CN115322910B - 一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用 - Google Patents
一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用，属于微生物诱变和发酵技术领域；本发明以能够代谢葡萄糖生产D‑阿拉伯糖醇的鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)为出发菌株，经过常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变筛选得到了一株能够利用葡萄糖有效生产D‑阿拉伯糖醇的突变株，有效提升了天然菌株的发酵能力，所述突变株记为鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年1月14日，保藏地址为中国武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2022075。
Description
技术领域
本发明微生物诱变和发酵技术领域，具体涉及一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用。
背景技术
阿拉伯糖醇(D-arabitol)，是一种天然的五碳多元糖醇，其分子式为C5H12O5，分子量 152.15。D-阿拉伯糖醇是一种重要的功能性食品添加剂，其具有热量低、能够抑制致龋细菌生长、可作为合成药物或高附加值化学品的中间物等特点，在食品、医药、化工等众多领域的发展前景十分广阔。
目前，阿拉伯糖醇的生产方法有自然提取法、化学合成法和生物合成法。自然提取法底物昂贵，提取过程难度较大，在经济和产量上无法满足需求。化学合成法需要昂贵的催化剂、较高的能源消耗、严苛的实验条件以及高成本的生产设备，此外还存在环境污染的问题，这使得D-阿拉伯糖醇的生产难以满足各领域的市场需求。生物法利用微生物将来源广泛、价格低廉的底物如葡萄糖等转化为D-阿拉伯糖醇的过程。这种方法的优势在于，经济成本低廉，生产过程无需高温高压等严格条件，不产生对环境有害的废弃物，可以实现较低成本的大规模工业生产，符合绿色可持续的健康发展理念。但是目前报道菌株中可运用到工厂生产的菌株较少，且优化产量的方式多为简单的发酵优化，对菌株生产能力提升有限。
发明内容
针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用。本发明以能够代谢葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)为出发菌株，经过常压室温等离子体(Atmospheric and Room TemperaturePlasma,ARTP)诱变筛选得到了一株能够利用葡萄糖有效生产D-阿拉伯糖醇的突变株，有效提升了天然菌株的发酵能力。
本发明中首先提供了一种鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年1月14日，保藏地址为中国，武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2022075。
进一步的，所述鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075在YPD平板的菌落形态呈现为规则的圆形白色单一菌株；所述鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075经ITS rDNA 分子生物学特征鉴定，属于Zygosaccharomyces rouxii M75。
本发明中还提供了一种诱变筛选上述鲁氏酵母的方法，具体包括如下步骤：
(1)菌株的活化：
以鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)为出发菌株，采用平板划线培养，挑取单菌落在液体培养基中活化培养；
(2)ARTP诱变处理：
将活化后的鲁氏酵母培养至对数期，收集后重悬稀释处理，然后对稀释后的鲁氏酵母进行ARTP诱变处理；
(3)诱变后的鲁氏酵母的培养：
将诱变处理后的鲁氏酵母震荡洗脱，洗脱后稀释，然后涂布于新鲜YPD平板上培养，挑取菌落形态良好的单菌落在液体培养基中活化；
(4)菌株的筛选：
将液体活化后的鲁氏酵母接种至发酵培养基中发酵，发酵结束后取发酵液加入碘硝基四氮唑紫(INT)溶液和pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，置于37℃下暗处震荡，得到反应物，选取颜色比较明显的菌株保存；
(5)菌株的复筛：
将步骤(4)中保存的菌株活化，然后进行摇瓶发酵，发酵结束后取发酵液进行高效液相色谱(HPLC)分析，通过比较D-阿拉伯糖醇产量，筛选出产量较高的诱变菌株。
进一步的，步骤(1)中，所述活化培养的条件为：在30℃、200rpm的条件下摇床培养20h。
进一步的，步骤(2)中，所述稀释处理是将鲁氏酵母的浓度稀释至106～108个/mL。
进一步的，步骤(2)中，所述诱变处理的参数为：气体流量10slm，射频功率100～120 W、处理时间80s、距处理源距离2mm。
进一步的，步骤(3)中，所述稀释为稀释至10-1～10-6个/mL。
进一步的，步骤(3)中，所述培养的条件为在30℃培养48-72h。
进一步的，步骤(4)中，所述发酵的条件为：接种5v％液体活化后的鲁氏酵母，在30℃， 200rpm下发酵36h。
进一步的，步骤(4)中，所述发酵液、碘硝基四氮唑紫溶液和Tris-HCl缓冲液的体积比为1:2:2。
进一步的，步骤(5)中，所述摇瓶发酵的条件为：30℃、200rpm条件下发酵72h。
本发明中还提供了上述鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075在发酵生产D-阿拉伯糖醇中的应用。
本发明中还提供了一种D-阿拉伯糖醇的生产方法，所述方法为采用上述鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075在培养基中发酵生产；
所述发酵生产的条件为：培养温度28-30℃、接种量为体积比3-5％、摇床转速180-200rpm、发酵时间为72-96h；
所述培养基为葡萄糖250-300g/L，酵母提取物10-12g/L，蛋白胨10-12g/L，硫酸铵1-3 g/L，反丁烯二酸8-10g/L，Triton X-100接种量为体积分数1-2％。
进一步的，所述发酵生产的条件为：培养温度30℃、接种量为体积比5％、摇床转速200 rpm、发酵时间为96h。
进一步的，所述培养基为：葡萄糖300g/L，酵母提取物12g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵1g/L，反丁烯二酸10g/L，Triton X-100接种量为体积分数1.5％。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明中，采用INT比色法初筛诱变菌株可以大幅提高筛选效率。微生物代谢葡萄糖生成D-阿拉伯糖醇的过程中，涉及多步的脱氢反应，D-阿拉伯糖醇的产量与脱氢酶的活性息息相关。脱氢酶反应提供的H+能够将INT还原成紫红色，通过颜色深浅表征发酵液中D-阿拉伯糖醇的产量，颜色越深，D-阿拉伯糖醇产量越高。
本发明以鲁氏酵母为出发菌株，诱变得到可稳定遗传的高产菌株，筛选方法简单高效，提高了筛选D-阿拉伯糖醇生产菌株的筛选效率，并且其产量较原始菌株有大幅提升。出发菌株在发酵96小时后，D-阿拉伯糖醇产量为28.08g/L，而相同条件下，诱变菌株M 075产量达到42.01g/L，产量提高了49.6％。且诱变菌株的遗传稳定性良好，经10次传代后产量仍能保持较高水平。对基因改造在生产D-阿拉伯糖醇领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为INT与发酵液反应后的比色图。
图2为高效液相色谱法筛选结果图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
下列实施例中未注明具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。除特殊注明外，本发明所采用的均为该领域现有技术。所述出发菌株鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)可以为通过购买或者自行筛选得到的任意鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。
实施例1：鲁氏酵母ST 109的诱变处理
将自行筛选的出发菌株鲁氏酵母ST 109在YPD平板进行活化培养，挑取单菌落于新鲜YPD液体培养基(葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L，pH 7.0)中，控制培养温度30℃、装液量20％(250mL三角瓶装50mL培养基)、转速200rpm的条件培养20h。然后吸取1mL培养后的菌液，离心后用无菌生理盐水重悬，适当稀释至细胞浓度OD600＝1.0；吸取10μL菌液均匀涂布在灭菌冷却后的载片上，进行ARTP诱变处理。所述ARTP诱变的条件为：以高纯氦气为载气，射频功率为100W，气体流量10slm，处理时间80s。
对ARTP诱变处理后的菌体进行涂布培养，将处理过的菌梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5、10-6倍后，涂布于新鲜的YPD平板上，在温度30℃的条件下培养时间48h。培养结束后，挑选菌落形态良好的菌株进行液体培养并保存。
将液体培养菌株，按照5v％接种量分别接种于发酵培养基(葡萄糖200g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉3g/L、硫酸铵2g/L，pH 7.0)中，进行D-阿拉伯糖醇产量的初筛，每个菌株做三组平行实验，在30℃、200rpm条件下，发酵36h。取发酵液40μL分别加入2mg/mL的 INT溶液80μL和pH 8.5Tris-HCl缓冲液80μL，然后置于37℃下，暗处震荡30min，根据反应后颜色的深浅进行初步筛选。
将初筛得到的菌株进行摇瓶发酵，按照体积比5％的接种量接种于发酵培养基中，250mL 三角瓶装液量50mL，在30℃，200rpm条件下，发酵96h，取样离心后用HPLC测定D-阿拉伯糖醇产量。结果显示，在筛选得到的菌株中有一株突变株D-阿拉伯糖醇的产量达到42.01g/L，与原始菌株28.08g/L相比，产量提升了49.6％。
对筛选得到的诱变菌株进行分子生物学鉴定，挑取待鉴定菌株的单菌落于1mL无菌水中，沸水浴10min处理后，作为PCR模板。采用真菌的通用引物如下所示：
ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQ ID No:1)；
ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID No:2)。
PCR条件为：98℃预变性2min，94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s，反应 33个循环，72℃终延伸1min。将得到的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送测，在 NCBI核酸序列数据库中通过BLAST进行同源序列比对，诱变菌株测序结果如SEQ ID No:3 所示：
SEQ ID No:3：
5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATAGAAAATGACGTGAACTCTTAACG GAGTTCTCTCAAAGTGTTGGAGGGGAAGGCCTGCGCTTAATTGCGCGGCTGTTTTTAATCTCCTCCGCCTTTGATACACACATTGGAGTTTCTACTTTTTTGTTCTCTTTGGGAGGGTTC TACTCTCCCAGAGGTAAACACAAACAATTTTTTTTATTATACTATTAACACAGTCAAATGAATTTTAAAAACAAAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATG AAGAACGCAGCGAACTGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCCTCTCAAACTTTACGTTTGGTAGTGAGCGATACTCTACTCTGGAGTTTGCTTGAAAAT GGGAGGCCATAGGCGAAGCATTGCTTTCCAATCCTGCGGCCCTCTGCTTACTTCCCCTTGTGGGTTGTGGCAGGGGAAAGCGGGAGGCGCCTTGCCACGATAGTCGTATTAGGTTTTAC CGACTCGGCGAAAGTGAAGAGGTTTGCTTTTTAAAAAGAAGCAGGCAGCGTCTGGCTTGACAAAATTCTCAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAGGA-3’
对得到的诱变菌株进行YPD平板划线，发现诱变菌株的菌落形态与出发菌株一致，呈现为规则的圆形白色单一菌株。经ITS rDNA分子生物学特征鉴定，诱变菌株M 075同属于Zygosaccharomyces rouxii M75，命名为鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075，并将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年1月14日，保藏地址为中国，武汉，保藏号为CCTCC NO：M 2022075。
实施例2：鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075发酵生产D-阿拉伯糖醇
(1)培养条件对鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075发酵的影响
通过单因素试验，研究鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075最适培养条件。其中包括，培养温度、接种量、摇床转速和发酵时间等发酵条件，以获得生产D-阿拉伯糖醇的最佳培养条件。所述发酵生产的条件为：培养温度28-30℃、接种量为体积比3-5％、摇床转速 180-200rpm、发酵时间为72-96h。
通过控制单一变量，优化得到的最适培养条件为培养温度30℃、接种量为体积比5％、摇床转速200rpm、发酵时间为96h。
(2)培养基对鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075发酵的影响
培养基成分涉及基础的碳源、氮源以及添加物，这些因素共同影响菌株生产D-阿拉伯糖醇的能力。所述培养基为葡萄糖250-300g/L，酵母提取物10-12g/L，蛋白胨10-12g/L，硫酸铵1-3g/L，反丁烯二酸8-10g/L，Triton X-100接种量1-2％。
为进一步提高D-阿拉伯糖醇产量，本实施例中通过单因素实验，对葡萄糖浓度、氮源浓度、添加物浓度进行优化。
优化后的培养基成分为：葡萄糖300g/L，酵母提取物12g/L，蛋白胨12g/L，硫酸铵1g/L，反丁烯二酸10g/L，Triton X-100接种量1.5％。
(3)优化发酵条件后D-阿拉伯糖醇产量验证
经过对发酵条件优化后，在培养温度30℃、摇床转速200rpm，发酵96h，D-阿拉伯糖醇产量达到了58.19g/L。突变株在经过诱变与发酵条件的优化后，D-阿拉伯糖醇产量相较于原始菌株的28.08g/L提高了近一倍，使Z.rouxii生产能力大大提升。
(4)鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)M 075遗传稳定性验证
按照上述方法诱变筛选得到的高产菌株，每隔18h进行传代一次，取每次传代菌株进行发酵实验，30℃，200rpm发酵96h，然后用HPLC检测D-阿拉伯糖醇的产量；共传代10代，每代做3个平行样品，检测结果如表1所示。其中，所使用HPLC的条件如下：色谱柱为Bio-radAminex HPX-87H，流动相为5mM H2SO4溶液，流速0.6mL/min，柱温65℃；进样量为10μL。
表1.不同传代次数下D-阿拉伯糖醇的产量
| 传代次数 | D-葡萄糖残余量g/L | D-阿拉伯糖醇产量g/L |
| 第一代 | 25.57 | 57.81 |
| 第二代 | 25.76 | 56.92 |
| 第三代 | 22.95 | 58.34 |
| 第四代 | 22.54 | 58.19 |
| 第五代 | 27.14 | 55.42 |
| 第六代 | 27.03 | 54.68 |
| 第七代 | 27.36 | 55.46 |
| 第八代 | 25.35 | 56.07 |
| 第九代 | 23.65 | 56.85 |
| 第十代 | 24.65 | 55.44 |
如表1所示，经传代10次后，其D-阿拉伯糖醇产量仍能保持较高水平，没有出现大幅衰弱情况，具有良好的遗传稳定性。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种鲁氏酵母及其诱变筛选方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 727
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta tagaaaatga cgtgaactct taacggagtt 60
ctctcaaagt gttggagggg aaggcctgcg cttaattgcg cggctgtttt taatctcctc 120
cgcctttgat acacacattg gagtttctac ttttttgttc tctttgggag ggttctactc 180
tcccagaggt aaacacaaac aatttttttt attatactat taacacagtc aaatgaattt 240
taaaaacaaa atattcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga 300
acgcagcgaa ctgcgatacg taatgtgaat tgcagaattc cgtgaatcat cgaatctttg 360
aacgcacatt gcgccccttg gtattccggg gggcatgcct gtttgagcgt catttccctc 420
tcaaacttta cgtttggtag tgagcgatac tctactctgg agtttgcttg aaaatgggag 480
gccataggcg aagcattgct ttccaatcct gcggccctct gcttacttcc ccttgtgggt 540
tgtggcaggg gaaagcggga ggcgccttgc cacgatagtc gtattaggtt ttaccgactc 600
ggcgaaagtg aagaggtttg ctttttaaaa agaagcaggc agcgtctggc ttgacaaaat 660
tctcaaagtt tgacctcaaa tcaggtagga ttacccgctg aacttaagca tatcaataag 720
cggagga 727
Claims (7)
1. 一种鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075，为鲁氏酵母属，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年1月14日，保藏地址为中国武汉，保藏号为CCTCCNO：M 2022075。
2. 根据权利要求1所述的鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075，其特征在于，所述鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075在YPD平板的菌落形态为规则的圆形白色单一菌株。
3. 根据权利要求1所述的鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075，其特征在于，所述鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075的筛选方法为：
（1）菌株的活化：
以鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）为出发菌株，采用平板划线培养，挑取单菌落在液体培养基中活化培养；
（2）ARTP诱变处理：
将活化后的鲁氏酵母培养至对数期，收集后重悬稀释处理，然后对稀释后的鲁氏酵母进行ARTP诱变处理；
（3）诱变后的鲁氏酵母的培养：
将诱变处理后的鲁氏酵母震荡洗脱，洗脱后稀释，然后涂布于新鲜YPD平板上培养，挑取菌落形态良好的单菌落在液体培养基中活化；
（4）菌株的筛选：
将液体活化后的鲁氏酵母接种至发酵培养基中发酵，发酵结束后取发酵液加入碘硝基四氮唑（INT）溶液和pH 5.0 的Tris-HCl 缓冲液，置于37℃下暗处震荡，得到反应物，选取颜色比较明显的菌株保存；
（5）菌株的复筛：
将步骤（4）中保存的菌株活化，然后进行摇瓶发酵，发酵结束后取发酵液进行高效液相色谱（HPLC）分析，通过比较D-阿拉伯糖醇产量，筛选出产量较高的诱变菌株。
4. 权利要求1所述的鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075在发酵生产D-阿拉伯糖醇中的应用。
5. 一种D-阿拉伯糖醇的生产方法，其特征在于，所述方法为采用权利要求1所述鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）M 075在培养基中发酵生产；
所述发酵生产的条件为：培养温度28-30℃、接种量为体积比3-5%、摇床转速180-200rpm、发酵时间为72-96 h；
所述培养基为葡萄糖250-300 g/L，酵母提取物10-12 g/L，蛋白胨10-12 g/L，硫酸铵1-3 g/L，反丁烯二酸8-10 g/L，Triton X-100接种量为体积分数1-2 %。
6. 根据权利要求5所述的D-阿拉伯糖醇的生产方法，其特征在于，所述发酵生产的条件为：培养温度30℃、接种量为体积比5%、摇床转速200 rpm、发酵时间为96 h。
7. 根据权利要求5所述的D-阿拉伯糖醇的生产方法，其特征在于，所述培养基为：葡萄糖300 g/L，酵母提取物12 g/L，蛋白胨12 g/L，硫酸铵1 g/L，反丁烯二酸10 g/L，TritonX-100接种量为体积分数1.5%。
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