CN101220334B

CN101220334B - 卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在c21、c19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用

Info

Publication number: CN101220334B
Application number: CN2007103000639A
Authority: CN
Inventors: 刘宏民; 单丽红; 李永红; 曹晨; 张洪杰
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2007-12-25
Filing date: 2007-12-25
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2027-12-25
Also published as: CN101220334A

Abstract

本发明公开了一株具有立体选择性羟化酶活性的卷枝毛霉菌株(Mucorcircinelloides lusitanicuS)AY234877，已于2007年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC.NO.2256，其特征是能对C21和C19甾体类底物的6β，7α，11α，14α位置进行羟基化。并公开了利用其制备C21和C19甾体及氮杂甾体的6β，7α，11α，14α的羟基化衍生物的方法。该方法操作简便、成本低廉，收率和立体选择性均较好，并且不对环境产生污染。利用该菌种可对具有4-烯-3酮或5-烯-3-醇结构特征的C21和C19甾体及氮杂甾体类化合物进行羟基化反应，得到的羟基化衍生物是许多甾体药物合成的重要中间体。与甾体的羟基化化学合成相比，该方法可以简化药物的合成步骤，减少污染，降低成本，对推动我国甾体药物中间体的开发进程有着重要的应用价值。

Description

卷枝毛霉菌株、其培养方法及其在C21、C19甾体和氮杂甾体生物转化中的应用

技术领域

本发明涉及微生物菌株、其培养方法及其在甾体生物转化上的应用，尤其涉及-株具有立体选择性羟化甾体底物的霉菌和优化后的转化培养基及利用该菌株对具有4-烯-3-酮和5-烯-3-醇结构特征的C21和C19甾体底物转化为羟基化衍生物的方法。

背景技术

甾体化合物又称类固醇化合物(steroid)，是一类具有环戊烷骈多氢菲母核的有机化合物，广泛存在于生物体组织内，如甾醇，维生素D，胆汁酸，许多性激素，肾上腺皮质激素，某些致癌烃，甾族皂素以及甾族生物碱等均属此类。由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。如甾体激素是动物界所特有的一类甾体化合物，包括性激素和肾上腺皮质激素，是维持生命、保持正常生活、促进性器官发育、维持生殖的重要生物活性物质，不仅能治疗疾病，而且也是计划生育及调节免疫等方面不可缺少的药物。

近年来甾体药物的应用领域不断扩大，如用于治疗淋巴白血病、细菌性脑炎、人体器官移植以及和内分泌有关的老年性疾病，另外具有甾体骨架的抗肿瘤、利尿、麻醉、肌松等方面作用的新药也不断涌现，此外，甾体激素亦开拓应用于促进家畜繁殖生长及植物生长。随着甾体药物应用范围的不断扩大，甾体医药产业呈现出很好的发展态势，成为仅次于抗生素的第二大类药物。据统计，80年代初以来，世界甾体药物总产量及销售额以年14％-15％的速度增长，此增长率不低于抗生素、抗感染药物、心血管药物、中枢神经药物和解热镇痛药物。由于甾体药物的不可取代的作用及治疗适应症不断扩大，甾体药物越来越引起人们的重视。

甾体微生物转化反应是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物，其在甾体药物生产中占有重要地位，常常被用于某些甾体激素类药物中间体的合成。与化学合成相比，甾体微生物转化反应具有立体专一性强，收率高，副产物少，反应条件温和及价格低廉等优点。羟化反应是甾体微生物转化中最重要的反应，如可的松、泼尼松、地塞米松、倍他米松等皮质激素药物的生产，将底物16α、17α-环氧黄体酮引入11-α羟基是其关键一步。微生物能在甾体的任何位置进行羟基化反应，包括两个角甲基和侧链，而化学方法除了较易在C17引入羟基外，在其他位置都很难引入。

本发明筛选到一株对甾体化合物具有羟基化作用的霉菌，目前国内外均未见其用于甾体类物质转化的报道。经过对其进行培养条件优化，能够以较高的收率得到目标产物。该菌株对4-烯-3-酮类甾体底物的羟基化主要发生在6β位，7α位和14α位，而对5-烯-3醇类甾体底物的羟基化则是发生在7α位和11α位。11位的羟基是皮质激素类药物抗炎的必需基团，具有7-羟基的甾体物质则主要表现出调节激素水平、增强免疫、抗皮质激素样作用等，因此利用生物转化法合成该类物质，对激素类药物或其中间体的生产具有非常重要的意义。在此基础上再对转化产物进行衍生物设计，还可以为开发具有上述作用的新药奠定良好的基础。

发明内容

本发明目的在于提供一株具有羟基化甾体底物的霉菌；另一目的在于提供该菌种的培养方法；又一目的在于将该菌种应用于具有4-烯-3-酮或5-烯-3醇结构特征的C21和C19类甾体底物生物转化为其羟化产物方法中。

为实现本发明目的，本发明技术方案如下：

本发明提供一株卷枝毛霉菌株(Mucor circinelloides lusitanicus)AY234877，该菌株已于2007年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路)，保藏号为：CGMCC.NO.2256。该霉菌能产生具有立体选择性的羟化酶，其特征在于可在甾体底物的6β，7α，11α，14α等位置选择性地进行羟基化。

该菌株形态特征：菌落在PDA培养基上生长迅速，28℃时，20小时菌落半径达50～80mm，菌丝层较厚，初期为白色，后期逐渐转为黄褐色至深褐色，菌落背面无色，不分泌色素，菌落无味。镜下观察菌丝透明，有隔，无假根，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分枝多，孢囊梗为单轴状分枝，分枝不规则，孢子囊球形，顶生，直径20～70μm，囊轴球形至卵圆形，长20～60μm，孢子褐色，球形或短椭圆形，6×10～5×8μm。根据以上特征，初步鉴定为卷枝毛霉。

该菌株生理生化特征：菌丝的生长和孢子萌发与温度、湿度、pH值和培养基质有密切关系。菌株在20～32℃均有不同程度的生长，28℃生长速度最快；菌株对环境pH值有较强的适应性，在pH值4～7的弱酸性条件下均能生长，最适pH值为6.0；菌株在相对湿度为60～80％时孢子萌发率较低，饱和湿度时萌发率最高，可见充足的水分是孢子萌发的必要条件；孢子在无营养的蒸馏水中不能萌发，必须有一定的有机物作为营养或刺激，不同营养物质对其孢子萌发也有影响，在营养成分复杂的有机物浸汁如马铃薯葡萄样培养基中萌发率最高，可达到95％以上，其次为酵母膏蛋白胨培养基，萌发率达到83％左右，而在成分比较简单的无机溶液如察氏培养基中的萌发率最低，只有不到50％，

该菌株的筛选包括以下步骤：

(1)采集土样，以底物为唯一碳源进行富集培养，富集培养液适当稀释后涂布平板培养，将分离良好的菌落挑至斜面，得到能作用于底物的菌种。

(2)将斜面菌种接种于液体培养基中培养一定时间后加入底物进行转化，提取产物后进行分离纯化，并对产物的结构进行鉴定，确定具有羟化能力的菌株。

(3)通过对菌落形态、菌体细胞形状和大小、有无孢子和菌丝形成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。

(4)对筛选到的转化率高的菌种进行培养基优化，确定了发酵培养基组成为：麦芽糖30～65‰，优选50‰；蛋白胨10～24‰，优选18‰；酵母膏0.5～2.0‰，优选1.5‰；硫酸镁0.5～1.5‰，优选0.9‰；磷酸二氢钾0.5～1.5‰，优选0.9‰；pH4.0～7.5，优选6.0；接种量1～10％，优选5％；装液量60～120ml/500ml瓶，优选80ml/500ml瓶。

(5)摇瓶培养条件为：在温度25～40℃，优选28℃，转速为150～240rpm，优选220rpm条件下培养24～72h，优选48h。

最终对菌种进行16S DNA基因序列测定，表明其含有426个碱基对，经基因库检索证实该菌株的基因与卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)完全一致。确定其为卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)AY234877 CGMCC.NO.2256。

本发明以有如下结构通式的甾体作底物，利用上述的卷枝毛霉进行生物转化制备羟基化甾体衍生物：

通式1表示具有4-烯-3-酮结构的甾体底物，其中X为羰基、羟基、乙酰基、乙酰氨基；通式2表示具有5-烯-3-醇结构的甾体底物，其中X为羰基、羟基、乙酰基或乙酰氨基，R为羟基、乙酰氧基或丙酰氧基；通式3表示具有5-烯-3-醇结构且D环为氮杂六元环的甾体底物，R为羟基、乙酰氧基或丙酰氧基。

转化过程通过以下步骤实现：

(1)以上述卷枝毛霉菌株的培养液或湿菌体为催化剂，将底物1～10g/L，优选1.0g/L，加入霉菌培养液中，于25～35℃，优选28℃，进行生物转化48～120h，优选96h，生成其羟基衍生物。

(2)转化终止后，过滤除去菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取3～5次，合并有机相，减压浓缩，然后分别用饱和碳酸氢钠溶液洗3次、饱和氯化钠溶液洗1次、水洗3次，再用无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸干溶剂，得到的固体和混合物经柱层析分离得到各种转化产物，产物结构用IR、HRMS、NMR进行鉴定解析。

本发明的优点在于：1、本发明所提供的菌种易于培养和保存，对甾体底物转化能力强，转化率高，达到70-90％；2、本发明所提供的羟基化甾体衍生物制备方法简单方便、条件温和、环境友好，收率高，主产物收率可达到30-65％；3、本发明所合成的化合物为甾体制药工业的重要中间体，利用该方法使合成步骤减少，成本降低。

具体实施方式

为能更好地对本发明进行详细说明，举实例如下：

实施例1：

从郑州市北郊、洛阳栾川山区、嵩山等地采集土样，称取各种土样10g，分别悬浮于0.9％NaCl溶液中，用8层纱布过滤除去较大的杂质颗粒，接种富集培养基(酵母膏0.15％，蛋白胨0.12％，葡萄糖3％，磷酸二氢钾1％，pH4.5，甾体混合物0.5％)，培养48h后取10ml培养液再用同样方法二次富集。涂布选择性平板(组成同富集培养基，含琼脂3％)。经过初筛得到36个能在含有底物的平板上生长的菌株，将其挑出转接PDA培养基制成的斜面保藏并用于转化试验。

分别将上述初筛所得36个菌株接种至转化培养基(酵母膏0.15％，蛋白胨0.12％，葡萄糖3％，磷酸二氢钾1‰，pH4.5)中，25～35℃培养24～48小时(摇床转速180rpm)，加入甾体底物(浓度1～10‰)，继续转化培养24～72h，提取产物进行测定。TLC结果表明有新产物生成的13个菌株按初筛方法进行复筛。转化结束后提取产物进行TLC检测、柱层析分离，并对产物的结构进行鉴定。由此确定了一株转化能力强，定向性好的菌株，即卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)AY234877 CGMCC.NO.2256。

实施例2：

对筛选出的卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)AY234877 CGMCC.NO.2256进行发酵培养基优化，分别对碳源、氮源、金属离子、初始pH值、接种量、装液量等条件进行优化，确定了发酵培养基组成为：麦芽糖50‰；蛋白胨18‰；酵母膏1.5‰；硫酸镁0.9‰；磷酸二氢钾0.9‰；pH 6.0；接种量5％；装液量80ml/500ml瓶。

实施例3：

按照实施例2所述的培养基配方配置1L液体培养基，接入菌种后在28℃培养48h(摇床转速220rpm)，加入底物妊娠烯醇酮I 1.0g/L，再于28℃转化96h。TLC监测转化终止后(原料点消失)，过滤除去菌丝体，发酵液用乙酸乙酯萃取4次，合并有机相，减压浓缩，然后分别用饱和碳酸氢钠溶液洗3次、饱和氯化钠溶液洗1次、水洗3次，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸干溶剂，得白色固体1.05g，柱层析分离(乙酸乙酯∶氯仿1∶1)得到羟基化产物1 256mg，收率24.38％，化合物2 487mg，收率46.38％，结构如图所示，实验数据如下：

化合物1：C₂₁H₃₂O₃.IR 3420 2935 1698 1661 1358 1054cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ5.62(m，1H，H-6，J＝5.2Hz)，3.87(s，1H，H-7)，3.59(s，1H，H-3)，2.59(t，1H，H-17，J＝9.2，J＝18.4Hz)，2.14(s，3H，H-21)，1.00(s，3H，H-19)，0.64(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃，TMS)：δ209.6，146.3，123.7，71.3，65.2，63.5，49.7，43.8，42.2，41.9，38.2，37.4，37.4，37.0，31.6，31.3，24.4，22.9，20.7，18.2，13.0；HR-MS m/z：333.2424[M+H]⁺(calcd.333.2430)。

化合物2：C₂₁H₃₂O₄.IR 3328 2969 2936 1700 1357 1046cm^-1；¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δ5.44(d，1H，H-6，J＝5.3Hz)，3.80(m，1H，H-11，J＝5.6，J＝10.3Hz)，3.56(t，1H，H-7，J＝3.5，J＝8.5Hz)，3.34(m，1H，H-3)，2.06(s，3H，H-21)，1.00(s，3H，H-19)，0.50(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d6，TMS)：δ208.7，144.6，124.3，70.2，67.2，63.5，62.8，49.5，49.1，47.8，43.6，42.8，38.5，38.4，37.1，31.6，31.3，23.7，22.6，17.7，14.1；HR-MS m/z：371.2208[M+Na]⁺(calcd.371.2198)。

实施例4：

按照实施例3的方法转化底物黄体酮II 1.0g/L，其中化合物3397mg，收率37.81％，化合物4 202mg，收率18.36％，化合物5 176mg，收率16.00％，结构如图所示：

化合物3：C₂₁H₃₀O₃.IR 3478 2949 1696 1650 1358 1058cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃，TMS)：δ5.73(s，1H，H-4)，3.24(t，1H，H-17，J＝8.6，J＝17.4)，2.12(s，3H，H-21)，1.20(s，3H，H-19)，0.76(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，CDCl₃，TMS)：δ210.45，199.57，170.65，123.78，84.93，59.35，47.87，46.15，38.52，38.17，35.61，33.84，33.14，32.50，31.39，30.79，27.00，21.24，20.01，17.13，17.11；HR-MS m/z％：353.2092[M+Na]⁺(calcd.353.2093)。

化合物4：C₂₁H₃₀O₄.IR 3471 2945 1678 1627 1355 1054cm^-1；¹H NMR(400MHz，CD₃OD，TMS)：δ5.77(s，1H，H-4)，4.27(s，1H，H-7)，3.20(t，1H，H-17，J＝8.3，J＝17.1)，2.13(s，3H，H-21)，1.25(s，3H，H-19)，0.70(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，CD₃OD，TMS)：δ213.04，201.30，170.95，126.68，86.44，69.54，60.00，49.63，41.75，40.75，40.38，39.38，36.10，34.37，33.52，31.64，31.54，22.02，20.69，17.44，17.28；HR-MS m/z％：369.2040[M+Na]⁺(calcd.369.2042)。

化合物5：C₂₁H₃₀O₄.IR 3465 2958 1658 1632 1360 1047cm^-1；¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δ5.66(s，1H，H-4)，4.20(s，1H，H-6)，3.13(t，1H，H-17，J＝8.4，J＝17.0)，2.04(s，3H，H-21)，1.28(s，3H，H-19)，0.66(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d6，TMS)：δ210.12，199.47，169.36，125.06，83.44，71.59，59.38，48.02，46.02，37.79，37.05，34.48，34.11，32.53，32.09，31.38，30.55，21.25，20.00，19.06，16.90；HR-MS m/z％：369.2039[M+Na]⁺(calcd.369.2042)。

实施例5：

按照实施例3的方法转化底物3-乙酰氧基-17-乙酰氨基5-烯-雄甾III 1.0g/L，最终得浅黄色固体0.89g，柱层析分离得到化合物6 550mg，收率62.0％，化合物7 320mg，收率34.40％，结构如图所示：

化合物6：C₂₁H₃₃NO₂.¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δ7.48(d，1H，N-H，J＝8.6Hz)，5.26(d，1H，H-6，J＝4.9Hz)，4.55(d，1H，3-OH，J＝4.6Hz)，3.67(dd，1H，H-17，J＝9.16，J＝18.28Hz)，3.25(m，1H，H-3)，1.80(s，3H，H-21)，0.94(s，3H，H-19)，0.64(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d6，TMS)：δ169.35，141.81，120.74，70.45，58.70，53.06，52.95，50.24，43.00，42.70，37.44，37.30，36.62，32.13，31.90，31.54，27.62，23.70，20.71，19.65，12.39；HR-MS m/z％：354.2403[M+Na]⁺(calcd.354.2409)。

化合物7：C₂₁H₃₃NO₃.¹H NMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δ7.44(d，1H，N-H，J＝8.6Hz)，5.14(s，1H，H-6)，4.64(d，1H，3-OH，J＝4.6Hz)，4.20(d，1H，7-OH，J＝7.24Hz)，3.64(d，1H，H-7，J＝8.8Hz)，3.59(t，1H，H-17，J＝7.76，J＝15.36Hz)，3.26(m，1H，H-3)，1.80(s，3H，H-21)，0.96(s，3H，H-19)，0.62(s，3H，H-18)；¹³C NMR(100.6MHz，DMSO-d6，TMS)：δ169.38，141，78，127.51，72.04，70.29，58.44，52.65，48.51，43.41，42.16，40.60，39.36，37.23，36.51，31.95，27.87，26.08，23.22，20.76，19.24，12.43；HR-MS m/z％：370.2352[M+Na]⁺(calcd.370.2358)。

化合物III根据如下文献制得：

1、Herbert L，Holland，Gingipalli L，et al.Microbialhydroxylation ofacetylaminosteroids[J].Steroids，1998，63(9)：484

2、Anna I，Koutsourea ES，Arsenou MA，et al.Synthetic approaches forthe synthesis of acytostatic steroidal B-D bilactam[J].Steroids，2003，68(7-8)：659。

Claims

1.卷枝毛霉菌株(Mucor circinelloides lusitanicus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC.NO.2256。

2.如权利要求1所述卷枝毛霉菌株的培养方法，特征在于，包括以下步骤：

(1)以PDA为斜面培养基进行培养；

(2)配制发酵培养基：麦芽糖30～65‰，蛋白胨10～24‰，酵母膏0.5～2.0‰，硫酸镁0.5～1.5‰，磷酸二氢钾0.5～1.5‰，pH4.0～7.5，接种量1～10％，装液量60～120ml/500ml瓶；

(3)在温度25～40℃，转速150～240rpm条件下培养24～48h。

3.如权利要求1所述卷枝毛霉菌株在甾体生物转化中的应用，特征在于，利用该卷枝毛霉菌株通过如下步骤实现C21甾体羟基衍生物的制备：以卷枝毛霉菌株的培养液或湿菌体为催化剂，将C21甾体底物加入到霉菌培养液中，至终，其浓度为1～10g/L；于25～40℃温度条件下，继续培养48～120h，在C21甾体底物的7α，14α位分别进行单羟基化或同时在7α，11α位或6β，14α位或7α，14α位进行双羟基化得到其羟基衍生物。

4.根据权利要求3所述卷枝毛霉菌株在甾体生物转化中的应用，其特征在于，所述的C21甾体底物为具有如下结构通式的化合物：

通式1 通式2

其中X为乙酰基或乙酰氨基，R为羟基、乙酰氧基或丙酰氧基。

5.根据权利要求3所述卷枝毛霉菌株在甾体生物转化中的应用，其特征在于，以3-乙酰氧基-17-乙酰氨基-5-烯雄甾为底物，利用该微生物进行生物转化，制备3，7α-二羟基-17-乙酰氨基-5-烯-雄甾。