒。

固体筛选培养基的组成为：甘油15 g/L，NH₄NO₃2 g/L，KH₂PO₄0.6 g/L，MgSO₄·7H2O 0.4 g/L，FeSO₄ 0.02 g/L，MnSO₄·H₂O 0.0017 g/L，琼脂为23 g /L。

挑取能在该固体培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌株单菌落，进行产生物表面活性剂实验。

4）对诱变后的菌株进行生物表面活性筛选

利用步骤3）获得菌株在血平板上进行涂板，培养12-24h，在血平板上分离获得溶血圈大且透明的单个菌落，获得枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis G-34。

5）对菌株进行传代稳定性考察，结果显示菌株遗传特性稳定，不存在菌株退化的现象。

实施例2

本实施例说明对枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis G-34所产生物表面活性剂类型进行初步鉴定的结果。

以Bacillus subtilis G-34菌株为菌种，以甘油为碳源进行摇瓶发酵，对Bacillus subtilis G-34产生的生物表面活性剂提纯，进行FT-IR分析。

分析结果见附图1。在IR谱图上，3303cm-1是由分子链间氢键引起的NH伸缩振动，1656cm-1及1550cm-1为酞胺谱带Ⅰ和Ⅱ。上述特征的吸收表表面活性剂分子的亲水基是--肽链。谱图2872-2960cm-1和1243-1402cm-1的两处吸收是脂肪酸族的C-H伸缩振动表该表面活性剂分子的疏水基部分是一脂肪半分子，表明该表面活性剂是一种环状脂肽类物质。

实施例3

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用纯甘油发酵生产脂肽类生物表面活性剂的步骤。

（1）种子培养基配制：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g /L，NaCl 10 g/L。121 ℃灭菌20 min，冷却待用。

（2）发酵培养基配制：甘油20 g/L，NH₄NO₃2 g/L，KH₂PO₄ 3 g/L，Na₂HPO₄10 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02 g/L。

培养基用磷酸(1mol/L)调节pH为7.0，121℃灭菌20min，冷却待用。

（3）挑取一环Bacillus subtilis G-34菌株，置于步骤（1）所获得的培养基中；置于37℃，200rpm培养12h，获得种子液。

（4）取1ml步骤（3）所获得Bacillus subtilis G-34种子液接种于50ml步骤（2）所获得的发酵培养基中。置于37℃，200rpm培养。

（5）实验结果见附图2，可以看出，Bacillus subtilis G-34菌株，在发酵培养过程中，可以快速代谢甘油，高产脂肽类生物表面活性剂surfactin。

实施例4

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用工业级甘油（>80%）发酵生产脂肽类生物表面活性剂的有益效果。

（1）种子培养基配制：酵母浸粉 5 g/L，甘油2 0g/L。115 ℃灭菌30 min，冷却待用。

（2）发酵培养基配制：甘油:20 g/L，NH₄NO₃ 2g/L，KH₂PO₄ 3g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，酵母浸粉 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，MnSO₄·H₂O 0.0017g/L。用磷酸(1mol/L)调节pH为8.0。115℃灭菌30min。冷却待用。

（3）种子培养：在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时，获得菌种种子。

（4）发酵培养：将上诉步骤（3）中所获得种子液以10%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，摇床转速200rpm，培养24小时，获得脂肽类生物表面活性剂发酵液。

（5）结果显示，发酵液中脂肽类生物表面活性剂浓度487mg/L。

实施例5

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用生物柴油副产物生产脂肽类生物表面活性剂的方法步骤。

（1）种子培养基配制：酵母浸粉 5g/L，粗甘油15g/L。115℃灭菌30min，冷却待用。

（2）发酵培养基配制：粗甘油:30g/L，NH₄NO₃ 2g/L，KH₂PO₄3g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，酵母浸粉 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，MnSO₄·H₂O 0.0017g/L。用NaOH(1mol/L)调节pH为6.0。115℃灭菌30min。冷却待用。

（4）发酵培养：将上诉步骤（3）中所获得种子液以2%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，摇床转速200rpm，培养24小时，获得脂肽类生物表面活性剂发酵液。

（5）结果显示，发酵液中脂肽类生物表面活性剂浓度450mg/L。

实施例6

本实施例说明利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34代谢粗甘油发酵生产脂肽类生物表面活性剂的中试实验过程。

（1）摇瓶种子培养：将在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，搅拌转速为200rpm，培养12小时，获得摇瓶种子液。

（2）一级种子培养：将步骤（5）所获得种子接种到步骤（2）所获得的培养基中，接种量为5%，于37℃，搅拌转速为200rpm，溶氧为20%，培养12小时，获得一级菌种种子。

（3）二级种子培养：将步骤（6）所获得种子接种到步骤（3）所获得的培养基中，接种量为5%，于37℃，搅拌转速为200rpm，溶氧为20%，培养12小时，获得二级菌种种子。

（4）发酵培养：将步骤（7）所获得种子接种到步骤（4）所获得的培养基中，接种量为6%，于37℃，搅拌转速为350rpm，通气量为1VVM，pH7.5，发酵24小时。

其中

摇瓶种子罐培养基为：酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L。121 ℃灭菌20 min。冷却待用。

一级种子罐培养基：酵母浸粉1 g/L，甘油10 g/L，KH₂PO₄1 g/L。121 ℃灭菌20 min。

二级种子罐培养基：酵母浸粉0.5g/L，粗甘油10g/L，KH2PO41g/L，NH4NO3 2g/L MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.0017g/L。

发酵培养基：粗甘油 20 g/L，NH₄NO₃ 2 g/L，KH₂PO₄3 g/L，Na₂HPO₄ 3 g/L，酵母浸粉 0.2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02 g/L，MnSO₄·H₂O 0.0017 g/L。121 ℃灭菌20 min。

结果显示，发酵液中脂肽类生物表面活性剂浓度755mg/L。

实施例7

本实施案例说明Bacillus subtilis G-34的发酵液的优秀的表面活性功能，及耐酸碱、耐高温、耐高矿化度的性能。

（1）Surfactin提纯：发酵液在 10000 rpm 离心10 min，上清用浓盐酸调节 pH 至 2.0，在 4 ℃静置过夜。溶液在 10000 rpm下离心10 min，弃上清，用少量蒸馏水重悬沉淀，1 mol/L NaOH调节 pH至 7.0，样品在-20℃放置3个小时，冻结后，在真空条件下冷冻干燥 24 h。所得即为表面活性剂粗品，称重后用无水甲醇超声溶解，在 14 100 rpm 离心 10 min，上清溶液在 40℃下进行旋转蒸发，得到表面活性剂纯品，用于后续样品性质的各种检测分析。

（2）临界胶束浓度（CMC）测定：表面活性剂纯品溶于水，配制0-500 mg/L的溶液测定其表面面张力绘制浓度-表面张力曲线图，计算发酵所得生物表面活性剂的 CMC。

（3）理化性质的测定：使用纯水配制表面活性剂的浓度为40mg/L.考察其在pH 1-13；温度30-120 ℃；矿化度：在5 0g/L的氯化钠溶液中，氯化钙浓度0-130 g/L等范围内的表面张力。

（4）乳化性能的测定：取发酵液2 ml加入含有2 ml煤油的试管中，震荡5 min，静置24小时，测定其乳化指数。同时3 g/L的SDS溶液作为对照。

（5）实验结果：通过附图3的a-d图，可以看出其CMC为20mg/L，远低于化学类表面活性剂。并且其在酸碱、高温、高矿化度方面性能优越。

（6）乳化指数测定结果：发酵液与煤油的乳化指数为：64%；3g/L的SDS与煤油的乳化指数为：37%。结果表明在surfactin在较低浓度下其乳化效果强于常用表面活性剂。

实施例8-12

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用其它碳源和氮源以及营养成分代谢生产生物表面活性剂的情况。

培养方法采取实施例5所用的方法进行培养。

种子培养基中碳源取用毒性较大的10g/L的粗甘油，采用1g/L的酵母粉作为氮源。

实施例8-12中，发酵培养基中碳源分别选取粗甘油、葡萄糖、玉米糖化醪、甜高粱茎秆汁以及纤维素酶解液作为碳源。其相应浓度为甘油20 g/L；葡萄糖200 g/L；玉米糖化醪和甜高粱茎秆汁按比例稀释至其葡萄糖浓度为20-40 g/L的浓度范围；纤维素酶解液按需要将固含量稀释至30 %以下。

实施例8-12中，对照碳源的选择，其对应的氮源选用玉米浆、鱼粉、酵母膏、氨水、尿素其浓度分别为4 g/L、10 g/L、1 g/L、0.5 g/L、2 g/L。

实施例8-12中，分别加入2 g/L的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵作为磷源。

发酵结束后，测定脂肽类生物表面活性剂的浓度。

测定结果如表1所示：

实施例编号	Surfactin浓度（mg/L）
		实施例8	480
实施例9	323
		实施例10	876
实施例11	569
		实施例12	543

实施例13

本实施例说明甘油检测与脂肽类生物表面活性剂的检测方法

甘油检测方法采用高效液相色谱法检测。戴安U3000-GDP型高效液相色谱，RI检测器；

色谱柱：NH₂柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈：水=85:15，流速1.0ml/min；检测时间：15min。

脂肽类生物表面活性剂采用高效液相色谱法检测。戴安U3000-GDP型高效液相色谱，UV检测器；色谱柱：C18柱（250×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：0.05%三氟乙酸溶液=90:10，流速0.8ml/min；检测时间40min；检测波长214nm。

以上所述的实施方式仅仅是对本发明技术的优选实施方式进行的描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明技术的精神前提下，本领域工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34），于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC NO：M2014003。

2.一种生产脂肽类生物表面活性剂的方法，利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌G-34（Bacillus subtilis G-34）菌株进行发酵得到脂肽类生物表面活性剂产品，其特征在于，菌株在发酵过程中，可利用甘油作为唯一碳源。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程的具体步骤为：

b）取步骤a获得的菌体用于扩大培养，扩大培养条件为30~45℃、pH 7.0~8.0，培养时间为12-24h，扩大培养级数为1-3级；

c）按照体积百分比2%~10%的接种量将步骤b获得菌体接种于发酵培养基中，培养条件为30~45℃、pH 7.0~8.0，培养条时间为24-36h。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩大培养基或发酵培养基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种做为碳源，含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、氨水、尿素中的一种或几种做为氮源；并且含有、无机盐、氨基酸、微量元素。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、锰、镁、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙在内的多种微量元素。

7.根据权利4所述的培养基，其特征在于，所选碳源浓度以培养基中的葡萄糖计，其含量为1-200 g/L，优选40-80g/L；所选氮源浓度为0.5-20 g/L，优选2-10 g/L。

8.根据上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述甘油除来源于化学法合成甘油外，还包括化学法、生物法或超临界法生产生物柴油生产过程中的粗甘油。

9.权利要求1所述的菌株在发酵制备脂肽类表面活性剂中的应用。