JP2023549946A - 酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用 - Google Patents

酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023549946A
JP2023549946A JP2023530682A JP2023530682A JP2023549946A JP 2023549946 A JP2023549946 A JP 2023549946A JP 2023530682 A JP2023530682 A JP 2023530682A JP 2023530682 A JP2023530682 A JP 2023530682A JP 2023549946 A JP2023549946 A JP 2023549946A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
strain
yeast
nervonic acid
ketoacyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023530682A
Other languages
English (en)
Inventor
ワン，シアン
ルアン，ジャンチャン
リ，フリ
ス，ハン
ファン，ウェイミン
ハン，シンフェン
メン，ズユェ
シ，ペンフェイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Zhenyuan Biotech Co ltd
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Original Assignee
Zhejiang Zhenyuan Biotech Co ltd
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Zhenyuan Biotech Co ltd, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS filed Critical Zhejiang Zhenyuan Biotech Co ltd
Publication of JP2023549946A publication Critical patent/JP2023549946A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01015—Glycerol-3-phosphate O-acyltransferase (2.3.1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/78—Hansenula
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01199—Very-long-chain 3-oxoacyl-CoA synthase (2.3.1.199)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ネルボン酸および／または油脂を生産するための工学菌であって、当該工学菌のゲノムに３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する発現カセットが組み込まれている工学菌を提供する。

Description

本発明は、生物技術の分野に関し、より具体的に、酵母によるネルボン酸の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用に関する。
ネルボン酸（ｃｉｓ－１５－テトラコセン酸、ｃｉｓ－１５－Ｔｅｔｒａｃｏｓｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、２４：１Δ１５）は、超長鎖モノ不飽和脂肪酸（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ、ＶＬＣＭＦＡｓ）であり、主にスフィンゴ糖脂質およびスフィンゴリン脂質の形態で動物の大脳白質および髄鞘の神経線維に存在し、生物膜の重要な構成成分である。ネルボン酸は医学や保健の面において重要な作用があり、大脳発育の促進、記憶の改善、血中脂質の調節、免疫の増強といった効果を有し、多発性硬化症などの神経失調疾患の治療に有用である。また、研究では、ネルボン酸は神経系の発達に対して促進作用を有し、特に嬰幼児の脳神経細胞および視神経細胞の成長と発達の過程において重要な作用がある。
現在、リグノセリン酸（Ｃ２４：０）、ネルボン酸などの超長鎖脂肪酸の合成は、植物において比較的に明確に認識されている。植物は、オレイン酸を基質とし、超長鎖脂肪酸鎖の伸長サイクルによって炭素鎖の伸長を行い、１サイクルで元の脂肪酸の炭素鎖が２つの炭素原子ずつ伸長する。この伸長過程は４つの酵素（ＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲ）からなる酵素複合体の組み合わせによって触媒および調節され、現在、そのうちのＫＣＳ（３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ）が植物組織における超長鎖脂肪酸鎖の長さおよび合成速度を決定するキー酵素とされている。
ネルボン酸は用途が幅広く、人体の健康に非常に有益であるが、人体自身で合成することが困難で、外から摂取する必要がある。現在、化学法によってネルボン酸を合成するが、副産物が多く、スキームが長く、収率が低く、価格が１０００ドル／キロを超え、市場競争力がない。ネルボン酸の市場は需要が莫大であるが、主に植物由来で、生長が遅く、生長環境の要求が高いといった特徴によってネルボン酸の生産量が制限され、微生物によるネルボン酸の生産に良い将来性がある。しかしながら、既知のネルボン酸生産微生物の多くは病原性があるか、潜在的な生産力が不足しているため、産業化生産に応用することができない。
生物油脂は再生可能エネルギーの原料、機能性食品、健康食品、特殊食事サプリメントなどとして有用で、現在、主に植物から得られ、大量の耕地を占用する必要がある。油生産微生物は再生可能な原料で油脂を合成することができ、油脂の獲得方法の重要な補充になる。また、合成生物学的方法により、微生物油脂の構成を調節することができ、機能性食品、医薬などの分野で優れた将来性を示している。
微生物の選択および原料の転換効率は、油脂の合成コストに大きく影響される。近十数年、藻類などの光合成微生物による油脂の合成は重要視されているが、低コスストの二酸化炭素を炭素源としても、微藻類による油脂生産は低生物量、高水消耗、汚染しやすいといった課題を克服することが困難で、コストが高く、産業化が難しい。微藻類と違い、油脂生産酵母は従属栄養微生物で、糖類を利用して大量の油脂を合成することができ、油脂含有量が細胞の乾燥重量の７０％を占め、油脂生産量が９０ ｇ／Ｌ超である。そして、油脂生産酵母の遺伝的ツールは比較的に豊富で、改変が容易で、特殊な機能性脂肪酸を開発する優れたシャーシ細胞である。酵母によって合成されるネルボン酸は、細胞内における主な存在形態がトリグリセリドである。ネルボン酸合成の前駆体が主にオレイン酸で、オレイン酸がトリグリセリドの形態にエステル化されると、さらに伸長してネルボン酸になることがなく、ネルボン酸の生産量が影響される。そのため、超長鎖脂肪酸エステラーゼのスクリーニングは、迅速なネルボン酸のトリグリセリドへの転換に有利で、上流の前駆体の転換を促進し、さらにネルボン酸の生産量を向上させる。
そのため、本分野では、ネルボン酸および油脂の生産量が向上するように、特定の基質嗜好性を有する脂肪酸伸長酵素およびエステラーゼの開発が切望されている。
本発明の目的は、高生産量でネルボン酸および油脂を生産する、新たな方法を提供することにある。
本発明の第一の側面では、ネルボン酸および／または油脂を生産するための工学菌であって、前記工学菌のゲノムに遺伝子発現カセットが組み込まれており、前記の遺伝子発現カセットは３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する工学菌を提供する。
もう一つの好適な例において、前記工学菌は酵母菌を含む。
もう一つの好適な例において、前記工学菌は、ヤロウイア・リポリティカ、出芽酵母、メタノール酵母、ピキア・パストリス、ハンセヌラ酵母、クルイウェロマイセス酵母、カンジダ酵母、クリプトコッカス酵母、イサチェンキア・オリエンタリス、ロドトルラ酵母、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子は、マラニア・オレイフェラ（Ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）、カルダミネ・グラエカ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ）、マンシュウイタヤ（Ａｃｅｒ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ）、ゴウダソウ（Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ）、シメニア・カフラ（Ｘｉｍｅｎｉａ ｃａｆｆｒａ）、トロパエオラム・スペシオサム（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｓｐｅｃｉｏｓｕｍ）、ブンカンカ（Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａ）、油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記工学菌はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、好ましくはヤロウイア・リポリティカ Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳまたはヤロウイア・リポリティカ ＹＬ－８８－Ｂ１である。
もう一つの好適な例において、前記エステラーゼ遺伝子はマラニア・オレイフェラ（Ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）、カルダミネ・グラエカ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ）、マンシュウイタヤ（Ａｃｅｒ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ）、ゴウダソウ（Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ）、シメニア・カフラ（Ｘｉｍｅｎｉａ ｃａｆｆｒａ）、トロパエオラム・スペシオサム（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｓｐｅｃｉｏｓｕｍ）、ブンカンカ（Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａ）、油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記エステラーゼ遺伝子は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記のゲノムに、１－２０個（好ましくは１－１０個、より好ましくは１－５個）の前記の遺伝子発現カセットが組み込まれている。
もう一つの好適な例において、前記遺伝子発現カセットは、ＴＥＦ、ＴＥＦｉｎｔｒｏ、ＥＸＰ、ＧＰＤ、 ＧＰＡＴ、ＹＡＴ、ｈｐ４ｄ、ｈｐ８ｄ、ＸＰＲからなる群から選ばれる一つまたは複数のプロモーターに組み込まれている。
もう一つの好適な例において、前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子はコドンが最適化された３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前記エステラーゼ遺伝子はコドンが最適化されたエステラーゼ遺伝子である。
もう一つの好適な例において、前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子の配列は配列番号１－１１のいずれかで示される。
もう一つの好適な例において、前記エステラーゼ遺伝子の配列は配列番号４８、４９、５０、５１、５２のいずれかで示される。
もう一つの好適な例において、前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子またはエステラーゼ遺伝子は、構成型または誘導型プロモーターであるＴＥＦ、ＴＥＦｉｎｔｒｏ、ＥＸＰ、ＧＰＤ、 ＧＰＡＴ、ＹＡＴ、ｈｐ４ｄ、ｈｐ８ｄ、ＸＰＲによって駆動される。
もう一つの好適な例において、前記のプロモーターは、ＴＥＦ、ＴＥＦｉｎｔｒｏ、ＥＸＰ、ＧＰＤ、 ＧＰＡＴ、ＹＡＴ、ｈｐ４ｄ、ｈｐ８ｄ、ＸＰＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工学菌のネルボン酸の生産量が≧２０ ｇ／Ｌ、好ましくは２０－３０ ｇ／Ｌである。
もう一つの好適な例において、前記工学菌のネルボン酸の生産量が≧２５％、好ましくは２６－３０％向上した。
もう一つの好適な例において、前記工学菌の振とう発酵の油脂生産量が≧１６ ｇ／Ｌ、好ましくは１６－１８ ｇ／Ｌである。
もう一つの好適な例において、前記の工学菌のネルボン酸／全油脂の比率（質量百分率）が≧１８％、好ましくは１８－２０％である。
もう一つの好適な例において、前記油脂の脂肪酸の構成が主にＣ１６：１、Ｃ１８：１、Ｃ２４：１を含み、単一の成分の質量百分率が１５－４０％、好ましくは１８－４０％である。
もう一つの好適な例において、前記の工学菌の発酵生物量（細胞乾燥重量）が≧１２０ ｇ／Ｌ、好ましくは１３０－２００ ｇ／Ｌである。
もう一つの好適な例において、前記の工学菌のネルボン酸／全脂肪酸の比率が≧２０％、好ましくは２０－６５％、より好ましくは２５－６５％である。
本発明の第二の側面では、ネルボン酸および／または油脂を生産する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ｉ）本発明の第一の側面に記載の工学菌を培養することにより、ネルボン酸および／または油脂を含む発酵産物を得る；ならびに
（ｉｉ）前記発酵産物からネルボン酸および／または油脂を分離する。
本発明の第三の側面では、本発明の第一の側面に記載の工学菌を構築する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）スクリーニングマーカー遺伝子、耐性遺伝子エレメント、ｒＤＮＡ相同組換え遺伝子断片、および３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子である、標的遺伝子というエレメントを有する、遺伝子発現カセットを含有するベクターを構築する；ならびに
（ｂ）工程（ａ）で得られた前記遺伝子発現カセットを含有するベクターをレセプター菌株に導入し、レセプターのゲノムに前記遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を得る。
もう一つの好適な例において、さらに、以下の工程を含む：工程（ｃ）：ＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシングによって工程（ｂ）で得られた遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株の遺伝子型を検証する；ならびに／あるいは
工程（ｄ）：遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を発酵させて得られたネルボン酸および／または油脂の生産量を検出する。
もう一つの好適な例において、工程（ａ）の前記のベクターはプラスミド、コスミドまたは核酸断片である。
もう一つの好適な例において、工程（ａ）の前記の発現カセットは、さらに、強プロモーターエレメントを含む。
もう一つの好適な例において、前記の強プロモーターエレメントは、ＴＥＦｉｎｔｒｏ、ＧＰＡＴ、ＥＸＰ、ＧＰＤ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ、ｈｐ４ｄ、ｈｐ８ｄ、ＸＰＲを含む。
もう一つの好適な例において、前記の強プロモーターエレメントはＴＥＦｉｎｔｒｏである。
もう一つの好適な例において、前記強プロモーターエレメントは１－３個、好ましくは１－２個、より好ましくは２個である。
もう一つの好適な例において、前記スクリーニングマーカー遺伝子は、ＵＲＡ、ｌｅｕ、ＨＧＲ、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記耐性遺伝子エレメントはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
もう一つの好適な例において、工程（ａ）の前記の発現カセットは、強プロモーターエレメントとしてＴＥＦｉｎｔｒｏ、標的遺伝子として３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子、ＵＲＡ、ｌｅｕまたはＨＧＲのうちの一つまたは複数を含む酵母スクリーニングマーカー遺伝子、ならびにアンピシリン耐性遺伝子ＡＭＰというエレメントを含む。
もう一つの好適な例において、工程（ｂ）の前記のレセプターのゲノムに組み込まれた遺伝子発現カセットの数が１－５個、好ましくは１－３個である。
本発明の第四の側面では、本発明の第一の側面に記載の工学菌株の使用であって、発酵によってネルボン酸および／または油脂を生産する菌株として用いられる使用を提供する。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
図１は、異なる３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼのタンパク質配列の系統樹である。 図２は、異なる３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼのタンパク質配列のアラインメントである。枠内は、ＫＣＳファミリーの３つの機能保存ドメイン「ＦＧＮＴＳＳＳＳ」、「ＧＳＧＦＫＣＮＳＡＶＷ」および「ＧＭＧＣＳＡ」である。
図３は、組換え菌株の診断ＰＣＲ検証である。Ａ：下流のＰＣＲ結果である。ＣＫはブランク対照であるＰｏ１ｇ－Ｇ３で、数字１－８は組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１またはＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７の異なる形質転換体に相応する。Ｂ：組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の異なる形質転換体の下流のＰＣＲ結果である。Ｃ：上流のＰＣＲ結果である。ＣＫはブランク対照であるＰｏ１ｇ－Ｇ３で、数字１－８は組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７またはＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の異なる形質転換体に相応する。
図４は、組換え菌株の振とう発酵の結果である。異なる菌株間の乾燥重量、全脂質生産量および全脂質含有量の比較である。ｓｔｒａｉｎＣＫ：対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３； ｓｔｒａｉｎ３９８：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８； ｓｔｒａｉｎ４６１：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１； ｓｔｒａｉｎ４６７：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７； ｓｔｒａｉｎ８１７：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１。 図５は、組み換え菌株の脂肪酸の気相分析の結果である。ＣＫ：対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３； ＭａｏｌｅＫＣＳ ： Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８ 。数字１－１１は異なる脂肪酸成分を表し、順にＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１、Ｃ２４：０およびＣ２４：１である。
図６は、過剰発現ＭａｏｌｅＫＣＳ組み換え菌株の振とう発酵の結果である。Ａ：異なる菌株間の乾燥重量、全脂質生産量および全脂質含有量の比較である。Ｂ：異なる菌株の脂肪酸成分の分析である。ｓｔｒａｉｎＣＫ：対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ； ｓｔｒａｉｎ＃１：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８； ｓｔｒａｉｎ＃２：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１； ｓｔｒａｉｎ＃３：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７； ｓｔｒａｉｎ＃４：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７。
図７は、過剰発現ＭａｏｌｅＫＣＳ組み換え菌株の脂肪酸成分の気相分析スペクトルである。ａ：対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ； ｂ：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８； ｃ：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１； ｄ：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７； ｅ：Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７。数字１－１１は異なる脂肪酸成分を表し、順にＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１、Ｃ２４：０およびＣ２４：１である。
図８は、組み換え菌株の発酵タンク発酵の結果である。 図９は、組み換え菌株の発酵タンク発酵１６８ ｈの脂肪酸成分の気相分析スペクトルである。数字１－１１は異なる脂肪酸成分を表し、順にＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２０：０、Ｃ２０：１、Ｃ２２：０、Ｃ２２：１、Ｃ２４：０およびＣ２４：１である。
図１０は、エステラーゼ組み換え菌株の油脂生産量の分析を示す。 図１１は、エステラーゼ組み換え菌株のネルボン酸生産量の分析を示す。 図１２は、エステラーゼ組み換え菌株の脂肪酸の構成の変化を示す。 図１３は、エステラーゼ組み換え菌株の陽性クローンの同定結果を示す。
ここで、図１０－１２において、ＣＫはＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳである。
本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、意外に、１種類の酵母工学菌を構築したが、前記工学菌のゲノムに遺伝子発現カセットが組み込まれており、前記の遺伝子発現カセットは３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を発現し、本発明の工学菌は顕著にネルボン酸および／または油脂の生産量を向上させることができ、そして油脂の脂肪酸の構成を変えることもできる。これに基づき、本発明を完成させた。
用語
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学の用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。
本明細書で用いられるように、具体的に例示される数値で使用される場合、用語「約」とは当該値が例示される数値から１％以内で変わってもよい。たとえば、本明細書で用いられるように、「約１００」という表示は９９と１０１およびその間の全部の値（たとえば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
本明細書で用いられるように、用語「含有」または「含む」は開放式、半閉鎖式および閉鎖式のものでもよい。言い換えれば、前記用語は「基本的に・・・で構成される」、または「・・・で構成される」も含む。
本明細書で用いられるように、用語「以上」および「以下」はその数字を含み、例えば、「２０％以上」とは≧２０％で、「８：１以上」とは≧８：１である。
開始菌株
本明細書で用いられるように、用語「本発明の開始菌株」または「本発明の開始微生物」は、入れ替えて使用することができるが、いずれもヤロウイア・リポリティカであるＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇ（ＭＡＴａ， ｌｅｕ２－２７０， ｕｒａ３－３０２：：ＵＲＡ３， ｘｐｒ２－３）およびＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇ－ＫＣＳ（ＭＡＴａ， ｌｅｕ２－２７０， ｕｒａ３－３０２：：ＵＲＡ３， ｘｐｒ２－３，ＫＣＳ）のことで、ここで、Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇはＹｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入されたもので、Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇ－ＫＣＳは中科院青島生物エネルギーと過程研究所から得られたものである。
もちろん、開始菌株は、本発明のヤロウイア・リポリティカＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇのみならず、その誘導菌株も含む。
ネルボン酸
ネルボン酸（ｃｉｓ－１５－テトラコセン酸、ｃｉｓ－１５－Ｔｅｔｒａｃｏｓｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、２４：１Δ１５）は、超長鎖モノ不飽和脂肪酸（ｖｅｒｙ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ、ＶＬＣＭＦＡｓ）であり、主にスフィンゴ糖脂質およびスフィンゴリン脂質の形態で動物の大脳白質および髄鞘の神経線維に存在し、生物膜の重要な構成成分である。ネルボン酸は医学や保健の面において重要な作用があり、大脳発育の促進、記憶の改善、血中脂質の調節、免疫の増強といった効果を有し、多発性硬化症などの神経失調疾患の治療に有用である。また、研究では、ネルボン酸は神経系の発達に対して促進作用を有し、特に嬰幼児の脳神経細胞および視神経細胞の成長と発達の過程において重要な作用がある。
油脂
微生物油脂は、生物エネルギー、食品、医薬などの分野で重要な応用価値がある。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ）は偏性好気性の油脂生産酵母で、大量の中性脂質を蓄積することができ、そのうち、最も重要な成分はパルミトレイン酸およびオレイン酸を含み、強化油脂生産経路によって両者の含有量の合計が全脂肪酸における比率が７０％以上になる。パルミトレイン酸（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）は一部の慢性疾患、たとえば、代謝症候群、糖尿病および炎症において治療作用があり、ヒト細胞におけるメラニン因子を抑制し、皮膚の色素沈着を改善することができる。オレイン酸はシス構造で、血管軟化にある程度の作用があり、ヒトおよび動物の新陳代謝の過程においても重要な役割を担い、オレイン酸含有量の高い食用油の摂取が健康に有益である。また、オレイン酸はペイントのドライヤー、潤滑油の増稠剤、毛糸紡績工業、印刷染色業界の重要な原料でもある。油脂生産酵母によって合成される混合油脂はバイオリディーゼルファイナリーの原料として有用である。
３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子
本発明において、本明細書に記載の「３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子」によってコードされるタンパク質産物は３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼで、ネルボン酸の合成の触媒に関与する。
３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子によってコードされるタンパク質産物は３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼで、触媒して最終的にネルボン酸を合成する。３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）は単一の読み枠を含み、５１２－６５３アミノ酸のタンパク質をコードする。
本発明において、大量の創造的実験を経て工学菌へ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子を発現する発現カセットを組み込むことでネルボン酸の生産量を向上させ、不飽和脂肪酸の含有量を低下させることができることが見出された。そのため、本方案によって提供される改変後の工学菌は幅広い実用の価値および将来性がある。
当業者は汎用の方法によって３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子の配列を得ることができるが、たとえば、ＮＣＢＩから得られる。
本発明の３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子は、さらに、異なる由来の３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子、同一の由来の異なる相同配列、およびコドンが最適化された３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子を含む。
エステラーゼ
本発明において、本明細書に記載の「エステラーゼ遺伝子」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）およびグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）遺伝子で、コードされるタンパク質産物は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）およびグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）で、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼはトリアシルグリセロールの触媒に、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼはリゾホスファチジン酸の合成の触媒に関与する。
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）はＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）、ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）を含み、４０３－５２２アミノ酸のタンパク質をコードする。
グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）遺伝子はＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）を含み、２３１－３７０アミノ酸のタンパク質をコードする。
本発明において、大量の創造的実験を経て工学菌へ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼを発現する発現カセットを組み込むことでネルボン酸または油脂の生産量を向上させ、不飽和脂肪酸の含有量を低下させ、油脂の脂肪酸の構成を変え、オレイン酸の全油脂における比率を向上させ、ネルボン酸の全油脂における比率を向上させ、ネルボン酸の発酵濃度を向上させることができることが見出された。そのため、本方案によって提供される改変後の工学菌は幅広い実用の価値および将来性がある。
当業者は汎用の方法によってエステラーゼ遺伝子の配列を得ることができるが、たとえば、ＮＣＢＩから得られる。
本発明のエステラーゼ遺伝子は、さらに、異なる由来のエステラーゼ遺伝子、同一の由来の異なる相同配列を含む。
プライマー
本明細書で用いられるように、用語「プライマー」とは、鋳型にマッチし、ＤＮＡポリメラーゼの作用下でそれを起点として鋳型と相補的なＤＮＡ鎖を合成するオリゴヌクレオチドの総称である。プライマーは天然のＲＮＡ、ＤＮＡでもよく、あらゆる形態の天然ヌクレオチドでもよい。プライマーは非天然のヌクレオチド、たとえば、ＬＮＡやＺＮＡなどでもよい。
プライマーは「ほぼ」（または「基本的に」）鋳型の一本の鎖における一つの特殊な配列と相補的である。プライマーは鋳型の一本の鎖と十分に相補的でないと、伸長しないが、プライマーの配列は鋳型の配列と完全に相補的なものではなくてもよい。たとえば、一つの３’末端が鋳型と相補的なプライマーの５’末端に鋳型と相補的でない配列を加えても、このようなプライマーはほぼ鋳型と相補的である。十分に長いプライマーが鋳型と十分に結合する限り、完全に相補的でないプライマーも鋳型とプライマー－鋳型複合体を形成することで、増幅することが可能である。
工学菌の構築
本発明は、遺伝子工学菌のネルボン酸高生産菌株を構築する方法であって、以下の工程を含むが、これらに限定されない方法を提供する。
１．遺伝子発現カセットを含有するベクターの構築
コドン最適化後、遺伝子を合成し、３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子のＰＣＲプライマーを設計し、クローニングによって標的遺伝子を得、ギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）のシームレスクローニング法によってプラスミドを構築した。２．得られた前記遺伝子発現カセットを含有するベクターをレセプター菌株に導入し、レセプターのゲノムに遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を得る。一つの好適な例において、構築された発現カセットを有するベクターを属間接合伝達によって開始菌株に導入し、所定の耐性スクリーニング条件において陽性接合子を選択する。
一つの好適な例において、さらに、工程３：ＰＣＲによって工程２で得られた遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株の遺伝子型を検証する；ならびに／あるいは工程４：遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を発酵させて得られたネルボン酸の生産量を検出する。一つの好適な例において、所定の耐性を有する陽性接合子を液体培地において培養し、菌体の全ＤＮＡを抽出し、遺伝子型のＰＣＲによる検証を行う。標的遺伝子に対して複数対のプライマーを設計することにより、標的ゲノムに相応する遺伝子が組み込まれたことを検証してもよい。ＰＣＲによって増幅された正確な大きさの塩基断片を回収し、ＤＮＡシークエンシングの方法によって最終的に遺伝子工学菌株の正確さを確認する。
本発明で得られた菌株であるヤロウイア・リポリティカ菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－－ＭａｏｌｅＫＣＳは、発酵によるネルボン酸の生産能力が顕著に向上した。
一つの好適な実施様態において、本発明に使用される技術方案は、以下の通りである。
（１）バイオインフォマティクス分析により、マラニア・オレイフェラの３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼに対してスクリーニングおよび分析を行う。
（２）ヤロウイア・リポリティカを開始菌株とし、マラニア・オレイフェラの３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子（配列番号１－１１を参照する）を導入し、ヤロウイア・リポリティカにネルボン酸の合成能力を持たせるか、増強させる。
さらに、ヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３を開始菌株とし、相同組換えの手段によってＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子を導入し、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳを得る。
またさらに、まず相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを構築し、さらに得られたプラスミドを酵素切断してヤロウイア・リポリティカ菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ΔＵＲＡを形質転換し、ウラシル栄養要求性プレートで形質転換体をスクリーニングし、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子が導入された組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳを得る。
またさらに、前記相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡはプラスミドｐＹＬＥＸ－ＵＲＡを骨格鋳型とし、ＭａｏｌｅＫＣＳ発現カセットの上流と下流がそれぞれヤロウイア・リポリティカ２６Ｓ ｒＤＮＡの２つの断片である（配列番号１２と配列番号１３を参照する）。
（３）ヤロウイア・リポリティカを開始菌株とし、マラニア・オレイフェラの３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子（配列番号１－１１を参照する）を過剰発現させ、ヤロウイア・リポリティカにネルボン酸の合成能力を持たせるか、増強させる。
さらに、ヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳを開始菌株とし、相同組換えの手段によってＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子を導入し、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳを得る。
またさらに、まず相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを構築し、さらに得られたプラスミドを酵素切断してヤロウイア・リポリティカ菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ΔＵＲＡを形質転換し、ウラシル栄養要求性プレートで形質転換体をスクリーニングし、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子が導入された組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳを得る。
またさらに、前記相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡはプラスミドｐＹＬＥＸ－ＵＲＡを骨格鋳型とし、ＭａｏｌｅＫＣＳ発現カセットの上流と下流がそれぞれヤロウイア・リポリティカＦＡＤ２遺伝子の２つの断片である（配列番号１４と配列番号１５を参照する）。
（４）上記組換え菌株に対して発酵タンク培養を行い、ネルボン酸の全脂肪酸における比率が３６．９％に、ネルボン酸生産量が２５．７ ｇ／Ｌに達する。
本発明は、ネルボン酸遺伝子工学菌株を構築する方法を提供するとともに、油脂高生産菌株を構築する方法であって、以下の工程を含む、これらに限定されない方法を提供する。
１．遺伝子発現カセットを含有するベクターの構築
コドン最適化後、遺伝子を合成し、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）酵素遺伝子のＰＣＲプライマーを設計し、クローニングによって標的遺伝子を得、ギブソン・アッセンブリー（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）のシームレスクローニング法によってプラスミドを構築する。
２．得られた前記遺伝子発現カセットを含有するベクターをレセプター菌株に導入し、レセプターのゲノムに遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を得る。一つの好適な例において、構築された発現カセットを有するベクターを属間接合伝達によって開始菌株に導入し、所定の耐性スクリーニング条件において陽性接合子を選択する。
一つの好適な例において、さらに、工程３：ＰＣＲによって工程２で得られた遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株の遺伝子型を検証する；ならびに／あるいは工程４：遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を発酵させて得られたネルボン酸の生産量を検出する。一つの好適な例において、所定の耐性を有する陽性接合子を液体培地において培養し、菌体の全ＤＮＡを抽出し、遺伝子型のＰＣＲによる検証を行う。標的遺伝子に対して複数対のプライマーを設計することにより、標的ゲノムに相応する遺伝子が組み込まれたことを検証してもよい。ＰＣＲによって増幅された正確な大きさの塩基断片を回収し、ＤＮＡシークエンシングの方法によって最終的に遺伝子工学菌株の正確さを確認する。
本発明で得られる菌株であるヤロウイア・リポリティカ菌株ＹＬ－８８－Ｂ１は、発酵による油脂およびネルボン酸の生産能力が顕著に向上した。
もう一つの好適な実施様態において、本発明に使用される技術方案は、以下の通りである。
（１）バイオインフォマティクス分析により、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）酵素に対してスクリーニングおよび分析を行う。
（２）既に脂肪酸伸長酵素ＣｇＫＣＳを発現するヤロウイア・リポリティカ菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳを開始菌株とし、マラニア・オレイフェラのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）酵素（配列番号４８、４９、５０、５１、５２を参照する）を導入し、ヤロウイア・リポリティカに油脂およびネルボン酸の合成能力を持たせるか、増強させる。
さらに、ヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳを開始菌株とし、相同組換えの手段によってジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）酵素遺伝子を導入し、菌株ＹＬ－３５－Ｆ５、ＹＬ－４９－Ｃ６、ＹＬ－８８－Ｂ１、ＹＬ－９０－Ｂ６を得る。そして、本発明の方法によって伸長酵素ＣｇＫＣＳおよびエステラーゼを発現される場合、菌株ＹＬ－８８－Ｂ１の振とう発酵レベルの油脂生産量が２２．１％向上し、ネルボン酸の全脂肪酸における比率が１８－２０％に達する。
発酵によるネルボン酸の生産
本発明の遺伝子改変菌株は、発酵によるネルボン酸の生産に有用で、一つの好適な例において、培地は以下のものを含むが、これらに限定されず、培地の総体積に対して、重量体積比で計算する。
ＹＰＤ液体培地：ブドウ糖２０ ｇ／Ｌ、ペプトン２０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。通常の培養に使用される。
ウラシル栄養要求性培地（ＹＮＢ－Δｕｒａ）：ＹＮＢ （アミノ酸・硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ） １．７ ｇ／Ｌ、ブドウ糖 ２０．０ ｇ／Ｌ、ＣＳＭ－Ｕｒａ （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ） ０．６７ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。組換え菌株のスクリーニングおよび活性化培養に使用される。
振とう発酵培地：ブドウ糖１５０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物６ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１２ ｇ／Ｌ。
大腸菌に使用される培養温度が３７℃で、液体培養の場合、シェーカーの回転数が２００ ｒｐｍで、使用される培地は以下の通りである。
ＬＢ培地：トリプトン１０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。通常の培養に使用される。
Ａｍｐ耐性培地：ＬＢ培地に、Ａｍｐの最終濃度が１００ μｇ／ｍｌになるように、高濃度Ａｍｐ溶液が加え、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。組換え細菌菌株のスクリーニングおよび増幅培養に使用される。
本発明の菌株の発酵産物はネルボン酸の製造に使用することができる。
薬物組成物および施用方法
本発明の菌株の発酵産物におけるネルボン酸は薬物の製造に有用である。本発明のネルボン酸および油脂は、哺乳動物（たとえば、ヒト）に施用することができ、経口、直腸、胃腸外（静脈内、筋肉内または皮下）、局部などの手段で投与することができる。前記ネルボン酸および油脂は、単独で投与してもよいし、あるいは他の薬学的に許容される化合物と併用して投与してもよい。なお、本発明のネルボン酸および油脂は混合して投与することができる。
経口投与に用いられる固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤を含む。これらの固体剤形において、活性化合物は通常、少なくとも一種の不活性賦形剤（または担体）、たとえばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムと混合されるが、あるいは、（ａ）フィラーまたは相溶剤、たとえば、でん粉、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトールやケイ酸、（ｂ）バインダー、たとえば、ヒドロメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖やアラビアゴム、（ｃ）保湿剤、たとえば、グリセリン、（ｄ）崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉やタピオカ澱粉、アルギン酸、ある複合ケイ酸塩や炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、たとえばパラフィン、（ｆ）吸収促進剤、たとえば、アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、たとえばセタノール、グリセリンモノステアレート、（ｈ）吸着剤、たとえば、カオリン、また（ｉ）潤滑剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム、またはこれらの混合物、のような成分と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤において、剤形に緩衝剤を含んでもよい。
固体剤形、たとえば錠剤、ピル、カプセル剤、丸剤や顆粒剤は、コーディングやシェル剤、たとえば、腸衣および他の本分野で公知の材料で製造することができる。不透明剤を含んでもよく、且つこのような組成物において、活性物または化合物の放出は遅延の様態で消化管のある部分で放出してもよい。使用できる包埋成分の実例として、重合物質やワックス系物質が挙げられる。必要な場合、活性化合部も上記賦形剤のうちの一種または複数種とマイクロカプセルの様態に形成してもよい。
経口投与に用いられる液体剤形は、薬学的に許容される乳液、溶液、懸濁液、シロップまたはチンキ剤を含む。活性化合物のほか、液体剤形は、本分野で通常使用される不活性希釈剤、たとえば、水または他の溶媒、相溶剤および乳化剤、たとえば、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、プロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、ジメチルホルムアミドおよび油、特に、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、ヒマシ油やゴマ油またはこれらの物質の混合物などを含んでもよい。
これらの不活性希釈剤のほか、組成物は助剤、たとえば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料や香料を含んでもよい。
活性化合物のほか、懸濁液は、懸濁剤、たとえば、エトキシ化イソオクタデカノール、ポリオキシエチレンソルビトールやソルビタンエステル、微晶質セルロース、メトキシアルミニウムや寒天またはこれらの物質の混合物などを含んでもよい。
胃腸外注射用組成物は、生理的に許容される無菌の水含有または無水溶液、分散液、懸濁液や乳液、および再溶解して無菌の注射可能な溶液または分散液にするための無菌粉末を含む。適切な水含有または非水性担体、希釈剤、溶媒または賦形剤は、水、エタノール、多価アルコールおよびその適切な混合物を含む。
局所投与のための本発明の化合物の剤形は、軟膏剤、散剤、湿布剤、噴霧剤や吸入剤を含む。活性成分は、無菌条件で生理学的に許容される担体および任意の防腐剤、緩衝剤、または必要よって駆出剤と一緒に混合される。
薬物組成物を使用する場合、安全な有効量の本発明のネルボン酸および油脂を治療の必要のある哺乳動物（たとえばヒト）に使用し、使用の際の用量は薬学上で効果があるとされる投与量で、体重６０ｋｇの個体の場合、毎日の投与量は、通常１～１０００ ｍｇ、好ましくは２０～５００ ｍｇである。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、個体の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
本発明の主な利点は以下の通りである。
（１） 本発明において、３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子を発現させることで、顕著にネルボン酸の生産量を向上させる。
（２） 本発明において、単一の酵素の有効な発現だけで酵母工学菌、たとえば、ヤロウイア・リポリティカにネルボン酸の合成能力を持たせるか、増強させる。
（３） 本発明の組換え菌株において、ネルボン酸の全脂肪酸における比率が３６．９％に、ネルボン酸生産量が２５．７ ｇ／Ｌに達する。本発明によって提供されるマラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼはネルボン酸高生産酵母工学菌の構築に有用で、化学工業、医薬や保健などの分野において幅広い応用の将来性がある。
（４） 本発明において、エステラーゼの単独発現またはエステラーゼとケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子の共発現により、顕著にネルボン酸および油脂の生産量を向上させ、油脂の脂肪酸の構成を変え、オレイン酸の全油脂における比率を向上させ、ネルボン酸の全油脂における比率を向上させ、ネルボン酸の発酵濃度を向上させる。
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９） に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
特に説明しない限り、本発明の実施例における材料および試薬はいずれも市販品である。
実施例１：酵母におけるＭａｏｌｅＫＣＳの発現によるネルボン酸の合成
１．材料と方法
１．１ 菌株および培養条件
実施例で使用されたヤロウイア・リポリティカ開始菌株はＹ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ Ｐｏ１ｇ （ＭＡＴａ、ｌｅｕ２－２７０、ｕｒａ３－３０２：：ＵＲＡ３、ｘｐｒ２－３）で、Ｙｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄから購入されたものである。下記方法によって菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ΔＵＲＡを得たが、具体的に、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３はヤロウイア・リポリティカの内因性遺伝子ＤＧＡＴ１、ＡＣＣ１およびＳＣＤ遺伝子を過剰発現させて得たもので（ＱｉａｏおよびＳｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ．、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５、２９：５６－６５）、さらに５－ＦＯＡ法によって逆スクリーニングしてウラシル栄養要求性菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ΔＵＲＡを得た。
ヤロウイア・リポリティカに使用された培養温度が２８℃で、液体培養の場合、シェーカーの回転数が２２０ ｒｐｍで、使用された培地は以下の通りである。
ＹＰＤ液体培地：ブドウ糖２０ ｇ／Ｌ、ペプトン２０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。通常の培養に使用される。
ウラシル栄養要求性培地（ＹＮＢ－Δｕｒａ）：ＹＮＢ （アミノ酸・硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース、Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ） １．７ ｇ／Ｌ、ブドウ糖 ２０．０ ｇ／Ｌ、ＣＳＭ－Ｕｒａ （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ） ０．６７ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。組換え菌株のスクリーニングおよび活性化培養に使用される。
振とう発酵培地：ブドウ糖１５０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物６ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１２ ｇ／Ｌ。
大腸菌に使用される培養温度が３７℃で、液体培養の場合、シェーカーの回転数が２００ ｒｐｍで、使用される培地は以下の通りである。
ＬＢ培地：トリプトン１０ ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ ｇ／Ｌで、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。通常の培養に使用される。
Ａｍｐ耐性培地：ＬＢ培地に、Ａｍｐの最終濃度が１００ μｇ／ｍｌになるように、高濃度Ａｍｐ溶液が加え、固体培地が必要な場合、１．５％の寒天を添加する。組換え細菌菌株のスクリーニングおよび増幅培養に使用される。
１．２ マラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子のスクリーニングと発現
１．２．１ マラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子のバイオインフォマティクス分析
文献（Ｘｕら、ＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ、２０１９、８：１-１４）のゲノムデータから１２の潜在的なマラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子を得たが、それぞれＭａｏｌｅ＿００２４１１、Ｍａｏｌｅ＿００３０８５、Ｍａｏｌｅ＿００４２１５、Ｍａｏｌｅ＿００５６５４、Ｍａｏｌｅ＿００８０２０、Ｍａｏｌｅ＿００９８１７、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６１、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６３、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６６、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６７、Ｍａｏｌｅ＿０１７３９７およびＭａｏｌｅ＿０１７３９８である。さらに、そのうちの６つの遺伝子を選び、それぞれＫＣＳ３９７ （Ｍａｏｌｅ＿０１７３９７）、ＫＣＳ３９８ （Ｍａｏｌｅ＿０１７３９８）、ＫＣＳ４６１ （Ｍａｏｌｅ＿０１６４６１）、ＫＣＳ４６３ （Ｍａｏｌｅ＿０１６４６３）、ＫＣＳ４６７ （Ｍａｏｌｅ＿０１６４６７）およびＫＣＳ８１７ （Ｍａｏｌｅ＿００９８１７）と名付け、そして相応するアミノ酸配列を得たが、順にＭａｏｌｅ＿０１７３９７．Ｔ１、Ｍａｏｌｅ＿０１７３９８．Ｔ１、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６１．Ｔ１、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６３．Ｔ１、Ｍａｏｌｅ＿０１６４６７．Ｔ１およびＭａｏｌｅ＿００９８１７．Ｔ１で、詳細は表１を参照する。ＮＣＢＩデータベースから３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼと確認されたＭｏＫＣＳ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＱＤＡ３４２３８．１、Ｍ． ｏｌｅｉｆｅｒａ由来）、ＣｇＫＣＳ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＣＪ６１７７８．１、Ｃ． ｇｒａｅｃａ由来）、ＬａＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ８７１７８７．１、Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ由来）、ＢｒＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＵ３２５７２３、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ由来）、ＢｔＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ６６４１６５、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ由来）、ＢｅＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ６６４１６８、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｅｌｏｎｇａｔａ由来）、およびその遺伝子とアミノ酸配列を見つけた。ＭＥＧＡ５．１に付属したＣｌｕｓｔｅｒＷによってＫＣＳ３９７、ＫＣＳ３９８、ＫＣＳ４６１、ＫＣＳ４６３、ＫＣＳ４６７、ＫＣＳ８１７、ＭｏＫＣＳ、ＣｇＫＣＳ、ＬａＫＣＳ、ＢｒＫＣＳ、ＢｔＫＣＳおよびＢｅＫＣＳのアミノ酸配列に対してタンパク質配列の多重アラインメントを行った後、近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）のアルゴリズム（ブートストラップ１０００回）を利用し、系統樹を作成し、図１に示す。４つのＫＣＳ（ＫＣＳ３９８、ＫＣＳ４６１、ＫＣＳ４６７およびＫＣＳ８１７）遺伝子を選び、ＮＣＢＩオンラインドメイン分析ソフト （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ） およびＤＮＡＭＡＮソフトによってＣｇＫＣＳ、ＭｏＫＣＳおよび選ばれた４つのＫＣＳのタンパク質配列に対してアラインメントを行い、図２に示す。
１．２．２ ベクターの構築
ＫＣＳ３９８、ＫＣＳ４６１、ＫＣＳ４６７およびＫＣＳ８１７遺伝子は無錫青蘭生物科技有限公司によってコドンを最適化して合成されたもので（最適化された遺伝子配列が順に配列番号２、３、５、６である）、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つシャトルプラスミドを得たが、ｐＭｖ－ＭａｏｌｅＫＣＳ＃－ＡＭＰと名付けた（注：＃は異なるＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子の番号、すなわち、３９８， ４６１， ４６７または８１７を表す。以下同様。）。
プラスミドベクターの構築はギブソン・アセンブリ法を利用し、すべての組み立て断片はＰＣＲ増幅法によって得られた。プラスミド骨格はｐＹＬＥＸプラスミド由来のものである（Ｙｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）。すべてのＰＣＲ増幅はＫＡＰＡ ＨｉＦｉ高正確性ＤＮＡポリメラーゼを利用し、増幅系はいずれも５０ μｌで（２× ＫＡＰＡ Ｍｉｘ ２５ ｕｌ、１０ μＭプライマー １．５ ｕｌずつ、鋳型 １ μｌで、５０ μｌまで水を加えた）、各ＤＮＡ配列を得た。増幅条件は、９５℃で３分間予備変性し、９８℃で２０秒変性し、６０～７２℃で１５秒アニーリングし、７２℃で伸長し、伸長時間は３０秒／ｋｂで計算し、サイクル数は２９～３５で、７２℃で１０分間伸長した。
プラスミドｐＹＬＥＸ－ＵＲＡはギブソン・アッセンブリー法を利用し、ｐＹＬＥＸプラスミドにおけるＬＥＵ２遺伝子の代わりにＵＲＡ３遺伝子を用いて得られたものである。さらに、ｐＹＬＥＸ－ＵＲＡを骨格として相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡ（ＣｇＫＣＳは１．２におけるカルダミネ属ＫＣＳ遺伝子である）を構築した。ここで、ＣｇＫＣＳ発現カセットの上流と下流はそれぞれヤロウイア・リポリティカ２６Ｓ ｒＤＮＡの配列の一部で（配列番号１２および配列番号１３を参照する）、よって位置特異的組み込み部位が２６Ｓ ｒＤＮＡ領域にある相同組換えプラスミドを得た。プラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡを骨格とし、ギブソン・アッセンブリー法を利用し、ＣｇＫＣＳ遺伝子の代わりにＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子を使用し、相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを構築した。
具体的な構築の過程は以下の通りである。
プラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡは特許出願者によって実験室において直接得られたものである。まず、Ｐ＃－ＦおよびＰ＃－ＲプライマーでｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡプラスミドを鋳型とし、増幅してＡＭＰとＵＲＡスクリーニングマーカーを持つ骨格ＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＭｖ＃－ＦおよびｐＭｖ＃－Ｒプライマーで、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子を持つプラスミドｐＭｖ－ＭａｏｌｅＫＣＳ＃－ＡＭＰを鋳型とし、それぞれＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子断片を増幅させた。骨格およびＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子断片に対してギブソン・アッセンブリーを行った後、感受性大腸菌Ｔｒａｎｓ－Ｔ１（北京全式金生物技術有限公司）を形質転換させ、さらにプライマーｒＤＮＡ－ＳＦおよびｒＤＮＡ－ＳＲで集落のＰＣＲおよびシークエンシングによる検証を行った後、相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＭａｏｌｅＫＣＳ＃－ＵＲＡを得た（前記プライマーは表２を参照する）。
１．２．３ 酵母の形質転換
Ｎｏｔ Ｉ制限酵素で組換えプラスミド ｐＹＬＥＸ－ｒＤＮＡ－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを酵素切断し、アガロースゲル電気泳動によって確認し、形質転換用断片を回収した後、ＬｉＡｃ形質転換法によってヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３－ΔＵＲＡを形質転換させ、形質転換系が表３に示す通りで、方法の工程が以下の通りである。
（１）表３の形質転換系に従って各成分を添加し、均一に混合した。
（２）３０℃水浴で１ ｈ処理した後、ボルテックスで振とうし、３９℃で１０ ｍｉｎ熱刺激を与えた。
（３）そのまま形質転換系の混合液を取ってＹＮＢ－Δｕｒａ培地のスクリーニングプレートに塗布し、２８℃で２－４日培養し、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子が導入された組換え菌株を得たが、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ＃と名付けた。
１．２．４ 組換え菌株の診断ＰＣＲによる検証
上記で得られた各組換え菌株の異なる形質転換体に対して診断ＰＣＲによる検証を行った。
スクリーニングプレートから組換え菌株の単一集落を取ってＹＰＤプレートに接種し、約２４時間生長させた後、菌体を取り、真菌ゲノム快速抽出キット（生工生物工程股ふん有限公司）で組換え菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、遺伝子ＭａｏｌｅＫＣＳが導入された上流部分はプライマーｙｌｒ－ｄｕｆとｙｌｒ－ｄｕｒでＰＣＲによる検証を、下流部分はプライマーｙｌｒ－ｄｄｆとｙｌｒ－ｄｄｒで検証を行った（前記プライマーは表１を参照する）。
ＰＣＲ増幅はＥａｓｙＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、増幅系はいずれも２０ μｌで（２× ＥａｓｙＴａｑ Ｍｉｘ １０ ｕｌ、１０ μＭプライマー ０．６ μｌずつ、鋳型 １ μｌで、２０ μｌまで水を加えた）、増幅断片はアガロースゲル電気泳動によって確認した。増幅条件は、９４℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒変性し、５５℃で３０秒アニーリングし、７２℃で伸長し、伸長時間は６０秒／ｋｂで計算し、サイクル数は３６で、７２℃で１０分間伸長した。
１．２．５ 組換え菌株の振とう発酵培養
上流と下流のいずれも成功したと検証された（図３を参照する）組換え菌株２０ ｍｌ ＹＰＤ培地（２５０ ｍｌ三角フラスコにおいて）に接種し、約２４時間生長させた後、ＹＰＤ培地プレートに移し、約２４時間生長させた後、５ ｍｌ ＹＮＢ－Δｕｒａ培地（５０ ｍｌ三角フラスコにおいて）に接種し、３６時間生長させた後、１００ μｌ吸い取って新鮮な５ ｍｌ ＹＮＢ－Δｕｒａ培地に移して３６時間培養し、さらに３０ ｍｌ振とう発酵培地に移し、開始ＯＤを０．０８で統一させ、各群で３つの平行設け、１６８時間培養した。菌株の乾燥重量は秤量法によって得られた。
１．２．６ 酸熱法による全油脂の抽出
（１）５０ ｍｌ遠心管でヤロウイア・リポリティカ発酵培養液を収集し、６０００ ｒｐｍで５ ｍｉｎ高速遠心して酵母菌体を収集した。
（２）湿潤菌体１ ｇあたりに約１０ ｍｌの４ Ｍ塩酸を入れ、均一に振とうし、２８℃のシェーカーで約１－２ ｈ振とうさせた。
（３）沸騰水浴で６－８ ｍｉｎ処理し、すぐに－２０℃で３０ ｍｉｎ冷却した。
（４）クロロホルム：メタノール＝１： １（Ｖ／Ｖ）を２０ ｍｌ入れて十分に混合した。
（５）下層のクロロホルムを分離して体積を量り、等体積の０．１５％塩化ナトリウムを入れ、４０００ ｒｐｍで１０ ｍｉｎ遠心した。
（６）下層を取って新たな秤量しておいたガラス管に移し、窒素ブロー機器で溶媒相を乾燥させ、さらに重量を秤量して油脂生産量を計算し、全脂質含有量が全脂質生産量の乾燥重量における比率である。
１．２．７ 脂肪酸のメチルエステル化
（１）ガラス管に２．６ ｍｌのメタノール：硫酸＝９８： ２（Ｖ／Ｖ）溶液を添加し、均一に混合した後、８５℃において３ ｈ反応させ、さらに冷蔵庫において冷却した。
（２）１ ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液および１ ｍｌのｎ－ヘキサンを添加し、振とうした後、５０００ ｒｐｍで５ ｍｉｎ高速遠心し、上清をｅｐチューブに吸い取り、そして有機相ろ膜でろ過した後、ガスクロマトグラフィー実験を行った。
１．２．８ 脂肪酸成分のガスクロマトグラフィーによる分析
脂肪酸成分の分析にガスクロマトグラフィーを使用した（Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ｂ－ＧＣ）。クロマトグラフィーの検出条件：クロマトグラフィーカラムがＨＰ－ＩＮＯＷＡＸ（３０ ｍ × ０．３２ ｍｍ × ０．５ μｍ）である。仕込み温度：２５０℃、検出器温度：２５０℃、仕込み体積：１ μＬ。カラム初期温度は１４０℃で、１ｍｉｎ維持し、１０℃／ｍｉｎで１８０℃に昇温し、２ｍｉｎ維持し、５℃／ｍｉｎで２１０℃に昇温し、４ｍｉｎ維持し、さらに５℃／ｍｉｎで２５０℃に昇温し、４ｍｉｎ維持した。面積百分率法によって各脂肪酸成分の相対的含有量を得た。
１．３ ヤロウイア・リポリティカにおけるＭａｏｌｅＫＣＳの過剰発現
１．３．１ 過剰発現遺伝子組換えプラスミドの構築
プラスミドベクターの構築はギブソン・アセンブリ法を利用し、すべての組み立て断片はＰＣＲ増幅法によって得られたが、具体的な方法は１．２．２におけるものと同様である。ｐＹＬＥＸ－ＵＲＡを骨格として構築される相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡは特許出願者の実験室において直接得られたもので、ここで、ＣｇＫＣＳ発現カセットの上流と下流はそれぞれヤロウイア・リポリティカＦＡＤ２遺伝子の配列の一部で（配列番号１４および配列番号１５を参照する）、よって位置特異的組み込み部位がＦＡＤ２遺伝子座にある相同組換えプラスミドを得た。プラスミドｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＣｇＫＣＳ－ＵＲＡを骨格とし、ギブソン・アッセンブリー法を利用し、ＣｇＫＣＳ発現カセットの代わりに連続した２つのＭａｏｌｅＫＣＳ発現カセットを使用し、相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを構築した。
１．３．２ 酵母の形質転換、組換え菌株の診断ＰＣＲによる検証
５－ＦＯＡ法によって逆スクリーニングしてＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳのウラシル栄養要求性菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ΔＵＲＡを得た。Ｎｏｔ Ｉ制限酵素で組換えプラスミド ｐＹＬＥＸ－ＦＡＤ２－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ＵＲＡを酵素切断し、アガロースゲル電気泳動によって確認し、形質転換用断片を回収した後、ＬｉＡｃ形質転換法によってヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ－ΔＵＲＡを形質転換させ、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子が導入された組換え菌株を得たが、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３ＭａｏｌｅＫＣＳと名付けた。異なる形質転換体を選んで診断ＰＣＲによる検証を行ったが、方法は１．２．４と同様で、上流部分はプライマーＦＡＤ－ｄｆ （５’－ＣＴＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧ－３’） およびｙｌｒ－ｄｕｒで、下流部分はプライマーｙｌｒ－ｄｄｆおよびＦＡＤ－ｄｒ （５’－ＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＧＴＧＣＴＴＧ－３’） でＰＣＲによる検証を行い、上流と下流で同時に成功と検証されたた異なる形質転換体を振とう発酵培養し、培養方法および培養後の各指標の分析方法は１．２におけるものと同様である。
２． 結果と分析
２．１ マラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子のスクリーニングと発現
２．１．１ マラニア・オレイフェラ３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子のバイオインフォマティクス分析
マラニア・オレイフェラゲノムにおいて１２の３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼが検索されたが、これらの遺伝子の機能と応用が報告されておらず、そのうち、６つの３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼが文献の作者によって同時に脂肪酸伸長過程におけるＫＣＳ、ＫＣＲ、ＨＣＤおよびＥＣＲの作用を有すると注釈されている。６つのＫＣＳのアミノ酸配列とＮＣＢＩデータベースにおけるＭｏＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＱＤＡ３４２３８．１）およびＣｇＫＣＳ （ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＣＪ６１７７８．１）とでタンパク質配列の多重アラインメントを行った後、近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ）のアルゴリズムによって系統樹（図１を参照する）を作成したところ、ＭａｏｌｅＫＣＳ４６３はＭｏＫＣＳとアミノ酸配列が完全に一致し、そしてＭａｏｌｅＫＣＳ３９７はＭａｏｌｅＫＣＳ３９８と類似度が高いことが見出された。図２からわかるように、ＫＣＳ３９８、ＫＣＳ４６１、ＫＣＳ４６７およびＫＣＳ８１７と既に報告されたＣｇＫＣＳおよびＭｏＫＣＳはいずれもＫＣＳファミリーの３つの機能保存ドメイン「ＦＧＮＴＳＳＳＳ」、「ＧＳＧＦＫＣＮＳＡＶＷ」および「ＧＭＧＣＳＡ」（赤い枠の部分）を含有することから、これらのタンパク質はＫＣＳファミリーに属するタンパク質であることが示され、ＫＣＳ３９８、ＫＣＳ４６１、ＫＣＳ４６７およびＫＣＳ８１７を選んで後続の研究に供した。この４つのＫＣＳ遺伝子は無錫青蘭生物科技有限公司によってコドンを最適化して合成されたもので、ＭａｏｌｅＫＣＳ遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つシャトルプラスミドｐＭｖ－ＭａｏｌｅＫＣＳ＃－ＡＭＰを得た（＃は数字番号３９８、４６３、４６７、８１７を表す）。
２．１．２ 組換え酵母菌株の診断ＰＣＲによる検証
スクリーニングプレートから組換え菌株の異なる形質転換体を取ってＹＰＤプレートに接種し、そのうち、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８では７つ、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７およびＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７ではそれぞれ８つ選び、同時に対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３をＹＰＤプレートに接種し、約２４時間生長させた後、組換え菌株の異なる形質転換体および対照菌株のゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入された遺伝子ＭａｏｌｅＫＣＳの上流と下流の部分に対してＰＣＲ増幅を行い、遺伝子の組み込みと発現を検証した。Ｐｏ１ｇ－Ｇ３のゲノムＤＮＡを対照とし、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動パターンを図３に示す。まず、対照群Ｐｏ１ｇ－Ｇ３では、上流または下流のＰＣＲ産物がなく（図３Ａと図３Ｃの最も左側のレーンＣＫを参照する）、また、下流部分のＰＣＲ結果が陽性を示した（標的バンドが１６３２ ｂｐである）形質転換体は、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８の１、３、４、５および６番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１の１、２、３および４番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７の２、３、４、６および７番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の２、４、６および８番（図３Ｂ）である。
そして、さらに下流部分が陽性を示した組換え菌株の形質転換体に対して上流部分の組み込みの検証を行ったところ、上流部分が陽性を示した（標的バンドが１５５５ ｂｐである）ものは、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８の１、３、４、５および６番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１の１、２および４番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７の２、３、４、６および７番、
Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の２、４、６および８番である。
上・下流部分のＰＣＲ産物の輝度を合わせ、最終的にＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ
３９８の１番、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６１の２号、Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７の３番およびＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の８番を選んで後続の振とう発酵培養に供した。
２．１．３ 組換え菌株の振とう発酵の結果
図４に示すように、対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３と比べ、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ８１７の乾燥重量、全脂質生産量および全脂質含有量のいずれも大幅に低下し、菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ３９８およびＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳ４６７の乾燥重量、全脂質生産量および全脂質含有量が少し向上し、菌株の乾燥重量、全脂質生産量および全脂質含有量が顕著に変わっていない。
脂肪酸の構成分析から、対照菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３と比べ、すべての菌株が明らかにネルボン酸およびリグノセリン酸を生成し、そして生産量が近く、全脂肪酸における比率がそれぞれ８．９％および６．２％に達したことが示された（図５）。同時に、菌株のＣ１８：１およびＣ１８：０の比率が対照よりも明らかに低下し、また少量のＣ２０およびＣ２２脂肪酸が検出されたことから（図５を参照する）、ＭａｏｌｅＫＣＳがＣ１８：１およびＣ１８：０の炭素鎖を少しずつ伸長させ、ネルボン酸およびリグノセリン酸を生成させることができる。そのため、本発明は脂肪酸伸長酵素のスクリーニングおよび酵母体内における発現の分析により、マラニア・オレイフェラ由来の脂肪酸伸長酵素ＭａｏｌｅＫＣＳがネルボン酸の合成を触媒し、相応する遺伝子がネルボン酸高生産酵母の構築に有用であることを見出した。
２．２ ヤロウイア・リポリティカにおけるＭａｏｌｅＫＣＳの過剰発現
図６Ａに示すように、対照菌株の２９．２ ｇ／Ｌと比べ、組換え菌株の異なる形質転換体の乾燥重量がいずれも異なる程度で低下し、順に２６．７ ｇ／Ｌ、２７．４ ｇ／Ｌ、２５．８ ｇ／Ｌおよび２８．７ ｇ／Ｌであった。全脂質生産量において、対照菌株は１４．１６ ｇ／Ｌで、１、２および３番の形質転換体は明らかに低下し、そのうち、３番は最も明らかで、３２％低下し、４番の形質転換体の全脂質生産量が１４．１８ ｇ／Ｌで、顕著な変化がなかった。全脂質含有量において、全脂質生産量の場合と類似し、１、２および３番の形質転換体は明らかに低下し、そのうち、３番は最も明らかで、４番の形質転換体の油脂含有量に顕著な変化がなかった。
組換え菌株の各形質転換体の異なる脂肪酸の比率は図６Ｂおよび図７に示す。対照菌株では、ネルボン酸の全脂肪酸における比率が８．９６％で（図７ａ）、１、２および４番の形質転換体では、ネルボン酸が占める比率がいずれも大幅に向上し、それぞれ１３．２７％、１３．２６％および１２．６０％であったが（図７ｂ、ｃ、ｅ）、３番の形質転換体では、比率が少し低下し、８．６１％であった（図７ｄ）。同時に、４つの形質転換体のリグノセリン酸の全脂肪酸における比率がいずれも大幅に向上し、そのうち、３番の形質転換体は最も突出しており、対照よりも２倍近く向上した。相応的に、対照菌株のＣ１８：０およびＣ１８：１の比率がいずれも異なる程度で低下したことから、ＭａｏｌｅＫＣＳの過剰発現がさらにＣ１８：０およびＣ１８：１の炭素鎖の伸長を触媒したことが示され、そのうち、４番の形質転換体のネルボン酸の合成効果が最も顕著であった。４番の形質転換体では、全脂質生産量が対照と比べて顕著に変わっておらず、ネルボン酸が占める比率が４０％向上し、酵母のネルボン酸を合成する能力が増強した。
実施例２：組換え菌株の発酵タンク発酵
１． 材料と方法
１．１ 発酵培地
シード培地（ＹＮＢ培地）：ＹＮＢ ３ ｇ／Ｌ、ブドウ糖６０ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３５ ｇ／Ｌで、ＹＮＢと硫酸アンモニウムは滅菌後、ろ過除菌して入れた。
発酵培地（ＦＭ培地）：ブドウ糖５０ ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３５ ｇ／Ｌ、酵母粉末３８ ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム８ ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物６ ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物 ５ ｇ／Ｌ、消泡剤１ ｍＬ／Ｌ。
追加による制御：発酵タンクにおける残留糖濃度に応じて制御し、滅菌された６００ ｇ／Ｌのブドウ糖で追加した。
１．２ ５０ Ｌ発酵タンクの発酵プロセス
寄託菌種を－８０℃から取り出した後、氷上に置いて解凍した。１００ μｌ吸い取って２５０ ｍＬのＹＮＢ培地に接種し、２２０ ｒｐｍ、２８℃におけるシェーカーで２４ ｈ培養した後、接種後ＯＤ約０．０１を基準に５ Ｌシード発酵タンクに移し、シードタンクの培地がＦＭ発酵培地で、液体充填量が２．５ Ｌで、シードタンクの培養条件は、温度２８℃で、冷却機で循環冷却し、ｐＨは５ ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで５．５になるように制御し、ＤＯを２０％とし、２４ ｈ培養した後、５０ Ｌ発酵タンク（鎮江匯能達公司、ＨＮＤ－ＢＪ－５Ｌ－５０Ｌ型）に移して発酵を開始した。
実験プランに従ってＦＭ発酵培地を調製し、十分に均一に混合した後、５０ Ｌ発酵タンクに入れた。発酵タンクの液体充填量が２５ Ｌである。接種量が１０％で、温度が２８℃に低下した時点で、接種口から１５０ ｍｌのシード液を接種した。
発酵条件：発酵温度が２８℃で、冷却機で循環冷却し、ｐＨは５ ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで５．５になるように制御し、初期通気量が１ ｖｖｍで、最初の２４ ｈ内で少しずつ最大通気量の２ ｖｖｍまで上げた。溶存酸素の制御手段は回転数とのカスケード制御を使用し、ＤＯを２０％とし、４８ ｈ後、１０％になるように調整し、回転数の範囲が２００ ｒｐｍ－６００ ｒｐｍである。追加ブドウ糖濃度が６００ ｇ／Ｌで、タンクにおける残量糖濃度の変化に応じて追加し、その濃度が３０ ｇ／Ｌ以下に低下すると追加した。
発酵過程における指標の分析方法は実施例１を参照する。粗製ネルボン酸生産量（ｇ／Ｌ）＝全脂質生産量（ｇ／Ｌ）×ネルボン酸の全脂肪酸における比率（％）。
２． 結果と分析
振とう発酵に基づき、５０ Ｌ発酵タンクで組換え菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－３Ｍａｏｌｅ３９８の発酵培養を行ったが、その結果を図８に示す。組換え菌の油脂、乾燥重量および脂肪酸の構成を検出することにより、以下の結論が得られた。１６８ ｈの発酵で、乾燥重量（ＤＣＷ）が１４９．４ ｇ／Ｌに達し、全脂質生産量（Ｌｉｐｉｄ ｔｉｔｅｒ）が６９．６ ｇ／Ｌで、全脂質含有量（Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ）が４６．６％に達し、ネルボン酸の全脂肪酸における比率が３６．９％で、脂肪酸成分のガスクロマトグラフィーのスペクトルの結果が図９に示すように、ネルボン酸生産量が２５．７ ｇ／Ｌに達した。
実施例３ マラニア・オレイフェラにおけるエステラーゼの発掘と分析
バイオインフォマティクス分析に基づき、マラニア・オレイフェラのゲノムデータ（Ｘｕら、８、２０１９、８：１-１４）から２つのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）および３つのグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）の酵素遺伝子が得られた。ＤＧＡＴ２の２種類は、それぞれＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）、ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）と、ＧＰＡＴの３種類は、それぞれＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）と名付けられた。
＞配列番号３８
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＡＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＴＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＡＧＧＧＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＡＧＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＡＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＴＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＡＧＴＡＣＴＡＧＡＧＣＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＧＣＴＡＣＣＡＣＧＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＡＴＡＴＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＣＡＣＧＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＴＡＣＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＴＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＡＣＣＣＴＴＣＴＡＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＡＴＡＧＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＧＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＴＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＣＣＡＴＡＣＴＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＣＣＧＧＡＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＣＧＴＣＴＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＡＧＧＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＣＴＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＧＧＴＧＴＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＴＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＧＡＧＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＣＣＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＡＣＧＡＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＣＧＴＧＧＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１５６６
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。
＞配列番号３９
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５） アミノ酸配列
ＭＤＧＳＳＱＩＫＥＬＳＣＬＶＫＦＶＥＥＴＶＲＩＥＨＡＳＮＰＮＫＰＶＹＬＶＧＤＳＦＧＧＣＬＡＬＡＶＡＡＲＮＰＴＦＤＬＶＬＩＬＶＮＰＡＴＳＦＧＲＳＱＬＱＰＬＬＰＶＬＥＡＬＰＤＧＬＨＦＴＶＰＹＬＬＳＦＩＭＧＴＣＳＡＡＬＫＰＹＲＤＰＬＫＬＡＭＶＮＩＥＴＲＦＰＰＡＬＶＬＥＱＬＳＧＮＬＴＡＬＬＰＲＬＳＧＬＡＮＩＩＰＫＥＴＬＬＷＫＬＫＬＬＫＳＡＡＡＹＡＮＳＲＬＨＡＶＫＡＥＶＬＶＬＡＳＧＳＤＮＭＬＰＳＫＤＥＡＥＲＬＳＲＳＬＱＮＣＩＶＲＬＦＫＤＮＧＨＴＬＬＬＥＤＧＹＳＬＬＴＩＩＫＣＴＳＫＹＲＣＳＲＫＨＤＦＩＴＤＦＬＰＰＳＭＳＥＦＫＱＥＬＮＱＲＦＧＬＦＲＶＡＴＳＰＩＬＦＳＴＬＰＤＧＫＩＶＫＧＬＡＧＩＰＮＥＧＰＶＬＬＶＧＹＨＭＬＬＧＣＥＬＧＰＬＶＥＡＦＬＫＥＫＮＩＭＩＲＧＶＡＨＰＥＭＦＳＫＫＨＥＧＰＳＮＥＦＧＰＦＤＬＶＫＬＦＧＧＬＰＶＴＰＲＮＬＦＫＬＦＳＴＫＳＨＩＬＬＹＰＧＧＡＲＥＡＬＨＲＫＧＥＫＹＫＬＬＷＰＮＱＰＥＦＶＲＭＡＡＲＦＧＡＴＩＶＰＦＧＴＶＧＥＤＤＩＡＥＡＥＳＴＭＬＡＫＫＩＴＬＲＳＳＤＧＥＴＦＥＶＤＫＩＶＡＬＥＳＱＭＩＫＨＭＩＥＤＤＣＡＤＮＧＩＰＬＰＮＶＴＳＷＩＬＶＫＶＩＥＹＣＫＫＨＶＫＡＰＫＩＥＫＲＧＤＶＮＫＥＬＫＳＷＤＡＥＦＶＫＩＤ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：５２１
●種類：アミノ酸配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：アミノ酸
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該アミノ酸配列がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のアミノ酸配列である。
＞配列番号４０
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＣＧＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＴＴＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＧＴＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴＧＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＴＴＧＣＧＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＴＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＧＧＧＴＴＣＴＴＧＣＣＡＧＴＡＧＣＧＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＡＣＡＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＧＣＧＣＣＡＴＡＡＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＡＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＣＧＣＡＣＧＧＣＴＡＴＡＧＡＧＡＣＣＧＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＡＴＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＧＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＡＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＴＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＴＡＴＧＣＣＴＣＧＴＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＧＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１２０９
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。
＞配列番号４１
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９） アミノ酸配列
ＭＡＥＴＥＶＲＥＳＰＬＴＡＡＰＡＰＥＶＴＶＩＥＳＰＲＶＰＬＬＨＳＶＬＡＴＡＬＷＩＧＣＩＨＬＦＦＡＶＭＦＴＡＴＦＬＬＰＬＳＫＳＩＡＶＦＡＬＬＬＶＬＩＶＶＰＶＥＡＤＳＫＦＧＭＫＶＲＲＧＮＮＨＨＤＮＥＧＤＤＥＥＦＳＮＩＨＧＷＶＶＫＫＭＶＶＶＹＣＨＳＶＴＭＰＥＬＥＶＴＭＬＰＳＮＧＳＶＬＳＦＴＶＦＡＬＥＰＨＳＶＬＰＶＧＶＩＳＬＭＨＬＳＮＡＶＰＬＰＫＴＲＶＬＡＳＳＡＶＦＲＴＰＦＬＲＨＩＷＴＷＭＧＬＡＡＶＴＲＫＮＦＩＳＬＬＡＡＧＹＳＣＡＩＩＰＧＧＴＲＥＴＬＬＭＶＱＤＨＥＶＹＬＬＫＬＳＶＡＬＬＲＩＡＡＲＳＴＡＬＥＷＮＬＣＰＦＱＫＩＡＦＬＫＴＲＫＧＦＶＲＴＡＩＥＴＧＶＰＬＩＰＶＦＳＦＧＱＶＦＦＦＦＷＫＤＱＶＹＴＤＶＬＬＧＳＦＧＭＬＨＬＩＴＷＴＧＬＬＳＴＨＨＴＲＭＰＳＦＦＩＭＲＲＡＡＴＶＰＬＴＰＭＰＲＲＬＰＬＨＶＶＶＧＲＰＩＥＶＫＱＮＳＱＰＴＡＥＥＶＮＥＶＨＳＱＦＶＧＡＬＱＤＬＦＥＲＨＫＡＲＶＧＨＡＤＲＥＬＫＩＩ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：４０２
●種類：アミノ酸配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：アミノ酸
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該アミノ酸配列がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）のアミノ酸配列である。
＞配列番号４２
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＡＣＴＴＴＧＴＡＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＴＣＧＧＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＴＴＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＣＧＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣＡＣＡＡＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＡＴＣＧＡＡＣＣＧＡＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＣＧＴＣＡＣＣＴＴＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＧＴＧＧＴＴＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＡＧＴＧＣＧＡＴＣＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＡＧＴＣＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＴＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＡＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＣＡＴＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＴＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＧＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＴＡＴＴＣＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＴＧＴＧＣＴＣＡＡＡＴＣＴＧＣＣＡＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＧＣＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＡＧ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：８１９
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号４３
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８） アミノ酸配列
ＭＡＥＴＥＶＲＥＳＰＬＴＡＡＰＡＰＥＶＴＶＩＥＳＰＲＶＰＬＬＨＳＶＬＡＴＡＬＷＩＧＣＩＨＬＦＦＡＶＭＦＴＡＴＦＬＬＰＬＳＫＳＩＡＶＦＡＬＬＬＶＬＩＶＶＰＶＥＡＤＳＫＦＧＭＫＶＲＲＧＮＮＨＨＤＮＥＧＤＤＥＥＦＳＮＩＨＧＷＶＶＫＫＭＶＶＶＹＣＨＳＶＴＭＰＥＬＥＶＴＭＬＰＳＮＧＳＶＬＳＦＴＶＦＡＬＥＰＨＳＶＬＰＶＧＶＩＳＬＭＨＬＳＮＡＶＰＬＰＫＴＲＶＬＡＳＳＡＶＦＲＴＰＦＬＲＨＩＷＴＷＭＧＬＡＡＶＴＲＫＮＦＩＳＬＬＡＡＧＹＳＣＡＩＩＰＧＧＴＲＥＴＬＬＭＶＱＤＨＥＶＹＬＬＫＬＳＶＡＬＬＲＩＡＡＲＳＴＡＬＥＷＮＬＣＰＦＱＫＩＡＦＬＫＴＲＫＧＦＶＲＴＡＩＥＴＧＶＰＬＩＰＶＦＳＦＧＱＶＦＦＦＦＷＫＤＱＶＹＴＤＶＬＬＧＳＦＧＭＬＨＬＩＴＷＴＧＬＬＳＴＨＨＴＲＭＰＳＦＦＩＭＲＲＡＡＴＶＰＬＴＰＭＰＲＲＬＰＬＨＶＶＶＧＲＰＩＥＶＫＱＮＳＱＰＴＡＥＥＶＮＥＶＨＳＱＦＶＧＡＬＱＤＬＦＥＲＨＫＡＲＶＧＨＡＤＲＥＬＫＩＩ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：４０２
●種類：アミノ酸配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：アミノ酸
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号４４
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＧＣＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＡＧＧＴＡＧＣＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＧＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＧＣＧＧＡＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＣＧＧＧＴＴＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＴＧＴＧＣＧＴＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＡＴＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＴＡＴＧＡＧＧＣＧＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＡＴＣＣＧＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＴＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣＡＣＡＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＧＡＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＴＴＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＧＣＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＴＴＴＣＧＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＧＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＴＡＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＣＴＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１１１０
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号４５
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９） アミノ酸配列
ＭＶＬＷＱＣＧＧＳＧＬＲＧＳＤＥＧＬＲＷＨＧＡＡＭＬＡＴＲＴＶＰＡＡＡＧＬＤＳＧＲＨＳＨＮＶＱＧＳＱＰＱＩＱＥＩＣＡＫＥＳＬＧＮＩＤＧＶＲＧＤＳＩＮＤＡＥＷＡＧＫＡＶＴＹＶＡＧＤＲＶＬＴＤＩＬＣＫＰＦＳＭＧＲＮＬＭＣＶＹＳＫＫＨＭＬＤＤＰＫＬＡＥＭＫＫＫＡＮＩＲＳＬＫＥＭＡＭＬＬＲＧＧＳＱＩＶＷＩＡＰＳＧＧＲＤＲＰＤＰＱＴＧＥＷＨＰＡＰＦＤＡＳＳＶＤＮＭＲＲＬＡＥＮＡＧＶＰＡＨＩＹＰＬＡＬＩＣＹＮＩＭＰＰＰＰＫＶＥＫＥＩＧＥＫＲＶＶＳＦＨＧＶＧＬＳＶＩＰＤＩＳＹＡＥＩＡＡＡＣＥＮＳＥＥＴＧＤＡＤＴＮＱＳＨＹＱＣＨＲＲＩＰＱＡＥＫＦＧＩＬＡＡＬＰＤＤＥＳＲＡＫＡＴＳＰＲＳＴＰＳＫＲＬＲＹＫＩＡＧＦＳＡＨＬＭＫＲＩＱＫＧＰＦＲＧＩＳＬＫＬＱＥＥＥＨＥＲＲＭＤＦＶＰＤＩＳＡＩＫＴＤＫＩＫＶＤＫＥＴＲＳＴＰＳＲＲＬＲＮＫＩＡＴＳＰＰＴＳ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：２７２
●種類：アミノ酸配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：アミノ酸
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号４６
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０） 遺伝子配列
ＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＴＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＴＧＡＴＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＡＧＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＴＧＣＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＧＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣＣＧＡＣＧＧＴＡＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：６９３
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号４７
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０） アミノ酸配列
ＭＱＬＲＩＬＬＤＶＬＴＬＬＦＡＡＦＬＹＬＥＳＮＬＥＶＬＦＳＣＬＡＧＦＰＡＥＬＬＳＧＩＫＫＥＴＥＡＧＲＬＰＳＮＦＡＳＶＬＶＦＱＳＧＩＰＤＡＤＥＩＩＬＳＮＴＴＡＬＦＤＲＶＬＬＤＡＥＤＳＦＶＦＰＰＨＨＫＡＭＲＥＰＦＤＹＹＭＦＧＱＮＹＩＲＰＬＩＤＦＧＮＳＹＶＧＮＩＮＩＦＨＥＭＥＥＫＬＱＱＶＫＮＬＮＧＩＥＷＧＱＰＷＲＳＬＨＳＬＱＩＥＳＫＳＬＤＬＲＬＥＫＶＧＫＧＦＦＬＡＧＣＣＦＲＬＱＲＥＩＶＫＬＮＳＷＩＷＧＹＴＨＬＥＲＬＩＬＦＬＦＹＧＶＬＭＧＳＤＧＮＧＬＬＲＣＣＳＲＲ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：２３０
●種類：アミノ酸配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：アミノ酸
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
上記５つのエステラーゼのコドンのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で最適化された配列は以下の通りである。
＞配列番号４８
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＴＣＣＣＡＡＴＡＡＧＣＣＣＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＧＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＡＴＧＣＴＡＡＴＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＧＣＧＡＣＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＴＡＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＡＴＧＴＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＧＡＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＴＡＡＣＧＡＧＴＴＣＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＣＴＧＣＣＣＧＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＣＣＣＧＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＡＧＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＴＣＧＴＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＡＣＣＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＴＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＣＴＡＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１５６６
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。
＞配列番号４９
ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＡＣＴＧＡＡＧＴＧＣＧＡＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＡＡＡＴＣＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＴＧＣＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＴＴＡＣＴＡＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＴＣＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＡＣＴＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＴＡＣＴＣＴＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＴＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＴＴＧＣＣＧＣＴＡＧＡＴＣＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＴＧＣＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＴＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＡＣＣＣＧＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＡＣＣＴＡＴＴＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＧＡＧＧＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＡＣＡＴＡＡＧＧＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＣＡＣＧＣＣＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１２０９
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。
＞配列番号５０
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＡＴＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＧＡＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＡＣＣＡＡＡＴＧＣＧＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＣＧＡＧＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＧＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＣＧＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡＴＴＣＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＴＣＣＣＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：８１９
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号５１
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９） 遺伝子配列
ＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＡＣＴＧＣＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＧＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＡＡＴＧＧＧＣＣＧＧＣＡＡＡＧＣＣＧＴＧＡＣＴＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＣＧＡＡＡＣＣＴＧＡＴＧＴＧＣＧＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＣＡＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＣＧＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＧＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＴＧＡＴＴＣＣＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＡＣＴＧＣＧＡＴＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＧＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＣＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＴＡＣＣＣＣＣＴＣＴＣＧＡＣＧＡＣＴＧＣＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＡ
（ａ）配列の特徴：
●長さ：１１１０
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（ｃ）仮定：否
（ｄ）アンチセンス：否
（ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
＞配列番号５２
ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９） 遺伝子配列
ＡＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＡＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＡＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＣＧＡＣＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＧＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＣＧＧＣＡＡＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣＴＣＧＡＣＧＡＴＡＡ
（Ａ）配列の特徴：
●長さ：６９３
●種類：ＤＮＡ配列
●鎖タイプ：一本鎖
●位相構造：線状
（Ｂ）分子の種類：ＤＮＡ
（Ｃ）仮定：否
（Ｄ）アンチセンス：否
（Ｅ）最初の由来：マラニア・オレイフェラ
配列の特徴：当該遺伝子がコードする産物がグリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である。
実施例３ マラニア・オレイフェラにおけるエステラーゼの合成、プラスミドの構築および酵母の形質転換
遺伝子ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）、ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）、ＧＰＡＴ、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）、ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）は無錫青蘭生物科技有限公司によってコドンを最適化して合成されたもので（最適化された遺伝子配列が順に配列番号４８、４９、５０、５１、５２である）、エステラーゼ遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つシャトルプラスミドを得たが、ｐＭＶ－ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）－ＡＭＰ、ｐＭＶ－ ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）－ＡＭＰ、ｐＭＶ－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）－ＡＭＰ、ｐＭＶ－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）－ＡＭＰ、ｐＭＶ－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）－ＡＭＰと名付けた。
プラスミドベクターの構築はギブソン・アセンブリ法を利用し、すべての組み立て断片はＰＣＲ増幅法によって得られた。プラスミド骨格はｐＹＬ－ＰＥＸ１０－ＣｇＫＣＳプラスミド由来のものである（中国科学院青島生物エネルギーと過程研究所から得られた）。使用されたエステラーゼのプロモーターはＴＥＦｉｎｔｒｏである。すべてのＰＣＲ増幅はＫＡＰＡ ＨｉＦｉ高正確性ＤＮＡポリメラーゼを利用し、増幅系はいずれも５０ μｌで（２× ＫＡＰＡ Ｍｉｘ ２５ ｕｌ、１０ μＭプライマー １．５ ｕｌずつ、鋳型 １ μｌで、５０ μｌまで水を加えた）、各ＤＮＡ配列を得た。増幅条件は、９５℃で３分間予備変性し、９８℃で２０秒変性し、６０～７２℃で１５秒アニーリングし、７２℃で伸長し、伸長時間は３０秒／ｋｂで計算し、サイクル数は２９～３５で、７２℃で１０分間伸長した。
骨格およびエステラーゼ遺伝子断片をギブソンアッセンブリーした後、感受性大腸菌Ｔｒａｎｓ－Ｔ１（北京全式金生物技術有限公司）を形質転換させ、さらにプライマーＴＥＦｉｎ－ＰＦとＸＰＲ２－ＰＲで集落のＰＣＲおよびシークエンシングによる検証を行った（青島けい科生物科技有限公司）後、相同組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）－ＵＲＡを得た。前記プライマーを表１に示す。
１０ｕｐと１０ｄｎで組換えプラスミドｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）－ＵＲＡに対してＰＣＲ増幅を行って形質転換断片を得たが、すべてのＰＣＲ増幅にＫＡＰＡ ＨｉＦｉ高正確性ＤＮＡポリメラーゼを利用し、増幅系のいずれも５０ μｌで（２× ＫＡＰＡ Ｍｉｘ ２５ ｕｌ、１０ μＭプライマー １．５ μｌずつ、鋳型 １ μｌで、５０ μｌまで水を追加した）、各ＤＮＡ配列を得た。増幅条件は、９５℃で３分間予備変性し、９８℃で２０秒変性し、６０～７２℃で１５秒アニーリングし、７２℃で伸長し、伸長時間は３０秒／ｋｂで計算し、サイクル数は２９～３５で、７２℃で１０分間伸長した。
ＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動によって確認し、ゲルを切り出して形質転換断片を回収した後、ＬｉＡｃ形質転換法によって既に伸長酵素ＣｇＫＣＳを発現するヤロウイア・リポリティカＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳを形質転換させ、ＹＮＢ－Δｕｒａ培地のスクリーニングプレートに塗り、２８℃で２－４日培養し、関連エステラーゼ遺伝子が導入された組換え菌株を得た。ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８９）－ＵＲＡ、ｐＹＬＥＸ－ＰＥＸ１０－ ＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）－ＵＲＡを形質転換させた菌株をそれぞれ、左から右へ順に、ＹＬ－３５、ＹＬ－４９、ＹＬ－８８、ＹＬ－８９、ＹＬ－９０と略称する。組換え菌株の検証は診断ＰＣＲ方法を使用し、スクリーニングプレートから単一集落を取り、ＹＰＤプレートに画線し、約２４時間生長させ、新鮮な菌体を取り、真菌ゲノム快速抽出キット（生工生物工程股ふん有限公司）で組換え菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に記載のプライマーで陽性クローンを検証した。ＰＣＲ増幅はＥａｓｙＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用し、増幅系はいずれも２０ μｌで（２× ＥａｓｙＴａｑ Ｍｉｘ １０ ｕｌ、１０ μＭプライマー ０．６ μｌずつ、鋳型 １ μｌで、２０ μｌまで水を加えた）、増幅断片はアガロースゲル電気泳動によって確認した。増幅条件は、９４℃で３分間予備変性し、９４℃で３０秒変性し、５５℃で３０秒アニーリングし、７２℃で伸長し、伸長時間は６０秒／ｋｂで計算し、サイクル数は３６で、７２℃で１０分間伸長した。
スクリーニングプレートから組換え菌株を取ってＹＰＤプレートに接種し、ＹＬ－３５、ＹＬ－４９、ＹＬ－８８、ＹＬ－８９、ＹＬ－９０をそれぞれ４８箇所選び、同時に対照菌株をＹＰＤプレートに接種し、約２４時間生長させた後、組換え菌株および対照菌株のゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡを鋳型とし、遺伝子が導入されたものに対してＰＣＲ増幅を行い、遺伝子の組み込みと発現を検証した。中から５株の陽性クローンを選び、それぞれＹＬ－３５－Ｆ５（ＣｇＫＣＳおよびＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１００３５）を共発現する）、ＹＬ－４９－Ｃ６（ＣｇＫＣＳおよびＭｏＤＧＡＴ２（Ｍａｏｌｅ＿０１５９４９）を共発現する）、ＹＬ－８８－Ｂ１（ＣｇＫＣＳおよびＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０８８）を共発現する）、ＹＬ－９０－Ｂ６（ＣｇＫＣＳおよびＭｏＧＰＡＴ（Ｍａｏｌｅ＿００６０９０）を共発現する）と名付け、図１３に示すように、ここで、ＣＫ菌株は伸長酵素ＣｇＫＣＳを発現するＰｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳで、続いて振とう発酵を行い、開始菌株を対照群とした。
実施例４ マラニア・オレイフェラにおけるエステラーゼの油脂およびネルボン酸への影響
菌株および培養条件は実施例１の１．１と同様である。
振とう発酵培養の具体的な方法および工程は実施例１の１．２．５の部分と同様である。
振とう発酵後、ＹＬ－３５－Ｆ５、ＹＬ－４９－Ｃ６、ＹＬ－８８－Ｂ１、ＹＬ－９０－Ｂ６の油脂を抽出し、ＹＬ－３５－Ｆ５、ＹＬ－４９－Ｃ６、ＹＬ－８８－Ｂ１、ＹＬ－９０－Ｂ６は対照Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳ（ＣＫ）と比べ、いずれも明らかに向上し、それぞれ１５．６％、１７．２％、２２．１％および１８．７％向上し、結果を１０に示す。ネルボン酸の全油脂における比率を合わせるとわかるように、ＹＬ－３５－Ｆ５、ＹＬ－４９－Ｃ６、ＹＬ－８８－Ｂ１、ＹＬ－９０－Ｂ６のネルボン酸生産量は対照と比べ、いずれも明らかに向上した。中でも、ＹＬ－８８－Ｂ１は最も向上し、ネルボン酸が３．３６ ｇ／Ｌに達し、対照と比べ、２８．１６％向上し、結果を図１１に示す。開始菌株Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＣｇＫＣＳと比べ、ＹＬ－８８－Ｂ１のオレイン酸の全油脂における比率が２４．２％から２８．０％へ、ネルボン酸の全油脂における比率が１７．３％から１８．１％へ、ネルボン酸発酵濃度が２８．１％向上し、結果を図１２に示す。
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。

Claims (12)

  1. ネルボン酸および／または油脂を生産するための工学菌であって、前記工学菌のゲノムに遺伝子発現カセットが組み込まれており、前記の遺伝子発現カセットは３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質を発現することを特徴とする、前記工学菌。
  2. 前記工学菌は酵母菌を含むことを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  3. 前記工学菌は、ヤロウイア・リポリティカ、出芽酵母、メタノール酵母、ピキア・パストリス、ハンセヌラ酵母、クルイウェロマイセス酵母、カンジダ酵母、クリプトコッカス酵母、イサチェンキア・オリエンタリス、ロドトルラ酵母、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  4. 前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子は、マラニア・オレイフェラ（Ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）、カルダミネ・グラエカ（Ｃａｒｄａｍｉｎｅ ｇｒａｅｃａ）、マンシュウイタヤ（Ａｃｅｒ ｔｒｕｎｃａｔｕｍ）、ゴウダソウ（Ｌｕｎａｒｉａ ａｎｎｕａ）、シメニア・カフラ（Ｘｉｍｅｎｉａ ｃａｆｆｒａ）、トロパエオラム・スペシオサム（Ｔｒｏｐａｅｏｌｕｍ ｓｐｅｃｉｏｓｕｍ）、ブンカンカ（Ｘａｎｔｈｏｃｅｒａｓ ｓｏｒｂｉｆｏｌｉａ）、油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ）由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  5. 前記工学菌はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、好ましくはヤロウイア・リポリティカ Ｐｏ１ｇ－Ｇ３－ＭａｏｌｅＫＣＳまたはヤロウイア・リポリティカ ＹＬ－８８－Ｂ１であることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  6. 前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子または前記エステラーゼ遺伝子はコドンが最適化された３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子またはコドンが最適化されたエステラーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  7. 前記３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子の配列は配列番号１－１１のいずれかで示されることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  8. 前記エステラーゼ遺伝子は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）、グリセロール―３―リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）酵素遺伝子、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  9. 前記エステラーゼ遺伝子の配列は配列番号４８、４９、５０、５１、５２のいずれかで示されることを特徴とする、請求項１に記載の工学菌。
  10. ネルボン酸および／または油脂を生産する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）請求項１に記載の工学菌を培養することにより、ネルボン酸および／または油脂を含む発酵産物を得ること；ならびに
    （ｉｉ）前記発酵産物からネルボン酸および／または油脂を分離すること
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  11. 請求項１に記載の工学菌を構築する方法であって、以下の工程：
    （ａ）以下のエレメント：スクリーニングマーカー遺伝子、耐性遺伝子エレメント、相同組換え遺伝子断片、および標的遺伝子を有する遺伝子発現カセットを含有するベクターを構築すること、前記標的遺伝子は、３－ケトアシル－ＣｏＡシンターゼ（ＫＣＳ）遺伝子および／またはエステラーゼ遺伝子である；ならびに
    （ｂ）工程（ａ）で得られた前記遺伝子発現カセットを含有するベクターをレシピエント菌株に導入し、レシピエントのゲノムに前記遺伝子発現カセットが組み込まれた菌株を得ること
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  12. 請求項１に記載の工学菌株の使用であって、発酵によってネルボン酸および／または油脂を生産する菌株として用いられることを特徴とする、前記使用。
JP2023530682A 2020-11-19 2021-11-18 酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用 Pending JP2023549946A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011302605.8A CN114517164A (zh) 2020-11-19 2020-11-19 一种脂肪酸延长酶基因在酵母合成神经酸中的应用
CN202011302605.8 2020-11-19
PCT/CN2021/131563 WO2022105841A1 (zh) 2020-11-19 2021-11-18 一种脂肪酸延长酶基因和酯化酶基因在酵母合成神经酸和油脂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023549946A true JP2023549946A (ja) 2023-11-29

Family

ID=81595392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023530682A Pending JP2023549946A (ja) 2020-11-19 2021-11-18 酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240117391A1 (ja)
EP (1) EP4249583A1 (ja)
JP (1) JP2023549946A (ja)
CN (1) CN114517164A (ja)
WO (1) WO2022105841A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116024109B (zh) * 2022-09-29 2023-09-12 南京林业大学 一种高产神经酸的圆红冬孢酵母工程菌株及其构建方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273746B2 (en) * 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
CN103509817B (zh) * 2013-09-16 2015-09-09 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种粘红酵母高产油脂及亚油酸基因工程菌的构建方法和应用
EP3277827B1 (en) * 2015-04-02 2021-03-24 Biopetrolia AB Fungal cells and methods for production of very long chain fatty acid derived products
CN110358692B (zh) * 2018-04-09 2021-07-27 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生产神经酸的重组酵母菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114517164A (zh) 2022-05-20
EP4249583A1 (en) 2023-09-27
WO2022105841A1 (zh) 2022-05-27
US20240117391A1 (en) 2024-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7261815B2 (ja) ネルボン酸を生産する組換え酵母菌株およびその使用
CN110373437B (zh) 一种产十八碳四烯酸卷枝毛霉细胞工厂的构建及其发酵技术
US11414650B2 (en) Construction method of Mucor circinelloides cell factory for producing dihomo-gamma-linolenic acid and fermentation technology
CN112410357B (zh) 非从头合成的高产脂卷枝毛霉重组菌的构建方法、该方法构建的重组菌及应用
US20140256927A1 (en) Increasing the lipid content in microalgae by genetically manipulating a triacylglycerol (tag) lipase
JP2023549946A (ja) 酵母によるネルボン酸および油脂の合成における脂肪酸伸長酵素遺伝子およびエステラーゼ遺伝子の使用
US9574215B2 (en) Production of fatty acids by heterologous expression of gene clusters from myxobacteria
CN113604459B (zh) 一种磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及其应用
US11407793B2 (en) Dicarboxylic acid transporter for increasing oil yield of Mucor circinelloides
US20220177526A1 (en) C4-dicarboxylic acid transporter for increasing oil yield of mucor circinelloides
CN112661821B (zh) 一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用
CN109517834B (zh) 一种通过遗传改造提高裂殖壶藻atcc20888油脂和dha含量的方法
CN116606868B (zh) 一种乙酰CoA合成酶基因RkACS2及其应用
CN112391401B (zh) 一种提高解脂耶氏酵母油脂产量的方法
CN110499300B (zh) 一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用
CN116179381A (zh) 产opo型结构酯的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116179584A (zh) 一种高效生产epa的裂殖壶菌基因工程菌株、方法和应用
CN114621939A (zh) 一种溶血磷脂酸酰基转移酶突变体及其应用
CN112831508A (zh) 半乳糖脂-半乳糖脂半乳糖基转移酶及其基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230719