CN1884483A

CN1884483A - 生产灵菌红素的海洋细菌菌株及其生产灵菌红素的方法

Info

Publication number: CN1884483A
Application number: CN 200610036024
Authority: CN
Inventors: 蔡创华; 周毅频; 沈鹤琴; 张穗
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2006-06-20
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2026-06-20
Also published as: CN100392068C

Abstract

本发明提供一种从海洋细菌筛选出来的可生产灵菌红素的海洋细菌菌株及用该菌株发酵生产灵菌红素的方法。该海洋细菌菌株为Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164。用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164为生产菌株，经母种制备，发酵培养，提取红色代谢产物和纯化代谢产物制备步骤，即可制得菌种的红色代谢物——本发明产品灵菌红素类化合物。本发明所提供的海洋细菌新菌株遗传稳定，繁殖快，可进行大规模发酵生产，应用该海洋微生物进行灵菌红素生产，开辟了海洋微生物资源研究和开发的新途径。

Description

生产灵菌红素的海洋细菌菌株及其生产灵菌红素的方法

技术领域

本发明涉及一种从海洋细菌筛选出来的可生产灵菌红素的海洋细菌菌株及用该菌株发酵生产灵菌红素的方法。

背景技术

灵菌红素(Prodigiosin)，结构独特，具有吡咯吡咯亚甲基骨架，以前主要来自临床病原微生物沙雷氏菌(Sarratia marcesens)。灵菌红素类化合物是具有吡咯吡咯亚甲基结构特征的化合物的总称，在整个分子中可以是2个，3个或者4个吡咯环，吡咯环可以接有烷基长链或者其它官能团。灵菌红素有多种显著的药理活性：1)抗肿瘤活性；2)抗微生物活性；3)抗疟疾；4)促进细胞凋亡；5)有强的免疫抑制活性，其免疫作用机理与它独特的吡咯吡咯亚甲基骨架结构有关。由于灵菌红素的细胞毒性，在目前它作为免疫抑制药物的指数仍然受到限制，但以灵菌红素类化合物作为基本架构，寻找免疫抑制活性强、毒副作用低的衍生物，有较好的前景，备受国际关注。由于目前灵菌红素通常是以沙雷氏菌为生产菌株，通过发酵制备并提纯其代谢产物而获得，由于其制备过程的原因，难以大量生产，对进一步研究产生影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从海洋细菌筛选出来的可生产灵菌红素的海洋细菌菌株及用该菌株发酵生产灵菌红素的方法，以便开辟一种灵菌红素制取新途径，使之具有菌株无毒，环境友好，遗传稳定，繁殖快，可大规模发酵生产，易形成产业化等特点。

本发明提供的可生产灵菌红素的海洋细菌菌株是从大亚湾海水中筛选得到的新菌株，该菌株为海水中土生土长异养细菌，经16 rRNA分析，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其分类命名为Pseudomonas sp.105001，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCCNO：M 205164。

该菌株产红色代谢产物，生长快，代谢产物产量高，无急性毒性。

该菌株的生理生化特性是：

细胞产紫红色素，杆状，革兰氏阴性，无鞭毛运动，无芽孢，

GUL葡萄糖(O/F)-，XYL木糖发酵(O/F)+W，RHA鼠李糖(O/F)-，MAL麦芽糖(O/F)-，RAF棉子糖(O/F)-，LAC乳糖(O/F)-，SOR山梨醇(O/F)-，ADO侧金盏花醇(O/F)-，蛋白胨水(靛基质)+，DUL卫矛醇(O/F)-，MAN甘露醇(O/F)-，INO肌醇(O/F)-，SAC蔗糖-，ARA阿拉伯糖+，ESC七叶树苷利用-，OX氧化酶-，CAT接触酶-，AMY淀粉酶-，NO₃还原+，产H₂S-，IND+，VP-，ADH精氨酸双水解酶-，LDC赖氨酸脱羧酶-，URE尿素分解-，水杨苷发酵-，

％盐度生长试验：0％-，3％+，6％+，8％+，10％+。

本发明所提供的生产灵菌红素的方法，是用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164为生产菌株，经母种制备，发酵培养，提取红色代谢产物和纯化代谢产物的过程，具体制备步骤是：

(1)用2216E液体培养基生产发酵母种，所述的2216E液体培养基配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，陈海水1000ml，pH7.6，所述的陈海水是指将海区带回的自然海水陈放三个月以上的海水；

(2)用制备的生产发酵母种在发酵培养基发酵生产，发酵生产条件是，通气培养，生长温度：25-30℃，所述的发酵培养基的配方及制备如下：有机成分A：鱼粉10g水解，取上清液；无机成分B：粗盐32g，KCl 0.644g，NaHCO₃ 0.192g，KBr 0.096g，H₃BO₃ 0.026g，SrCl₂0.024g，NaF 0.003g，将A、B成分溶于去离子水至总量1000mL，PH 7.6；

(3)将发酵液离心，收集沉淀物，洗涤后，用乙醇溶解沉淀物，然后提取其中的红色代谢产物；

(4)将乙醇提取物经硅胶柱层析，用乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的组分，再经SephdexLH-20柱以及制备板层析纯化即得红色代谢物——本发明产品灵菌红素类化合物。

对上述方法所制得的产品(样品)的组分和结构的测定结果：

样品根据一维、二维核磁：¹HNMR，¹³CNMR，¹H-¹HCOSY，HMBC，HMQC，EIMS，UV推出化合物组分和结构如下：

结构：

灵菌红素R₁＝R₂＝H；二甲基灵菌红素R₁＝R₂＝Me

分子式为：C₂₀H₂₅N₃O

产物数据：

红色无定型固体：UV λmax(McOH)534(ε4.4×10⁶)，496(ε3.3×10⁶)；IRvmax(KBr)cm^-1 2950，1630，1600，1250，950：EIMS(m/z％)：323(M⁺，75)，308(M-CH₃，15)，266(100)，251(12)；¹HNMR(CDCl3，TMSδppm)：7.17(1H，b，H-2)，6.29(1H，dt，J＝4.0，2.0Hz，H-3)，6.85(1H，b，H-4)，6.02(1H，s，H-7)，6.89(1H，s，H-10)，6.62(1H，s，H-12)，3.94(3H，s，21-OCH₃)，2.47(3H，s，15-CH₃)，2.33(2H，t，J＝12.0Hz，Ch2-16)，1.28(6H，b，Ch2-17-19)，0.88(3H，t，J＝7.0Hz，20-CH₃).13CNMR(CDCl₃，δppm)：125.96(d，C-2)，110.72(d，C-3)，116.01(d，C-4)，121.23(s，C-5)，146.69(s，C-6)，91.62(d，C-7)，164.75(s，C-8)，119.68(s，C-9)，115.02(d，C-10)，124.14(s，C-11)，127.50(d，C-12)，127.42(s，C-13)，146.02(s，C-14)，11.45(q，C-15)，24.31(t，C-16)，28.79(t，C-17)，30.91(t，C-18)，21.49(t，C-19)，13.03(q，C-20)，57.70(q，C-21)，¹H-¹HCOSY(CDCl₃)：H-2/H-3，H-3/H-4，H2-16/H2-17，H2-19/H3-20；HMBC(CDCl₃)：H-2/C-3，C-4，C-5；H-3/C-2，C-5；H-4/C-2，C-5；H-7/C-5，C-6，C-8，C-9；H10/C8，C-12；H-12/C-11，C-13，C-14；15-CH₃/C-14，C-12；16-CH₂/C-13，C-14；21-CH₃/C-8；B-NH/C-7，C-8，C-9.HREIMS m/z 323.1968(M+，calcd for C₂₀H₂₅N₃O，323.1971)。

经过有关分子量和结构分析，可证明由海洋细菌Pseudomonas sp.105001 CCTCC M205164发酵提取的红色代谢物为灵菌红素类化合物。

本发明提供了一种由海洋细菌Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164生产灵菌红素的安全和大量的生产手段，在此基础上，可对其衍生物进行深入的药理药效进行研究，找新的免疫抑制活性强，毒副作用低的灵菌红素，虽然由于灵菌红素的毒副作用目前在临床上未能广泛应用，但可通过制备衍生物深入进行药理、药效的研究，发现新的、高效的、低毒的免疫抑制物，或是作用互补、没有毒性叠加的联合抑制剂，开发成为具有自主知识产权的新型器官移植免疫用药。灵菌红素类化合物具有与目前临床使用的免疫抑制剂有不同的作用机理，在用药方式上将更具灵活性，应用范围也更加广泛。本发明应用海洋微生物进行灵菌红素生产，开辟海洋微生物资源研究和开发新途径。该菌株遗传稳定，繁殖快，可进行大规模发酵生产，资源保障，环境友好，对灵菌红素类化合物的进一步研究和开发，具有广阔的前景和意义。

具体实施方式

以下对利用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164为生产菌株生产灵菌红素的方法作进一步的详细说明。

用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164为生产菌株生产灵菌红素的具体步骤如下：

(1)母种制备：用2216E液体培养基生产发酵母种，所述的2216E液体培养基配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，陈海水1000ml，pH7.6；

(2)将母种接种于发酵培养基进行发酵培养生产：发酵生产条件是，通气培养，生长温度：25-30℃，所述的发酵培养基的配方及制备如下：有机成分A：在10g鱼粉中加入水解酶0.1g，于60℃水解4小时，取上清液；无机成分B：粗盐32g，KCl 0.644g，NaHCO₃ 0.192g，KBr 0.096g，H₃BO₃ 0.026g，SrCl₂ 0.024g，NaF 0.003g，将A、B成分溶于去离子水至总量1000mL，PH 7.6，

发酵过程分四个阶段，逐步扩大培养。首先将母种菌株经过复壮后接种多支斜面(根据需要而定)(称一级培养，18-24小时)，然后接种到装在三角瓶中的液体培养基(250mL)进行摇床培养(称二级培养，约18-24小时)，再将三角瓶发酵液作为母液加到装有2L液体培养基中，进行通气发酵培养(称三级培养，一般24小时)，最后将三级培养发酵液作为母液加到装有20L液体培养液大罐中通气发酵培养(称为生产性发酵培养，两天左右)，将培养发酵液收集，进行产物提取。每级母液和液体培养基之间比例为1/10。

(3)提取红色代谢产物：代谢产物提取分两步：第一步为发酵产物的收集，第二步为代谢物的提取。

第一步：将发酵液离心(5000r/min)20min沉淀，弃去上清液；再用无菌水对沉淀物进行洗涤，离心，弃去上清液，反复多次，得菌体细胞及沉淀代谢物。

第二步：提取：根据红色代谢物溶于乙醇、酯类，不溶液于水物性，用乙醇作为溶剂提取代谢物。其过程包括：在收集产物中加入95％乙醇，使红色代谢物溶于乙醇中；对乙醇溶液进行过滤，使菌体和基质残渣分离(多次加入乙醇进行溶解和过滤)，收集溶有代谢产物的乙醇溶液；对乙醇溶解液进行蒸馏，回收乙醇，对余下物质进行干燥，获红色膏状物。

(4)纯化代谢产物：将上述乙醇提取物经硅胶柱层析，用20％乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的组分，再经Sephdex LH-20柱(淋洗剂按V/V计：氯仿∶甲醇＝1∶1)以及制备板层析(展开剂按V/V计：石油醚∶乙酸乙酯＝8∶2)进行纯化即得红色代谢物——本发明产品灵菌红素类化合物。

Claims

1.一种生产灵菌红素的海洋细菌菌株，从海洋细菌筛选而得，其特征在于该菌株经16rRNA分析，属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)，其分类命名为Pseudomonas sp.105001 CCTCCM 205164，该菌株的生理生化特性是：

％盐度生长试验：0％-，3％+，6％+，8％+，10％+。

2.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于用Pseudomonas sp.105001 CCTCC M 205164为生产菌株，经母种制备，发酵培养，提取红色代谢产物和纯化代谢产物的过程，具体制备步骤是：

(1)用2216E液体培养基生产发酵母种，所述的2216E液体培养基配方为：蛋白胨5g，酵母膏1g，柠檬酸铁0.1g，陈海水1000ml，pH7.6；

(3)将发酵液离心，收集沉淀物，用乙醇溶解沉淀物，然后提取其中的红色代谢产物；

(4)将乙醇提取物经硅胶柱层析，用乙酸乙酯、石油醚淋洗所得的组分，再经SephdexLH-20柱以及制备板层析纯化即得红色代谢物——灵菌红素类化合物。