CN103014037B - 一种提高集胞藻pcc6803脂肪酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下：（1）PCR扩增psbA2启动子、花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1；（2）经融合PCR，Promotor+AhFatA和Promotor+AhFatB1；（3）经融合PCR扩增，制得Promotor+AhFatA+AhFatB1；（4）插入质粒中，制得重组载体；（5）经转化制得转基因集胞藻；（6）在30℃条件下培养，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。本发明所述方法获得的转基因集胞藻在30℃混养条件下转AhFatA基因阳性集胞藻PCC6803的亚油酸含量明显增加，具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含有两个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。是构成高等动、植物细胞的重要成分之一，对人体具有重要的生理功能。在营养学和医学领域有着重要作用。目前市场上的多不饱和脂肪酸的主要来源是深海鱼类，但从鱼体内提取的PUFA具有较重的鱼腥味，且鱼油资源有限，价格昂贵，存在潜在的污染问题及因过度捕杀致使全球鱼类数量下降，影响海洋生物的多样化并造成沿岸生态系统的破坏，进而影响生态可持续发展。
蓝藻(cyanobacteria)是一类能进行光合作用的原核生物，蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.strain PCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。野生型集胞藻PCC 6803中亚油酸（LA）占54.5%，γ-亚麻酸（GLA）占27.3%，这为通过转化外源脂肪酸脱饱和酶基因进而增加集胞藻PCC 6803中多不饱和脂肪酸含量的研究提供了基础。
植物中脂酰-酰基载体蛋白硫脂酶（Acyl-Acyl Carrier Protein thioesterases,FAT）是游离脂肪酸合成的关键酶，能催化Acyl-ACPs脱去ACP，产生游离脂肪酸。对于植物脂肪酸的链长和饱和性有重要作用。植物Fat按其序列高同源性和底物偏好主要分为FatA和FatB1两个基因家族，不同FAT对底物的选择不同，这种底物的特异性直接导致了植物油脂储存在组成上和数量上的差异。其中FatA基因家族的酶主要对油酰-ACP（18:1-ACP）有活性，决定着植物体内18:1输出到质体外的水平。在大多数植物中，FatB1基因家族主要倾向于生成饱和的acyl-ACP脂酰碳链，如对棕桐酰-ACP(16:0-ACP)、硬脂酰-ACP(18:0-ACP)有活性，单非饱和的油酰-ACP(18:l-ACP)也有少量的活性。
目前已从向日葵（Helianthus annuus）、油菜（Brassica napus）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）、蓖麻（Ricinus communis）、山竹（Garcinia mangsotana）、小麦（Triticum aestivum）、葡萄（Vitis vinifera）等多种植物中获得FatA基因片段。FatB1基因也已在在加利福尼亚月桂树（Umbellularia californica）、萼苣花（Cuphea hookeriana）、油菜（Brassica napus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、山竹（Garcinia mangostana）、玉米（Zea mays）、毛白杨（Populustomentosa）等植物种子中获得，但国内外在目前的现有技术中对硫脂酶基因的研究很少，在花生中虽有硫脂酶基因的克隆，但是还没有硫脂酶基因功能研究的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。
本发明的技术方案如下：
一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下：
（1）PCR扩增集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA2ORF基因片段、Genbank登录号为GU324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登录号为GU324447的花生硫脂酶基因AhFatB1；
（2）将步骤（1）获得的psbA2启动子基因片段分别与步骤（1）制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+AhFatA和基因片段Promotor+AhFatB1；
（3）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1经融合PCR扩增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1；
（4）将步骤（1）获得的psbA2ORF基因片段经SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的pBluescriptIISK plus T1T2连接，得到质粒pBluescriptIISK plus T1T2-downstream；
分别对质粒pBluescript II SK plus T1T2-downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescriptIISK plus T1T2-downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript II SK plusT1T2-npt-downstream；
（5）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatB1或者步骤（3）制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1插入步骤（4）制得的质粒pBluescriptII SK plus T1T2-npt-downstream中，制得重组载体；
（6）将步骤（5）制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；
（7）将步骤（6）制得的转基因集胞藻在20～30℃条件下通气培养8～12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增psbA2启动子基因片段的引物为：
Promotor-F:5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803psbA2ORF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为：
psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；
psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增花生硫脂酶基因AhFatA的引物为：
AhFatA-F：5’-GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’；
AhFatA-R：5’-GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，PCR扩增花生硫脂酶基因AhFatB1的引物为：
AhFatB1-F：5’-GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’；
AhFatB1-R：5’-CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中花生硫脂酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，花生硫脂酶基因AhFatB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，融合基因AhFatA+AhFatB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
根据本发明优选的，所述步骤（4）中质粒pBluescript II SK plus T1T2采用如下方法制备：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’—ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’；
T1T2-R：5’—TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript II SK plus连接，得到质粒pBluescript II SK plus T1T2。
根据登陆Genbank的两类花生硫脂酶基因序列（AhFatA：GU324446；AhFatB1：GU324447），通过RT-PCR方法，扩增两类花生硫脂酶基因编码区全长序列，其中AhFatA基因信使RNA序列为1119个碱基，编码372个氨基酸（序列如SEQ ID NO.3所示），AhFatB1基因信使RNA序列为1242个碱基，编码413氨基酸（序列如SEQ ID NO.4，Arachis hypogaeaL.所示）。
有益效果
（1）本发明所述方法在集胞藻PCC6803中表达花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1及两类基因的融合基因（AhFatA+AhFatB1），通过转基因方法增加脂酰-酰基载体蛋白硫脂酶基因的表达。
（2）本发明所述方法获得的转基因集胞藻在30℃混养条件下转AhFatA基因阳性集胞藻PCC6803的亚油酸含量增加了24.6%，α-亚麻酸含量增加了18.8%；转AhFatB1基因阳性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了116.8%，α-亚麻酸含量增加了56.2%；转AhFatA+AhFatB1基因阳性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了211.8%，α-亚麻酸含量增加了19.9%，十八碳四烯酸含量则增加了11.6%。
（3）本发明所述方法获得的转基因集胞藻在20℃混养条件下转AhFatA基因阳性集胞藻PCC6803的α-亚麻酸和十八碳四烯酸含量分别增加了49.2%和34.8%；转AhFatB1基因阳性集胞藻PCC6803的棕榈油酸和γ-亚麻酸酸含量分别增加了53.8%和57.3%；转AhFatA+AhFatB1基因阳性集胞藻PCC6803的油酸和α-亚麻酸含量分别增加了42.5%和19.0%。
（4）本发明所述方法获得的转基因集胞藻具有较强的低温耐受性。
（5）本发明首次在集胞藻PCC6803中表达硫脂酶基因，为对于提高集胞藻PCC6803总脂肪酸含量、增强其生物量具有重要意义，这为集胞藻PCC6803中多不饱和脂肪酸的研究提供了理论支持。
附图说明
图1为花生硫脂酶基因转集胞藻同源重组载体结构图；
其中：A、表达载体pSDFatA，B、表达载体pSDFatB1，C、表达载体pSDFatA+FatB1；
图2为30℃混养条件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表达量柱状图；
图3为20℃混养条件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表达量柱状图；
图4为AhFatA基因在集胞藻PCC6803中表达的Western blot分析；
其中：1、野生型集胞藻PCC6803；2、含表达载体pSDFatA的转基因集胞藻PCC6803；3、含表达载体pSDFatA+FatB1的转基因集胞藻PCC6803。
图5为AhFatB1基因在集胞藻PCC6803中表达的Western blot分析；
1：野生型集胞藻PCC6803；2：含表达载体pSDFatB1的转基因集胞藻PCC6803；3：含表达载体pSDFatA+FatB1的转基因集胞藻PCC6803。
图6为30℃混养条件下转硫脂酶基因对集胞藻生长的影响；
图7为20℃混养条件下转硫脂酶基因对集胞藻生长的影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实验材料来源：
大肠杆菌菌株（Escherichia coli）DH5α及T3载体购自北京全式金生物技术有限公司；
野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；
质粒pKK233-2购自Clontech公司；
质粒pBluescript II SK plus购自天津博美科生物技术有限公司；
质粒PUC4k购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；
其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。
实施例1
分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803表达载体的花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatB1和融合基因AhFatA+AhFatB1的cDNA片段及同源重组片段psbA2ORF cDNA片段。
集胞藻PCC6803psbA2ORF基因片段克隆：
根据GenBank登陆的集胞藻PCC6803（登录号：BA000022，AP012205，序列如SEQ ID NO.7，Synchocystis sp.PCC6803所示）中psbA2ORF cDNA序列设计引物：
psbA2-F：5’-CTTGCGGCCGCCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’，
psbA2-R：5’AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’，
扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后；72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC6803psbA2ORF基因片段。
集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段克隆：
根据GenBank登陆的集胞藻PCC 6803（登录号：BA000022，AP012205）中psbA2ORF前端序列设计引物，将psbA2ORF前500bp作为启动子序列（序列如SEQ ID NO.6，Synchocystis sp.PCC6803所示），设计PCR引物：
Promotor-F:5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’，
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC 6803的psbA2启动子基因片段。
大肠杆菌T1T2终止子片段克隆：
根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2（U02439.1）片段序列（序列如SEQ ID NO：8，）设计引物：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
基因片段Promotor+AhFatA克隆：
根据GenBank数据库中公布的花生FatA序列（登录号为：GU324446）设计扩增引物，所用引物为：
AhFatA-F：5’-GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’；
AhFatA-R：5’-GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得花生硫脂酶基因AhFatA。
分别取psbA2启动子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatA各2μl为模板，进行融合PCR反应，程序为：94℃5min，(94℃1min，55℃1min，72℃5min)2cycles，加入引物Promotor-F和AhFatA-R各0.5μl，进行如下程序：(94℃30s，55℃30s，72℃3min)25cycles，72℃10min，4℃保存。将扩增后的产物连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+AhFatA。
基因片段Promotor+AhFatB1克隆：
根据GenBank数据库中公布的花生FatB1序列（登录号为：GU324447，GU324448，EF117308，EF117305，EF117306，EF117309，EF117307）设计扩增引物，所用引物为：
AhFatB1-F：5’-GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTA CTGCT-3’；
AhFatB1-R：5’-CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得花生硫脂酶基因AhFatBl。
分别取psbA2启动子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatB1各2μl为模板，进行融合PCR反应，所用程序为：94℃5min，（94℃1min，55℃1min，72℃5min）2cycles，加入引物Promotor-F和AhFatB1-R各0.5μl，进行如下程序：（94℃30s，55℃30s，72℃3min）25cycles，72℃10min，4℃保存。将扩增后的产物连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得基因片段Promotor+AhFatB1。
基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1克隆：
分别取上述获得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1各2μl为模板，进行融合PCR反应，所用程序为：94℃5min，(94℃1min，60℃1min，72℃5min)2cycles，加入引物Promotor-F和AhFatB1-R各0.5μl，进行如下程序：(94℃30s，60℃30s，72℃3min)25cycles，72℃10min，4℃保存。将扩增后的产物连接到T3载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序，获得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1。
实施例2
转集胞藻PCC6803表达载体的构建及转化
为更好地研究花生硫脂酶基因的功能，本发明人通过过表达技术使花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1在集胞藻PCC6803中表达，根据转基因阳性集胞藻的表型和脂肪酸组成研究该花生硫脂酶基因的功能。
质粒pBluscript SK plus T1T2的制备：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluscript SK plus连接，得到质粒pBluscript SK plus T1T2。
转集胞藻PCC6803表达载体的构建方法如下：
将实施例1制得的psbA2ORF阳性克隆（含psbA2ORF cDNA片段）用SacII和SacI双酶切，回收psbA2ORF cDNA片段；用同样的方法双酶切质粒pBluescript II SK plus T1T2回收载体片段1。用回收的psbA2ORF cDNA片段和载体片段1做连接反应，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript II SK plus T1T2-downstream。
将质粒PUC4k用BamHI单酶切，回收卡那霉素抗性npt片段，质粒pBluescript II SKplus T1T2-downstream用BamHI单酶切，回收载体片段2。用回收的npt片段和载体片段2做连接反应，转化大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆，获得卡那霉素抗性载体，命名为pBluescript II SK plus T1T2-npt-downstream。
将实施例1中得到的阳性克隆Promotor+AhFatA、Promotor+AhFatB1、Promotor+AhFatA+AhFatB1质粒DNA分别用SalI酶切，回收基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatB1和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1。同样，对含有T1T2终止子且具有卡那霉素抗性的质粒pBluescript II SK plus T1T2npt-downstream进行SalI单酶切，回收载体片段3。分别将基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatB1和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1和载体片段3做连接反应，转化大肠杆菌DH5α。通过酶切筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803原核表达载体，分别命名为表达载体pSDFatA（见图1A）、表达载体pSDFatB1（见图1B）、表达载体pSDFatA+FatB1（见图1C）。
通过自然转化方法（Williams,J.G.K.(1988)Construction of specific mutations inphotosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods inSynechocystis 6803.Methods Enzymol.167:766-778.）将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻。
具体步骤：取对数培养期（OD730＝0.6）的集胞藻PCC680330ml于室温，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11洗涤一次后，加新鲜BG-11至终浓度OD730＝4.8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1.5ml EP管中（每管400μl），每管加5-10μg质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那抗生素（12μg/ml）的BG-11平板上。约10天可见转化子。制得含表达载体pSDFatA的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDFatB1的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDFatA+FatB1的转基因集胞藻PCC6803。
实施例3
转基因集胞藻阳性植株中花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatB1和AhFatA+AhFatB1基因表达量水平检测
以含表达载体pSDFatA、pSDFatB1、pSDFatA+FatB1的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总RNA进行Real time quantitative PCR分析。
具体操作步骤如下：取50ml OD＝1.8的蓝藻，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，液氮中研磨至细粉面状后加入1.5ml离心管中，迅速加入1ml TRIZOL（Invitrogen），颠倒混匀，室温静置5min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入200μl三氯甲烷，用手剧烈震荡15s，静置3-5min，4℃，11900rpm离心10-15min。取上清到新的1.5ml离心管中，加入500ml异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。4℃，11900rpm离心10min。去上清，加入1ml 75%乙醇，颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心10min。弃上清，室温下敞口晾干至沉淀透明。加入适量DEPC-H2O溶解沉淀。
以上述制得的含表达载体pSDFatA的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDFatB1的转基因集胞藻PCC6803、含表达载体pSDFatA+FatB1的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803总RNA为模板，用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录成cDNA。
具体操作步骤如下：依次加入1μl Oligo dT Primers(2.5μM)、1μl dNTP Mixture(10mM)、2μg总RNA和DEPC-H2O至10μl。于PCR仪上65℃，5min进行变性退火反应。离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于离心管底部。依次加入4μl 5×PrimeScript Buffer、0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl)、0.5μl PrimeScript RNase(for 2step)和5μl RNase Free ddH2O。42℃，30min后95℃5min。即已获得第一链cDNA。以获得的第一链cDNA为模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因为内参基因，以TaKaTa公司PrimeScript RT reagent Kit（Perfect RealTime）进行Real-time quantitative PCR检测。其中集胞藻PCC6803rnpB内参基引物序列为：
上游引物P1：5’-GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3’；
下游引物P2：5’-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3’；
AhFatA基因的Real-time quantitative PCR引物序列为：
上游引物P3：5’-AGGCCTCATATGGGTCACTG-3’；
下游引物P4：5’-TGACTTGATCGGTCGCATAG-3’；
AhFatB1基因的Real-time quantitative PCR引物序列为：
上游引物P5：5’-GCAGCCAATCTTGGAGAGTC-3’；
下游引物P6：5’-TCAGCACCATCTTCAAGTCG-3’。
Real-time quantitative PCR具体操作步骤如下：依次加入12.5μl 2×SYBR premix Ex Taq（TM）、上下游引物各1.0μl、cDNA模板2.0μl和8.5μl ddH2O。95℃预变性1min。95℃10s，60℃30s，72℃30s，42个循环。95℃10s，58℃30s，72℃5min。55℃1s，81个循环，每隔0.5s检测一次。
实施例4
转基因集胞藻阳性植株中AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1蛋白水平检测
以转化AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1基因的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取藻总蛋白，利用Western blot方法检测转基因阳性集胞藻种AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1蛋白质水平。具体方法如下：
取自养生长的藻细胞离心收集后用5mL40mM的Tris-Cl（pH8.0）悬浮，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠（购自Sigma公司）至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以最大速率震荡1min，然后置于冰上1min，如此重复5次。在4000rpm低速离心10min收集上清，再将所收集的上清用较高转速6000rpm进行离心10min，收集上清。即得到藻细胞总蛋白。取适量样品，加等体积的2×BSA，沸水中煮10分钟。离心后放-20℃存放。取少量样品，稀释一定倍数（5×、10×、20×），以40mM Tris-Cl(pH8.0)为参照空白，测蛋白质浓度。利用10%SDS-PAGE进行蛋白质电泳，每个上样孔50μg蛋白。电泳结束后，通过印记法转移到PVDF膜。然后按照何庆芳等人的方法进行免疫化学分析，检测AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1蛋白质水平（Qingfang He等，Eur.J.Bilchem.，1999，263,561-570）。结果表明，转基因集胞藻中，均检测出AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1蛋白质水平，而野生型中则没有信号，见图4，图5。
实施例5
转基因集胞藻阳性植株中脂肪酸成分分析
在30℃，30μE.m-2.s-1持续光照下，取转基因集胞藻和野生型集胞藻，离心后收集菌体，40℃干燥，经甲酯化后进行气象色谱分析；具体步骤如下：
（1）称取适量样品于厌氧培养管中。
（2）加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰:甲醇＝1:10（体积比）。
（3）精确加入1mL含有C19:0内标的正己烷溶液。内标浓度为1mg/mL。
（4）盖紧管盖，80℃水浴两小时。取出冷却至室温。
（5）加入7％的碳酸钾溶液5mL，振荡均匀，静置10min，1,000rpm离心5min分层。
（6）吸取上层液相，由中国农大农业部饲料研究中心进行气相色谱分析。
与对照野生型集胞藻PCC6803相比，在30℃混养条件下转基因集胞藻PCC6803pSDFatA、pSDFatB1、pSDFatA+FatB1脂肪酸含量变化如表1所示，20℃混养条件下转基因集胞藻PCC6803pSDFatA、pSDFatB1、pSDFatA+FatB1脂肪酸含量变化如表2所示。
表1
表2
结果分析
在集胞藻PCC6803中，通过转基因方法增加脂酰-酰基载体蛋白硫脂酶基因的表达后，发现在集胞藻PCC6803中表达AhFatA基因显著提高了C16:1和C18:0的含量。由表1可以看出，在30℃混养条件下，与野生型对照相比，C16:1和C18:0含量分别增加了73.7%和72.5%，C18:2的含量也增加了24.6%；在20℃混养条件下，与野生型对照相比C16:1和C18:0的含量分别增加了12.7%和22.7%，而在该温度下，C14:0和C18:1含量也得到明显增加，分别增加了50.4%和111.3%。在30℃混养条件下，与野生型对照相比，在集胞藻PCC6803中表达AhFatB1基因则显著提高了C16:1、C18:0和C18:3n3的含量，分别增加了29.5%、116.8%和56.2%；
由表2可以看出，在20℃混养条件下，与野生型对照相比，在集胞藻PCC6803中表达AhFatB1基因则显著提高了C14:0、C16:1和C18:3n6的含量，分别增加了34.1%、53.8%和57.3%。在集胞藻PCC6803中共表达AhFatA+AhFatB1基因增加了C18:0和C18:3n3含量，在30℃混养条件下，与野生型对照相比，C18:0和C18:3n3含量分别增加了211.8%和19.9%；而在20℃混养条件下，与野生型对照相比，则分别增加了10.0%和19.0%，在该温度下还使C18:1显著增加了42.5%。
由图6可以看出，在30℃混养条件下，转花生硫脂酶AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1基因的集胞藻PCC6803，其生长速率与野生型对照相同。而在20℃混养条件下，转花生硫脂酶AhFatA、AhFatB1和AhFatA+AhFatB1基因的集胞藻PCC6803，其生长速率则明显高于野生型对照（图7），说明转花生硫酯酶基因提高了集胞藻PCC6803对低温的耐受性。
Claims (2)
1.一种提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步骤如下：
（1）PCR扩增集胞藻 PCC 6803的psbA2 启动子基因片段、集胞藻 PCC 6803的psbA2 ORF基因片段、Genbank登录号为GU324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登录号为GU324447的花生硫脂酶基因AhFatB1；
（2）将步骤（1）获得的psbA2 启动子基因片段分别与步骤（1）制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1进行融合PCR扩增，分别制得基因片段Promotor+AhFatA和基因片段Promotor+ AhFatB1；
（3）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB1经融合PCR扩增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1；
（4）将步骤（1）获得的psbA2 ORF基因片段经SacII和SacI双酶切后与经相同酶切的pBluescript II SK plus T1T2连接，得到质粒pBluescript II SK plus T1T2-downstream；
分别对质粒pBluescript II SK plus T1T2-downstream和质粒pUC4K进行BamHI单酶切，电泳后分别回收pBluescript II SK plus T1T2-downstream载体片段和pUC4K中的npt片段，对载体片段去磷酸化后与npt片段连接，得到质粒pBluescript II SK plus T1T2-npt-downstream；
（5）将步骤（2）制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatB1或者步骤（3）制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB1插入步骤（4）制得的质粒pBluescript II SK plus T1T2-npt-downstream中，制得重组载体；
（6）将步骤（5）制得的重组载体转化至集胞藻PCC6803中，制得转基因集胞藻；
（7）将步骤（6）制得的转基因集胞藻在20～30℃条件下通气培养8～12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803；
所述步骤（1）中，PCR扩增psbA2 启动子基因片段的引物为：
Promotor-F: 5’-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’；
Promotor-R：5’-CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
所述步骤（1）中，PCR扩增集胞藻PCC6803 psbA2 ORF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位点，在其3’端引入SacI酶切位点，所用引物为：
psbA2-F：5’-CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’；
psbA2-R：5’-AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
所述步骤（1）中花生硫脂酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，花生硫脂酶基因AhFatB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，融合基因AhFatA+AhFatB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述步骤（4）中质粒pBluescript II SK plus T1T2采用如下方法制备：
扩增含有大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’—ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3’；
T1T2-R：5’—TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存；获得的片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript II SK plus连接，得到质粒pBluescript II SK plus T1T2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增花生硫脂酶基因AhFatA的引物为：
AhFatA-F：5’-GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’；
AhFatA-R：5’- GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增花生硫脂酶基因AhFatB1的引物为：
AhFatB1-F：5’-GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’；
AhFatB1-R：5’-CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’；
扩增程序如下: 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
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