CN105112476A

CN105112476A - 一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法

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Publication number: CN105112476A
Application number: CN201510176402.1A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 黄和; 刘强; 徐晴; 江凌
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2035-04-15
Also published as: CN105112476B

Abstract

本发明公开了一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，将枯草芽孢杆菌固定化于固体材料上，采用双阶段pH调控连续批次发酵工艺，有效提高了生产表面活性剂的效率。

Description

一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，涉及固定化枯草芽孢杆菌生产生物脂肽类表面活性剂的方法，特别涉及利用该菌株连续发酵生产脂肽类生物表面活性剂的双阶段pH调控方法。

背景技术

脂肽是由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链组成的一类化合物，其含有7-10个氨基酸组成的肽链和β-羟基脂肪酸链或β-胺基脂肪酸链，其中脂肪酸上的羟基或胺基与肽链氨基酸上的羟基结合形成内酯键或酰胺键，使肽链闭合形成环状脂肽。由于脂肽具有特殊的化学组成与两亲分子结构，因此在医药、食品、农业及微生物采油等领域有广阔的应用前景。通过微生物发酵生产可降解生物表面活性剂已成为国际生物工程领域中的一个新兴课题。

Arima于1968年首次发现，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）能产生具有抗生素作用的环状脂肽化合物，为结晶状脂肽类表面活性剂，商品名为表面活性素（Surfactin）。此后，研究人员通过不同的分离技术和结构鉴定手段，发现了多种脂肽表面活性剂surfactin的结构类似物。自被发现以来，表面活性素的表面活性一直最强，是迄今报道效果最好的生物表面活性剂之一（食品工业科技，2008,29(11)：296-298）。

脂肽类生物表面活性剂主要是通过微生物发酵方法制备，其生产菌一般是革兰氏阳性芽孢杆菌。一般的脂肽类表面活性剂生产菌的产量较低，其产量均小于1.0g/L，少的甚至在0.1g/L以下，要能达到较好的工业应用，通常需要对生产菌进行高产突变株的诱变选育和发酵工艺优化，目前，国内外研究者在诱变育种、培养基优化及发酵调控等方面开展了大量研究。

为提高表面活性素的产量，科学工作者尝试了多种发酵方式提高surfactin产量。Yeh等研究了活性炭、琼脂、膨胀粘土添加到培养液中对surfactin发酵的影响，结果表明添加25g/L的活性炭时，surfactin产量达到最大，是没有对照样的36倍（YehMS,WeiYH,ChangJS.EnhancedProductionofSurfactinformBacillussubtilisbyAdditionofSolidCarriers[J].BiotechnologyProgress,2005,21(4):1329-1334.）。汪文静等人研究了添加凹凸棒、活性炭、纱布等几种大表面积基质对发酵抗菌脂肽的影响，观察到芽孢杆菌在凹凸棒表面形成的生物被摸组织致密，粘附稳定，抗菌脂肽产量最高；而活性炭、纱布的生物被膜态菌体少于凹凸棒表面，产量也有所下降。

为了实现其工业化应用，研究者利用表面活性素在发酵过程中产生大量气泡的性质，采用泡沫分离技术分离提纯表面活性素。ChienYC等人借助泡沫分离技术收集发酵过程中产生的泡沫，泡沫破碎液中的生物表面活性剂的浓度是残留发酵液中的50倍左右；同时，其产量也有相应的提高（ChienYC,SimonCB,RichardCD,Batchproductionofbiosurfactantwithfoamfractionation[J]JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology,2006,81,1923-1931）。

现有发酵方法生产生物表面活性剂产量较低，分离成本较高，工业化生产不成熟。发明人在前期工作中发现，利用枯草芽孢杆菌生产表面活性素（Surfactin）的时候，其表面活性素的产生与分泌与pH值存在密切的关联关系。

因此，在此基础上开发发酵调控的方法及发酵方式会成为其工业化应用的关键点。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于，现有发酵方法生产生物表面活性剂产量较低，技术不成熟。

针对现阶段生物表面活性剂的生产问题，本发明的技术目的之一为提供了一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，以提高目标产品的产量以及生产效率。

为了实现技术目的，本发明的技术方案为：

本发明所述的方法，采用如下步骤进行发酵（1）取产脂肽类生物表面活性剂的菌株进行固体斜面活化培养；（2）将上述活化培养获得的菌株进行液体扩大培养，扩大培养级数为1-3级；（3）将扩大培养的菌体进行液体发酵；其中：所述液体扩大培养基中添加了固定化细胞载体，还包括了在液体发酵体系中固定化于发酵反应罐上的固定化细胞载体，且任一所述固定化细胞载体为毛巾、纱布、海藻酸钠、活性炭、膨胀土、琼脂、凹凸棒中的一种。

对于固定化细胞载体的应理解为可以从发酵液体系中吸附聚集细胞，且可以采用现有技术的方式分散存在于摇瓶体系，或者采用现有固定技术固定于发酵罐中，例如，在一个优选的实施方式中，将毛巾固定于发酵罐的挡板上，经过此种固定方式，固定化细胞载体可以有效聚集细胞，因此可以避免在生物表面活性产生时通过泡沫带出大量的菌体。

本发明所述的方法，其中，所述液体发酵的过程采用连续批次发酵的方法进行生物表面活性剂的生产，且连续批次发酵的批次生产数为2-8批次。

本发明所述的方法，其中，在连续操作条件下，将每次批次发酵结束后的发酵液与固定化细胞分离，并补充新的发酵液。

对于连续批次发酵的理解应理解为在首次发酵时，采用常规的方法接入菌种并进行发酵；在第一个发酵批次周期结束以后，分离倒出发酵液体，保留已固定化于固定化载体上的细胞，并继续补进第二个批次的发酵培养基，循环操作直至整个发酵培养周期的结束。

本发明所述的方法，其中，在连续批次发酵中，每个发酵批次发酵周期为24h；每个周期的前2~12h，pH控制在2~6，剩余的12~22h，pH控制在5~9。

对于分阶段的pH值应理解为，在整个周期的发酵控制中，环境对于菌体的调节采用了pH值调节的方案，即采用常规的pH调节方式实现本方案的pH值调节，如至少在每个发酵周期的前2h内，维持发酵体系pH值在2-6，优选4-6的范围，剩余时间在发酵周期内pH值控制为5-9；优选6-8；再如至多在发酵周期的前12h内，维持发酵体系pH值在2-5，优选2-4的范围，剩余时间在发酵周期内pH值控制为5-9；优选7-9；其中，更优的低pH(如pH2-4)的维持时间与高pH值的维持时间的确定为本方案中已经公开的技术。

本发明所述的方法，其中，扩大培养的培养条件为，30~45℃、pH7.0~8.0，培养时间为12~24小时。

本发明所述的方法，其中，扩大培养的接种至发酵培养的接种量为体积占比为接种液占发酵液2~10%体积。

本发明所述的方法，其中，发酵培养的条件为搅拌转速200~1000转/min；通气量0.1~1VVM；装液量为发酵罐总体积40%~80%；培养温度为30~45℃。

本发明所述的方法，其中，所述扩大培养基或发酵培养基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种作为碳源；含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、尿素、氨水中的一种或几种作为氮源；含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种作为无机盐，优选磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾；含有铜、钙、铁、锌、锰、镁等微量元素。其中所选碳源浓度以培养基中的葡萄糖计，其含量为1-200g/L，优选20-40g/L；所选氮源浓度为0.5-10g/L，优选1-5g/L。

对于本发明中的培养基的确定，可以理解为，现有技术中的培养方法即可满足本方案的要求。如，培养基中含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种作为碳源；含有黄豆饼粉、玉米饼粉、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、氨水、尿素中的一种或几种作为氮源；并且含有无机盐、氨基酸、微量元素等。

上述公开的培养基可以有效满足本发明的要求，为优选的实施方案之一。

本发明所述的方法，其中，所述括大培养的培养基的配方为：水，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；115℃灭菌30min，冷却待用。

所述发酵培养基的配方为：水，甘油20g/L，磷酸氢二钠10g/L，磷酸氢二钾3g/L，硝酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，使用1mol/L的磷酸调节pH为8.0。

对于本培养基，应理解为在连续批次发酵培养的至少第一个周期以后，细胞大量固定于体系的固定化载体中，因此在发酵培养基的补充过程中，即使采用生料补料的方式也可以满足本方案的发明目的，且该培养基的配方为该方案的优选方案。

本发明所述的方法，所用菌株为产表面活性素生产菌株，优选枯草芽孢杆菌G-34，于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCCNO：M2014003；还优选枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCICC23659，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

即可以理解为，本发明所述的方法，所使用菌株并不限于枯草芽孢杆菌G-34，即常规产生物表面活性剂，如表面活性素及其类似物的菌株均可实现该技术方案。

本发明的有益效果在于，采用该方法进行生物表面活性剂的发酵，可以有效提高发酵产量以及发酵效率，从而提高经济效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。

实施例1

本实施例说明枯草芽孢杆菌BacillussubtilisG-34在摇瓶中生产surfactin生物表面活性剂的方法步骤。其中BacillussubtilisG-34由本实验室分离，于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCCNO：M2014003。

具体的培养步骤如下：

（1）种子培养基配制：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L;121℃灭菌20min，冷却待用。

（2）发酵培养基配制：甘油20g/L，磷酸氢二钠10g/L，磷酸氢二钾3g/L，硝酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，使用磷酸（1mol/L）调节pH为8.0。115℃灭菌30min。冷却待用。

（3）种子培养：在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时，获得菌种种子。

（4）发酵培养：将上述步骤（3）中所获得种子液以10%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，摇床转速为200rpm，培养24小时，获得脂肽类生物表面活性剂发酵液。

（5）结果显示，发酵液中脂肽类生物表面活性剂浓度为478mg/L。

实施例2-8

本实施例说明不同固定化细胞载体对surfactin生产影响情况。

（1）培养方法采取实施例1所用的方法进行培养。

（2）在发酵培养基配制过程中每50ml的发酵培养基中，实施案例2-8中分别加入2.5g/L的活性炭、琼脂、膨胀粘土、凹凸棒、毛巾、纱布与海藻酸钠固定化载体。

（3）实施例2-8中，采取的对照样为实施例1中的样本。

（4）发酵结束后，测定脂肽类生物表面活性剂的浓度。

测定结果如表1所示：

表1

实施例编号	2	3	4	5	6	7	8
								Surfactin浓度（mg/L）	830	576	680	870	1200	1034	367

实施例9

本实施例说明在5L搅拌式发酵罐中获得surfactin的方法步骤。

（1）种子培养基配制：酵母浸粉5g/L;蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L。121℃，20min灭菌，冷却后备用。

（2）发酵培养基配制：甘油20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L；115℃灭菌30min。冷却待用。

（3）5L搅拌式发酵罐的改装，在排气口处，安装内径2cm，高25cm的泡沫分离柱，同时使用毛巾作为固定化材料固定在发酵罐内置挡板上，毛巾尺寸为15×44cm。

（4）种子培养：在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时，获得菌种种子。

（5）发酵培养：将上述步骤（4）中所获得种子液以5%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，300rpm，通气量为1VVM的条件下培养24h。其中前6h控制发酵pH在5.0，后18h的发酵pH在7.5。

（6）检测泡沫破碎液以及发酵残留液中surfactin含量；结果显示在发酵残留液中没有检测到surfactin，在泡沫破碎液中检测到surfactin产量为1674.1mg。

实施例10

本实施例说明在5L搅拌式发酵罐中连续批次发酵获得surfactin的方法步骤。

（3）补充发酵培养基配制：配制方法如步骤（2）

（4）5L搅拌式发酵罐的改装，在排气口处，安装内径3cm，高20cm的泡沫分离柱，同时使用毛巾作为固定化材料固定在发酵罐内置挡板上，毛巾尺寸为11×44cm。

（5）种子培养：在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，摇床转速为200rpm，培养12小时，获得菌种种子。

（6）发酵培养：将上述步骤（4）中所获得种子液以5%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，300rpm，通气量为1VVM的条件下连续批次培养；发酵pH始终控制在7.5。

（7）每批次培养周期为24小时，每批次结束后，排出发酵残留液体，同时补充2L步骤（3）所获得的发酵培养基，继续发酵。

（8）连续发酵至发酵残液剩余量达到1.5L时，结束发酵。

测量泡沫破碎液中每批次的surfactin产量及发酵残液中surfactin含量。实验结果发现，在发酵残液中没有surfactin残留，皆随着泡沫析出。

实验结果如表2所示：

表2固定化细胞连续批次发酵实验结果

批次	泡沫体积(L)	泡沫液中surfactin浓度（mg/L）	总产量（mg）
				1	1.43	1047.4	1496.9
2	0.65	960.7	620.5
				3	0.30	825.7	249.5

实施例10

本实施例说明在5L搅拌式发酵罐中连续批次、pH双阶段调控发酵获得surfactin的方法步骤。

（3）补充发酵培养基配制：配制方法如步骤（2）

（6）发酵培养：将上述步骤（4）中所获得种子液以5%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，300rpm，通气量为1VVM的条件下连续批次培养；

（7）每批次培养周期为24小时，每批次结束后，排出发酵残留液体，同时补充2L步骤（3）所获得的发酵培养基，继续发酵。每批次培养周期中，前8h控制发酵pH为4.0，后16h控制发酵pH为7.0。

（8）连续发酵至发酵残液剩余量达到1.5L时，结束发酵。

（9）测量泡沫破碎液中每批次的surfactin产量及发酵残液中surfactin含量。实验结果发现，在发酵残液中没有surfactin残留，皆随着泡沫析出。具体实验结果如表3所示：

表3固定化细胞连续批次、pH双阶段调控发酵实验结果

批次	培养基体积（L）	泡沫中surfactin浓度（mg/L）	泡沫量（L）	Surfactin产量（mg）
					1	2.5	782.05	1.5	1173.1
2	2	686.44	1.6	1098.3
					3	2	726.9	1.5	1090.4
4	2	861.9	1.3	1120.6
					5	2	643.2	1.6	1029.1
6	2	549.6	1.4	769.5
					7	2	519.5	1.5	779.3
8	2	346.9	1.03	357.3

实施例11

本实施例说明在5L搅拌式发酵罐中连续补料发酵获得surfactin的方法步骤。

（3）补充发酵培养基配制：甘油200g/L，磷酸氢二钾10g/L，硝酸铵20g/L，七水合硫酸镁2g/L，七水合硫酸亚铁0.2g/L；115℃灭菌30min。冷却待用。

（4）5L搅拌式发酵罐的改装，在排气口处，安装内径2cm，高40cm的泡沫分离柱，同时使用毛巾作为固定化材料固定在发酵罐内置挡板上，毛巾尺寸为10×44cm。

（6）发酵培养：将上述步骤（4）中所获得种子液以5%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于37℃，300rpm，通气量为1VVM的条件下连续补料培养。发酵12h后，开始以2ml/min的恒定流速补充步骤（3）获得的发酵培养基。

（7）每24h为一个培养周期，前7控制发酵pH为4.5，后17h控制发酵pH为7.5。

（8）连续发酵至发酵残液剩余量达到3L时，结束发酵。

（9）测量泡沫破碎液中surfactin的产量，结果如表4：

表4

发酵类型	发酵培养基体积（L）	泡沫液体积（L）	发酵时间（h）	Surfactin产量（mg）
					连续补料发酵	8	4.5	72	2367.1

实施例12

本实施例说明发酵代谢生产surfactin的中试实验过程。

（1）摇瓶种子培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；121℃，20min灭菌，冷却后备用。

（2）一级种子培养基：酵母浸粉2g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠8g/L，甘油5g/L；121℃，20min灭菌，冷却后备用。

（3）二级种子培养基：酵母浸粉1g/L，甘油10g/L，硝酸铵1g/L，磷酸氢二钾1g/L；115℃，30min灭菌，冷却后备用。

（4）发酵培养基：甘油20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硝酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L；115℃灭菌30min。冷却待用。

（5）摇瓶种子培养：将在步骤（1）中所获得培养基中接种一环枯草芽孢杆菌，于37℃，摇床转速为200rpm，培养12h，获得摇瓶种子液。

（6）一级种子培养：将步骤（5）所获得种子接种到步骤（2）所获得的培养基中，接种量为5%，于37℃，搅拌转速为200rpm，溶氧为20%，培养12h,获得一级菌种种子。

（7）二级种子培养：将步骤（6）所获得种子接种到步骤（3）所获得的培养基中，接种量为5%，于37℃，搅拌转速为200rpm，溶氧为20%，培养12h,获得二级菌种种子。

（8）发酵罐改造：在发酵罐排气口安装直径0.5m,长3m的泡沫分离柱，且在发酵罐内部安装固定化材料平板----活性炭板。

（9）发酵培养：将步骤（7）获得的二级种子接种到发酵培养基中，后进行批次连续发酵，每36h为一发酵周期，前10h控制pH为5.0，后26h控制pH为7.5。直至发酵残液大于发酵罐总装液量60%时停止发酵。

（10）结果显示，发酵残液中没有surfactin存在，泡沫破碎液中的surfactin浓度为615mg/L。

实施例13

本实施例说明surfactin的液相检测方法

脂肽类生物表面活性剂采用高效液相色谱法检测。赛默飞世尔科技U3000-GDP型高效液相色谱，UV检测器；色谱柱：C18柱（4.6×250mm,5μm）；流动相：甲醇：0.05%三氟乙酸溶液=90:10，流速0.8ml/min；检测时间40min；检测波长214nm；柱温35℃。

实施例14-18

本实施案例说明枯草芽孢杆菌利用其它碳源和氮源以及营养成分代谢生产生物表面活性剂的情况。

培养方法采用实施例9中所用的方法进行培养。

实施例14-18中，发酵培养基中碳源分别选取粗甘油、葡萄糖、玉米糖化醪、甜高粱茎秆以及纤维素酶解液做为碳源。其相应的浓度为粗甘油20g/L；葡萄糖200g/L；玉米糖化醪和甜高粱茎秆汁比例稀释至其葡萄糖浓度为20-40g/L的浓度；纤维素酶解液按需要将固含量稀释至30%以下。

实施例14-18中，对照碳源的选择，其对应的氮源选用玉米浆、鱼粉、酵母膏、氨水、尿素其浓度分别为4g/L、10g/L、1g/L、0.5g/L、2g/L。

实施例14-18中，分别加入2g/L的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵作为磷源。

发酵结束后，测定表面活性剂的产量。

测定结果如表5所示：

表5

实施例编号	Surfactin产量（mg）
		实施例14	684
实施例15	594
		实施例16	1036
实施例17	783
		实施例18	806

实施例19-20本实施例说明利用枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCICC23659进行发酵生产的情况，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实施例19-20具体实施情况跟实施例1与实施例11相似，其中实施例19采用实施例1的方式进行培养，实施例20采用实施例11的方式进行培养，不同之处在于，菌种采用BacillussubtilisCICC23659。

其实施结果如表6所示：

表6

实施例编号	Surfactin产量（mg）
		实施例19	276
实施例20	864

Claims

1.一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法，采用如下步骤进行发酵（1）取产脂肽类生物表面活性剂的菌株进行固体斜面活化培养；（2）将上述活化培养获得的菌株进行液体扩大培养，扩大培养级数为1-3级；（3）将扩大培养的菌体进行液体发酵；其特征在于：所述液体扩大培养基中添加了固定化细胞载体，还包括了在液体发酵体系中固定化于发酵反应罐上的固定化细胞载体，且任一所述固定化细胞载体为毛巾、纱布、海藻酸钠、活性炭、膨胀土、琼脂、凹凸棒中的一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体发酵的过程采用连续批次发酵的方法进行生物表面活性剂的生产，且连续批次发酵的批次生产数为2-8批次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在连续操作条件下，将每次批次发酵结束后的发酵液与固定化细胞分离，并补充新的发酵液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在连续批次发酵中，每个发酵批次发酵周期为24h；每个周期的前2~12h，pH控制在2~6，剩余的12~22h，pH控制在5~9。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩大培养的培养条件为，30~45℃、pH7.0~8.0，培养时间为12~24小时。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，扩大培养的接种至发酵培养的接种量为体积占比为接种液占发酵液2~10%体积。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养的条件为搅拌转速200~1000转/min；通气量0.1~1VVM；装液量为发酵罐总体积40%~80%；培养温度为30~45℃。

8.上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述扩大培养基或发酵培养基含有甘油、玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种作为碳源；含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏、酵母浸粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、尿素、氨水中的一种或几种作为氮源；含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种作为无机盐，优选磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钾；含有铜、钙、铁、锌、锰、镁等微量元素，其中所选碳源浓度以培养基中的葡萄糖计，其含量为1-200g/L，优选20-40g/L；所选氮源浓度为0.5-10g/L，优选1-5g/L。

9.上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，

所述扩大培养的培养基的配方为：水，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；115℃灭菌30min，冷却待用；所述发酵培养基的配方为：水，甘油20g/L，磷酸氢二钠10g/L，磷酸氢二钾3g/L，硝酸铵2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，使用1mol/L的磷酸调节pH为8.0。

10.上述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所用菌株为产表面活性素生产菌株；优选枯草芽孢杆菌G-34，于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCCNO：M2014003；还优选枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCICC23659，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。