CN110499300B

CN110499300B - 一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用

Info

Publication number: CN110499300B
Application number: CN201910777811.5A
Authority: CN
Inventors: 唐鑫; 陈海琴; 常璐璐; 顾舒婕; 赵建新; 张灏; 陈永泉; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN110499300A

Abstract

本发明公开了一种β‑异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β‑异丙基苹果酸脱氢酶具有促进微生物产脂肪酸的功能，将含有本发明β‑异丙基苹果酸脱氢酶的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使含有本发明β‑异丙基苹果酸脱氢酶的高山被孢霉中的脂肪酸含量达细胞干重的46.4％，较不含本发明β‑异丙基苹果酸脱氢酶的高山被孢霉提升20.2％，该结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产脂肪酸的能力，进而为提高脂肪酸的生物合成能力提供了充实的理论支持。

Description

一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用

技术领域

本发明涉及一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用，属于基因工程和微生物工程技术领域。

背景技术

脂质是生物体需要的重要营养素之一，能够为生物体的多种生命活动提供原料和能量。脂肪酸是脂质的组成成分之一，根据碳氢链饱和与不饱和的不同可分为饱和脂肪酸(Saturated fatty acids，SFA)、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acids，MUFA)以及多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)。

其中，多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括ω-3系列的α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和ω-6系列的亚油酸(LA)、γ－亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)等。多不饱和脂肪酸(PUFAs)对生物体的生长代谢至关重要，具有改善高血压、预防动脉硬化、降低心血管疾病等慢性疾病发病率的作用，此外，多不饱和脂肪酸(PUFAs)能有效维持细胞膜的生理功能，并且，能提高生物体免疫能力和降低炎症反应。

虽然多不饱和脂肪酸对人体具有重要作用，但是，人体内合成多不饱和脂肪酸尤其是ω-3和ω-6系列多不饱和脂肪酸的能力较差，需从外界汲取，通过膳食进行补充。

目前，市场上售卖的多不饱和脂肪酸(PUFAs)多来源于水生浮游植物，食此类植物为生的野鳕鱼、鲱鱼、鲑鱼等深海鱼类的内脏中也富含多不饱和脂肪酸(PUFAs)。但是，由于动植物的生长周期过于长且动植物的培育成本相对高，仅靠从这些动、植物中提取获得多不饱和脂肪酸(PUFAs)已无法满足日益增长的市场需求，并且，由于环境污染、气候变化等多方面影响，动植物来源的油脂受污染的情况越来越多，油脂的安全性不能得到保证，因此，急需找到可以提升多不饱和脂肪酸(PUFAs)产量及安全性的方法。

研究表明，有些细菌、真菌等微生物也具有生产脂质的功能，并且，这些细菌、真菌等微生物均具有生长周期短、繁殖快、培养成本低、不受地理环境及气候条件影响、环境友好等诸多优势，另外，这些细菌、真菌等微生物还具有油脂产量高、产得的油脂种类丰富等特点，因此，通过微生物产油脂提升多不饱和脂肪酸(PUFAs)的产量及安全性是一种极具潜力的方法。

不过，这些微生物产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的能力有限，目前，仍很难实现工业化生产，达到取代动植物来源多不饱和脂肪酸(PUFAs)的目的，因此，急需找到提高产油微生物产多不饱和脂肪酸(PUFAs)能力的方法，进而为提高多不饱和脂肪酸(PUFAs)的生物合成能力提供了充实的理论支持。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可提高微生物产脂肪酸能力的β-异丙基苹果酸脱氢酶。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种β-异丙基苹果酸脱氢酶(3-isopropylmalatedehydrogenase，IPMDH，EC 1.1.1.85)，所述β-异丙基苹果酸脱氢酶为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有β-异丙基苹果酸脱氢酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述β-异丙基苹果酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pBIG2-ura5s-ITs载体。所述pBIG2-ura5s-ITs载体记载于公开号为CN103571762A的专利申请文本中。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为高山被孢霉、大肠杆菌或根癌农杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为高山被孢霉。

本发明还提供了上述β-异丙基苹果酸脱氢酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞在生产脂质方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述脂质为磷脂、甘油三酯或游离脂肪酸。

本发明还提供了一种生产脂质的方法，其特征在于，所述方法为先将上述宿主细胞加入培养基中，于温度为12～28℃、转速为150～250rpm的条件下培养7～12d，得到富含脂质的宿主细胞，然后将富含脂质的宿主细胞的进行提取，得到脂质。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为Broth培养基或Kendrick培养基。

本发明还提供了一种生产上述β-异丙基苹果酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法为先将上述宿主细胞加入培养基中，于温度为12～28℃、转速为150～250rpm的条件下培养7～12d，然后将富含β-异丙基苹果酸脱氢酶的宿主细胞的进行提取，得到β-异丙基苹果酸脱氢酶。

[有益效果]

本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的β-异丙基苹果酸脱氢酶具有促进微生物产脂肪酸的功能，将含有本发明β-异丙基苹果酸脱氢酶的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使含有本发明β-异丙基苹果酸脱氢酶的高山被孢霉中的脂肪酸含量达细胞干重的46.4％，较不含本发明β-异丙基苹果酸脱氢酶的高山被孢霉提升20.2％，该结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产脂肪酸的能力，进而为提高脂肪酸的生物合成能力提供了充实的理论支持。

附图说明

图1：MaLeuB与NCBI中已鉴定功能的β-异丙基苹果酸脱氢酶的氨基酸序列比对结果。

图2：重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，M表示marker，N1和N2表示阴性对照(N1为转入空质粒的根癌农杆菌、N2为转入空质粒的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株)，编号1～14表示14个阳性转化子(转入重组质粒的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株)，P表示阳性对照(转入重组质粒的根癌农杆菌)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC 32222购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)；下述实施例中涉及的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1购自北京华越洋生物；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的pBIG2-ura5s-ITs载体记载于公开号为CN103571762A的专利申请文本中；下述实施例中涉及的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株记载于公开号为CN103468581A的专利申请文本中。

下述实施例中涉及的KOD plus高保真DNA聚合酶购自日本Toyobo公司；下述实施例中涉及的Taq DNA聚合酶购自CWBIO公司；下述实施例中涉及的反转录试剂盒(PrimeScript RT regent Kit with gDNA Eraser RR047A&R6110A)购自日本Takara公司；下述实施例中涉及的质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；下述实施例中涉及的真菌基因组DNA提取试剂盒购自BioFlux公司；下述实施例中涉及的限制性内切酶(EcoRⅠ、XbaⅠ)、T4连接酶、Trizol、PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、GeneRuler DNA LadderMix、PageRuler Prestained Protein Ladder购自Thermo Scientific公司；下述实施例中涉及的正十五烷酸(C15:0)、20％(w/w)盐酸甲醇购自Sigma公司；下述实施例中涉及的DEPC水、卡那霉素(Kanamycin,Kana)、利福平(Rifampicin，Rif)、壮观霉素(Spectinomycin,Spe)、头孢噻肟钠(Cefotaxime,Cef)、无氨基酵母氮源(YNB)和各类氨基酸购自上海生物工程有限公司；下述实施例中涉及的酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid公司；下述实施例中涉及的低吸附型无酶枪头、无酶离心管、无酶PCR管、2mL棕色气相瓶及瓶盖购自苏州科晴生物公司；下述实施例中涉及的诱导转化剂乙酰丁香酮(Acetosuringone，AS，CAS#[2478-38-8])、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES缓冲液，CAS#[145224-94-8])、尿嘧啶(Urail)、酵母氮源(Yeast Nitrogen Base,WITHOUTAminoAcids CAS#[A610507-0500]Lot:C418BA0040)和各类氨基酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂购自国药集团。

下述实施例中涉及的载体构建和细菌感受态细胞制作均参考《分子克隆手册》。

下述实施例中涉及的引物由上海桑尼公司合成，测序工作由上海华大基因公司完成。

(高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC 32222、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1以及大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)

下述实施例中涉及的培养基如下：

Broth培养基：20g/L(活化)/50g/L(产脂)葡萄糖、5g/L酵母提取物、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水硫酸镁、10g/L硝酸钾。

Kendrick培养基：30g/L(活化)/50g/L(产脂)葡萄糖、3.3g/L(活化)/2.0g/L(产脂)酒石酸铵、1.5g/L酵母提取物、7g/L磷酸氢二钾、2.0g/L磷酸二氢钾、1.5g/L七水硫酸镁、0.008g/L二水氯化钙以及微量元素；

其中，微量元素浓度为：0.001g/L七水氯化铁、0.0001g/L七水硫酸锌、0.0001g/L五水硫酸铜、0.0001g/L硝酸钴、0.0001g/L五水硫酸锰。

GY培养基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、2g/L硝酸钾、1g/L磷酸二氢钠、3g/L七水硫酸镁。

MM基础培养基：1.74g/L磷酸氢二钾、1.37g/L磷酸二氢钾、0.146g/L氯化钠、0.49g/L七水硫酸镁、0.078g/L氯化钙、0.53g/L硫酸铵、1.8g/L葡萄糖、10mL/L七水硫酸铁(100X)、5mL/L甘油，灭菌后加入已滤菌的MES缓冲液至终浓度为7.8g/L。

IM诱导培养基：在MM培养基的基础上稍作调整，额外添加0.1g/L的尿嘧啶，葡萄糖改为0.9g/L，其余不变，使用前添加100μg/mL的乙酰丁香酮(AS)和7.8g/L的MES，用于固体培养基时添加20g/L的琼脂条，添加AS的IM培养基需避光保存。

SC-CS培养基：20g/L葡萄糖、5g/L无氨基酵母氮源、1.7g/L硫酸铵、10mL/L氨基酸母液(100X)、20g/L琼脂，倒平板前添加100μg/mL的头孢噻圬和100μg/mL的壮观霉素；

其中，氨基酸母液：60mg/L异亮氨酸、60mg/L亮氨酸、60mg/L苯丙氨酸、50mg/L苏氨酸、40mg/L赖氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L腺嘌呤、20mg/L精氨酸、20mg/L组氨酸、10mg/L甲硫氨酸。

SOC复苏培养基：20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、0.5g/L氯化钠、0.186g/L氯化钾、0.95g/L氯化镁、3.6g/L葡萄糖。

LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

YEP液体培养基：10g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白陈、5g/L氯化钠，使用前添加100μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的利福平，避光保存。

YEP固体培养基：10g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白陈、5g/L氯化钠、20g/L琼脂，使用前添加100μg/mL的卡那霉素和100μg/mL的利福平，避光保存。

实施例1：编码β-异丙基苹果酸脱氢酶的基因的筛选

具体步骤如下：

根据NCBI中已鉴定功能的β-异丙基苹果酸脱氢酶基因的序列为模板，在已完成测序的M.alpinaATCC 32222菌株的基因库中进行BLAST比对，获得备选的目的基因；然后将备选基因在NCBI库中进行二次比对筛选，将最终得到的目的基因命名为MaLeuB(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)，对应蛋白命名为MaLeuB(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)。

MaLeuB对应cDNA的全长为1146bp，编码381个氨基酸。为了进一步判断筛选出的MaLeuB是否属于异丙基苹果酸脱氢酶，将其与NCBI中已鉴定功能的β-异丙基苹果酸脱氢酶进行氨基酸同源性和保守结构分析。

如图1所示，比对结果表明，MaLeuB与NCBI中已鉴定功能的β-异丙基苹果酸脱氢酶具有很高的同源性，且具备β-异丙基苹果酸脱氢酶的保守序列，因此，可判断MaLeuB为β-异丙基苹果酸脱氢酶。

实施例2：MaLeuB的克隆

具体步骤如下：

使用Trizol法提取高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC 32222的总RNA，按照Takara反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，在高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC 32222的cDNA文库中通过PCR反应扩增MaLeuB，扩增MaLeuB所用引物见表1。

所用PCR仪为BIO-RAD T100 Thermal Cycler，使用KOD plus高保真DNA聚合酶，反应体系为50μL，体系内容按照该DNA聚合酶说明书内容进行；反应过程如下：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1.5min，重复上述三步骤30次，然后68℃充分延伸5min，最后降到12℃保持10min后停止。

反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小，获得MaLeuB。

表1引物序列及其用途

实施例3：MaLeuB在高山被孢霉中的表达

具体步骤如下：

(1)高山被孢霉表达载体的构建

使用限制性内切酶HindⅢ和SmaⅠ对实施例2获得的MaLeuB以及表达载体pBIG2-ura5s-ITs进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的的DNA进行连接，获得连接产物，具体酶切体系(20μL)如表2。

表2酶切体系

试剂	用量
		10×cutmart buffer	2μL
限制性内切酶	1μL
		PCR产物或载体	200ng～1μg
ddH<sub>2</sub>O	补至20μL

将获得的连接产物于4～16℃下过夜连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法如下：无菌状态下取100μL感受态细胞，加入5～8μL连接产物，吹吸混匀；将混匀的感受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡；将电转柄放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转，电压条件为1.8kv；加入1mL SOC复苏培养基于电转后的感受态细胞中，混匀转移至1.5mL离心管中，37℃、150rpm孵育1h；取200μL涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养过夜；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB。

(2)高山被孢霉的转化筛选

将获得的重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB通过电击转化法转入根癌农杆菌AGL-1，获得携带重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB的根癌农杆菌；使用生理盐水刮取野生型高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的孢子，于4℃～28℃培养箱放置6～24h，获得萌发的孢子液；将携带重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB的根癌农杆菌分别在YEP培养基中活化、MM培养基中培养和IM培养基中诱导，取经IM培养基诱导培养的根癌农杆菌测定OD₆₆₀，用IM培养基梯度稀释为OD₆₆₀＝0.2～1.2，得到携带重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB的根癌农杆菌菌液；取携带重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB的根癌农杆菌菌液与孢子液100～200μL于无菌EP管中上下颠倒混匀，涂布于贴有玻璃纸的IM固体培养基中于16～28℃的条件下避光共培养12～48h；共培养结束后，将带有共培养体系的玻璃纸转移至含有壮观霉素(Spe)和头孢噻肟(Cef)的SC-CS培养基，于16～28℃的条件下进行培养，直至有菌落长出；菌落长出后，挑取菌落边缘新长出的菌丝，连续在新的SC-CS培养基上于28℃的条件下培养12～48h进行传代培养；传代培养后，选取可以稳定生长的菌落，挑取至Broth液体活化培养基中于28℃的条件下培养2d，获得菌液；取菌液提取真菌基因组DNA进行PCR验证，认为扩增得到目的条带的转化子为正确的阳性转化子(PCR结果如图2所示)；PCR验证共获得14个阳性转化子，将这些阳性转化子进行测序，各转化子中过表达的MaLeuB的碱基序列与高山被孢霉基因组中的序列数据一致，证实所选14个阳性转化子在基因组水平验证正确，获得携带MaLeuB基因的重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB；其中，PCR使用Taq酶体系进行，所用引物为质粒载体pBIG2-ura5s-ITs的通用引物，具体序列如下：

上游引物Hispro F1：CACACACAAACCTCTCTCCCACT(SEQ ID No.5)；

下游引物TrpCR 1：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC(SEQ ID No.6)。

由图2可知，通过使用通用引物进行PCR验证，携带重组质粒pBIG2-ura5s-MaLeuB的根癌农杆菌的T-DNA区域的尿嘧啶回补标记ura5s和目的基因MaLeuB可被成功扩增出来，且条带大小符合理论值(因引物设计在载体上，所获得的片段比实际片段大156bp)，说明目的基因被成功转入高山被孢霉中。

取重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB的单孢子接种于Broth培养基(含有20g/L葡萄糖)中，于28℃的条件下培养2d进行活化；连续活化三代，离心，收集活化后的菌体；将菌体打碎至均匀菌絮状；将打碎的菌体以1％(v/v)的接种量接种到Broth培养基(含有50g/L葡萄糖)中，于28℃、200rpm摇床培养7d后，离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，弃去沉淀，获得上清液，上清液中含有β-异丙基苹果酸脱氢酶MaLeuB。

实施例4：重组高山被孢霉的生长和产脂

具体步骤如下：

以高山被孢霉原养型菌株为阴性对照，取重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB以及高山被孢霉原养型菌株的单孢子接种于Broth培养基(含有20g/L葡萄糖)中，于28℃的条件下培养2d进行活化；连续活化三代，离心，收集活化后的菌体；将菌体打碎至均匀菌絮状；将打碎的菌体以1％(v/v)的接种量接种到Broth培养基(含有50g/L葡萄糖)中，于28℃、200rpm摇床培养7d后，离心，收集菌体，真空冷冻干燥至恒重，称量菌体重量，计算生物量，计算结果见表2；将菌体研磨成粉末，称取50mg，精确加入100μL 2mg/mL的C15:0作为内标，加入2mL4 mol/L的盐酸充分混匀；80℃水浴1h，-80℃放置15min；重复3次后冷却至室温，加入1mL甲醇和1mL氯仿，混匀，震荡2min；3000g离心10min；收集氯仿层于新的提脂瓶中；重复此步骤两次；合并氯仿层，氮吹干燥后加入1mL 10％的盐酸-甲醇，60℃水浴3h进行甲酯化处理；之后在上述甲酯化处理体系中加入1mL饱和氯化钠和1mL正己烷，混匀，3000g离心10min，重复此步骤两次；收集正己烷层于新瓶，剩余液体继续加入1mL正己烷，震荡混匀1min后于3000g离心10min；合并正己烷层，氮吹干燥，加入1mL正己烷回溶，即获得脂肪酸甲酯；使用GC-MS检测菌体中脂肪酸的组成及含量，检测结果见表3-4；

其中，脂肪酸甲酯分析采用GC2010(Shimadzu Co.，Japan)，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32m，0.22μm)；氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1uL，分流比10:1，载气为氮气；程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min；通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。

由表3可知，除转化子5的生物量有所降低外，其余重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB的总生物量与阴性对照相比无明显变化，说明过量表达目的基因MaLeuB对重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB的生长不造成影响；转化子5生物量的降低可能与基因插入位点有关。

由表3可知，多数重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB中的脂肪酸含量(细胞干重％)和脂肪酸产量(g/L)均有了不同程度的提高，其中，转化子8、9和12的提升效果最明显，脂肪酸含量分别较阴性对照组提高16.5％，17.1％和20.2％，脂肪酸产量分别较阴性对照组提高25.5％，18.7％和27.2％，提升最明显的转化子12的生物量达到11.8g/L，脂肪酸含量达到细胞干重的46.4％，说明，过量表达目的基因MaLeuB对脂肪酸的合成具有明显的促进作用。

由表4可知，重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB所产脂肪酸中，多不饱和脂肪酸(PUFAs)的占比最高。

上述结果为通过基因工程手段进一步提升高山被孢霉等产油微生物产脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)的能力，进而为提高脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)的生物合成能力提供了充实的理论支持。

表3重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB以及高山被孢霉原养型菌株的生物量以及菌体中脂肪酸的含量

表4重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB以及高山被孢霉原养型菌株的菌体中脂肪酸的组成及含量

实施例5：重组高山被孢霉的基因转录水平分析

具体步骤如下：

以高山被孢霉原养型菌株为阴性对照，取重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB中的转化子8、9、12以及高山被孢霉原养型菌株的单孢子接种于Broth培养基(含有50g/L葡萄糖)中，28℃、200rpm摇床培养7d，离心，收集菌体；取收集的菌体，于预冷的无菌无酶研钵中加入液氮充分研磨；加入1mL TRIZOL(Invitrogen，Carl shad，CA，USA)继续研磨至粉末，室温放置至溶解；用无酶枪头吸取1mL溶解后的液体于无酶离心管中，加入200μL预冷的氯仿混匀；12000g、4℃下离心15min，吸上清于新的无酶离心管中；加入200μL三氯甲烷混匀，12000rpm、4℃下离心15min吸上清于新的无酶离心管中；加入等体积预冷的异丙醇，静置15min，12000g、4℃下离心15min，弃上清，室温晾干；加入1mL DEPC水配制的的75vol％乙醇，12000g、4℃下离心15min，用无酶枪头吸去乙醇，加入1mL乙醇水，重复上述步骤，用于洗净残存的杂质；离心弃上清后，将沉淀于室温下晾至半透明状；加入50μL无酶水溶解RNA，测定浓度并稀释至1μg/μL，冰上储存；取1μL RNA用Nanodrop 2000测定浓度；同时取1μg RNA在1.2％的变性胶中电泳，观察RNA完整性；取1μg总RNA为模板，根据Primescript RTreagent kit(Takara，0tsu，Shiga，Japan)试剂盒说明书进行反转录，获得高山被孢霉的cDNA；按照BIO-RAD iTAQTM Universal SYBR Green SuperMix的说明配制样品进行RT-qPCR反应；

其中，RT-qPCR反应体系为：10μL iTAQTM Universal SYBR Green Supermix(2×)、上下游引物各1μL、150～200ng cDNA，ddH₂0补足至20μL；PCR循环设置为：50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃30s，40个循环；18S rDNA作为内参基因，每个实验设置三个生物学平行，每个平行设置3个复孔；

相对转录水平计算公式为2^-ΔΔt，Δt为目的基因CT值与内参基因之差，ΔΔt为实验组Δt与对照组Δt的差值，RT-qPCR反应所用引物见表5。

由表6可知，所选3个转化子中，目的基因MaLeuB的转录水平分别比阴性对照组提高4.2倍、2.9倍和4.7倍，可见，目的基因MaLeuB确实在转录水平实现了过量表达，且其表达水平与重组菌脂肪酸积累量呈正相关，说明，即过量表达目的基因MaLeuB对于提高产油丝状真菌高山被孢霉脂质积累量具有很好的提升效果。

表5引物序列及其用途

表6重组高山被孢霉M.alpina-MaLeuB以及高山被孢霉原养型菌株的基因转录水平

组别	相对转录水平
		高山被孢霉原养型菌株	1
8号转化子	4.2
		9号转化子	2.9
12号转化子	4.7

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种β-异丙基苹果酸脱氢酶及其在脂质合成中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 381

<212> PRT

<213> Mortierella alpina

<400> 1

Met Ala Ala Ser Pro Lys Gln Ala Thr Val Val Leu Leu Pro Gly Asp

1 5 10 15

Gly Val Gly Pro Glu Val Ile Ala Gln Ala Gln Arg Val Leu Glu Leu

20 25 30

Val Ala Lys Val Arg Ser Asp Lys Val Lys Ile Thr Phe Lys Thr Glu

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Ala Ser Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Ser Asp

50 55 60

Ser Ala Leu Ala Ser Cys Lys Ala Ala Asp Ala Ile Leu Leu Gly Ala

65 70 75 80

Val Gly Gly Pro Lys Trp Ala Thr Gly Asn Pro Arg Pro Glu Gln Gly

85 90 95

Leu Leu Ala Leu Arg Lys Ser Leu Asp Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro

100 105 110

Cys Thr Phe Ala Ser Glu Ala Leu Val Ala Tyr Ser Pro Leu Lys Glu

115 120 125

Ser Ile Val Lys Gly Val Asp Phe Met Met Ile Arg Glu Leu Val Gly

130 135 140

Gly Ile Tyr Phe Gly Asp Arg Lys Glu Ala Thr Glu Glu Asp Gly Phe

145 150 155 160

Ala Tyr Asp Thr Leu Pro Tyr Ser Lys Ala Glu Val Glu Arg Val Thr

165 170 175

Arg Leu Ala Ala Ala Leu Ala Leu Gln His Glu Pro Ala Trp Pro Ile

180 185 190

His Ser Ile Asp Lys Ala Asn Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg

195 200 205

Lys Thr Val Thr Glu Val Ile Glu Arg Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Val

210 215 220

Asp His His Leu Val Asp Ser Ala Ala Met Phe Leu Val Lys Asn Pro

225 230 235 240

Arg Ser Leu Asn Gly Val Ile Leu Thr Glu Asn Met Phe Gly Asp Ile

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Ala Ser Val Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro

260 265 270

Ser Ala Ser Leu Asn Gly Leu Pro Glu Lys Gly Lys Pro Cys Leu Gly

275 280 285

Met Tyr Glu Pro Ile His Gly Ser Ala Pro Asp Ile Ala Gly Lys Gly

290 295 300

Ile Ala Asn Pro Val Gly Thr Ile Leu Ser Ala Ala Met Leu Leu Arg

305 310 315 320

Tyr Ser Leu Asp Met Glu Ala Glu Ala Val Ala Val Glu Ser Ala Val

325 330 335

Arg Lys Val Leu Asp Asp Val Glu Ser Ala Gly Phe Gly Phe Arg Thr

340 345 350

Arg Asp Leu Gly Gly Asp Lys Ser Thr Gln Glu Met Gly Asp Lys Val

355 360 365

Leu Glu Val Leu Glu Lys Glu Leu Gln Ser Ile Ser Ala

370 375 380

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> Mortierella alpina

<400> 2

atggccgctt cacccaaaca ggctacagtc gtgctcttgc ccggagacgg cgttggtccc 60

gaggttattg ctcaagccca gcgtgttctc gagctggtcg ccaaagtccg atccgacaag 120

gtgaagatca ccttcaagac tgagctcatc ggaggtgcct cgatcgatgc tactggcacg 180

cccttgtccg atagtgcact cgcctcttgc aaggctgcgg atgcgatcct cttgggagca 240

gtaggaggac ccaagtgggc gacaggaaac ccaagacctg agcaaggatt gctcgctctc 300

cgaaagagct tggatctgta cgcaaacctc cgtccttgta cgttcgcgtc cgaggccctg 360

gtcgcgtact cgcccctcaa ggagtcgatc gtcaagggtg tggatttcat gatgatccgt 420

gagttggtcg gaggcattta ctttggagac cgcaaggagg cgacagagga ggatggattc 480

gcgtacgata cgcttcctta ttccaaggct gaggtggagc gtgtgactcg actggcggcg 540

gcgttggcgc tccagcacga gcccgcgtgg cccattcact cgatcgacaa ggcgaatgtg 600

ttggcgtcgt ctcgtctgtg gcgcaagacg gtgacggagg tgattgagag ggaataccct 660

cagctcaagg ttgatcatca cctcgtggac tctgcggcca tgttcttggt caagaaccct 720

cgcagtttga acggagtgat cctgaccgag aacatgtttg gcgatatctt gtcggatgag 780

gcttcggtga ttccgggttc gcttgggttg ttgccctcgg cctcgttgaa tgggttgccc 840

gagaagggta agccctgctt gggcatgtac gagcctattc acggatcggc acctgacatt 900

gcaggcaagg gtattgccaa ccctgtggga acgatcctgt cggcggccat gttgttgcgt 960

tactcgttgg atatggaggc cgaggccgtg gcggtggagt cggcggtgcg caaggtgttg 1020

gatgatgtgg agagtgcagg attcggattc cgtacgcggg atttgggtgg tgacaagtcg 1080

actcaggaga tgggtgataa ggtcctcgag gtgttggaga aggagctcca gagcatcagc 1140

gcttag 1146

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagcttc aatggccgct tcacccaaac aggctac 37

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcccccgggc taagcgctga tgctctggag ctcct 35

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacacacaaa cctctctccc act 23

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaatgaacg tatcttatcg agatcc 26

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aggcatttac tttggagac 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttggaataag gaagcgtatc 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtactaccg attgaatggc ttag 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctacggaaa ccttgttacg act 23

Claims

1.一种β-异丙基苹果酸脱氢酶，其特征在于，所述β-异丙基苹果酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的β-异丙基苹果酸脱氢酶。

3.如权利要求2所述的一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2或3所述的基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组质粒。

6.如权利要求5所述的一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为高山被孢霉、大肠杆菌或根癌农杆菌。

7.权利要求1所述β-异丙基苹果酸脱氢酶，或权利要求2或3所述的基因，或权利要求4所述重组质粒，或携带权利要求2或3所述基因的重组高山被孢霉，或携带权利要求4所述重组质粒的重组高山被孢霉在生产脂肪酸中的应用。

8.一种生产脂质的方法，其特征在于，所述方法为：将携带权利要求2或3所述基因的重组高山被孢霉，或将携带权利要求4所述重组质粒的重组高山被孢霉加入培养基中，于温度为12~28℃、转速为150~250 rpm的条件下培养7~12 d，得到富含脂质的重组高山被孢霉细胞，然后将得到的重组高山被孢霉细胞进行提取，得到脂质；所述脂质为脂肪酸。

9.一种生产权利要求1所述β-异丙基苹果酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述方法为将携带权利要求2或3所述基因的重组高山被孢霉，或将携带权利要求4所述重组质粒的重组高山被孢霉加入培养基中，于温度为12~28℃、转速为150~250 rpm的条件下培养7~12 d，得到表达β-异丙基苹果酸脱氢酶的重组高山被孢霉细胞，然后将得到的重组高山被孢霉细胞进行提取，得到β-异丙基苹果酸脱氢酶。