CN106854669B

CN106854669B - 一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法

Info

Publication number: CN106854669B
Application number: CN201710072034.5A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 陈晨; 易高斌; 宋萍
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2017-02-09
Filing date: 2017-02-09
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2037-02-09
Also published as: CN106854669A

Abstract

本发明公开了一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）G‑34作为发酵菌株，以木糖为主要碳源进行发酵制备生物表面活性剂；所述菌株登记保藏号为CCTCC NO：M2014003。其中，所述的碳源为木糖、木糖母液或农业副产物酸解液；发酵的氮源选用廉价生物质废弃物如羽毛水解废液、味精发酵废液；发酵培养基中添加乙酸促进菌株发酵制备生物表面活性剂。本发明的方法高效利用廉价的农业废弃物为原料生产脂肽类生物表面活性剂，实现农业废弃物变废为宝，极大的降低了脂肽类生物表面活性剂的生产成本，为脂肽类生物表面活性剂的工业化生产提供了技术支持。

Description

一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法。

背景技术

脂肽类生物表面活性剂是枯草芽孢杆菌的次级代谢产物，最初是Arima在枯草芽孢杆菌发酵液中发现的。脂肽类生物表面活性剂分子主要由两部分组成，一部分是疏水的脂肪酸链，另一部分是亲水的肽环，这样的分子结构使脂肽类生物表面活性剂具有良好的表面活性，根据文献报道，脂肽类生物表面活性剂是迄今已报道的效果最好的表面活性剂之一。早在20世纪40年代，Zobell就指出，微生物产生的表面活性剂是微生物驱油的主要机制之一。随着石油资源日益紧缺以及人们对环保意识的加强，人们逐渐意识到生物表面活性剂驱油的重要性，近年来，各大石油公司也相继涉足微生物驱油领域，为生物表面活性剂的发展提供了巨大的支持。尽管脂肽类生物表面活性剂具有很大的应用潜力，但由于脂肽类生物表面活性剂的产量低、生产成本高等原因，使得脂肽类生物表面活性剂的生产和应用很受限制，目前几乎没有大规模生产脂肽类生物表面活性剂的公司。

目前，脂肽类生物表面活性剂的生产主要处于实验室研究阶段，主要生产方法为发酵法。发酵过程中所用到的碳源大多是葡萄糖或者甘油，氮源主要是硝酸铵、酵母膏或蛋白胨。昂贵的生产原料以及生产产量过低，使得脂肽类生物表面活性剂无法进行大规模生产。

为了提高脂肽类生物表面活性剂的产量，科学工作者做了很多努力和尝试，朱玲燕等人对枯草芽孢杆菌进行诱变，希望能得到更高产的菌株；刘强等人通过优化发酵工艺提高脂肽类生物表面活性剂的产量；Femke等人通过研究脂肽类生物表面活性剂合成的基因，利用代谢工程手段增加脂肽类生物表面活性剂的产量。为降低发酵原料成本，最近，也有一些学者使用橄榄油废液、大米抛光废料等廉价的原料生产脂肽类生物表面活性剂，但其产量方面很难满足人们的需要（橄榄油废液，发酵72h，产量13.7mg/L）。

我国秸秆资源丰富，但却不能得到有效的利用。根据吉林《调研信息报》的数据，吉林省的秸秆焚烧或者作燃料的占秸秆总量的81.24%，动物饲料占10.5%，能够有效利用的不足5%，其他各省情况类似。所以，如果秸秆能够得到有效的利用，将带来巨大的经济效益和环境效益。

玉米芯等秸秆作为发酵原料加以利用时，通常需要对其进行预处理，处理方法有稀酸水解、稀碱水解、酶处理等，其中稀酸水解（硫酸）是最常见的水解方法，稀酸水解后的主要产物是木糖(占总糖60-70%)。玉米芯稀酸水解过程中，会产生甲酸、乙酸、糠醛、5-羟基及糠醛等可能会抑制微生物生长代谢的物质。因此，在秸秆水解液用于生产有机酸、乙醇等的发酵利用过程中，通常使用Ca(OH)₂对秸秆水解液进行中和脱毒，通过形成硫酸钙沉淀的方式以达到降低或去除甲酸、乙酸、糠醛等抑制成分的目的。秸秆作为发酵原料，经处理后获得木糖和葡萄糖，其比例大致为1：2；但是，占总糖含量1/3的木糖却很难成为微生物高效利用的碳源；至少，目前还难以作为大宗产品（乙醇、有机酸）的发酵原料。因此，木糖的高效利用一直是困扰秸秆原料经济性的难题。选择秸秆原料中的木糖组分作为微生物生产脂肽类生物表面活性剂的发酵原料，将有助于大幅降低脂肽类生物表面活性剂的原料成本。

发明内容

针对现阶段脂肽类生物表面活性剂产量低，生产成本高等阻碍其工业化等缺陷，本发明的目的在于提供一种高效利用木糖的脂肽类生物表面活性剂的制备方法。

为了达到发明目的，本发明采用如下技术方案：

采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） G-34作为发酵菌株，以木糖为主要碳源进行发酵制备生物表面活性剂；所述菌株登记保藏号为CCTCC NO ：M2014003。

其中，所述碳源为木糖、木糖母液或农业副产物的酸解液。

农业副产物的酸解液可为玉米芯酸解液、秸秆酸解液，本发明中优选采用玉米芯酸解液或玉米秸秆酸解液。

所述玉米芯/玉米秸秆酸解液的制备方法具体为：将玉米芯/玉米秸秆粉碎为颗粒，玉米芯/玉米秸秆颗粒与浓度为2%的稀硫酸按照1：6的质量比混合后于90-100℃水解1h，冷却后过滤除渣，获取玉米芯/玉米秸秆酸解液，作为发酵的碳源。

优选的，所述玉米芯/玉米秸秆酸解液采用NaOH中和处理。使用NaOH中和玉米芯/玉米秸秆酸解液即可获得适于脂肽类生物表面活性剂发酵的碳源，摒弃了传统上针对秸秆酸解液使用的Ca(OH)₂脱毒工艺，大幅简化了玉米芯酸解液预处理的操作步骤。

作为本发明的进一步优选，发酵的氮源选用廉价有机氮源。本发明研究中发现，G-34菌株以木糖为碳源时，相比无机氮源，使用有机氮源能大大促进脂肽类生物表面活性剂的合成。而采用廉价有机氮源可以降低生产成本，所用的廉价有机氮源可为羽毛水解废液、味精发酵废液等。本发明采用的羽毛水解废液由江苏新汉菱生物工程股份有限公司(江苏，新沂)提供，是将羽毛采用酸水解提取L-胱氨酸、L-异亮氨酸等氨基酸后的废液，其主要成分含总氨基酸18-20%，NH₄Cl 20-25%，小肽及灰分2%。味精发酵废液由河南莲花味精股份有限公司（河南，项城）提供，是味精生产过程中产生的废液，脱除硫酸铵后，其主要成分含总氨基酸18-20%。本发明中优选采用羽毛水解废液作为氮源，采用羽毛水解废液作为有机氮源，成本低廉，并且脂肽类生物表面活性剂产量高。

作为本发明的进一步优选，在发酵培养基中添加乙酸。本发明发现在以木糖为碳源发酵G-34菌株生产脂肽类生物表面活性剂时，添加适量的乙酸，会促进脂肽类生物表面活性剂的生产。

本发明的方法具有如下有益效果：

（1）高效利用廉价的农业废弃物为原料生产脂肽类生物表面活性剂，实现农业废弃物变废为宝，极大的降低了脂肽类生物表面活性剂的生产成本；

（2）以农业副产物酸解液为碳源时，不采用繁琐的秸秆酸解液脱毒方法，节约了预处理成本，减少了操作步骤；

（3）对脂肽类生物表面活性剂的发酵原料进行了拓展，为脂肽类生物表面活性剂的工业化生产提供了技术支持。

具体实施方式

本发明实施例中，发酵过程的具体步骤如下：

a）取原始菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34，使用LB斜面培养基进行活化；

b）取步骤a获得的菌体接种于种子培养基中，种子培养条件为37℃、pH 7.5，培养时间为12~14h；

c）按照2%（v/v）的接种量取步骤b中所得的种子液接种于发酵培养基（250mL三角瓶，装液量50mL）中，发酵培养基培养条件为37℃。

d）发酵过程中，每隔12小时取一次样品，用来检测脂肽类生物表面活性剂的产量以及枯草芽孢杆菌的生物量。

实施例1

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用木糖生产脂肽类生物表面活性剂。

（1）种子培养基配制：酵母浸粉 5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L； 121℃灭菌20min，冷却待用。

（2）发酵培养基配制：木糖20-30g/L，七水合硫酸镁 0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，磷酸二氢钾10g/L，氮源分别为：羽毛水解废液、味精发酵废液、或酵母浸粉（氮源含N量为50-100mmol/L），使用NaOH溶液（6mol/L）调节pH为7.5。115℃灭菌20min。冷却待用。

羽毛水解废液由江苏新汉菱生物工程股份有限公司（江苏，新沂）提供，是将羽毛采用酸水解提取L-胱氨酸、L-异亮氨酸等氨基酸后的废液，其主要成分含总氨基酸18-20%，NH₄Cl 20-25%，小肽及灰分2%。

味精发酵废液由河南莲花味精股份有限公司（河南，项城）提供，是味精生产过程中产生的废液，主要成分含总氨基酸18-20%。

（3）种子培养：在步骤（1）中所获得的种子培养基中接种一环枯草芽孢杆菌G-34，并置于37℃，200rpm的摇床中培养12小时，获得菌种种子液。

（4）发酵培养：将上述步骤（3）中所获得种子液以2%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，并置于37℃，200rpm的摇床中培养60h，获得脂肽类生物表面活性剂发酵液。

（5）发酵结束后，通过DNS法测得培养基中木糖的含量变化，使用高效液相色谱仪检测surfactin的产量。

测定结果如表1所示：

表1 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34利用木糖和不同氮源发酵产生脂肽类生物表面活性剂(发酵时间60h)

实施例2

本实施例说明和常见的Ca（OH）₂中和脱毒相比，NaOH中和是更佳的玉米芯/玉米秸秆酸解液预处理的方法。

（1）种子培养基与实施例1中一致，培养方法采取实施例1中所采用的方法进行培养。

（2）发酵培养基：玉米芯酸解液或玉米秸秆酸解液（含总糖20g/L），羽毛水解废液（含N量为50mmol/L），七水合硫酸镁 0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，磷酸二氢钾10g/L，使用NaOH溶液（6mol/L）调节pH为8.0。115℃灭菌20min。冷却待用。

玉米芯/玉米秸秆酸解液的制备方法为：将玉米芯或玉米秸秆粉碎成颗粒，玉米芯或玉米秸秆颗粒与浓度2%的稀硫酸按照质量比1：6混合后于90-100℃水解1h，冷却后过滤除渣，获得玉米芯或玉米秸秆酸解液。

羽毛水解废液和实施例1采用相同方式制备。

本实施例玉米芯/玉米秸秆酸解液的处理方式分实验组和对照组两组，实验组中的酸解液使用Ca（OH）₂调节pH至10.0，然后使用H₂SO₄将pH调节至5.5，离心去除沉淀后使用；对照组中酸解液在添加完其他成分后，使用NaOH调节pH至8.0。

（3）发酵84h，发酵结束后，测定发酵液中脂肽类生物表面活性剂的含量。

表2 玉米芯酸解液和玉米秸秆酸解液中和方式对Bacillus subtilis G-34发酵产脂肽类生物表面活性剂的影响

实验编号	碳源(总糖20g/L)	酸解液中和方式	Surfactin浓度（mg/L）
				实验组1	玉米芯酸解液	Ca（OH）<sub>2</sub>中和脱毒	246.4
对照组1	玉米芯酸解液	NaOH中和	572.8
				实验组2	玉米秸秆酸解液	Ca（OH）<sub>2</sub>中和脱毒	221.5
对照组2	玉米秸秆酸解液	NaOH中和	513.6

实施例3

本实施例说明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis G-34对玉米芯酸解液中各种抑制成分具有很强的耐受性。

（2）发酵培养基：玉米芯酸解液（总糖30g/L），七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，磷酸二氢钾10g/L，氮源为羽毛水解废液（氮源含N量为50mmol/L），使用NaOH溶液（6mol/L）调节pH为7.8。115℃灭菌20min。冷却待用。实验组1-4中分别加入甲酸（65mmol/L）、乙酸（45mmol/L）、糠醛（12mmol/L）、5-羟甲基糠醛（12mmol/L）等生物质稀酸水解过程中产生的抑制成分。

采用实施例1中的样本作为对照组。

（3）发酵时间为60h，发酵结束后，测定脂肽类生物表面活性剂的浓度。

测定结果如表3所示：

表3 玉米芯酸解液中抑制物组分对Bacillus subtilis G-34发酵产脂肽类生物表面活性剂的影响

实验编号	抑制物组分及用量	脂肽类生物表面活性剂浓度（mg/L）
			实验组1	甲酸（65mmol/L）	199.2
实验组2	乙酸（45mmol/L）	531.6
			实验组3	糠醛（12mmol/L）	211.1
实验组4	5-羟甲基糠醛（12mmol/L）	284.2
			对照组	0	359.5

实施例4

本实施例说明乙酸可以促进Bacillus subtilis G-34利用木糖产脂肽类生物表面活性剂。

（2）发酵培养基配制成分与方法除另外加入的乙酸外，与实施例1相同，实验组1-4中分别加入33.3mmol/L乙酸、66.7mmol/L乙酸、100.0mmol/L乙酸、133.3mmol/L的乙酸。

采用实施例1中的样本作为对照组。

测定结果如表4所示：

表4 乙酸对Bacillus subtilis G-34以木糖为碳源发酵产脂肽类生物表面活性剂的影响

实验编号	添加乙酸浓度	脂肽类生物表面活性剂浓度（mg/L）
			实验组1	33.3mmol/L	448.4
实验组2	66.7mmol/L乙酸	500.5
			实验组3	100.0mmol/L乙酸	566.6
实验组4	133.3mmol/L的乙酸	489.2
			对照组	0	359.5

实施例5

本实施例说明Bacillus subtilis G-34利用木糖产脂肽类生物表面活性剂的优选配方。

（2）发酵培养基: 木糖26g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，磷酸二氢钾10g/L，氮源为羽毛水解废液（氮源含N量为65mmol/L），添加乙酸105mmol/L，使用NaOH溶液（6mol/L）调节pH为8.0。115℃灭菌20min。

（3）发酵时间为72h，发酵结束后，测定脂肽类生物表面活性剂的浓度，结果表明发酵液中surfactin产量达628.6±31.8mg/L。

实施例6

本实施例说明玉米芯酸解液中添加适量的乙酸也能促进脂肽类生物表面活性剂的生产。

（2）调整玉米芯酸解液中总还原糖浓度为25g/L，发酵培养基配制成分与方法除另外加入的乙酸外，与实施例2相同，实验组1-4中分别加入33.3mmol/L乙酸、66.7mmol/L乙酸、100.0mmol/L乙酸、133.3mmol/L乙酸。

采用实施例2中的样本作为对照组。

（3）发酵时间为84h，发酵结束后，测定脂肽类生物表面活性剂的浓度。

测定结果如表5所示：

表5 乙酸对Bacillus subtilis G-34以玉米芯酸解液为碳源发酵产脂肽类生物表面活性剂的影响

实验编号	添加乙酸浓度	脂肽类生物表面活性剂浓度（mg/L）
			实验组1	33.3mmol/L	597.1
实验组2	66.7mmol/L乙酸	718.8
			实验组3	100.0mmol/L乙酸	405.4
实验组4	133.3mmol/L的乙酸	187.6
			对照组	0	572.8

实施例7

本实施例说明以木糖母液（山东龙力生物科技有限公司提供，山东.禹城）为碳源时，添加适量的乙酸也能促进脂肽类生物表面活性剂的生产。

（2）发酵培养基配制成分与方法除碳源和另外加入的乙酸外与实施例1相同，将木糖母液稀释至总糖浓度为20-30g/L作为碳源，氮源为羽毛水解废液（氮源含N量为50-100mmol/L）。分别加入33.3-133.3mmol/L乙酸，对照组不添加乙酸。

测定结果如表6所示：

表6 乙酸对Bacillus subtilis G-34以木糖母液为碳源发酵产脂肽类生物表面活性剂的影响

以上所述的实施方式仅仅是对本发明技术的优选实施方式进行的描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明技术的精神前提下，本领域工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于，采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)G-34作为发酵菌株，以木糖、木糖母液或农业副产物的酸解液为碳源进行发酵制备生物表面活性剂；所述菌株登记保藏号为CCTCC NO：M2014003；

所述农业副产物的酸解液包括玉米芯酸解液、玉米秸秆酸解液；

所述玉米芯酸解液的制备方法具体为：将玉米芯粉碎为颗粒，玉米芯颗粒与浓度为2％的稀硫酸按照1：6的质量比混合后于90-100℃水解1h，冷却后过滤除渣，获取玉米芯酸解液，作为发酵的碳源；

所述玉米秸秆酸解液的制备方法具体为：将玉米秸秆粉碎为颗粒，玉米秸秆颗粒与浓度为2％的稀硫酸按照1：6的质量比混合后于90-100℃水解1h，冷却后过滤除渣，获取玉米秸秆酸解液，作为发酵的碳源；

发酵的氮源选用廉价有机氮源，包括羽毛水解废液、味精发酵废液；

所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素Surfactin。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述玉米芯/玉米秸秆酸解液采用NaOH中和处理。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵的氮源选用羽毛水解废液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基的成分为：碳源，有机氮源，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，磷酸二氢钾10g/L，使用NaOH溶液调节pH为7.5-8.0；

其中，所述碳源为木糖20-30g/L，或含总糖20-30g/L的玉米芯/玉米秸秆酸解液，或稀释至总糖浓度为20-30g/L的木糖母液；

所述氮源为羽毛水解废液或味精发酵废液，氮源含N量为50-100mmol/L。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，发酵培养基中添加乙酸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，乙酸添加浓度为33.3mmol/L～133.3mmol/L。