CN108330114B - 一种利用epa的甘油二酯酰基转移酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种高效利用二十碳五烯酸(EPA)作为底物合成甘油三酯(TAG)的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，以及含有该DGAT基因的表达载体在相应宿主中的应用。该DGAT在宿主细胞中的高效表达能够提供一种代谢拉力，增强EPA的合成并将EPA富集到中性油脂TAG上。通过此方法获得的富含EPA的宿主细胞可作为提取纯化EPA的原料或是直接作为添加剂用于功能食品、化妆品、水产及禽类养殖等行业。

Description

一种利用EPA的甘油二酯酰基转移酶及其应用

技术领域

本发明属于生物代谢工程领域，具体涉及一种通过代谢工程提高中性油脂(甘油三酯，TAG)中多不饱和脂肪酸EPA含量的新方法。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)属于ω-3多不饱和脂肪酸，和二十二碳六烯酸(DHA)一样是公认的高附加值营养成分，对人体健康起着非常重要的作用。但是，它们不能在人体内合成，必须从食物中摄取。目前，许多国家民众的EPA和DHA平均日摄取量远低于权威组织的推荐水平。过去几十年，人类摄取的EPA主要来源于深海鱼油。但野生海洋鱼类自身也无法合成EPA，只能从海洋微生物主要是微藻中富集。由于过度捕捞，全球海鱼储量迅速减少，超过100种鱼类已经或者濒临灭绝。此外，海洋污染的严重性导致鱼类中重金属、有毒有机物含量较高，不利于人体健康。并且鱼油不适合素食者食用，兼有难闻气味。随着国内外市场对EPA的需求量越来越大，鱼油EPA的产量远远无法满足巨大的市场需求。

近年来，研究探索可持续的ω-3多不饱和脂肪酸生产的生物新资源倍受关注，包括真菌、植物和微藻等。EPA的生物合成，从C18:0开始，需要一系列的去饱和与延长反应。第一个去饱和反应由C18:0-ACP去饱和酶(SAD)催化，生成C18:1。经由Δ12去饱和酶催化，C18:1转化成C18:2，然后进入ω-3或者ω-6途径，再经过Δ6去饱和酶、Δ6延长酶和Δ5去饱和酶最终生成EPA。这些去饱和酶反应需要消耗氧气和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)。此外，EPA还有可能通过聚酮体合成酶(PKS)途径合成。PKS途径同样以乙酰辅酶A作为最初前体，不同之处在于它不需要氧气和去饱和酶的参与。EPA主要以偶联的形式整合在极性膜脂如糖脂和磷脂上，在甘油三酯(TAG)中的含量很低，不利于下游的提取和纯化。

TAG的合成途径主要有两条：依赖于酰基CoA的从头合成途径和不依赖于酰基CoA的替代合成途径。前者起始于3-磷酸甘油，经过三个脂酰化反应形成。最后一个脂酰化反应是该途径的限速步骤，由甘油二酯酰基转移酶(DGAT)催化，从酰基CoA上将酰基转移到二酰基甘油(DAG)生成TAG。DGAT有底物特异性，合成的EPA通过对EPA有高活力的DGAT可有效地整合到TAG上进行储存。如果缺乏有效的DGAT，EPA很容易被氧化降解，导致了中性油脂TAG上的EPA含量低。

发明内容

本发明的目的是针对上述中性油脂TAG上的EPA含量低的问题，提供含有能够高效利用EPA作为底物合成TAG的DGAT，及其基因和表达载体，通过代谢工程的方法，增强EPA的合成，并将EPA富集到中性油脂TAG上，从而提高EPA的生产。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，来源于小球藻Chlorella zofinginesis，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

一种DGAT基因，来源于小球藻Chlorella zofinginesis，编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)相同的功能。

序列表中SEQ ID No：1所示氨基酸序列由327个氨基酸残基组成，在5’端含有2个跨膜区域，分别位于第28-50位氨基酸残基和第62-84位氨基酸残基。通过NCBI蛋白序列比对软件分析表明，该蛋白序列含有保守区域PLN02783(diacylglycerol O-acyltransferase)，属于DGAT。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法，以及对蛋白功能的检测均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白并检测其功能。

本发明的小球藻DGAT基因的核酸序列可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。序列表中SEQID No：2所示的是小球藻DGAT基因的编码序列。

包含上述核酸序列的载体、宿主细胞也在本发明的保护范围内。

所述载体可以是包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。所述的表达载体包括但不限于微藻表达载体、植物表达载体、动物表达载体、酵母表达载体和细菌表达载体，由相应的高效启动子驱动在宿主中表达DGAT，将合成的EPA富集到TAG上。在具体实施方案中，所述表达调控序列包括高效表达的组成型或诱导型基因启动子，例如油滴表面蛋白(LDSP)启动子、热激蛋白70A(HSP70A)启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(RBCS)启动子、硝酸还原酶(NR)启动子等。

所述载体还可以包含抗性筛选标记，在本发明的一个实施例中，表达载体以Ble作为抗性筛选标记。抗性筛选标记也可以是其它经过密码子优化后的抗性基因，比如潮霉素(Hygromycin)抗性基因、巴龙霉素(Paromomycin)抗性基因、遗传霉素(G418)抗性基因。可以使用各种组成型或诱导型基因启动子来驱动抗性筛选标记的表达，比如内源β-微管蛋白(β-tubulin)启动子、热激蛋白70A(HSP70A)启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(RBCS)启动子、硝酸还原酶(NR)启动子等。

将包含上述小球藻DGAT基因的表达载体通过电击法、基因枪法、热激法、转染法或是农杆菌介导法导入宿主细胞，通过筛选获得能够高效利用EPA作为底物合成TAG的工程宿主细胞，可用于生产EPA。在本发明的一个实施例中，将所述表达载体导入微藻细胞中，通过筛选获得TAG中富含EPA的工程藻株。

将上述工程宿主细胞培养繁殖可作为EPA提取原材料，其生产的TAG中EPA的含量高，可直接用于或将EPA提取纯化后用于功能食品、化妆品、水产和禽类养殖等。

具体的，本发明的实施例中从小球藻(绿藻)中分离克隆出一种DGAT基因的编码序列并进行分析，然后克隆到酵母表达载体pYES2-CT上，将该表达载体导入TAG缺陷型酿酒酵母H1244中进行功能互补验证。对获得的酵母转化子进行Bodipy染料染色和提取油脂分析表明，该基因编码有功能的DGAT，能够回补H1244表型生成TAG。通过提取表达DGAT的H1244细胞的微粒体(microsome)粗蛋白，选用不同的脂酰CoA进行体外功能分析，结果表明该DGAT能够高效利用EPA作为底物合成TAG。

进一步的，将含有所述DGAT基因的微藻表达载体在大肠杆菌DH5α中繁殖扩增后提取质粒，用限制性内切酶线性化后通过电击法导入微拟球藻中，抗性筛选获得转化藻株。过量表达的DGAT对EPA的活力强，能提供一种代谢拉力将微拟球藻中合成的EPA整合到TAG上进行保护，从而提高中性油脂TAG中的EPA含量。对所获得的转化藻株提取油脂进行分析，筛选出TAG中富含EPA的工程藻株。

本发明上述获得的富含EPA的工程藻株可作为原材料进行EPA的提取和纯化。富含EPA的工程藻株以及从其提取和纯化的EPA可用于功能食品、化妆品、水产和禽类养殖等。

本发明上述获得的富含EPA的工程藻株用于EPA生产的优点表现在：1、光合效率高(远远高于植物)，生长快，生物量可在一天之内翻一番；2、易培养，可在盐碱、荒地等非耕地大规模生长，不与粮食生产产生冲突；3、EPA富集在中性油脂TAG中，含量高，有利于下游的提取和纯化步骤。

本发明上述高效利用EPA合成TAG的DGAT基因也可克隆到其它表达载体，包括但不限于植物表达载体、动物表达载体、酵母表达载体和细菌表达载体，由相应的高效启动子驱动在宿主中表达，将合成的EPA富集到TAG上。如果宿主不能合成EPA，则需要导入相应的去饱和酶和延长酶基因。获得的工程宿主生产的TAG中EPA的含量高，可直接用于、也可将EPA提取纯化后用于功能食品、化妆品、水产和禽类养殖等。

附图说明

图1为小球藻Chlorella zofinginesis ATCC 30412的DGAT蛋白序列的跨膜区域预测结果；

图2为小球藻Chlorella zofinginesis ATCC 30412的DGAT在TAG合成缺陷型酿酒酵母H1244中的功能互补分析实验结果；

图3为小球藻Chlorella zofinginesis ATCC 30412的DGAT对不同脂酰CoA活性的体外功能分析结果；

图4为实施例2构建的微藻表达载体pLDSP::DGAT-Ble的物理图谱；

具体实施方式

下文结合附图，通过实施例以更详细的方式介绍本发明，但并不以此来限定本发明的技术方案。

实施例1、小球藻DGAT基因的克隆、序列分析和在酵母体系中的功能鉴定

(1)小球藻DGAT基因的克隆和序列分析

小球藻Chlorella zofinginesis ATCC 30412由美国模式培养物保藏所AmericanType Culture Collection(Rockville,MD,USA)提供，用BG-11培养基在温度为25℃、光强为80μE m^-2s^-1、摇床转速为150rpm条件下进行培养。细胞生长达到对数期后，通过离心(3000×g,5min)收获约10⁸个细胞，在有液氮存在的情况下研磨破碎细胞，然后用TRIReagent试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA。总RNA的提取方法参照试剂盒说明书的步骤。总RNA的浓度用NannoDrop 2000c(Thermo Scientific,Wilmington,Delaware,USA)测定，并通过凝胶电泳进行质量检测。取1μg总RNA进行反转录合成cDNA，采用的试剂盒为SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)，方法参照试剂盒说明书的步骤。以反转录合成的cDNA为模板，在高保真DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，得到全长的小球藻DGAT编码序列。PCR扩增所用引物为：

正向引物：5’-GGCGGATCCATGCTGGAGACTCGTAAG-3’(BamHI)(SEQ ID No：3)；

反向引物：5’-GGCTCTAGA TTGCCAGCCATAACTTGCCT-3’(XbaI)(SEQ ID No：4)。

扩增后的序列纯化后用BamHI和XbaI进行双酶切，然后纯化回收克隆到酵母表达载体pYES2-CT(Invitrogen)的相应酶切位点上，获得质粒pYES-DGAT，并进行测序验证，确定无误。用软件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对DGAT翻译的蛋白序列进行跨膜区域预测，表明它在5’端含有2个跨膜区域，分别为氨基酸28-50和62-84(图1)。通过NCBI蛋白序列比对软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析表明，该蛋白序列含有保守区域PLN02783(diacylglycerol O-acyltransferase)，属于DGAT。

(2)小球藻DGAT基因在酵母体系中的功能互补

酿酒酵母H1244是一种TAG合成缺陷型突变体，不能够生成TAG。如果将外源基因导入此突变体后能够生成TAG，说明该外源基因编码有功能的DGAT。将上述构建好的质粒pYES-DGAT通过PEG介导法导入酿酒酵母H1244感受态细胞，用含2％葡萄糖的SC-uracil培养基(Teknova,Hollister,CA,USA)平板进行转化子筛选。H1244感受态细胞用试剂盒S.c.EasyComp Transformation Kit(Invitrogen)制备，制备和转化方法参照说明书的步骤进行。挑取平板上长出的单克隆接种到含2％棉子糖的SC-uracil液体培养基培养24小时(温度为30℃，摇床转速为220rpm)，然后离心(3000×g,5min)去除上清，重悬于50mL含2％半乳糖的SC-uracil液体培养基到OD₆₀₀＝0.4，继续培养24小时诱导DGAT的表达合成TAG。

诱导24小时后的细胞离心(3000×g,5min)后用预冷的去离子水洗涤2次，加入玻璃珠，用迷你型bead-beater(BioSpec Products,Bartlesville,OK,USA)将细胞打碎。然后加入3mL体积比为2∶1的氯仿∶甲醇，剧烈振荡10min进行油脂抽提。接着加入0.75mL 0.75％的氯化钠水溶液，混匀后离心(1000×g,5min)分层：上层为甲醇与氯化钠水溶液混合层，下层为含油脂的氯仿层。将下层吸出，用液氮吹干后定容到200μL。取10μL上样到TLC硅胶板(Merck,Darmstadt,Germany)上，用体积比为80∶20∶2的正己烷∶甲基叔丁基醚∶冰醋酸作为展开剂进行薄层层析。展开后的TLC硅胶板喷洒染色液(10％硫酸铜，8％磷酸)，风干后在180℃烘烤3min显色。结果表明小球藻DGAT的表达能够使H1244合成TAG，从而证明它是有功能的(图2)。

(3)DGAT体外功能验证

上述功能互补实验只能证明DGAT是否有功能，而不能证明它对哪些脂酰CoA有功能，需要体外功能分析。上述携带DGAT的H1244细胞在250mL含2％半乳糖的SC-uracil液体培养基培养15小时，离心(3000×g,5min)后用预冷的去离子水洗涤2次，然后重悬于20mL细胞裂解液[5％甘油，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.3M硫酸铵，10mM氯化镁，1mM EDTA，1mMDTT，1×EDTA-free protease inhibitor cocktail set X(Calbiochem,San Diego,CA,USA)，1mM PMSF]，用French pressure cell(Spectronics Instruments,Rochester,NY,USA)在15000PSI的内压下破碎2次。破碎后的细胞残渣离心(10000×g,10min)去除，取上清进行超速离心(100000×g,60min)。超速离心获得微粒体膜沉淀，重悬于保存液(50mM-TrisCl,pH 7.5,10％甘油)，使蛋白浓度为10μg/μL。

DGAT体外功能分析体系为200μL，包括50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、10mM氯化镁、40μg微粒体膜、250μM acyl-CoA和250μM DAG。其中acyl-CoA有9种，为C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:4、C20:5(EPA)、C22:6(DHA)。反应条件为：30℃，振荡速度250rpm，1小时。反应完成后立刻加入3mL体积比为2∶1的氯仿∶甲醇，按照上述油脂提取和TLC层析步骤进行。层析后的TLC板改用碘蒸汽进行显色，将TAG从板上刮下来，在含1％硫酸的甲醇中85℃反应2小时进行转酯化。生成的脂肪酸甲酯(FAME)用正己烷进行抽提，定溶，然后用GC-MS(PerkinElmer CLarus 680capillary gas chromatograph,SQ8mass spectrometrydetector)进行定量分析。载气为氦气(流速1.45mL/min)，离子化能量为70eV，上样量为1μL，柱箱起始温度为45℃，保持1.5min后以7℃/min的速率升至150℃，然后以6℃/min的速率升至240℃并在此温度保持3min后结束。用FAME样品进行定量分析。结果表明DGAT对EPA有很强的活力和选择性(图3)。

实施例2、微藻表达载体的构建和微拟球藻的转化

(1)微藻表达载体的构建

载体pLDSP::DGAT-Ble的构建来源于pSelect100(Vieler et al,PLoS Genetics8:e1003064,2012)、以及pXJ004和pXJ015(Xin et al,Molecular Plant 10:1523-1539,2017)。首先，将小球藻DGAT基因用引物[正向引物：5’-GGCGGATCCATGTTGGACACGGGTACG-3’(EcoRI)(SEQ ID No：5)；反向引物：5’-GGCTCTAGATTGCCAGCCATAACTTGCCT-3’(BamHI)(SEQID No：6)]从质粒pYES-DGATPCR扩增出来，酶切纯化后连接到pXJ015的相应酶切位点上，形成中间载体1。接着将Ble用引物[正向引物：5’-GGCAAGCTTTACTCCTTTTATACGCCTTGAC-3’(HindIII)(SEQ ID No：7)；反向引物：5’-GGCGAGCTCAATTGGTCACCCTGATGGTAT-3’(SacI)(SEQ ID No：8)]从pXJ004扩增出来，酶切纯化后连接到中间载体1的相应酶切位点上，形成中间载体2。最后，将LDSP启动子用引物[正向引物：5’-GGCGGTACCGGTCTCTAAGATGGAGTGGAT-3’(KpnI)(SEQ ID No：9)；反向引物：5’-GGCGGATCCTGTTGATGCGGGCTGA-3’(EcoRI)(SEQ IDNo：10)]从pSelect100扩增出来，酶切纯化后连接到中间载体2的相应酶切位点上，形成微藻表达载体pLDSP::DGAT-Ble(图4)。所有经PCR扩增后的产物都经过测序验证无误。

(2)微拟球藻的转化

将微藻在F/2液体培养基中培养至对数期(～2×10⁷cells/ml)，按每个电击反应取25ml藻液，离心(4000×g,10min,4℃)收集。去上清液后，向离心管中加入1ml冰上预冷的375mM无菌Sorbitol重悬藻细胞并转移至灭菌的1.5ml离心管中，充分混匀，然后离心(4000×g,10min,4℃)。弃去上清，再用冰上预冷的375mM无菌Sorbitol洗涤两次。洗涤结束后，弃上清，加入100μl 375mM Sorbitol重悬，再加入5μg线性化的质粒pLDSP::DGAT-Ble，轻弹混匀，冰上放置30min，然后将混合物转移至2mm电击杯中进行电击。电击参数：2200V、50μF、600Ohm。电击后，将细胞立即转移至盛有10ml F/2培养基的15ml无菌离心管中，22℃，30μEm^-2s^-1光强培养24小时。取出装有藻液的15ml离心管，离心(4000×g,10min,4℃)，弃9ml上清，将剩余浓藻液混合均匀，取200μl用无菌玻璃棒均匀涂布于含2μg/ml Zeocin的抗性平板上进行筛选。一般3-4周后，平板上肉眼可见抗性克隆，4-5周后可以挑取抗性克隆于24孔板，添加含1μg/ml Zeocin的液体F/2培养基进行培养。

实施例3、微拟球藻转化子的筛选和鉴定

(1)转化子的基因表达鉴定

将转化子在1μg/ml Zeocin的液体F/2培养基中培养到对数期后离心(4000×g,5min)收取约2×10⁸cells，用于总RNA的提取、cDNA的合成、以及随后的实时荧光定量PCR。总RNA的提取以及cDNA的合成参照实施例1中的步骤。实时荧光定量PCR用SYBR Green PCRMaster Mix(Invitrogen)，具体参照说明书中的步骤进行。DGAT表达用内参基因Actin进行归一化处理。DGAT所用正向引物和反向引物分别为5’-CCAGCAGCGTGTTCTCCATT-3’(SEQ IDNo：11)和5’-GCAATACCCCCCACAATCAC-3’(SEQ ID No：12)。Actin所用正向引物和反向引物分别为5’-CCCAGGGAATGACAGTGCTT-3’(SEQ ID No：13)和5’-GCTCCCGTCAAAATCACGTT-3’(SEQ ID No：14)。

(2)转化子的油脂提取和分析

将转化子在1μg/mL Zeocin的液体F/2培养基中培养到平台期后离心(4000×g,5min)收取用于油脂提取。油脂提取方法参照实施例1中酵母油脂提取的步骤。提取后的油脂用TLC进行层析分离和回收TAG，以及后续的转酯化和GC-MS定量分析，具体参照实施例1中的步骤。分析结果表明，转化子的TAG含量增加，TAG中的EPA含量也有了大幅度的升高。

利用本发明的方法，可将小球藻来源的DGAT导入能合成EPA的微拟球藻中高效表达，培育出的工程藻株合成TAG的能力提高了1.6倍，TAG中EPA的比重从野生型中的1.6％增加到了8.9％，提高了7.5倍。EPA含量的增加以及在中性油脂TAG中的富集有利于下游的提取、纯化等工艺流程。获得的工程藻株以及从其提取的EPA应用广泛，可用于功能食品、化妆品、水产和禽类养殖等。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 一种高效利用EPA的甘油二酯酰基转移酶及其应用

<130> WX2018-03-038

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 327

<212> PRT

<213> Chlorella zofingiensis

<400> 1

Met Leu Glu Thr Arg Lys Gly Gln Ser Ala Leu Asn Val Arg Ile Tyr

1 5 10 15

Ser Asp Gly His Ser Lys Asp His Lys Gln Ser Leu Val Ser Trp Val

20 25 30

Val Ala Ile Thr Thr Leu Phe Ile Tyr Cys Gly Trp Met His Ile Leu

35 40 45

Phe Gly Leu Met Ile Gly Ser Leu Phe Ser Arg Val Cys Leu Tyr Ile

50 55 60

Tyr Leu Gly Leu Leu Ala Thr Leu Ala Leu Pro Ala Lys Pro Val Leu

65 70 75 80

Trp Thr Ala Phe Cys Gln Ser Trp Val Phe Gln Thr Trp Arg Glu Tyr

85 90 95

Phe Asn Tyr Ser Tyr Leu Asn Glu Ser Val Leu Asp Leu Lys Lys Arg

100 105 110

Tyr Ile Phe Val Glu Phe Pro His Gly Val Phe Pro Ile Ser Glu Leu

115 120 125

Ile Ala Gly Thr Gln Cys Gln Ala Ile Trp Pro Asp Phe Pro Ile Phe

130 135 140

Ser Val Ala Ala Ser Ser Val Phe Ser Ile Pro Phe Trp Arg His Phe

145 150 155 160

Ile Ala Trp Ile Gly Ser Val Pro Ala Thr Arg Gln Asn Phe Lys Arg

165 170 175

Ile Leu Gln Lys Gly Ser Val Ala Val Ile Val Gly Gly Ile Ala Glu

180 185 190

Met Tyr Met Gln His Pro Arg Lys Glu Arg Ile Lys Leu Arg Ser Arg

195 200 205

Lys Gly Phe Val Arg Ile Ala Val Glu Glu Gly Leu Asn Gly Gly Leu

210 215 220

Ile Pro Val Tyr His Phe Gly Asn Thr Gln Ile Phe Asp Phe Ala Pro

225 230 235 240

Gln Ser Met Ala Gly Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Val Ser Leu Gly Phe

245 250 255

Leu Val Gly Arg Trp Gly Leu Pro Val Pro Arg Lys Gln Pro Leu Tyr

260 265 270

Met Val Ser Gly Ala Pro Ile Pro Val Pro Lys Val Ala Lys Asp Ser

275 280 285

Pro Glu Phe Glu Ala Thr Val Asp Lys Val His Asp Gln Val Val Asn

290 295 300

Ala Leu Gln Asp Leu Tyr Asp Arg His Lys Ala Ser Tyr Gly Trp Gln

305 310 315 320

Asp Arg Pro Leu Glu Ile Glu

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> Chlorella zofingiensis

<400> 2

atgctggaga ctcgtaaggg acagtccgct ttgaacgtca ggatctactc ggatgggcat 60

tccaaggatc acaagcagtc gctggtgtca tgggtggtcg ccatcactac gctgttcata 120

tactgtggtt ggatgcacat tctgtttggc ttgatgattg ggtctttgtt cagcagagta 180

tgtctgtaca tatatctggg tttgctagcc acattagcac ttccagcaaa accagtgctg 240

tggacagcct tctgccaaag ttgggtgttc cagacatggc gtgagtactt caactatagc 300

tacctgaatg agtctgtgtt ggacctcaag aaacgttaca tctttgtgga atttccacat 360

ggtgtgttcc caattagtga actgatcgct ggcactcagt gtcaagccat ctggccagac 420

ttcccaatct tcagtgtggc tgccagcagc gtgttctcca ttcccttctg gcgccatttc 480

atagcatgga ttgggtctgt gccagcgact cgtcagaact tcaaaaggat cttgcagaag 540

ggcagtgttg cggtgattgt ggggggtatt gcagagatgt atatgcagca tccacgtaag 600

gagcgcatca agctgaggag caggaagggt tttgtgcgca tagcggttga ggaggggctc 660

aatggtggcc ttatacccgt gtatcacttt ggcaacacac agatctttga ctttgcgcca 720

cagtcaatgg ctggcatcag ccgcaagtat caggtcagct taggtttcct ggtgggtagg 780

tggggtctgc cagtgcccag gaaacaaccc ttgtacatgg tcagtggtgc gccaatccct 840

gtgcccaagg ttgccaagga ctctcctgag tttgaggcaa ctgtggacaa ggtgcacgac 900

caggtagtaa acgccttgca ggatctgtat gaccgccaca aggcaagtta tggctggcaa 960

gatcggccat tggagattga gtga 984

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcggatcca tgctggagac tcgtaag 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctctagat tgccagccat aacttgcct 29

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcggatcca tgttggacac gggtacg 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggctctagat tgccagccat aacttgcct 29

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcaagcttt actcctttta tacgccttga c 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcgagctca attggtcacc ctgatggtat 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcggtaccg gtctctaaga tggagtggat 30

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcggatcct gttgatgcgg gctga 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccagcagcgt gttctccatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaatacccc ccacaatcac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cccagggaat gacagtgctt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

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Claims (8)

1.一种DGAT蛋白，来源于小球藻（Chlorella zofinginesis），其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.一种DGAT基因，来源于小球藻（Chlorella zofinginesis），编码序列表中的SEQ IDNo：1所示氨基酸序列的蛋白质。

3.如权利要求2所述的DGAT基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：2所示。

4.包含权利要求2或3所述DGAT基因的载体。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体是微藻表达载体、酵母表达载体或细菌表达载体，由组成型或诱导型启动子驱动所述DGAT基因在宿主细胞中表达。

6.包含权利要求2或3所述DGAT基因的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是包含所述DGAT基因的表达载体的微藻细胞。

7.权利要求1所述的DGAT蛋白、权利要求2或3所述的DGAT基因、或者权利要求4或5所述的载体在制备利用二十碳五烯酸作为底物合成富含二十碳五烯酸的甘油三酯的工程藻株中的用途。

8.权利要求1所述的DGAT蛋白、权利要求2或3所述的DGAT基因、权利要求4或5所述的载体、或者权利要求6所述的宿主细胞在生产二十碳五烯酸中的应用，通过基因工程获得合成的甘油三酯中富含二十碳五烯酸的工程藻株，将其作为二十碳五烯酸的提取原材料。

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