CN102277323B

CN102277323B - 高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株及其应用

Info

Publication number: CN102277323B
Application number: CN 201110225762
Authority: CN
Inventors: 蒋冬花; 韦凤; 蔡琪敏; 蓝丽精; 嵇豪; 高爱同
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2011-08-08
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2031-08-08
Also published as: CN102277323A

Abstract

本发明属于生物技术医学及生活领域，尤其涉及一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）Sm-128菌株和用途。高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）Sm-128菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2010347，保藏时间为：2010年12月13日。本发明的粘质沙雷氏菌Sm-128菌株可应用于灵菌红素的合成，经紫外吸收光谱和傅立叶核磁共振波谱（H-NMR）分析证实Sm-128菌株所产色素为灵菌红素，该纯品产量可达3～5g/L。该色素对热极稳定，对氧化剂、还原剂稳定，对光的稳定性较差。

Description

高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)Sm-128菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术医学及生活领域，尤其涉及一株高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株及其筛选方法和用途。

背景技术

灵菌红素（prodigiosins，PG）是一类具有三吡咯环的天然红色素的总称，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等活性。近年来，有关灵菌红素的研究主要集中在其潜在的临床应用方面，灵菌红素是一种很有发展潜力的抗肿瘤药物，其平均IC50（半抑制浓度）为2.1 μmol/L时对人体57种不同癌细胞均具有较强的抗性，对体外肝癌转移和人原发癌细胞等多种人类癌细胞也有抗性，且对非恶性细胞系没有明显的毒性。

灵菌红素作为次生代谢产物，可以由多种微生物代谢产生，其产生菌主要有粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、放线菌和其他一些细菌，国内采集于大亚湾的海洋假单孢细菌（Pseudomonas sp.）中也可分离得到灵菌红素和其衍生物二甲基灵菌红素，其中以沙雷氏菌属（Serratia）合成灵菌红素的报道居多。

灵菌红素具有较强的药理活性，但由于灵菌红素难以化学合成，而利用微生物合成时往往产率较低，使得其药理机制，药理功效以及毒副作用等方面问题都悬而未决，限制了灵菌红素的应用，但灵菌红素是一种极具特色的抗癌备选药物。微生物发酵生产的 PG 是比较理想的天然色素，其产生的色素可直接用于工业、制药业等，具有很好的市场潜力，因此对产灵菌红素菌种的开发及发酵生产工艺条件的研究具有非常重要的意义。

目前国内对灵菌红素的发酵生产工艺研究较少，尚处于探索阶段，国内已有文献报道的产灵菌红素菌株的产量均处于较低水平，不能满足工业化生产的要求。

发明内容

针对市场上对灵菌红素需求的日益增长，而目前高产灵菌红素菌株缺乏、发酵生产工艺不完善等问题。本发明的一个目的是提供一株从鱼体中筛选到的高产灵菌红素Sm-128菌株。本发明的另外一个目的是提供采用上述的灵菌红素Sm-128菌株生产灵菌红素的方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2010347，保藏时间为：2010年12月13日。

本发明所述菌株筛选自淡水鱼体。筛选方法如下：取一淡水鲫鱼，以无菌水浸泡洗涤，解剖鱼体，得表层鳞片、肌肉组织和内脏。分别用无菌水密闭条件下低温浸泡过夜，采用浓度梯度稀释法，将稀释液涂布于PDA培养基平板上，28 ℃下恒温培养。挑取早期菌落为白色，后期为红色或紫红色的单菌落，连续划线分离纯化，得性状单一的Sm-128菌株。本发明从淡水鱼体中分离获得的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）具有生长条件粗放、营养要求简单、代谢快、生长周期短、生产色素能力强、性状稳定等特征，可为工业化生产灵菌红素提供菌种资源。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种高产灵菌红素的生产方法，该方法包括以下的步骤：

1）取粘质沙雷氏菌Sm-128保藏菌种，在无菌条件下，挑取少许菌种转接到活化培养基上；

2）活化培养后，进行种子扩大培养；

3）最后在培养液及菌体中获得目的产物灵菌红素。

作为优选，上述步骤3）中发酵培养基为蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH 7.4；发酵条件为装液量36 mL/250 mL，转速180 r/m，接种量6 %，温度28 ℃，发酵时间65 h。

作为优选，上述步骤3）中发酵液离心洗涤后得菌体，以无水乙醇配制成20%～40%菌悬液，通过高压匀浆破碎后以乙酸乙酯反复浸提直至菌体无色为止；将乙酸乙酯相合并浓缩，得色素粗品。

作为再优选，上述色素粗品用乙醇复溶，以正己烷:乙酸乙酯=1:30～1：50作为洗脱剂进行柱层析，得到一橙色组分a1，将a1蒸干用甲醇复溶，过LH-20凝胶柱，得纯品。

本发明的粘质沙雷氏菌Sm-128菌株可应用于灵菌红素的合成。经紫外吸收光谱和傅立叶核磁共振波谱（H-NMR）分析证实Sm-128菌株所产色素为灵菌红素，该纯品产量可达3～5 g/L。本发明所述灵菌红素具有以下性质：易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿，微溶于石油醚、纯水。在不同溶剂中得紫外吸收峰有一定差异性。在不同pH下色调有一定变化。该色素对热极稳定，对氧化剂、还原剂稳定，对光的稳定性较差。

附图说明

图1为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株的菌落形态特征照片。

图2为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株的菌体细胞形态特征照片。

图3为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株制备的灵菌红素纯品照片。

图4为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株制备的灵菌红素紫外吸收波谱图。

图5为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株基于16S rDNA基因序列建立的沙雷氏属系统发育树。

生物材料保藏说明

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，其保藏编号为CCTCC NO：M2010347，保藏时间为：2010年12月13日。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

实施例1 从淡水鱼体中分离筛选得到Sm-128菌株

1.1 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH。

LB培养基：胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂20 g/L，pH7.0-7.2。

菌株的分离筛选鉴定

取一淡水鲫鱼，以无菌水浸泡洗涤，解剖鱼体，得表层鳞片、肌肉组织和内脏。分别用无菌水密闭条件下低温浸泡过夜，采用浓度梯度稀释法（10^-1-10^-4），取稀释液200 μL涂布于PDA培养基平板上，28 ℃下恒温培养。挑取早期菌落为白色，后期为红色或紫红色的单菌落（1 d），经三次连续划线分离纯化，得性状单一的Sm-128菌株，编号后4 ℃冰箱保存备用。用LB固体斜面培养基进行菌种活化传代，菌种每4 W转接一次；菌种使用之前需活化。对选出的菌株进行形态学、生理生化和16S rDNA基因序列鉴定。

该菌在LB培养基上28 ℃培养12 h后，单菌落形状为圆形，光滑粘稠，表面隆起，边缘整齐，有轻微异味，随生长时间菌落颜色由白色成粉红色直到紫红色，所产色素可扩散到培养基中。

显微镜下观察菌体细胞呈球形及短杆状；长度约1.0-1.2 μm，宽度约0.9-1.0 μm；无芽孢；无运动；革兰氏染色呈阴性（附图1、图2）。

生理生化结果表明：Sm-128菌株兼性好氧，V-P试验和过氧化氢酶反应阳性，甲基红（MR）试验、氧化酶和苯丙氨酸反应阴性；能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇和阿拉伯糖产酸，不能利用乳糖产酸；能还原硝酸盐；利用柠檬酸盐可使明胶水解；不能在三糖铁（TSI）琼脂实验上产生H₂S。

16S rDNA基因序列分析结果表明，与粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）菌株的同源性达99.2 %（附图5）。依据形态特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列，鉴定Sm-128菌株为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

实施例2 粘质沙雷氏菌Sm-128菌株用于合成灵菌红素的方法

2.1 培养基

发酵培养基：蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH7.4。

灵菌红素的生物合成

从活化的LB培养基上挑取约2环菌种接入培养液中，28 ℃、150 r/min培养12 h，再以3 %的接种量接入发酵培养液，在28 ℃，150 r/min培养24 h，可得含灵菌红素的粘质沙雷氏菌菌体，并有少量目的产物在发酵液中。

培养基及发酵条件的确定

以LB培养基为出发培养基，进行培养基优化，最终确定碳源为甘油，氮源为蛋白胨，并去除NaCl等无机盐。在此基础上，运用minitab 15软件将培养基进一步优化，得蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH7.4的简单实用培养基。最后运用minitab 15软件设计中心组合实验对发酵条件进行优化，得装液量36 mL/250mL，转速180 r/m，接种量6 %，温度28 ℃，发酵时间2.8 d。

实施例3 粘质沙雷氏菌Sm-128菌株所产灵菌红素的提取方法

发酵液离心洗涤后得菌体，以无水乙醇配置成30 %菌悬液。通过高压匀浆破碎后以乙酸乙酯反复浸提直至菌体无色为止。将乙酸乙酯相合并浓缩，得色素粗品。将粗品用乙醇复溶，进行TLC实验，得到最佳展开剂正己烷:乙酸乙酯=1:40。以此展开剂作为洗脱剂，以200目硅胶进行柱层析，得到一橙色组分a1，将a1蒸干用甲醇复溶，过LH-20凝胶柱，得到b1，b2，b3共三个组分，其中b2组分为优势组分，将其烘干后进行紫外吸收光谱和傅立叶核磁共振波谱（H-NMR）分析，最终确定b2为灵菌红素（附图3、图4）。该菌利用上述方法所得灵菌红素产量可达3～5 g/L。

上述制得灵菌红素具有以下性质：易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿，微溶于石油醚、纯水；不同pH下色调有一定变化。该色素对热极稳定，对氧化剂、还原剂稳定，对光的稳定性较差。

本发明中所描述的具体实施例子仅仅对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例子做各种修改或补充或采用类似的方式代替，但并不会偏离本发明的精神或超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已做出详细的说明并引证了一些具体实例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims

1.高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128 菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2010347，保藏时间为：2010 年12 月18 日。

2.根据权利要求1 所述的高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）Sm-128 菌株在灵菌红素生产中的应用。

3.一种高产灵菌红素的生产方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）取粘质沙雷氏菌Sm-128 保藏菌种，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2010347，保藏时间为：2010 年12 月18 日；在无菌条件下，挑取少许菌种转接到活化培养基上；

2）活化培养后，进行种子扩大培养，发酵培养基为蛋白胨9 g/L，甘油10 ml/L，pH 7.4；发酵条件为装液量36 mL/250 mL，转速180 r/m，接种量6%，温度28 ℃，发酵时间65 h；

3）最后在培养液及菌体中获得目的产物灵菌红素，具体步骤如下：

发酵液离心洗涤后得菌体，以无水乙醇配制成20%～40%菌悬液，通过高压匀浆破碎后以乙酸乙酯反复浸提直至菌体无色为止；将乙酸乙酯相合并浓缩，得色素粗品；色素粗品用乙醇复溶，以正己烷:乙酸乙酯=1:30～1：50 作为洗脱剂进行柱层析，得到一橙色组分a1，将a1 蒸干用甲醇复溶，过LH-20 凝胶柱，得纯品。