CN111575301A - 一种非从头合成的卷枝毛霉产油细胞工厂构建及其发酵技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产脂的卷枝毛霉细胞工厂的构建技术，属于基因工程领域，本发明从卷枝毛霉中克隆获得二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT），连接至整合型质粒pMAT2075上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株M65中，通过同源重组将二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑DGAT，最终实现了DGAT基因在卷枝毛霉中的表达，重组菌株Mc‑DGAT在添加大豆油的培养基中油脂含量与对照菌Mc2075相比变化较大，在表达菌株Mc‑DGAT中获得53%的油脂含量。

Description

一种非从头合成的卷枝毛霉产油细胞工厂构建及其发酵技术

技术领域

本发明涉及一种提高脂质积累量的卷枝毛霉细胞工厂的构建技术，属于基因工程领域。本发明利用同源重组技术在卷枝毛霉WJ11中进行二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）的过表达，并添加外源油进行发酵，从而构建能够高产脂的卷枝毛霉细胞工厂。

背景技术

在能够积累超过自身干重20%的油脂的微生物被称为产油微生物，其分布比较广泛，主要有真菌、酵母、细菌和微藻。因为产油真菌卷枝毛霉富含γ-亚麻酸，人们对其的研究越来越深入，卷枝毛霉是全球首次用来工业化生产亚麻酸的菌株，由于其产脂能力强、基因组已被测序且其基因研究体系完善而被用来作为研究微生物生产亚麻酸的模式生物。

多不饱和脂肪酸（PUFAs）只能通过饮食获得，是人体必需脂肪酸，对人体营养与健康方面均十分有益，因此得到越来越多的人的重视。哺乳动物(包括人类在内)在体内只能合成饱和脂肪酸(SAFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)，而ω-6和ω-3系列多不饱和脂肪酸如亚油酸(LA,18:2,n-6)和α-亚麻酸(ALA,18:3,n-3)均不能在体内合成。亚油酸和亚麻酸经过多种酶催化后可用于合成二十二碳五烯酸(DPA,22:5,n-6)和二十二碳六烯酸(DHA,22:5,n-3)。经研究发现，肥胖、高血压、糖尿病、冠状动脉硬化、精神分裂症及老年痴呆等多种疾病的发生与必需脂肪酸的代谢有关。因此，必需脂肪酸及其衍生物对于人类的健康具有重要意义。

已有研究表明，二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油合成途径上的关键酶，它是三酰甘油合成最后的一步所需要的酶，能够催化二酰甘油转化成三酰甘油。卷枝毛霉中的二酰甘油酰基转移酶（DGAT）一共有两大类，分别是DGATⅠ和DGATⅡ，这两类均是膜结合蛋白。近几年，关于卷枝毛霉二酰甘油酰基转移酶（DGAT）的研究较多，主要是对其在油脂合成路径中发挥的作用进行研究，但较多的研究是针对该酶在其他菌株内的异源表达，并且发现表达了该酶的菌株的脂质含量得到提高。然而，关于在卷枝毛霉中内源过表达卷枝毛霉二酰甘油酰基转移酶（DGAT）以提高其脂质积累量的研究并不多见。

本研究室前期研究发现一株油脂积累量能够达到36%的卷枝毛霉，其细胞内脂肪酸组成中的γ-亚麻酸含量为18-19%，而且其发酵条件可控性高。因此，本研究根据该菌种的优势条件，将来源于卷枝毛霉的二酰甘油酰基转移酶（DGAT），通过同源重组的基因工程方法来在卷枝毛霉中进行内源表达，构建能够高产脂质的细胞工厂，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导。

发明内容

本发明提供一种卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT，来源于卷枝毛霉的二酰甘油酰基转移酶（DGAT），在卷枝毛霉基因组上的进行整合表达，与对照菌Mc2075相比，其脂质含量有所提高，且其脂肪酸组成有所改变，优化发酵条件后脂质含量可达细胞干重的53%。

本发明的技术方案是：提取卷枝毛霉菌株的mRNA反转出cDNA，设计特异引物PCR扩增二酰甘油酰基转移酶（DGAT）（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），将该基因连接至整合型质粒pMAT2075上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株M65的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养，发酵条件为：采用Kendrick或改进的Kendrick培养基，并外源添加大豆油作为碳源，于28℃，700 rpm，进气量1 v/v min^-1，pH 6.0的条件下进行发酵。发酵过程中，根据油脂积累规律采集样品，进行油脂含量与组成的测定。

本发明还提供了编码卷枝毛霉二酰甘油酰基转移酶（DGAT）的基因，其基因核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

本发明还提供了含有SEQ ID NO: 1的表达载体，能够表达二酰甘油酰基转移酶（DGAT）基因，所述载体是卷枝毛霉表达载体。

本发明还提供了含有大豆油的发酵培养基，能够使卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT的产油量达到细胞干重的53%。

有益效果

本发明的有益效果：本发明提供了一种提高脂质积累量的卷枝毛霉细胞工厂的构建方法；在添加大豆油的发酵培养基中生长的重组菌株Mc-DGAT的脂质含量可以达到细胞干重的53%。

附图说明

图1卷枝毛霉重组菌株的PCR验证。

具体实施方式

实施例1：卷枝毛霉二酰甘油酰基转移酶（DGAT）克隆。

将卷枝毛霉菌株接种在含100 mL Kendrick培养基（葡萄糖，30 g/L；MgSO₄·7H₂O，1.5 g/L；酒石酸铵，3.3 g/L；KH₂PO_4，7.0 g/L；Na₂HPO₄，2.0 g/L；酵母提取物，1.5 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.01 g/L；FeCl₃·6H₂O，8 mg/L；ZnSO₄·7H₂O，1 mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.1 mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O，0.1 mg/L；MnSO₄·5H₂O，0.1 mg/L）的500 mL带挡板的锥形瓶中，28℃，150rpm条件下培养48 h，抽滤收集菌体。提取RNA，反转cDNA，参考反转录试剂盒说明书进行。根据已测得的WJ11的基因组信息，查找到二酰甘油酰基转移酶（DGAT）（K14457, 1265bp），根据基因序列设计特异引物DGAT-F和DGAT-R，以卷枝毛霉cDNA为模板进行PCR。

DGAT-F：5’–GCTAGCTACGTCTTTGGGTC–3’

DGAT-R：5’–AACCCACTCAGGAGGAATTC–3’

PCR反应50 μL体系：5×PS buffer 10 µL，dNTPs Mixture (each 2 mM) 5 µL，上游引物1 µL，下游引物1 µL，总cDNA 100~200 ng，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 1 µL，ddH2O补足至50 µL中进行。反应条件为95℃变性3 min后开始循环，然后95℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1.5min，共30个循环后，再于72℃延伸10 min，降温至4℃保持5 min。扩增得到1265bp的PCR片段，回收片段与pMAT2075载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板（蛋白胨，10 g/L；酵母膏，5 g/L；NaCl，10 g/L；琼脂，1.5%）。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏，5 g/L；NaCl，10 g/L），8~10 h后提取质粒进行序列测定，将序列正确的质粒命名为pMAT2075-DGAT。

卷枝毛霉原生质体制备：将卷枝毛霉M65菌株孢子接种到YPG培养基（酵母提取物，3 g/L；蛋白胨，10 g/L；葡萄糖，20 g/L；亮氨酸，20 µg/mL；尿嘧啶，200 µg/mL；pH 4.5）的平板中，28℃培养1天。取单克隆菌丝点植于YPG培养基的平板上，28℃培养3~4天孢子即可长好。取孢子生长良好的平板，每个平板加入5~6 mL的YPG培养基，用灭菌的涂布棒刮取孢子，将孢子悬浮液收集于灭菌的50 mL离心管中，用血球计数板计算浓度并用pH 4.5的YPG调整孢子浓度为1×10⁷个/mL。取12.5 mL上述孢子悬液于灭菌的250 mL锥形瓶中，置于4℃冰箱过夜使孢子充分吸水膨胀。将锥形瓶置于30℃，250 rpm的摇床培养至孢子萌发。1100rpm离心后用5mL pH 6.5的PS缓冲液[18.22 g山梨醇与20 mL PBS缓冲液（NaCl，137mM；KCl，2.7 mM；Na₂HPO₄，10 mM；KH₂PO₄，2 mM）]洗两次，将培养基洗去。用5mL PS缓冲液重悬，并加入终浓度为4 mg/mL的裂解酶和0.06 U/mL的壳聚糖酶，置于30℃，60 rpm的摇床孵育90 min以除去细胞壁。100×g离心后用0.5 M 4℃预冷的山梨醇溶液洗两次，加入800 μL0.5 M的山梨醇轻轻吹吸重悬沉淀，得到原生质体，分装为100 μL/管以备使用。

重组菌株Mc-DGAT构建：取100 μL上述制备好的原生质体与1 μg质粒pMAT2075-DGAT混匀电击转化，电击结束后立即加入1 mL预冷的YPGS（0.5 mol/L 山梨醇，酵母提取物，3 g/L；蛋白胨，10 g/L；葡萄糖，20 g/L），26℃，100 rpm孵育1 h，100×g离心除去YPGS，以YNBS[山梨醇，91.1 g/L；谷氨酸，1.5 g/L；(NH₄)₂SO₄，1.5 g/L；酵母提取物，0.5 g/L；葡萄糖，10 g/L；调pH 4.5，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]重悬后均匀涂布于MMC培养基[酪蛋白氨基酸，10 g/L；酵母提取物，0.5 g/L；葡萄糖，20 g/L；琼脂，15g/L；调pH 3.2，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]上，28℃避光培养3~4天。随机挑取8个平板上长出的单菌落菌丝于新的MMC平板，28℃培养2~3天收集孢子，将大约200-300个孢子分别接种于MMC和含尿嘧啶的MMC平板中，28℃培养2~3天计数，重复上述筛选步骤直到两个平板中孢子生长数量基本相同则说明得到稳定遗传的转化子。稳定遗传的转化子菌丝在YPG培养基平板，30℃培养5~7天后收取孢子，调整孢子浓度为1×10⁷个/mL，-80℃保存于30%甘油管中。最终获得了卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT和对照菌株Mc2075。将涂布后摇瓶培养的剩余菌体用布氏漏斗真空抽滤分离得到，提取卷枝毛霉基因组DNA（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行），以此为模板，以2075-F和2075-R为引物，进行PCR验证。

2075-F: 5’–CGAGAACATTCTGTCTAGCG–3’

2075-R: 5’– CATACACGGCCCACATTATC–3’

反应体系及扩增条件，95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。PCR验证结果如图1，卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT得到的片段为964 bp，说明质粒已成功转化进入卷枝毛霉中。

高产脂细胞工厂发酵生产：

（1）卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT油脂含量测定

待测样品制备：在1 L发酵罐中采用优化后的Kendrick培养基并添加大豆油为碳源培养卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT。发酵条件为28℃，600 rpm，进气量1 v/v min^-1，pH维持6.0。根据卷枝毛霉产油规律，收集全发酵液样品，用布氏漏斗真空抽滤，分离发酵液和菌体，收集发酵液于-20℃保存待用，用蒸馏水洗涤菌体3遍，然后冷冻干燥备用。

采用差重法测定菌株中的油脂含量，结果如表1，过表达菌株Mc-DGAT胞内油脂的含量有所提高。

表1 发酵培养对照型和DGAT过表达型菌株油脂含量。

序列表

<110> 山东理工大学

<120> 一种非从头合成的卷枝毛霉产油细胞工厂构建及其发酵技术

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1086

<212> DNA

<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides)

<400> 1

atgaacagct cttctgagac attggtcgcc tctgagcctc cccaaaccac aaaggagaag 60

cctagcaagc ccacctctca agtcagatgg gctcccattc gtggcatccc tatcgagaga 120

agactgcaga tgctggctgt ctgcacatgg atcagcatga tgttcatttt ggtgtctttg 180

tttttcttca tggccaccta caagttcatg tggcccattc tgatcgccta catcagcttt 240

ttgtacgtcg acaaagcccc cgaatctggt ggccgtagat ttgaaagcgc cagacactgg 300

gctctgtgga gatatttcgc tgcctacttc cccgctcaac tgatcaagga gcacgatttg 360

gaccccaaga acaattatgt ctttggttac cacccccacg gcattatctc ttacggtgcc 420

cagctggcct ttgctaccga ggctaccggc tttagcgaga agttccccgg tatcacaccc 480

agcttgctga cattgaacag caacttccgt atccctttct accgtgacgt gatcatggct 540

ttgggcatcg cttctgtcag ccgtcgttct tgcgagaaca ttctgtctag cggccccggt 600

agatctatcg ctatcgtcgt cggtggcgcc gctgaaagct tgaacgccag acccggtacc 660

gctgatctgg tgttgcgtaa acgtctgggc ttcatccgtc tggccatcaa gcacggcgct 720

tctttggtcc ccgtcttcag cttcggtgag aacgaagtct acgaccagct ggacaacgcc 780

aagggctcta aggtcttcat gtaccagaag aagatgcaag ctatgctggg cttcacaatg 840

cccttgttcc atgcccgtgg catcttcaac tacgacgtcg gcatcatccc cttcagacac 900

cagatcacca ccgtcgtcgg taagcctatc cccgtccccg ctttggaaga gggccagacc 960

gaacccacac aagagcagat cttgcaagtc cagaagctgt acatcgacga gttgttcacc 1020

atttataata agtacaagga cgtgtacgcc aaggaccgta agcaagaact gcgtatcacc 1080

gattga 1086

Claims (3)

1.一种高产脂卷枝毛霉细胞工厂的构建技术，其特征是，将从卷枝毛霉菌株中克隆获得的二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）通过同源重组的方法转入卷枝毛霉得到积累高含量的卷枝毛霉重组菌株Mc-DGAT，再添加外源油的发酵工艺下获得含量高达53% 的脂质含量的菌株。

2.根据权利要求1所述的重组菌株Mc-DGAT的制备方法，其特征是，以卷枝毛霉总cDNA为模板，设计引物PCR得到编码二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT），其核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示，将该基因连接至整合型质粒pMAT2075上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株M65的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养。

3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征是在Kendrik培养基中添加大豆油与葡萄糖共同作为碳源，并在最佳的发酵参数下培养重组卷枝毛霉细胞。

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