CN111979135A - 一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是在能够生产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母工程菌的基础上通过过表达蜡酯合成酶和脂肪酰辅酶A还原酶基因后得到。所述的生产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌是将AtKCS基因、CraKCS基因和MaELO3基因敲入敲除了PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中构建而成。最终构建了四个产蜡酯的解脂耶氏酵母工程菌WE01、WE02、WE03、WE04。其中WE01工程菌通过连续补料发酵，蜡酯的产量可以达到2g/L。本发明构建的解脂耶氏酵母基因工程菌，其操作简便，性能定可靠，能够应用于大规模的商业化生产。

Description

一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。
背景技术
蜡酯是由长链脂肪醇和长链脂肪酸经过酯化形成的一种中性脂质。在自然界中广泛存在在动物、植物和微生物体内，对它们的生命活动有重要意义。由于其优良的特性，蜡酯被广泛用于化妆品、医药及食品等多种领域。自从世界捕鲸公约禁止捕捞抹香鲸后，来源于荷荷巴油(jojoba/Simmondsia chinensis oil)的液态蜡酯成为目前主要的商用蜡酯来源，市场需求不断增长，相对于其他蜡酯展现出更高的价值。荷荷巴蜡酯是一种超长链蜡酯的混合物，一共由39种不同的蜡酯组成，主要的蜡酯成分碳链长度在C38至C44之间，由C20:1脂肪酸和C20:1及C22:1的脂肪醇组成。蜡酯主要由超长链脂肪酰辅酶A和超长链脂肪醇为前体通过蜡酯合成酶(WS)酯化形成。只是在不同生物中合成过程和关键酶有所差异。因此，利用基因操作技术，构建异源蜡酯生物合成途径是一个新的选择。
由于许多植物自身能够生产C20链长以上的超长链脂肪酸，因此在不外源添加底物的情况下许多研究使用转基因植物实现了荷荷巴型超长链蜡酯(链长最高至C44)的异源生产。但是，用转基因植物生产蜡酯依赖农业生长环境，植物生长周期长，又容易受到自然环境的影响导致产量波动较大，基因改造也比微生物更复杂。因此，通过生物改造微生物来异源生产荷荷巴型的超长链蜡酯是更稳定且持续的方法。
目前，一般通过外源引入蜡酯合成途径相关基因可在大肠杆菌和酿酒酵母中生产蜡酯，但在不额外添加前体的情况下产量都比较低。因此亟需开发一种高产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌。
发明内容
本发明将脂肪酸延长酶基因AtKCS，基因CraKCS和基因MaELO3转化解脂耶氏酵母能够使其产超长链脂肪酸(VLCFAs)，在此基础上过表达了脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR或TaFAR和蜡酯合成酶基因MhWS或AbWS成功获得了产蜡酯的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第二个目的是提供一种产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第三个目的是提供一种所述产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备超长链脂肪酸中的应用。本发明的第四个目的是提供一种所述产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备蜡酯中的应用。本发明的第五个目的是一种所述产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将AtKCS基因，CraKCS基因和MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中构建获得，所述AtKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；所述CraKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述MaELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
根据本发明，所述产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌是先将MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母GQ06工程菌；再将AtKCS基因和CraKCS基因敲入解脂耶氏酵母GQ06工程菌中构建获得解脂耶氏酵母GQ07工程菌。
根据本发明，已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母是参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of Fatty AcidEthyl Esters by the Oleaginous Yeast Yarrowia lipolytica through MetabolicEngineering and Process Optimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得。
根据本发明，所述MaELO3基因是采用CRISPR/Cas9操作系统并通过敲入质粒对敲入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10的方法敲入；所述敲入质粒对为用于在解脂耶氏酵母中进行基因敲入的基于CRISPR/Cas9系统的质粒对，所述敲入质粒对为pHR_F1_MaELO3和pCRISPRyl_F1；
所述pHR_F1_MaELO3是以质粒p32UTMaELO3为模板，使用引物对F1_MaELO3-f/F1_MaELO3-r通过PCR扩增“UAS4B+TEF-MaELO3”片段通过酶切位点NheI和BssHII构建到质粒pHR_F1_hrGFP中获得；其中，引物F1_MaELO3-f和F1_MaELO3-r的引物序列分别如SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10所示；
质粒p32UTMaELO3是使用核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的引物对32UTMaELO3-f和32UTMaELO3-r将核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示的延长酶基因MaELO3通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中获得，所述质粒p3204参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of Fatty Acid Ethyl Esters by the Oleaginous YeastYarrowia lipolytica through Metabolic Engineering and Process Optimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得；
质粒pCRISPRyl_F1参见Zhang,X.K.，Wang,D.N.，Chen,J.，Liu,Z.J.，Wei,L.J.，Hua,Q.2020.Metabolic engineering of beta-carotene biosynthesis in Yarrowialipolytica.Biotechnol Lett，42(6)，945-956所记载的制备方法制得。
根据本发明，所述AtKCS基因和CraKCS基因是通过敲入质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS敲入解脂耶氏酵母GQ06工程菌的方法敲入；
所述质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS是将来源于质粒p32UTCraKCS的“UAS4B+TEF-CraKCS-T”表达盒片段通过EcoRI酶切位点构建到质粒p32UTAtKCS中；
所述质粒p32UTCraKCS是使用核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物对32UTCraKCS-f和32UTCraKCS-r将核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示的延长酶基因CraKCS通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中构建获得；
所述质粒p32UTAtKCS是使用核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对32UTAtKCS-f和32UTAtKCS-r将核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示的延长酶基因AtKCS通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中中获得；
所述质粒p3204参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of Fatty Acid Ethyl Esters by the OleaginousYeast Yarrowia lipolytica through Metabolic Engineering and ProcessOptimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得。
作为本发明的第二个方面，一种产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将AtKCS基因,CraKCS基因和MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入TaFAR基因和MhWS基因构建而成；或者，
再敲入MaFAR基因和MhWS基因构建而成；或者，
再敲入MaFAR基因和AbWS基因构建而成；或者，
再敲入TaFAR基因和AbWS基因构建而成；
所述AtKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；所述CraKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述MaELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；所述MaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；所述TaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；所述MhWS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述AbWS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示。
根据本发明，所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌是先将MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母GQ06工程菌；再将AtKCS基因和CraKCS基因敲入解脂耶氏酵母GQ06工程菌中构建获得解脂耶氏酵母GQ07工程菌；然后，再将TaFAR基因和MhWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌中，构建而成WE01；或者，
然后，再将MaFAR基因和MhWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE03；或者，
再将MaFAR基因和AbWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE04；或者，
再将TaFAR基因和AbWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE02。
根据本发明，所述已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母为敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10。
作为本发明的第三个方面，一种上述所述的产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备超长链脂肪酸中的应用。
作为本发明的第四个方面，一种上述所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备蜡酯中的应用。
作为本发明的第五个方面，一种蜡酯的生产方法，其是通过发酵生产上述所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌获得蜡酯。
作为本发明的第六个方面，一种产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，构建含有启动子为UAS4B+TEF的优化的MaELO3基因的donor质粒pHR_F1_MaELO3；与sgRNA质粒pCRISPRyl_F1可以组成一对敲入质粒对；
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_F1_MaELO3和sgRNA质粒pCRISPRyl_F1同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10中，将筛选标记进行回收后获得菌株GQ06；
(3)构建质粒p32UTAtKCS，并将质粒p32UTAtKCS转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10中，获得产超长链脂肪酸(VLCFAs)的解脂耶氏酵母的GQ03；
(4)构建质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS，并将质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS分别转入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10和步骤(2)所得的解脂耶氏酵母GQ06中，分别获得产VLCFAs的解脂耶氏酵母的GQ05和GQ07。
根据本发明，步骤(1)的质粒pHR_F1_MaELO3的构建步骤为：将来源于质粒p32UTMaELO3的“UAS4B+TEF-MaELO3”片段通过酶切位点NheI和BssHII构建到质粒pHR_F1_hrGFP中，得到质粒pHR_F1_MaELO3；
所述的质粒p32UTMaELO3的构建步骤为：将来源于高山被孢霉菌(Mortierellaalpine)的C16/18延长酶基因MaELO3通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTMaELO3；所述MaELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
根据本发明，步骤(3)的质粒p32UTAtKCS的构建步骤为：将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延长酶基因AtKCS通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTAtKCS；所述AtKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。
根据本发明，步骤(4)的质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS的构建步骤为：将来源于质粒p32UTCraKCS的“UAS4B+TEF-CraKCS-T”表达盒片段通过EcoRI酶切位点构建到质粒p32UTAtKCS中；
所述的质粒p32UTCraKCS的构建步骤为：将来源于海甘蓝(Crambe abyssinica)的延长酶基因CraKCS通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTCraKCS；所述CraKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。
作为本发明的第七个方面，一种产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建质粒p69UTMhWS_UTTaFAR，并将质粒p69UTMhWS_UTTaFAR转入解脂耶氏酵母GQ07中，获得产蜡酯的解脂耶氏酵母的WE01；
(2)构建质粒p69UTAbWS_UTTaFAR，并将质粒p69UTAbWS_UTTaFAR转入解脂耶氏酵母GQ07中，获得产蜡酯的解脂耶氏酵母的WE02；
(3)构建质粒p69UTMhWS_UTMaFAR，并将质粒p69UTMhWS_UTMaFAR转入解脂耶氏酵母GQ07中，获得产蜡酯的解脂耶氏酵母的WE03；
(4)构建质粒p69UTAbWS_UTMaFAR，并将质粒p69UTAbWS_UTMaFAR转入解脂耶氏酵母GQ07中，获得产蜡酯的解脂耶氏酵母的WE04。
根据本发明，步骤(1)的质粒p69UTMhWS_UTTaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTMhWS的“UAS4B+TEF-MhWS-T”表达盒片段构建到质粒p69UTTaFAR中；
所述的质粒p69UTTaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTTaFAR“UAS4B+TEF-TaFAR”片段构建到质粒pINA1269中，得到质粒p69UTTaFAR；
所述的质粒p32UTTaFAR的构建步骤为：将来源于来源于仓鸮(barn owl T.alba)的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTTaFAR；所述TaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
根据本发明，步骤(2)的质粒p69UTAbWS_UTTaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTAbWS的“UAS4B+TEF-AbWS-T”表达盒片段构建到质粒p69UTTaFAR中；
所述的质粒p32UTAbWS的构建步骤为：将来源于不动杆菌(Acinetobacter baylyiADP1)的蜡酯合成酶基因AbWS通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTAbWS，所述AbWS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。
根据本发明，步骤(3)的质粒p69UTMhWS_UTMaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTMhWS的“UAS4B+TEF-MhWS-T”表达盒片段构建到质粒p69UTMaFAR中；
所述的质粒p69UTMaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTMaFAR“UAS4B+TEF-MaFAR”片段构建到质粒pINA1269中，得到质粒p69UTMaFAR；
所述的质粒p32UTMaFAR的构建步骤为：将来源于来源于海杆菌(Marinobacteraquaeolei VT8 Maqu_2220)的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR通过酶切位点PmlI和BamHI构建到质粒p3204中，得到质粒p32UTMaFAR；所述MaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
根据本发明，步骤(4)的质粒p69UTAbWS_UTMaFAR的构建步骤为：将来源于质粒p32UTAbWS的“UAS4B+TEF-AbWS-T”表达盒片段构建到质粒p69UTMaFAR中。
本发明的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其有益效果是其构建方法简便，在仅导入5个基因(脂肪酸延长酶基因AtKCS，基因CraKCS和基因MaELO3，脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR或TaFAR和蜡酯合成酶基因MhWS或AbWS)获得的解脂耶氏酵母基因工程菌WE01、WE02、WE03、WE04，通过发酵可以高产蜡酯，具有良好的应用前景。
本发明的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果：(1)蜡酯的产量高：本发明的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌WE01能使蜡酯在5L发酵罐中达到2g/L的产量。(2)蜡酯的组分优：本发明的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌WE03和WE04生产的蜡酯链长以C38-C42为主，与荷荷巴油中的蜡酯链长相似，是同类型的微生物合成蜡酯中的最高产量。(3)其构建方法简便，通过CRISPR/Cas9及整合型质粒回补筛选标记的方式仅仅导入5个基因，获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够应用于大规模的商业化生产，前景良好。
附图说明
图1为引入延长酶基因，脂肪酰辅酶A还原酶基因和蜡酯合成酶基因后的解脂耶氏酵母生成蜡酯的代谢途径。
图2为菌株Po1f，GQ03，GQ05和GQ07摇瓶发酵生产VLCFAs的各脂肪酸比例图。
图3为WE01，WE02，WE03和WE04菌株摇瓶发酵生产蜡酯的结果图。
图4为WE01菌株在5L发酵罐中分批补料发酵生产蜡酯的结果图。
图5为WE01菌株在48h，72h，96h和120h时蜡酯各组分比例结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本申请所用的解脂耶氏酵母自身能够合成C16和C18链长的脂肪酸，为此，将来自拟南芥的延长酶基因AtKCS、海甘蓝的延长酶基因CraKCS和高山被孢霉菌的C16/18延长酶基因MaELO3经密码子优化后转化敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母，能够使其有效生产最长为C24的VLCFAs，最后将来自于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR或自于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR与来自于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS和来自于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS两两组合最终得到4个生产超长链蜡酯的解脂耶氏酵母工程菌(参见图1)。
本发明所用的试剂和原料均市售可得。
本发明涉及的菌株和质粒来源如下：
1、菌株Po1f和质粒pINA1269：根据Madzak,C.,Treton,B.,Blanchin-Roland,S.2000.Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectorsfor quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeastYarrowia lipolytica.J Mol Microbiol Biotechnol,2(2),207-216所记载的制备方法制得。
2、质粒pINA1312：参见Nicaud,J.M.,Madzak,C.,van den Broek,P.,Gysler,C.,Duboc,P.,Niederberger,P.,Gaillardin,C.2002.Protein expression and secretionin the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res,2(3),371-379所记载的制备方法制得。
3、质粒pCRISPRyl_F1和pHR_F1_hrGFP：参见Zhang,X.K.，Wang,D.N.，Chen,J.，Liu,Z.J.，Wei,L.J.，Hua,Q.2020.Metabolic engineering of beta-carotenebiosynthesis in Yarrowia lipolytica.Biotechnol Lett，42(6)，945-956所记载的制备方法制得。
4、质粒p3204：在pINA1312的基础上将启动子替换为UAS4B+TEF。
质粒p32UTMhWS:含有来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS。
解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10：在解脂耶氏酵母Po1f的基础上敲除了PEX10基因。
质粒p3204、质粒p32UTMhWS和解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10均参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of FattyAcid Ethyl Esters by the Oleaginous Yeast Yarrowia lipolytica throughMetabolic Engineering and Process Optimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得。
5、质粒pHR_F1_MaELO3和p32UTMaELO3：含有来源于高山被孢霉菌的C16/18延长酶基因MaELO3。
质粒p32UTAtKCS：含有来源于拟南芥的延长酶基因AtKCS。
p32UTCraKCS：含有来源于海甘蓝的延长酶基因CraKCS。
质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS：同时含有来源于拟南芥的延长酶基因AtKCS和来源于海甘蓝的延长酶基因CraKCS。
质粒p32UTMaFAR和p69UTMaFAR:含有来源于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR。
质粒p32UTTaFAR和p69UTTaFAR:含有来源于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR。
质粒p32UTAbWS:含有来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS。
质粒p69UTMhWS_UTMaFAR：同时含有来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS和来源于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR。
质粒p69UTAbWS_UTMaFAR：同时含有来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS和来源于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR。
质粒p69UTMhWS_UTTaFAR：同时含有来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS和来源于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR。
质粒p69UTAbWS_UTTaFAR：同时含有来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS和来源于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR。
构建上述质粒的引物序列如表1所示。
表1质粒对的引物序列
Figure BDA0002662570600000061
Figure BDA0002662570600000071
以下实施例中涉及的延长酶基因AtKCS,CraKCS和MaELO3均指优化后的AtKCS,CraKCS和MaELO3基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示。
以下实施例中涉及的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR和TaFAR均指优化后的MaFAR和TaFAR基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示。
以下实施例中涉及的蜡酯合成酶基因MhWS和AbWS均指优化后的MhWS和AbWS基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示。
实施例1构建产超长链脂肪酸(VLCFAs)的解脂耶氏酵母基因工程菌
(1)分别构建启动子为UAS4B+TEF的延长酶基因AtKCS,CraKCS和MaELO3表达质粒p32UTAtKCS，p32UTCraKCS和p32UTMaELO3。
使用引物32UTAtKCS-f和32UTAtKCS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1～2所示)将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的延长酶基因AtKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTAtKCS。使用引物32UTCraKCS-f和32UTCraKCS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：3～4所示)将来源于海甘蓝(Crambe abyssinica)的延长酶基因CraKCS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTCraKCS。使用引物32UTMaELO3-f和32UTMaELO3-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：7～8所示)将来源于高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的C16/18延长酶基因MaELO3的优化序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO：25所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTMaELO3。其中，密码子优化过的AtKCS,CraKCS和MaELO3基因是通过分别将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，海甘蓝(Crambe abyssinica)和高山被孢霉菌(Mortierella alpine)的AtKCS,CraKCS和MMaELO3的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)构建同时含有启动子为UAS4B+TEF的延长酶基因AtKCS和CraKCS的表达质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS。
使用引物32UTAtKCS_CraKCS-f和32UTAtKCS_CraKCS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：5～6所示)将步骤(1)所得的质粒p32UTCraKCS的“UAS4B+TEF-CraKCS-T”表达盒片段通过EcoRI酶切位点构建到步骤(1)所得的质粒p32UTAtKCS中，获得质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS。
(3)基于已有的CRISPR/Cas9操作系统，构建含有启动子为UAS4B+TEF的优化的MaELO3基因的donor质粒pHR_F1_MaELO3。与sgRNA质粒pCRISPRyl_F1可以组成一对敲入质粒对。
本实施例中的敲入质粒对为本领域常规的重组载体，其中sgRNA质粒中含有亮氨酸筛选标记，donor质粒中含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶和亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母，该敲入质粒对能够敲入上述优化的MaELO3基因。
具体步骤如下：
使用引物F1_MaELO3-f和F1_MaELO3-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：9～10所示)将步骤(1)所得的质粒p32UTMaELO3的“UAS4B+TEF-MaELO3”片段通过酶切位点NheI和BssHII构建到质粒pHR_F1_hrGFP中，得到质粒pHR_F1_MaELO3。
(4)将步骤(3)中所得的质粒pHR_F1_MaELO3和sgRNA质粒pCRISPRyl_F1同时转化入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10中，将筛选标记进行回收后获得菌株GQ06，经验证，菌株GQ06中敲入MaELO3基因。其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
(5)将步骤(1)所得的质粒p32UTAtKCS通过使用NotI酶切位点将质粒单酶切线性化，将线性化p32UTAtKCS质粒转入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10中，获得菌株GQ03。其中，转化的方法与步骤(4)中转化的方法相同。
(6)将步骤(2)所得的质粒p32UTAtKCS_UTCraKCS通过使用NotI酶切位点将质粒单酶切线性化，将线性化p32UTAtKCS_UTCraKCS质粒分别转入解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10和步骤(4)所得的菌株GQ06中，获得菌株GQ05和GQ07。其中，转化的方法与步骤(4)中转化的方法相同。
实施例2解脂耶氏酵母基因工程菌产各链长脂肪酸比例的测定
将菌株解脂耶氏酵母Po1f、实施例1制备的菌株GQ03,GQ05,GQ07分别接种于2mLYPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。发酵培养3天后，提取脂肪酸，然后衍生为脂肪酸甲酯，使用GC(气相色谱)检测各脂肪酸甲酯的比例。
脂肪酸的提取：发酵结束后，取发酵液20mL至离心管内，4500rpm离心5分钟，用20mL去离子水重悬后洗涤两次。接着加入4M盐酸5mL重悬菌体，并将重悬的菌体转移至螺口离心管中。置于30℃摇床中震荡30分钟。取出后将混合液放入沸水浴中5分钟后立即取出置于冰上5分钟，此步骤再重复一次以完全破坏细胞。向其中加入7mL甲醇和14mL氯仿(体积比为1:2)混合液用来萃取油脂。将混合液放入30℃摇床中震荡30分钟。静置30分钟后吸取下层油脂萃取液到预先烘干并称重的圆底玻璃瓶中。使用水浴锅在70℃下旋转蒸发萃取液，最终得到油脂粗产品，将其转移至105℃的烘箱中进一步烘干至恒重。
由于脂肪酸不能用气相色谱法直接检测，因此首先需要将脂肪酸衍生为脂肪酸甲酯。将提取的油脂进一步衍生为脂肪酸甲酯的方法为：将之前提取的油脂溶于3mL、0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，超声使油脂溶解，放置于75℃的水浴锅中水浴20分钟。继续加入3mL14％三氯化硼溶液，75℃的水浴锅中水浴20分钟后取出。加入1mL饱和氯化钠溶液，再加入500μL正己烷，震荡1分钟后将所有溶液转移至10mL离心管中，6000rpm离心10分钟后，吸取上层正己烷层得到甲酯化的脂肪酸产物样品。将样品用正己烷稀释十倍后以5:1(样品：内标)的体积比与十七烷酸甲酯内标混合。用0.22μm的有机相滤膜过滤后用GC进行检测。
脂肪酸含量的测定：脂肪酸样品的测定使用气相色谱仪器检测(GC)。色谱柱为DB-5HT(30m T用气相色谱仪器检测(0.1μm)。起始柱温为150℃，保持2min，然后以20℃/min的升温速度升至180℃，接着又以4℃/min的升温速度升至215℃，保持1.5min，最后以20℃/min的升温速度升至300℃。进样量为1μL，检测器温度为200℃，进样口温度为280℃，分流比为20:1。
检测的结果参见表2以及图2。
表2不同菌株的脂肪酸比例
Figure BDA0002662570600000091
表2和图2的结果说明，菌株GQ03,GQ05和GQ07能生产超过C18链长的脂肪酸。其中GQ07工程菌与前两个工程菌相比，能生产比例更多的C22和C24链长的超长链脂肪酸。
实施例3构建产超长链蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌
(1)分别构建启动子为UAS4B+TEF的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR和TaFAR表达质粒p32UTMaFAR和p32UTTaFAR。
使用引物32UTMaFAR-f和32UTMaFAR-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：13～14所示)将来源于海杆菌(Marinobacter aquaeolei VT8 Maqu_2220)的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTMaFAR。使用引物32UTTaFAR-f和32UTTaFAR-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：15～16所示)将来源于来源于仓鸮(barn owl T.alba)的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTTaFAR。其中，密码子优化过的MaFAR和TaFAR基因是通过分别将来源于海杆菌(Marinobacter aquaeolei VT8 Maqu_2220)和仓鸮(barn owl T.alba)的MaFAR和TaFAR的核苷酸序列进行优化后得到。
(2)构建启动子为UAS4B+TEF的蜡酯合成酶基因AbWS表达质粒p32UTAbWS。
使用引物32UTAbWS-f和32UTAbWS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：11～12所示)将来源于不动杆菌(Acinetobacter baylyi ADP1)的蜡酯合成酶基因AbWS的优化序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示)通过酶切位点PmlI和BamHI构建到启动子为UAS4B+TEF的质粒p3204中，得到质粒p32UTAbWS。其中，密码子优化过的AbWS基因是通过将来源于不动杆菌(Acinetobacter baylyi ADP1)的蜡酯合成酶基因AbWS的核苷酸序列进行优化后得到。
(3)分别构建启动子为UAS4B+TEF的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR和TaFAR表达质粒p69UTMaFAR和p69UTTaFAR。
使用引物69UTMaFAR-f和69UTMaFAR-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：17～18所示)将步骤(1)中所得的质粒p32UTMaFAR的“UAS4B+TEF-MaFAR”片段构建到质粒pINA1269中，得到质粒p69UTMaFAR。
使用引物69UTTaFAR-f和69UTTaFAR-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：19～20所示)将将步骤(1)中所得的质粒p32UTTaFAR的“UAS4B+TEF-TaFAR”片段构建到质粒pINA1269中，得到质粒p69UTTaFAR。
(4)构建同时含有启动子为UAS4B+TEF的来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS和来源于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR的表达质粒p69UTMhWS_UTMaFAR和同时含有启动子为UAS4B+TEF的来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS和来源于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR的表达质粒p69UTMhWS_UTTaFAR。
方法是使用引物69UTFAR_UTWS-f和69UTFAR_UTWS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：21～22所示)将质粒p32UTMhWS的“UAS4B+TEF-MhWS-T”表达盒片段分别构建到步骤(3)所得的质粒p69UTMaFAR和p69UTTaFAR中。其中质粒p32UTMhWS含有来源于除烃海杆菌的蜡酯合成酶基因MhWS的优化序列(优化后的基因MhWS的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示)，分别获得质粒p69UTMhWS_UTMaFAR和质粒p69UTMhWS_UTTaFAR。
构建同时含有启动子为UAS4B+TEF的来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS和来源于海杆菌的脂肪酰辅酶A还原酶基因MaFAR的表达质粒p69UTAbWS_UTMaFAR和同时含有启动子为UAS4B+TEF的来源于不动杆菌的蜡酯合成酶基因AbWS和来源于仓鸮的脂肪酰辅酶A还原酶基因TaFAR的表达质粒p69UTAbWS_UTTaFAR。
方法是使用引物69UTFAR_UTWS-f和69UTFAR_UTWS-r(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO：21～22所示)将步骤(2)所得的质粒p32UTAbWS的“UAS4B+TEF-AbWS-T”表达盒片段分别构建到步骤(3)所得的质粒p69UTMaFAR和p69UTTaFAR中，分别获得质粒p69UTAbWS_UTMaFAR和质粒p69UTAbWS_UTTaFAR。
(5)基因工程菌WE01，WE02,WE03和WE04的构建。将步骤(4)所得的质粒p69UTMhWS_UTTaFAR,p69UTAbWS_UTTaFAR,p69UTMhWS_UTMaFAR,p69UTAbWS_UTMaFAR单酶切线性化，将线性化的质粒分别转入实施例2步骤(6)所得的解脂耶氏酵母工程菌GQ07中，获得菌株WE01，WE02,WE03和WE04。其中，转化的方法与实施例2步骤(4)中转化的方法相同。
实施例4测定菌株产蜡酯的产量
将实施例3制备的菌株WE01，WE02，WE03和WE04分别接种于2mLYPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养。发酵培养3天后，提取蜡酯使用GC(气相色谱仪)检测各蜡酯组分的含量。
蜡酯含量的测定：发酵结束后，从发酵液中提取得到解脂耶氏酵母工程菌中的总油脂。使用1mL正己烷将提取的油脂溶解，取200μl样品与1g/L内标C28:0蜡酯混合用0.22μm的有机相滤膜过滤后用GC进行检测。
色谱柱为DB-5HT。起始柱温为150℃，保持2min，然后以20℃/min的升温速度升至180℃，接着又以8℃/min的升温速度升至200℃，接着以1℃/min的升温速度升至218℃，最后以3.5℃/min的升温速度升至350℃并保持10min。进样量为1μL，检测器温度为200℃，进样口温度为280℃，分流比为20:1。
对蜡酯进行定量使用的标准品有C32:0蜡酯、C32:1蜡酯、C34:0蜡酯、C34:1蜡；0酯、C36:0蜡酯、C36:1蜡酯、C38:0蜡酯、C38:1蜡酯、C40:0蜡酯、C40:1蜡酯和C42:0蜡酯，内标为C28:0蜡酯。
测定蜡酯的结果如图3和表3所示。其中的WE01工程菌产量为417.2mg/L，生产的蜡酯链长以C38为主；WE02工程菌产量为647.8mg/L，生产的蜡酯链长以C32-C36为主；WE03和WE04工程菌产量分别为159.4mg/L和94.5mg/L，生产的蜡酯链长以C38-C42为主。
表3发酵生产蜡酯的结果
Figure BDA0002662570600000111
实施例5WE01菌株连续补料发酵培养
将筛选到的高产蜡酯的解脂耶氏酵母工程菌株WE01在5L发酵罐中进行连续补料发酵实验，本实验选用的培养基为2x YNB培养基(13.4g/L酵母基础氮源(缺乏氨基酸)，40g/L葡萄糖)，初始罐体积为2L。从甘油保种管中取出菌液在YPD固体平板上划线，将长起来的单克隆接种到两瓶各含有50mL YPD培养基的摇瓶中(在摇瓶中添加氨苄青霉素抗性和卡那霉素抗性以防染菌)，摇瓶置于30℃恒温摇床中220rpm过夜培养后，将处于指数生长期的细胞接种到发酵罐中。发酵罐的设定温度为30℃，通气量设置为2vvm，溶氧设置为20％，搅拌转速(300-1000rpm)与溶氧偶联，使用3M氢氧化钠或者3M盐酸调节酸碱度使其pH控制在5.5。在发酵12小时之后，将500g/L葡萄糖溶液以7g/h的速度流加入发酵罐中以维持发酵罐中的低糖浓度。在发酵过程中，每隔12h对发酵液进行取样，同时测定糖浓度，蜡酯以及菌体的生物量，结果如图4所示。测定48h，72h，96h和120h时蜡酯各组分比例结果如图5所示。
图4结果显示：在发酵的第4天，蜡酯的产量达到最大值2g/L。随后蜡酯产量不再继续增加，但菌体干重却继续增加并在12小时后达到最大值48g/L。图5结果显示：在发酵过程中生产的蜡酯的组分会随时间变化，特别是C38-C40链长的蜡酯从35.1％最终增加至58.1％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
<130> 201098
<141> 2020-09-02
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagtataaga atcattcaaa cacgtgatga cctccgtgaa cgt 43
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggggacagg ccatggaggt accggatcct taggatcggc cgt 43
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtataagaat cattcaaaca cgtgatgacc tctatcaacg tgaagct 47
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caggccatgg aggtaccgga tccttaagat cggccgttct gggct 45
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tagtctgcag cccaagctag cttatcgata agctagctta tcgatacgcg 50
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acacctcagc atgcacgcgt atcgatggac acgggcatct cacttgcgt 49
<210> 7
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtataagaat cattcaaaca cgtgatggag tctggcccca tgcccgc 47
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggccatgga ggtaccggat ccttactggg ccttcttctg ggc 43
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagaatacaa cgcctgccat actagtaagc tagcttatcg atacgcgt 48
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagcctgtg gaggacttca agcctagggg acacgggcat ctcact 46
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtataagaat cattcaaaca cgtgatgcga cccctgcacc ccatt 45
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggacaggcc atggaggtac cggatcctta gttggcggtc ttaatgt 47
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tataagaatc attcaaacac gtgatggcca tccagcaggt gc 42
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggccatgg aggtaccgga tccttaggcg gccttctttc g 41
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tataagaatc attcaaacac gtgatggtct ccatccccga gt 42
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggccatgg aggtaccgga tccttagtat cgcatggtgg agg 43
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggctctcaag ggcatcggtc gacaagcttt agtctgcagc ccaagctagc 50
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cttagtttcg ggttcccacg tgttaggcgg ccttctttcg ct 42
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggctctcaag ggcatcggtc gacaagcttt agtctgcagc ccaagctagc 50
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cttagtttcg ggttcccacg tgttagtatc gcatggtgga ggaggct 47
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgaaggctct caagggcatc ggtcgacaag cttaagctag cttatcgata cgcgtgc 57
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taagctagct tgggctgcag actaaagctt catctcactt gcgtatg 47
<210> 23
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgacctccg tgaacgtcaa gctgctgtac cgatacgtcc tgaccaactt cttcaacctg 60
tgcctgttcc ccctgaccgc cttcctggcc ggcaaggctt cccgactgac catcaacgac 120
ctgcacaact tcctgtccta cctccagcac aacctcatca ccgtcaccct cctgttcgcc 180
ttcaccgtct tcggcctcgt cctctacatc gtcacccgac ccaaccccgt ctaccttgtc 240
gactactcct gctacctgcc ccccccccac ctcaaggtct ccgtctccaa ggtcatggac 300
atcttctacc agatccgaaa ggccgacacc tcctcccgaa acgtcgcctg cgacgacccc 360
tcctccctgg acttcctccg aaagatccag gagcgatccg gcctcggcga tgagacctac 420
tcccccgagg gcctgatcca cgttcccccc cgaaagacct tcgccgcctc ccgagaggag 480
accgagaagg tcatcatcgg agccctcgag aacctgtttg agaacaccaa ggtcaacccc 540
cgagagatcg gcatcctcgt cgtcaactcc tccatgttca accccacccc ctccctgtcc 600
gctatggtcg tcaacacttt taagctgcga tccaacatca agtccttcaa cctcggcggc 660
atgggctgtt ccgccggcgt tatcgccatc gacctcgcca aggacctcct ccacgtccac 720
aagaacacct acgccctggt cgtctccacc gagaacatca cccagggcat ctacgctggc 780
gagaaccgat ccatgatggt ctccaactgc ctctttcgag ttggcggcgc cgccatcctg 840
ctgtccaaca agtccggcga ccgacgacga agcaagtaca agctggtcca cactgtgcga 900
acccacaccg gcgccgatga caagtccttc cgatgcgtcc agcaggagga tgacgagtcc 960
ggcaagatcg gcgtgtgcct gagcaaggac atcaccaacg tcgccggcac cactctgacc 1020
aagaacatcg ccaccctggg cccccttatt ctgcctctct ccgagaagtt tctgttcttc 1080
gccacctttg tcgccaagaa gctgctgaag gacaagatca agcattacta cgtccccgac 1140
ttcaagcttg ccgtcgatca cttctgcatc cacgccggcg gccgagccgt catcgacgag 1200
cttgagaaga acctgggact ctcccccatc gacgtcgagg cctcccgatc caccctgcac 1260
cgattcggca acacctcttc ctcctccatc tggtacgagc ttgcctacat cgaggccaag 1320
ggacgaatga agaagggcaa caaggcctgg cagatcgccc tcggctccgg cttcaagtgc 1380
aactcggccg tctgggtcgc cctgcgaaac gtcaaggcct ccgccaactc cccctggcag 1440
cactgcatcg accgataccc cgttaagatc gactccgacc tgtccaagtc caagacccac 1500
gtccagaacg gccgatccta a 1521
<210> 24
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgacctcta tcaacgtgaa gctgctgtac cactacgtga tcaccaacct gttcaacctg 60
tgcttcttcc ctctgaccgc catcgtggcc ggcaaggcct ctcgactgac catcgacgac 120
ctgcaccacc tgtactactc ttacctgcag cacaacgtga ttaccattgc tcctctgttc 180
gccttcaccg tgttcggctc tatcctgtac atcgtgaccc gacctaagcc tgtgtacctg 240
gtcgagtact cttgctacct gcctcctact cagtgccgat cttctatctc taaggtgatg 300
gacatcttct accaggtgcg aaaggctgac cccttccgaa acggaacctg cgacgactct 360
tcttggctgg acttcctgcg aaagatccaa gagcgatctg gcctgggcga cgagactcac 420
ggccccgagg gcctgctcca ggtgcctcct cgaaagacct tcgccgctgc tcgagaagag 480
actgagcagg tcatcgtggg cgccctgaag aacctgttcg agaacaccaa ggtgaacccc 540
aaggacatcg gcatcctggt ggtgaactct tctatgttca accccactcc ttctctgtct 600
gccatggtgg tcaacacctt caagctgcga tctaacgtgc gatctttcaa cctcggcggc 660
atgggctgct ctgccggcgt gatcgccatc gacctggcca aggacctgct gcacgtccac 720
aagaacacct acgctctggt ggtgtctacc gagaacatca cctacaacat ctacgccggc 780
gacaaccgat ctatgatggt gtctaactgc ctgttccgag tcggcggagc cgccatcctg 840
ctgtctaaca agccccgaga tcgacgacga tctaagtacg agctggtgca caccgtgcga 900
acccacaccg gcgctgacga caagtctttc cgatgcgtcc agcagggcga cgacgagaac 960
ggcaagaccg gcgtgtctct gtctaaggac atcaccgagg tggccggacg aaccgtgaag 1020
aagaacattg ccactctggg acccctgatt ctgcccctgt ctgagaagct cctgttcttc 1080
gtgaccttca tggccaagaa gctgttcaag gacaaggtga agcactacta cgtgcccgac 1140
tttaagctgg ctatcgacca cttctgcatc cacgctggcg gccgagccgt gatcgacgtg 1200
ctggaaaaga acctgggact cgctcccatt gacgtcgagg cttctcgatc taccctgcac 1260
cgattcggca acacctcttc ttcgtctatc tggtacgaac tggcctacat cgaggccaag 1320
ggccgaatga agaagggcaa caaggtctgg cagatcgccc tcggctctgg cttcaagtgc 1380
aactctgccg tgtgggtcgc cctgtctaac gtgaaggcct ctaccaactc tccctgggag 1440
cactgcattg atcgataccc cgtgaagatc gactctgact ctgccaagtc tgagactcga 1500
gcccagaacg gccgatctta a 1521
<210> 25
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atggagtctg gccccatgcc cgccggtatc cccttccctg agtactacga cttcttcatg 60
gactggaaga cccccctggc cattgccgcc acctacaccg ccgccgtcgg tcttttcaac 120
cccaaggtgg gcaaggtgtc ccgagtcgtc gccaagtctg ccaacgccaa gcccgccgag 180
cgaacccagt ccggtgccgc tatgaccgcc ttcgtgttcg tgcacaacct gattctgtgc 240
gtctactctg gtatcacctt ctactacatg ttccccgcca tggtcaagaa cttccgaacc 300
cacaccctgc acgaggccta ctgtgacacc gaccagtccc tgtggaacaa cgccctgggc 360
tactggggct acctgttcta cctgtccaag ttctacgagg tcatcgacac catcattatc 420
atcctgaagg gtcgacgatc ctccctgctg cagacctacc accacgccgg tgccatgatt 480
accatgtggt ctggcatcaa ctaccaggcc acccccattt ggatcttcgt cgtcttcaac 540
tctttcattc acaccatcat gtactgttac tacgccttca cctccattgg tttccacccc 600
cccggtaaaa agtacctgac ctctatgcag attacccagt tcctggtggg tatcaccatc 660
gccgtctcct acctgttcgt ccccggctgc attcgaaccc ccggtgccca gatggccgtc 720
tggatcaacg tcggttacct gttccccctg acctacctgt tcgtggactt cgccaagcga 780
acctactcta agcgatctgc catcgccgcc cagaagaagg cccagtaa 828
<210> 26
<211> 1542
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atggccatcc agcaggtgca ccacgccgac acctcctctt ctaaggtcct gggtcagctg 60
cgaggcaagc gagtgctgat taccggtacc accggtttcc tgggtaaggt cgtgctggag 120
cgactgattc gagccgtgcc cgacattggc gccatttacc tgctgattcg aggtaacaag 180
cgacaccccg acgcccgatc ccgattcctg gaggagatcg ccacctcttc cgtcttcgac 240
cgactgcgag aggccgactc cgagggcttc gacgccttcc tggaggagcg aatccactgc 300
gtcaccggtg aggtcaccga ggccggcttc ggcatcggtc aggaggacta ccgaaagctg 360
gccaccgagc tggacgccgt cattaactct gccgcctccg tcaacttccg agaggagctg 420
gacaaggccc tggccatcaa caccctgtgt ctgcgaaaca tcgccggcat ggtggacctg 480
aaccccaagc tggccgtgct gcaggtctcc acctgctacg tcaacggtat gaactccggc 540
caggtcaccg agtccgtcat caagcccgcc ggcgaggccg tgcctcgatc tcctgacggt 600
ttctacgaga tcgaggagct ggtgcgactg ctgcaggaca agatcgagga cgtccaggcc 660
cgatactccg gtaaggtcct ggagcgaaag ctggtggacc tgggtatccg agaggccaac 720
cgatacggct ggtccgacac ctacaccttc accaagtggc tgggcgagca gctgctgatg 780
aaggccctga acggccgaac cctgaccatc ctgcgaccct ctatcattga gtctgccctg 840
gaggagcccg cccccggttg gattgagggt gtgaaggtgg ccgacgccat tattctggcc 900
tacgcccgag agaaggtgac cctgttcccc ggtaagcgat ccggtatcat tgacgtcatc 960
cccgtggacc tggtggccaa ctccattatt ctgtctctgg ccgaggccct gggcgagcct 1020
ggtcgacgac gaatttacca gtgctgctct ggcggcggca accccatttc cctgggcgag 1080
ttcattgacc acctgatggc cgagtccaag gccaactacg ccgcctacga ccacctgttc 1140
taccgacagc cctccaagcc cttcctggcc gtgaaccgag ccctgttcga cctggtcatc 1200
tccggcgtcc gactgcccct gtctctgacc gaccgagtcc tgaagctgct gggcaactct 1260
cgagacctga agatgctgcg aaacctggac accacccagt ctctggccac cattttcggt 1320
ttctacaccg cccccgacta catcttccga aacgacgagc tgatggccct ggccaaccga 1380
atgggtgagg tggacaaggg tctgttcccc gtcgacgccc gactgatcga ctgggagctg 1440
tacctgcgaa agatccacct ggccggcctg aaccgatacg ccctgaagga gcgaaaggtg 1500
tactctctga agaccgcccg acagcgaaag aaggccgcct aa 1542
<210> 27
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atggtctcca tccccgagta ctacgagggt aagaacattc tgctgaccgg tgccaccggc 60
ttcatgggta aggtgctgct ggagaagctg ctgcgatcct gtcccaaggt gaaggccgtc 120
tacgtcctgg tgcgacacaa ggccggccag acccccgagg ctcgaatcga ggagatcacc 180
aactgcaagc tgttcgaccg actgcgagac gagcagcccg acttcaaggc caagatcatc 240
gtcattacct ccgagctgac ccagcccgag ctggacctgt ctgagcccat caaggagaag 300
ctgattgagc gaattaacat tatcttccac tgcgccgcca ccgtgcgatt caacgagacc 360
ctgcgagacg ccgtgcagct gaacgtgacc gccacccagc agctgctgtt cctggcccag 420
cgaatgaaga acctggaggt cttcatgcac gtgtctaccg cctacgccta ctgcaaccga 480
aagcagatcg aggagattgt ctaccccccc cccgtggacc ccaagaagct gattgactcc 540
ctggagtgga tggacgacgg tctggtgaac gacatcaccc ccaagctgat tggtgaccga 600
cccaacacct acacctacac caaggccctg gccgagtacg tggtccagca ggagggtgcc 660
aagctgaaca ccgccatcat tcgaccctcc attgtcggcg cctcttggaa ggagcccttc 720
cccggctgga tcgacaactt caacggtccc tccggtctgt tcattgccgc cggtaagggc 780
attctgcgaa ccatgcgagc ctctaactcc gccgtggccg acctggtccc cgtggatgtg 840
gtcgtcaaca ccaccctggc cgccgcctgg tactctggcg tgaaccgacc ccgaaacgtc 900
atgatttaca actgcaccac cggcggtacc aaccccttcc actggggcga ggtcggctac 960
cacattaacc tgaacttcaa gattaacccc ctggagaacg ccgtgcgaca ccccaactgt 1020
tctctgcagt ccaaccccct gctgcaccag tactggaccg ccgtctccca caccatgccc 1080
gccttcctgc tggacctgct gctgcgactg accggtcaca agccctggat gatgaagacc 1140
attacccgac tgcacaaggc catgatgctg ctggagtact tcacctccaa ctcctggatt 1200
tggaacaccg agaacatgac catgctgatg aaccagctga accccgagga caagaagacc 1260
ttcaacttcg acgtccgaca gctgcactgg gccgagtaca tggagaacta ctgcatgggt 1320
accaagaagt acgtcctgaa cgaggagatg tctggcctgc ccgccgcccg aaagcacctg 1380
aacaagctgc gaaacatccg atacggtttc aacaccgtgc tggtgatcct gatttggcga 1440
atcttcatcg cccgatccca gatggcccga aacatttggt acttcgtcgt ctctctgtgt 1500
tacaagttcc tgtcctactt ccgagcctcc tccaccatgc gatactaa 1548
<210> 28
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgaagcgac tgggcaccct tgacgcttct tggctcgccg tggagtctga ggacactcct 60
atgcacgtcg gtactctcca gattttctct ctgcctgagg gcgcccccga gactttcctg 120
cgagacatgg ttactcgcat gaaagaagcc ggagacgttg ctcctccttg gggatacaag 180
ctggcttggt ccggattcct cggtcgagtt attgctcccg cttggaaggt ggacaaggac 240
attgaccttg actaccacgt tcgacactcc gctctgcctc gacctggtgg tgagcgagag 300
ctgggtattc ttgtgtctcg actgcactcc aaccctctgg acttctctcg acctctttgg 360
gagtgccacg tcattgaggg tctggagaac aaccgattcg ctctgtacac caagatgcac 420
cactccatga ttgacggtat ttccggcgtt cgacttatgc agcgagtgct tactactgac 480
cctgagcgat gcaacatgcc tcccccttgg accgtgcgac cccaccagcg acgaggtgct 540
aagactgaca aggaagcctc tgttcccgcc gccgtgtccc aggctatgga cgctctcaag 600
ctccaggctg acatggcccc tcgactgtgg caggccggaa accgactcgt ccactccgtg 660
cgacaccccg aggacggtct taccgctcct ttcactggtc ccgtgtctgt gcttaaccac 720
cgagttaccg cccagcgacg attcgctact cagcactacc agcttgaccg attgaaaaac 780
ctcgctcacg cttccggcgg atctctcaac gacattgttc tttacctttg cggaactgcc 840
cttcgacgat tccttgctga gcagaacaac ctgcctgaca ctcccctcac cgccggcatc 900
cccgtgaaca tccgacctgc tgacgacgag ggaactggca cgcagatttc tttcatgatc 960
gcttccctgg ctactgacga ggctgacccc ctcaaccgac ttcagcagat caagacttct 1020
actcgacgag ccaaagaaca ccttcagaag ctgcctaagt ccgctctcac ccagtacact 1080
atgctgctta tgtctcccta catccttcag ctgatgtccg gcctcggcgg tcgaatgcga 1140
cctgtgttca acgtcactat ttctaacgtt cccggtcctg agggaactct gtactacgag 1200
ggcgcccgac ttgaggccat gtaccccgtg tctctcatcg cccacggcgg cgcccttaac 1260
attacttgcc tgtcctacgc cggatctctt aacttcggtt tcaccggttg ccgagacacc 1320
ctgccttcta tgcagaagct ggccgtttac actggtgagg ctctggacga gctggagtct 1380
cttatcctgc ctcctaagaa gcgagcccga gcccgaaag 1419
<210> 29
<211> 1377
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgcgacccc tgcaccccat tgacttcatt ttcctgtccc tggagaagcg acagcagccc 60
atgcacgtcg gcggtctgtt cctgttccag attcccgaca acgcccccga caccttcatt 120
caggacctgg tcaacgacat ccgaatctcc aagtccatcc ccgtcccccc cttcaacaac 180
aagctgaacg gcctgttctg ggacgaggac gaggagttcg acctggacca ccacttccga 240
cacattgccc tgccccaccc cggccgaatc cgagagctgc tgatctacat ttcccaggag 300
cactccaccc tgctggaccg agccaagccc ctgtggacct gtaacatcat tgagggcatt 360
gagggtaacc gattcgccat gtacttcaag attcaccacg ccatggtgga cggcgtcgcc 420
ggtatgcgac tgatcgagaa gtccctgtcc cacgacgtga ccgagaagtc tatcgtgccc 480
ccctggtgcg tcgagggcaa gcgagctaag cgactgcgag agcccaagac cggtaagatt 540
aagaagatca tgtccggtat caagtcccag ctgcaggcca cccccaccgt gatccaggag 600
ctgtctcaga ccgtcttcaa ggacattggc cgaaaccccg accacgtctc ctccttccag 660
gccccctgtt ccattctgaa ccagcgagtc tcttcttccc gacgattcgc cgcccagtct 720
ttcgacctgg atcgattccg aaacattgcc aagtccctga acgtgaccat taacgacgtg 780
gtcctggccg tctgctccgg tgccctgcga gcttacctga tgtcccacaa ctctctgccc 840
tctaagcccc tgatcgccat ggtccccgcc tccatccgaa acgacgactc cgacgtgtcc 900
aaccgaatta ccatgatcct ggccaacctg gccacccaca aggacgaccc cctgcagcga 960
ctggagatta tccgacgatc cgtccagaac tctaagcagc gattcaagcg aatgacctct 1020
gaccagattc tgaactactc tgccgtcgtc tacggtcccg ccggtctgaa catcatttct 1080
ggtatgatgc ccaagcgaca ggccttcaac ctggtcatct ctaacgtccc cggcccccga 1140
gagcccctgt actggaacgg cgccaagctg gacgccctgt accccgcttc catcgtcctg 1200
gacggtcagg ccctgaacat caccatgacc tcctacctgg acaagctgga ggtcggtctg 1260
attgcctgtc gaaacgccct gccccgaatg cagaacctgc tgacccacct ggaggaggag 1320
atccagctgt tcgagggtgt gattgccaag caggaggaca ttaagaccgc caactaa 1377

Claims (9)

1.一种产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是将AtKCS基因，CraKCS基因和MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中构建获得，所述AtKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；所述CraKCS基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:24所示；所述MaELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
2.如权利要求1所述的产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是先将MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母GQ06工程菌；再将AtKCS基因和CraKCS基因敲入解脂耶氏酵母GQ06工程菌中构建获得解脂耶氏酵母GQ07工程菌。
3.如权利要求1所述的产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母是参见Gao,Q.,Cao,X.,Huang,Y.Y.,Yang,J.L.,Chen,J.,Wei,L.J.,and Hua,Q.2018.Overproduction of Fatty Acid Ethyl Esters by theOleaginous Yeast Yarrowia lipolytica through Metabolic Engineering andProcess Optimization,ACS synthetic biology 7,1371-1380所记载的制备方法制得。
4.一种产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是将AtKCS基因,CraKCS基因和MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，再敲入TaFAR基因和MhWS基因构建而成；或者，
再敲入MaFAR基因和MhWS基因构建而成；或者，
再敲入MaFAR基因和AbWS基因构建而成；或者，
再敲入TaFAR基因和AbWS基因构建而成；
所述AtKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；所述CraKCS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述MaELO3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；所述MaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；所述TaFAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；所述MhWS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述AbWS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。
5.如权利要求4所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其是先将MaELO3基因敲入已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母的染色体中，构建获得解脂耶氏酵母GQ06工程菌；再将AtKCS基因和CraKCS基因敲入解脂耶氏酵母GQ06工程菌中构建获得解脂耶氏酵母GQ07工程菌；然后，再将TaFAR基因和MhWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌中，构建而成WE01；或者，
然后，再将MaFAR基因和MhWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE03；或者，
再将MaFAR基因和AbWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE04；或者，
再将TaFAR基因和AbWS基因敲入解脂耶氏酵母GQ07工程菌，构建获得WE02。
6.如权利要求4或5所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述已敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母为敲除PEX10基因的解脂耶氏酵母Po1f-ΔPEX10。
7.一种如权利要求1-3任一项所述的产超长链脂肪酸的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备超长链脂肪酸中的应用。
8.一种如权利要求4-6任一项所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌在制备蜡酯中的应用。
9.一种蜡酯的生产方法，其特征在于，通过发酵生产权利要求4-6任一项所述的产蜡酯的解脂耶氏酵母基因工程菌获得蜡酯。
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