CN112063574B - 一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法。本发明使用番茄红素β‑环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉菌进行驯化，有效提高了三孢布拉氏霉菌对于咪唑等番茄红素β‑环化酶抑制剂的耐受性，驯化得到的三孢布拉氏霉菌的生物量、总色素产量以及番茄红素产量均显著提高，且总色素含量中番茄红素的含量也显著提高，有效降低了β‑胡萝卜素的含量，整体提高了三孢布拉氏霉菌产番茄红素的发酵生产性能。

Description

一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法。

背景技术

番茄红素(locopene，LYC)是类胡萝卜素中结构最为简单的一种色素，是一种强抗氧化剂,具有活化免疫细胞、预防癌症和冠心病等作用。番茄红素被联合国食品添加剂专家委员会(JECFA)认定为A类营养素，并被50多个国家和地区作为营养和着色双重作用的食品添加剂，广泛应用于保健食品、医药和化妆品工业。

微生物发酵法是番茄红素生产的最佳方法。目前，三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)是唯一能够实现β-胡萝卜素工业化生产的高产菌株。番茄红素是β-胡萝卜素的代谢中间产物，因此在发酵过程中需要加入阻断剂阻断番茄红素向β-胡萝卜素转化的环化反应，使番茄红素在细胞内大量积累。目前已知效果良好的阻断剂有咪唑、尼古丁和2-甲基咪唑等，其中咪唑已被用于工业生产。阻断剂的添加虽然能够促进番茄红素的积累，但是其会对菌体生长产生一定的抑制作用。同时，在相同条件下，加入阻断剂后所得的番茄红素的产量与未加入阻断剂时得到的β-胡萝卜素的产量相比明显降低。因此，解除阻断剂对于菌株的生长抑制作用，提高番茄红素的产量对于番茄红素的发酵生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法，该方法能够解除番茄红素β-环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉菌生长的抑制，提高发酵过程中三孢布拉氏霉菌的生物量，提高其番茄红素产量。

本发明利用番茄红素β-环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉菌进行驯化，以提高三孢布拉氏霉菌对β-环化酶抑制剂的耐受性，使得在添加β-环化酶抑制剂的发酵体系中，三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量和生物量显著提高。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明首先提供一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法，其为使用番茄红素β-环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉菌进行驯化。

以上所述的所述番茄红素β-环化酶抑制剂可选自咪唑、尼古丁、2-甲基咪唑中的一种或多种。

本发明的方法优选利用咪唑和/或2-甲基咪唑对三孢布拉氏霉菌进行驯化。更优选利用咪唑对三孢布拉氏霉菌进行驯化。

具体地，在驯化过程中，番茄红素β-环化酶抑制剂的添加浓度为0.1～1.5g/L。

为获得生长和生产性能优异的三孢布拉氏霉菌，以上所述驯化为多次驯化，在多次驯化过程中，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度大于第n次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度，其中n为≥1的自然数。

本发明经大量摸索确定了多次驯化过程中较优的β-环化酶抑制剂浓度变化方式，通过特异地设置多次驯化过程中β-环化酶抑制剂的浓度梯度，显著提高了驯化获得三孢布拉氏霉菌的生长和番茄红素发酵生产性能。

具体地，当n＝1时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高60％～100％；当n＝2时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高80％～150％；当n＝3时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高25％～40％。

优选地，所述番茄红素β-环化酶抑制剂为咪唑，第1～4次驯化的咪唑添加浓度依次为0.1～0.2g/L，0.25～0.4g/L，0.5～0.8g/L，0.6～1.1g/L。

本发明经大量实验验证发现，利用本发明的方法经4次驯化即可获得发酵生物量和番茄红素产量非常显著提高的三孢布拉氏霉菌。

若需要进一步提高三孢布拉氏霉菌的上述性能，可选择增加驯化次数，即进行大于4次的驯化。当进行第5次以及以后的驯化时，β-环化酶抑制剂的添加浓度可按照以下方式设置：

当n为＞4的自然数时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高25％～40％。

为与以上所述的番茄红素β-环化酶抑制剂浓度梯度设置配合作用，本发明进一步优化了驯化所用培养基的组成，本发明偶然发现，降低驯化培养基中的有机氮源含量能够促进三孢布拉氏霉菌的番茄红素β-环化酶抑制剂耐受性驯化。

具体地，所述驯化的培养基中有机氮源的含量不高于3.5％。

优选地，所述驯化的培养基中，有机氮源为酵母粉和/或黄豆饼粉，有机氮源的质量百分含量为1.5～3.5％。将有机氮源控制在上述范围内更有利于促进三孢布拉氏霉菌的生长和番茄红素生产性能提升。

具体地，除相应浓度的番茄红素β-环化酶抑制剂外，所述驯化的培养基还包括如下质量百分含量的组分：葡萄糖0.5-2％，黄豆饼粉1-2.5％，酵母粉0.5-1.0％，磷酸二氢钾0.05-0.1％，硫酸镁0.005-0.015％，植物油1-4％，谷氨酸钠0.01-0.05％。

以上所述的多次驯化过程中，每次驯化均进行三孢布拉氏霉菌的多次转接。

具体地，第n次驯化包括如下步骤：

(1)将初始待驯化的三孢布拉氏霉菌或前次驯化得到的三孢布拉氏霉菌接种于所述驯化的培养基中，于26～28℃振荡培养36～60h；

(2)将步骤(1)的培养液接种于与步骤(1)相同的新鲜驯化培养基中，于26～28℃振荡培养36～60h；

按照步骤(1)～步骤(2)的方法，重复转接4～6次，将最后一次转接获得的培养液进行固体培养基活化培养得到第n次驯化的菌株。

优选地，以上各步骤所述接种的接种量为体积百分含量1～4％。

三孢布拉氏霉菌是异宗接合菌，包括正菌B.trispora(+)和负菌B.trispora(-)两种单性菌株。三孢布拉氏霉菌发酵过程中主要生产者为负菌，正菌则通过分泌三孢酸等性激素激活负菌中番茄红素的代谢合成。一般地，三孢布拉氏霉菌发酵过程中，负菌的占比量较大，因此提高负菌对于咪唑等番茄红素β-环化酶抑制剂的耐受是至关重要的。同样地，三孢布拉霉正菌也需要提高其对于咪唑等番茄红素β-环化酶抑制剂的耐受性。

以上所述方法中，所述三孢布拉氏霉菌可为三孢布拉氏霉菌的正菌或负菌。本发明发现，在进行三孢布拉氏霉菌的正菌驯化时，以上所述方法还可显著提高其三孢酸的分泌量。

本发明进一步提供一种发酵生产番茄红素的方法，包括：发酵按照以上所述方法驯化得到的三孢布拉氏霉菌。

优选发酵使用的三孢布拉氏霉菌的正菌和负菌均为按照以上所述方法驯化得到。

针对驯化得到的三孢布拉氏霉菌，本发明对其发酵过程中番茄红素β-环化酶抑制剂的添加量和添加时间进行了优化，更进一步地提高了菌株的番茄红素产量。

优选地，发酵过程中添加以上所述方法中使用的所述番茄红素β-环化酶抑制剂，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加量为0.1～1g/L。更优选为0.7-0.85g/L。

优选地，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加时间为发酵的18～48h。更优选为18～24h。

以上所述发酵优选采用如下发酵培养基：

发酵培养基(质量百分含量)：3-6wt％葡萄糖，3-5wt％酵母粉，1-3wt％黄豆饼粉，0.4-1wt％磷酸二氢钾，0.5-1.5wt％硫酸镁，2-4wt％葵花籽油。

所述发酵优选采用如下种子培养基：

种子培养基(质量百分含量)：1-3wt％葡萄糖，2-4wt％黄豆饼粉，0.5-1.5wt％酵母粉，0.04-0.1wt％磷酸二氢钾，0.005-0.015wt％硫酸镁，0.02-0.04wt％谷氨酸钠和2-4wt％植物油溶液。

本发明的有益效果在于：利用本发明提供的驯化方法对三孢布拉氏霉菌进行驯化，可有效提高三孢布拉氏霉菌对于咪唑等番茄红素β-环化酶抑制剂的耐受性，驯化得到的三孢布拉氏霉菌生物量、总色素产量以及番茄红素产量均显著提高，且总色素含量中番茄红素的含量也显著提高，有效降低了β-胡萝卜素的含量。此外，在进行三孢布拉氏霉菌的正菌驯化时，本发明提供的驯化方法还可显著提高其三孢酸的分泌量，进一步提高正菌促进负菌产生番茄红素的能力。

本发明提供的驯化方法经多批次的大量实验验证均能够获得较未驯化菌株在咪唑存在的发酵体系中番茄红素产量以及三孢布拉氏霉菌生物量方面显著提高的三孢布拉氏霉菌，具有较好的重复性和稳定性，可在实践中用于三孢布拉氏霉菌的选育。

本发明提供的基于驯化得到的三孢布拉氏霉菌的发酵生产番茄红素的方法使得三孢布拉氏霉菌在添加咪唑等番茄红素β-环化酶抑制剂的培养环境中，表现出更优的生长性能和番茄红素生产性能，发酵产物中番茄红素的含量比例显著提高，不含或仅含有极少量的β-胡萝卜素，从而整体提高了番茄红素的发酵生产性能。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所使用的菌种信息如下：三孢布拉氏霉菌正菌为三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7251(+)，该菌株已于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014378，该菌株已在专利申请CN104531538A中公开。三孢布拉氏霉菌负菌为三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)BT7603(-)，该菌株已于2014年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2014379，该菌株已在专利申请CN104531538A中公开。

实施例1三孢布拉氏霉菌的驯化(1)

1、斜面培养：取三孢布拉氏霉菌负菌的孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天。

2、驯化培养：

(1)第1次驯化：

从步骤1培养得到的负菌的PDA斜面上用接种铲铲取一铲正菌/负菌，接种到含有150ml的驯化培养基的1000ml三角瓶中，于28℃、220rpm条件下培养48小时，获得第1批负菌培养液；

将第1批驯化得到的负菌培养液按接种量2％转接至新的驯化培养基中，于28℃、220rpm条件下培养48小时，获得第2批负菌培养液；

按照上述第1批培养到第2批培养的方法(计为转接1次)，继续转接培养，共转接5次，将最后1次培养得到的负菌培养液接种到PDA斜面进行斜面培养，获得第1代咪唑驯化的菌株。

2、第2～4次驯化：将第1代咪唑驯化的菌株接种于驯化培养基中进行第2次驯化，驯化方法同第1次驯化，获得第2代咪唑驯化的菌株。按照同样的方法进行第3次、第4次驯化，以第4次驯化得到的第4代咪唑驯化的菌株作为最终驯化菌株。

驯化培养基的配方如下：各次驯化对应浓度的咪唑，葡萄糖1wt％，黄豆饼粉1.75wt％，酵母粉0.75wt％，磷酸二氢钾0.07wt％，硫酸镁0.01wt％，葵花籽油2wt％，谷氨酸钠0.03wt％。各次驯化的驯化培养基中，咪唑的浓度如下：第1次，0.15g/L；第2次0.3g/L；第3次，0.75g/L；第4次，1g/L。

三孢布拉氏霉菌正菌的驯化方法同以上所述的负菌的驯化方法。

将本实施例得到的驯化菌作为第一批次驯化三孢布拉氏霉菌。

实施例2三孢布拉氏霉菌的驯化(2)

取三孢布拉氏霉菌负菌和正菌的孢子悬液(与实施例1的孢子悬液为不同批次)，重复实施例1的驯化过程，得到第二批次驯化三孢布拉氏霉菌。

实施例3三孢布拉氏霉菌的驯化(3)

取三孢布拉氏霉菌负菌和正菌的孢子悬液(与实施例1和2的孢子悬液为不同批次)，重复实施例1的驯化过程，得到第三批次驯化三孢布拉氏霉菌。

实施例4三孢布拉氏霉菌的驯化(4)

本实施例提供的对三孢布拉氏霉菌负菌的驯化方法与实施例1的区别仅在于每次驯化转接次数为4次，各次驯化的驯化培养基中，咪唑的浓度如下：第1次，0.2g/L；第2次0.4g/L；第3次，0.8g/L；第4次，1g/L，得到第四批次驯化三孢布拉氏霉菌。

实施例5驯化得到的三孢布拉氏霉菌的发酵

对实施例1～4中驯化得到的三孢布拉氏霉菌进行发酵实验，具体方法如下：

1、种子培养：分别从驯化得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌株的PDA斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，再分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于28℃、220rpm条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。

2、发酵培养：将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌种子液的体积比为1:7(即1ml正菌种子液，7ml负菌种子液)接种至装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于28℃，220rpm条件下培养。在发酵过程中添加咪唑，添加量(咪唑在发酵体系中的终浓度)为0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.85g/L或1g/L，添加时间为18h或24h。

以上所用的培养基配方如下：

PDA斜面培养基(g/L)：葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；其配制方法可参考如下：将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉即可。

种子培养基(质量百分含量)：1wt％葡萄糖，3.5wt％黄豆饼粉，1.5wt％酵母粉，0.07wt％磷酸二氢钾，0.01wt％硫酸镁，0.03wt％谷氨酸钠和2wt％葵花籽油。

发酵培养基(质量百分含量)：3wt％葡萄糖，3wt％酵母粉，1.5wt％黄豆饼粉，0.07％磷酸二氢钾，0.01wt％硫酸镁，4wt％

3、发酵产物的检测方法：

番茄红素的检测方法如下：

准确称量0.02g干菌体，用酸热法破壁后，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测番茄红素产量。其中，高效液相色谱检测方法参考如下：

(1)色谱条件：波长：472nm；流速：0.5ml/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；

(2)流动相配制及条件：A相：甲醇；B相：称取50mg BHT至1L容量瓶中，加20ml异丙醇溶解，加入0.2ml N,N-二异丙基乙胺，25ml 0.2％醋酸铵溶液，455ml乙腈，450ml甲醇，溶液恢复至室温，并用甲醇稀释至刻度。

β-胡萝卜素(BC)的检测方法如下：

(1)色谱条件：波长：455nm；流速：1ml/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；

(2)流动相配置及条件检测：流动相为乙腈：水(9:1)，乙酸乙酯梯度洗脱。

三孢酸的检测方法如下：

(1)色谱条件：波长：325nm；流速：1.mL/min；进样体积：10μL；

(2)流动相配制及条件：A相：甲醇；B相：0.1％TFA超纯水，甲醇从50％开始35min内线性升为70％。

生物量的检测方法如下：

发酵完毕后，搅匀取样，过滤得到菌丝体后，烘干称重，根据菌丝体的重量计算得到生物量。

所有检测结果取三次平行试验的平均值。

未驯化三孢布拉氏霉菌的生物量、番茄红素产量的检测结果如表1所示，其中，LYC占产物的质量百分含量的计算公式如下：LYC占产物的质量百分含量＝LYC质量/(LYC质量+BC质量)。

表1未驯化三孢布拉氏霉菌的检测结果

以上结果表明，未驯化三孢布拉氏霉菌的发酵过程中，咪唑于24h添加较为合适，但其生物量较未添加咪唑的降低4-40％，咪唑添加量0.3-0.7g/L时的β-胡萝卜素(BC)含量依然偏高(12-28％)。

第一批次驯化后的三孢布拉氏霉菌(实施例1)的生物量、番茄红素产量的检测结果如表2所示。

表2第一批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的发酵结果

第二批次驯化后的三孢布拉氏霉菌(实施例2)的生物量、番茄红素产量的检测结果如表3所示。

表3第二批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的发酵结果

第三批次驯化后的三孢布拉氏霉菌(实施例3)的生物量、番茄红素产量的检测结果如表4所示。

表4第三批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的发酵结果

实施例4得到的驯化后的三孢布拉氏霉菌的生物量和LYC产量情况与实施例1相当。

以上结果表明，驯化后的三孢布拉氏霉菌的发酵过程中，不添加咪唑时，生物量比未驯化菌株显著提高；在18h添加相同浓度的咪唑时，对其生物量的影响较未驯化菌株显著降低，番茄红素的产量和总色素中的占比均显著高于未驯化三孢布拉氏霉菌。可见，在相同条件下发酵，与未驯化菌株相比，利用本发明的驯化方法获得的三孢布拉霉正、负菌菌株的细胞干重和番茄红素产量均显著提高。

实施例6驯化得到的三孢布拉氏霉菌正菌的三孢酸分泌检测

对实施例1～4得到的驯化后三孢布拉氏霉菌正菌的三孢酸分泌情况进行检测。斜面、种子和发酵培养基的配方和发酵条件同实施例5。发酵分为两组：(1)取驯化后的正菌同未驯化的负菌种子液接入发酵瓶中，(2)取未驯化的正菌同未驯化的负菌种子液接入发酵瓶中。正菌和负菌的接种比例为1：7。为保证对生物量的影响较小，于24h添加咪唑至0.3g/L。

在发酵进行到48h时检测发酵液中三孢酸，三孢酸含量检测结果显示，第一批次(实施例1)、第二批次(实施例2)、第三批次(实施例3)的驯化正菌+未驯化负菌的发酵液中三孢酸含量比较未驯化正菌+未驯化负菌分别提高16％，22％和17％。可见，在负菌均未进行驯化的情况下，利用本发明的驯化方法能够进行正菌的驯化能够提高三孢酸的分泌。

第一批次、第二批次、第三批次的驯化正菌+未驯化负菌以及未驯化正菌+未驯化负菌的发酵生物量和色素产量的检测结果分别如表5、表6和表7所示，其中，色素的质量为LYC与BC的总质量。结果表明，在负菌均未进行驯化的情况下，驯化正菌可显著提高发酵的色素产量，进一步验证了驯化正菌能够提高三孢酸的分泌。

表5第一批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的生物量和色素产量的检测结果

	驯化正菌+未驯化负菌	未驯化正菌+未驯化负菌
			生物量(g/L)	42	40
色素占干菌体的质量百分数	6.1％	5.2％

表6第二批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的生物量和色素产量的检测结果

	驯化正菌+未驯化负菌	未驯化正菌+未驯化负菌
			生物量(g/L)	41	39
色素占干菌体的质量百分数	7.0％	5.6％

表7第三批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的生物量和色素产量的检测结果

	驯化正菌+未驯化负菌	未驯化正菌+未驯化负菌
			生物量(g/L)	40	40
色素占干菌体的质量百分数	6.6％	5.4％

利用实施例4得到的驯化后的三孢布拉氏霉菌进行上述发酵实验，其三孢酸、生物量和色素产量情况与实施例1相当。

实施例7三孢布拉氏霉菌的驯化(第五批次)及其发酵

取三孢布拉氏霉菌负菌和正菌的孢子悬液分别进行驯化，驯化方法与实施例1的区别仅在于用于驯化的培养基的有机氮源含量与种子培养基相同。

驯化用培养基的配方：1wt％葡萄糖，3.5wt％黄豆饼粉，1.5wt％酵母粉，0.07wt％磷酸二氢钾，0.01wt％硫酸镁，0.03wt％谷氨酸钠和2wt％葵花籽油。

将得到的驯化后三孢布拉氏霉菌进行发酵验证，发酵方法同实施例5。

发酵的生物量和产物检测结果如表8所示，在不添加咪唑时，驯化后三孢布拉氏霉菌的LYC产量提升略差于实施例1的驯化方法。

表8第五批次驯化后的三孢布拉氏霉菌的生物量和色素产量的检测结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (17)

1.一种提高三孢布拉氏霉菌的番茄红素产量的方法，其特征在于，使用番茄红素β-环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉菌进行驯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述番茄红素β-环化酶抑制剂为选自咪唑、尼古丁、2-甲基咪唑中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述所述番茄红素β-环化酶抑制剂为咪唑和/或2-甲基咪唑。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，驯化过程中，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加浓度为0.1～1.5g/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述驯化为多次驯化，驯化过程中，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度大于第n次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度，其中n为≥1的自然数。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，n＝1时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高60％～100％；n＝2时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高80％～150％；n＝3时，第n+1次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度较第n次驯化的番茄红素β-环化酶抑制剂添加浓度提高25％～40％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的番茄红素β-环化酶抑制剂为咪唑，第1～4次驯化的咪唑添加浓度依次为0.1～0.2g/L，0.25～0.4g/L，0.5～0.8g/L，0.6～1.1g/L。

8.根据权利要求1～3、5、6、7任一项所述的方法，其特征在于，所述驯化的培养基中有机氮源的含量不高于3.5％。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述驯化的培养基中，有机氮源为酵母粉和/或黄豆饼粉，有机氮源的质量百分含量为1.5-3.5％。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，除相应浓度的番茄红素β-环化酶抑制剂外，所述驯化的培养基还包括如下质量百分含量的组分：葡萄糖0.5-2％，黄豆饼粉1-2.5％，酵母粉0.5-1.0％，磷酸二氢钾0.05-0.1％，硫酸镁0.005-0.015％，植物油1-4％，谷氨酸钠0.01-0.05％。

11.根据权利要求5～7、9、10任一项所述的方法，其特征在于，驯化过程中，第n次驯化包括如下步骤：

(1)将未驯化的三孢布拉氏霉菌或前次驯化得到的三孢布拉氏霉菌接种于所述驯化的培养基中，于26～28℃振荡培养36～60h；

(2)将步骤(1)的培养液接种于与步骤(1)相同的新鲜驯化培养基中，于26～28℃振荡培养36～60h；

按照步骤(1)～步骤(2)的方法，重复转接4～6次，将最后一次转接获得的培养液进行固体培养基活化培养得到第n次驯化的菌株。

12.根据权利要求1～3、5～7、9、10任一项所述的方法，其特征在于，所述三孢布拉氏霉菌为三孢布拉氏霉菌正菌或三孢布拉氏霉菌负菌。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述三孢布拉氏霉菌为三孢布拉氏霉菌正菌或三孢布拉氏霉菌负菌。

14.一种发酵生产番茄红素的方法，其特征在于，包括：发酵按照权利要求1～13任一项所述的方法驯化得到的三孢布拉氏霉菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，发酵过程中添加权利要求1～13任一项所述的方法使用的番茄红素β-环化酶抑制剂，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加量为0.1～1g/L；

和/或，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加时间为发酵的18～48h。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加量为0.7-0.85g/L。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述番茄红素β-环化酶抑制剂的添加时间为18-24h。