CN107574190B

CN107574190B - 一种提高卷枝毛霉产油量的制备方法

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Publication number: CN107574190B
Application number: CN201710604454.3A
Authority: CN
Inventors: 宋元达; 杨俊换; 亢新鑫
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2037-07-24
Also published as: CN107574190A

Abstract

本发明涉及一种提高卷枝毛霉油脂产量的制备方法，属于基因工程领域，本发明从卷枝毛霉菌株WJ11克隆获得三羧酸转运体TCT基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Pleu‑Mu402中，通过同源重组将TCT基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mutct，最终实现了TCT基因在卷枝毛霉中的过量表达，重组菌株Mutct中油脂含量比对照菌Mc1552提高了45.1%，胞内油脂含量可以达到总生物量的15.24%。

Description

一种提高卷枝毛霉产油量的制备方法

技术领域

本发明涉及一种提高卷枝毛霉产油量的制备方法，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术过量表达三羧酸转运体（TCT）基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂产量。

背景技术

产油微生物是指能够利用碳源，如碳水化合物、碳氢化合物等，产生大量脂肪酸并以甘油三酯的方式储存在自身体内，并且产油量占其生物总量的20%的微生物。在产油微生物中，不同种类的微生物产油脂量相差巨大，积累量从占细胞干重的20%到80%不等。现如今，随着科技进步和人口的增长，人类社会对于油品的需求日益增加，但与此同时，石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨以及环境污染等问题也同时出现。通过微生物产生的油脂以及其衍生品来代替部分石油资源，是解决资源短缺问题、实现可持续发展的一剂良方。

卷枝毛霉是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。卷枝毛霉 CBS277.49菌株（已得到基因组全序列）产油率不到25%，新菌株WJ11所产生的脂质可以占到细胞干重的36%。卷枝毛霉能够大量产生γ-亚麻酸 (GLA)，这也是其主要的商业价值。GLA是一种重要的多不饱和脂肪酸，是ω-△6系列的十八碳多不饱和脂肪酸， GLA在生殖系统、免疫系统、内分泌系统和心血管系统中扮演着重要角色。

三羧酸转运体TCT基因是脂质合成的关键因素之一。产油真菌通常在碳源充足，其它营养成分（如氮、磷、硫等）缺乏的条件下积累大量脂质。在此条件下，细胞不再进行繁殖，而是将过量的碳源转化为脂肪酸，并且以甘油三酯的形式储存在体内。卷枝毛霉是研究微生物产脂的模式菌株，利用同源重组的基因工程方法来提高卷枝毛霉油脂产量，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导，并且能够用微生物油脂或其衍生品代替一定的石油制品，符合可持续发展的要求。

发明内容

本发明提供一种卷枝毛霉重组菌株Mutct，包括三羧酸转运体（TCT）基因在卷枝毛霉基因组上的整合并过量表达，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了45.1%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的15.24%。

本发明的技术方案是：将卷枝毛霉（Mucor circinelloides）WJ11菌株接种在含100 mL Kendrick培养基（葡萄糖30 g/L，MgSO₄·7H₂O1.5 g/L，酒石酸铵3.3 g/L，KH₂PO₄7.0 g/L，Na₂HPO₄2.0 g/L，酵母提取物1.5 g/L，CaCl₂0.076 g/L，FeCl₃·6H₂O 8 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.1 mg/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.1 mg/L，MnSO₄·5H₂O0.1 mg/L）的500 mL带挡板的锥形瓶中，28℃，150 rpm，培养24 h，抽滤收集菌体。提取RNA，反转录cDNA。根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到三羧酸转运体（TCT）基因（00069.38,966 bp），根据基因序列设计特异引物Mutct-F和Mutct-R，以卷枝毛霉cDNA为模板进行PCR,Mutct-F：5’– act ttt ata tac aaa ata act aaa tct cga gat gac aag cac tgt tgactt–3’，Mutct-R：5’– act agt cgc aat tgc cgc ggc tcg agc tat aaa cct tta ttgaaa t–3。’

PCR反应50 μL体系，体系如下：

模板	5μL
		上游引物	1μL
下游引物	1μL
		dNTP	4μL
酶	0.5μL
		5*PS	10μL
水	补足至50μL
		总体积	50μL

扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。扩增结束后，对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳液为0.5×TBE缓冲液，电压120 V。电泳结束后在紫外灯下切下含有基因的条带，基因片段的回收使用多功能DNA纯化回收试剂盒，具体操作步骤按照说明书进行。取 2 μL DNA溶液，用Nano Drop2000 分光光度计测定浓度。

回收片段与pMAT1552载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂1.5%）。经37 ℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl10 g/L），8~10 h后提取质粒进行序列测定，将序列正确的质粒命名为pMAT1552-tct。

原生质体制备

将卷枝毛霉Pleu-Mu402菌株接种到含100 mL Kendrick培养基（添加尿嘧啶200 µg/mL）的500 mL带挡板锥形瓶中，28 ℃，150 rpm培养1天。取150 μL培养液，涂布到Kendrick培养基（添加尿嘧啶200 µg/mL）平板上，28℃培养5~7天孢子即可长好。取孢子生长良好的平板，每个平板加入5~6 mL的YPG培养基（酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸20 µg/mL，尿嘧啶200 µg/mL，pH 4.5），用灭菌的涂布棒刮取孢子，将孢子悬浮液收集于灭菌的50 mL离心管中，用血球计数板计算浓度并用pH 4.5的YPG调整孢子浓度为1×10⁷个/mL。取50 mL上述孢子悬液于灭菌的250 mL锥形瓶中，置于4 ℃冰箱过夜使孢子充分吸水膨胀。将锥形瓶置于30 ℃，250 rpm的摇床培养至孢子萌发管的长度为孢子直径的4倍。400×g离心后用pH 5.8的PS缓冲液[18.22 g山梨醇与20 mL PBS缓冲液（NaCl137 mM，KCl 2.7 mM，Na₂HPO₄ 10 mM，KH₂PO₄ 2 mM），定容至200 mL]洗两次，将培养基洗去。用PS缓冲液重悬，调整孢子浓度至1×10⁸个/mL，并加入终浓度为4 mg/mL的裂解酶和0.06U/mL的壳聚糖酶，置于30 ℃，60 rpm的摇床孵育90 min以除去细胞壁。100×g离心后用0.5M 4 ℃预冷的山梨醇洗两次，加入800 μL 0.5 M的山梨醇轻轻吹吸重悬沉淀，得到原生质体，分装100 μL/管以备使用。

电击转化

取100 μL上述制备好的原生质体与1 μg质粒pMAT1552-tct或pMAT1552混匀，置于冰上10 min，转移至电极间隙尺寸为2 mm的电击杯，选择指数波形，以电压1500 V，电阻200Ω，电容25 μF的条件电击转化。电击结束后立即加入1 mL预冷的YPGS（0.5 mol/L 山梨醇，酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L），30 ℃，100 rpm孵育1 h，100×g离心除去YPGS，以YNBS[山梨醇91.1 g/L，谷氨酸1.5 g/L，(NH₄)₂SO₄1.5 g/L，酵母基本氮源0.5g/L，葡萄糖10 g/L，调pH 4.5，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]重悬后均匀涂布于YNB选择培养基上[谷氨酸1.5 g/L，(NH₄)₂SO₄1.5 g/L，酵母基本氮源0.5 g/L，葡萄糖10 g/L，调pH 4.5，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]，30 ℃避光培养3~4天。

卷枝毛霉重组转化子的筛选及验证过程

随机挑取选择性平板上长出的单菌落菌丝于新的YNB平板传代3次，以验证转化子的稳定性。稳定遗传的转化子菌丝在Kendrick培养基中摇瓶培养1天后涂布于Kendrick平板，30 ℃培养5~7天后收取孢子，调整孢子浓度为1×10⁷个/mL，-80 ℃保存于30%甘油管中。最终获得了卷枝毛霉重组菌株Mutct和对照菌株Mc1552。将涂布后摇瓶培养的剩余菌体用布氏漏斗真空抽滤分离得到，提取卷枝毛霉基因组DNA（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行），以此为模板，以Mutct-F和Mutct-R为引物，进行PCR验证。

反应体系及扩增条件，95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。PCR验证结果如图1，卷枝毛霉重组菌株Mutct(四组平行)得到的片段为966bp，而对照菌株Mc1552在相应位置没有明显条带，说明质粒已成功转化进入卷枝毛霉中。

卷枝毛霉重组菌株Mutct脂肪酸组成及含量测定

在2 L发酵罐中采用Kendrick培养基培养卷枝毛霉重组菌株Mutct。发酵条件为28℃，700 rpm，进气量1 v/v min^-1，pH维持6.0。自24 h起每隔12 h收集全发酵液样品，用布氏漏斗真空抽滤分离发酵液和菌体，用蒸馏水洗涤菌体3遍，然后冷冻干燥。接着用下列方法测定不同发酵时期脂肪酸的组成和含量。

采用酸处理与反复冻融结合的破壁方式，用有机溶剂提取重组菌Mutct干菌体中油脂，参照方法（Folch J, Lees M, Sloane-Stanley G, et al. A simple method forthe isolation and purification of total lipids from animal tissues. BiolChem, 1957, 226, 497-509），并作适当修改，具体方法如下：①将冷冻干燥后的菌体研磨后，称取20 mg干重菌体于5 mL的玻璃瓶中，加入2 mL 4 M盐酸；②80 ℃水浴1 h，-80 ℃15min，重复一次；③恢复至室温后，加入1 mL甲醇和1 mL氯仿，并用微量进样器加入100 μL浓度为2.02 μg/μL内标C15:0；④置于混匀仪中旋转萃取0.5 h，3000 rpm离心3 min，收集氯仿层于新的5 mL的玻璃瓶中；⑤向原玻璃瓶中再次加入1 mL氯仿，重复④的过程并合并氯仿层；⑥氮气吹干；⑦加入1 mL 10%的盐酸甲醇溶液，60℃水浴3 h，期间每隔半小时震荡30sec；⑧冷却至室温后加入2 mL正己烷和1 mL饱和NaCl溶液，漩涡震荡混匀，4000 rpm离心3min，吸取正己烷层1 mL，转移至气相瓶得到脂肪酸甲酯溶液。

采用气相色谱分析，以商业化的脂肪酸甲酯标准品（37种脂肪酸甲酯混标）为标样来对脂肪酸甲酯进行分析。气相色谱为日本岛津公司的GC-2010，测量条件：气相色谱柱为DB-WAXETR（30m*0.32mm，膜厚度为0.25μm），利用氢离子火焰检测器检测（FID），氢气通气量60ml/min，载气为氮气，载气流量为2mL/min，采用不分流方式进样，进样体积为1μL，汽化室温度260℃，检测器温度260℃。气相程序设置为：初始温度80℃保持0min，以5℃/min的速率升温至200℃，在以4℃/min的速率升温至240℃，之后保持5min。以十五烷酸（C15：0）作为参照，记录各个脂肪酸组成峰面积的大小，计算总脂肪酸的含量。结果如表1，过表达菌株Mutct胞内油脂的含量比对照菌Mc1552提高45.1%。

表1 发酵培养对照型和TCT过表达型菌株油脂含量

本发明的有益效果

本发明的有益效果：本发明提供了一种胞内油脂含量明显提高的卷枝毛霉重组菌株及其制备方法；重组菌株Mutct中油脂含量比对照菌株Mc1552提高45.1%，胞内油脂含量可以达到总脂肪酸的15.24%。

附图说明

图1卷枝毛霉重组菌株的PCR验证。

M、标准蛋白分子量；0、空质粒阴性对照；1-4、卷枝毛霉重组菌株Mutct；5-6、对照菌株Mc1552；9、TCT基因阳性对照。

<110> 山东理工大学

<120> 一种提高卷枝毛霉产油量的制备方法

<140> 201710604454.3

<141> 2017-07-24

<160> 1

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 卷枝毛霉种（Circinelloides M. ）

<400> 1

atgacaagca ctgttgactt gacaaaacct agatattccc aagatacata ttggggtaga 60

attagacact ttattgatgt tactgatcca agaacgttgt ttgtctcttc atctgagctc 120

gagaaatgca aacaactgtt ggcaaacaca tctcaacatg acaagatgga cccagaaaga 180

ctttggaagg caaagaaagt cgtggattcg actatccatc cagacactgg cgaagcagta 240

ttcttgccat tcagaatgtc atgctttgtg cctaccaaca tggtgttggt agcaggtatg 300

ctgttaccta atcccagtat caagagcata ttgttttggc agtgggccaa tcaaagtgtc 360

aatgtcgcct ttaattctgc aaatgccaac aagacaacac cgatgagtct caaggaaact 420

ggcattgcct atgtatctgc tgttactaca tcttgcgcca tcgcagtagg cttaaaccaa 480

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ttcacagcag ttgctgctgc tggtacagtc aacgtctttt tgatgagagg aaaagagatc 600

cgtgatggta ttgatgtatt tacaaaggag ggacaatctg tgggtaaatc caaggaagct 660

ggtttctcgg ctgtgtctca agtggctatt tctcgcatct tgacaaacgc acccgtcttg 720

atcttgcctc ctgtcatctt gggtcgcttg caaaagactg actttatcaa gcaaagaccc 780

aagttgattg tgccacttaa tttcggtttg attgcactct ctttaatgac agctttacct 840

gctgctatcg ctgtattccc tcaaattggt gaattacaaa cggctaatat ggaaaaggag 900

tttcaagatc ttaaagatgt ggatggcaag cctatcacaa agttgtattt caataaaggt 960

tta tag 966

Claims

1.一种提高卷枝毛霉产油量的制备方法，其特征是，将从卷枝毛霉WJ11菌株中克隆获得的三羧酸转运体TCT基因通过同源重组的方法转入卷枝毛霉得到重组菌株Mutct，所述TCT基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组菌株Mutct的制备方法，其特征是，以卷枝毛霉WJ11总cDNA为模板，设计引物PCR得到编码三羧酸转运体TCT基因，所述TCT基因序列如SEQ IDNO.1所示，连接至整合型质粒pMAT1552上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Pleu-Mu402的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养。