CN109628473A - 一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体，属于基因工程领域，本发明从高产油卷枝毛霉WJ11克隆获得碳四二羧酸转运体C4‑dicarboxylate/malic acid transporter基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将c4mt基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mu‑C4mt，最终实现了c4mt基因在卷枝毛霉中的表达，过表达菌株Mu‑C4mt胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mc‑C4mt菌株油脂总脂肪酸含量提了25.30%，胞内油脂含量最多可以达到细胞干重的16.34%。

Description

一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体
技术领域
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术过量表达碳四二羧酸转运体(C4-dicarboxylate/malic acidtransporter)基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂产量。
背景技术
产油微生物可以大量合成甘油三酯，其中丝状真菌和微藻可以合成长链多不饱和脂肪酸，这些具有生物活性的脂肪酸已经被认定为重要的营养食品资源。随着人民生活水平日益提高，越来越多的人重视身体健康与生活质量。饮食中的脂肪酸与营养健康的研究成为慢性病研究的热点，研究结果表明，膳食油脂的营养成分与慢性病的发生密切相关，油脂中重要的活性多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、α-亚麻酸（ALA）、紫草酸（十八碳四烯酸、SDA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），可以调节体内脂质代谢，预防多种慢性疾病的发生。γ-亚麻酸为人体必需脂肪酸，是人体合成活性多不饱和脂肪酸的前体物质，需要从膳食中获得。产油微生物由于其油脂含量高，生长周期短，碳源利用广谱等特点备受关注，通过微生物产生的多不饱和脂肪酸用于膳食补充剂正在被人们所接受，随着微生物油脂发酵、提取、加工等技术的发展，可能在未来生物产油产业中发挥重要作用。产油微生物细胞工厂是指利用产油微生物，发酵过程中通过添加过量的碳源，如碳水化合物、碳氢化合物等，使得微生物胞内脂肪酸以甘油三酯的方式大量储存在自身体内，进而将细胞转变成工厂。
卷枝毛霉是全球首次利用微生物商业化培养生产油脂的菌株。卷枝毛霉被用来作为产油微生物研究的模式菌种，然而，本研究中分离获得新菌株WJ11，其所产生的脂质可以占到细胞干重的36%，且其基因组测序已完成，遗产背景与产油机制研究较为深入，同时其基因操作简单，遗传工具较为齐全，比较适于进行细胞工厂制备。卷枝毛霉能够大量产生对人体具有重要生理功能的γ-亚麻酸 (GLA)，这也是其主要的商业价值。
碳四二羧酸转运体(C4-dicarboxylate/malic acid transporter，c4mt)基因是脂质合成的关键因素之一。产油真菌通常在碳源充足，其它营养成分（如氮、磷、硫等）缺乏的条件下，糖酵解的最终产物丙酮酸进入线粒体内，线粒体中三羧酸循环受阻，导致柠檬酸大量积累在线粒体中，此时柠檬酸被转运到细胞质中由柠檬酸裂解酶裂解产生脂肪酸合成底物乙酰辅酶A和草酸乙酰。乙酰辅酶A为细胞中油脂合成前体物质，进而通过生化反应被用于合成脂肪酸，而脂肪酸则以甘油三酯的形式储存在细胞内，从而形成微生物油脂。因此柠檬酸的转出对于微生物细胞油脂的积累具有重要作用，据报道，碳四二羧酸转运体能够将细胞质内的苹果酸等二羧酸透过线粒体细胞膜转运到线粒体内，进而促进柠檬酸的转出，为细胞油脂合成起到促进作用，因此碳四二羧酸转运体对于微生物油脂合成与积累具有重要作用。本专利利用卷枝毛霉作为研究微生物产脂的细胞工厂的模式菌株，利用同源重组的基因工程方法来提高卷枝毛霉油脂产量，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用提供指导，并且能够用微生物油脂提供高营养价值的多不饱和脂肪酸，符合人民对身体健康和高质量生活的日益增长的要求。
发明内容
本发明提供一种卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt，包括碳四二羧酸转运体（c4mt）基因在卷枝毛霉基因组上的整合并过量表达，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了25.30%，胞内油脂含量最多可以达到总脂肪酸的16.34%。
本发明的技术方案是：提取卷枝毛霉（Mucor circinelloides）WJ11菌株的mRNA反转出cDNA，设计特异引物PCR扩增碳四二羧酸转运体（c4mt）基因将该基因连接至整合型质粒pMAT1552上，然后将该重组质粒电转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402的原生质体中，挑选阳性克隆进行发酵培养，发酵条件为：采用Kendrick培养基， 28 ℃，700 rpm，进气量1 v/vmin-1，pH 6.0。发酵过程中，根据油脂积累规律采集样品，进行油脂含量与组成的测定。
本发明还提供了编码碳四二羧酸转运体（c4mt）基因，其基因核酸序列如SEQ IDNO: 1所示。
本发明还提供了含有SEQ ID NO: 1的表达载体，能够表达碳四二羧酸转运体（c4mt）基因，所述载体是卷枝毛霉表达载体。
本发明成功的表达了碳四二羧酸转运体，其蛋白质序列如SEQ ID NO: 2所示。
有益效果
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体；构建了重组菌株Mc-C4mt，与对照菌Mc1552相比生成的胞内油脂产量提高了25.30%，胞内油脂含量最多可以达到总脂肪酸的16.34%。
附图说明
图1是卷枝毛霉重组菌株的PCR验证图，其中 M代表标准蛋白分子量；0代表对照菌株Mc1552；1-3代表卷枝毛霉重组菌株Mc-C4mt。图2是卷枝毛霉重组菌株的c4mt基因mRNA表达水平测定图。
具体实施方式
实施例1：碳四二羧酸转运体（c4mt）基因信息学分析
根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到碳四二羧酸转运体（c4mt）基因（000 18.48,1113 bp）（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），通过基因序列进行信息学分析，该序列编码370个氨基酸（其蛋白质序列如SEQ ID NO: 2），预计分子量为32.12kDa，PI 9.16，该序列编码的蛋白与来自Mucor ambiguus的碳四二羧酸转运体基因（NCBI基因ID：GAN00662.1）和Rhizopus microsporus ATCC 52813的碳四二羧酸转运体基因（NCBI基因ID：XP_023469779.1）的同源性分别为91%和67%，因此，初步确定该基因可以编码卷枝毛霉WJ11的碳四二羧酸转运体（c4mt）。
实施例2：重组质粒构建
将卷枝毛霉（Mucor circinelloides）WJ11菌株接种在含100 mL Kendrick培养基（葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O1.5 g/L，酒石酸铵3.3 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，酵母提取物1.5 g/L，CaCl20.076 g/L，FeCl3·6H2O 8 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O0.1 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.1 mg/L，MnSO4·5H2O 0.1 mg/L）的500 mL带挡板的锥形瓶中，28℃，150 rpm，培养24 h，抽滤收集菌体。提取RNA，反转录cDNA。根据已测序的WJ11的基因组信息，查找到碳四二羧酸转运体（c4mt）基因（scaffold00018.48, 1113bp）（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示），根据基因序列设计特异引物MuC4mt -F和MuC4mt -R，以卷枝毛霉cDNA为模板进行PCR, MuC4mt-F：5’– ACTTTTATATACAAAATAACTAAATCTCGAGATGGGCGAAAAATTAAAACG–3’，MuC4mt-R：5’– ACTAGTCGCAATTGCCGCGGCTCGAGCTACAGAGAAGGTAGAGAAT–3。’
PCR反应参照PrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara）说明书进行试验，反应条件为95℃变性3 min 后开始循环，然后95 ℃变性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1min，共30个循环后，再于72 ℃延伸10 min，降温至4 ℃保持5 min。扩增得到1113bp的PCR片段，回收片段与pMAT1552载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂1.5%）。经37 ℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L），8~10h后提取质粒进行序列测定，将序列正确的质粒命名为pMAT1552-C4mt。
实施例3：卷枝毛霉原生质体制备
将卷枝毛霉Mu402菌株孢子接种到YPG培养基（酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸20 µg/mL，尿嘧啶200 µg/mL，pH 4.5）的平板中，28 ℃，培养1天。取单克隆菌丝点植于YPG培养基的平板，28℃培养3~4天孢子即可长好。取孢子生长良好的平板，每个平板加入5~6 mL的YPG培养基，用灭菌的涂布棒刮取孢子，将孢子悬浮液收集于灭菌的50mL离心管中，用血球计数板计算浓度并用pH 4.5的YPG调整孢子浓度为1×107个/mL。取12.5 mL上述孢子悬液于灭菌的250 mL锥形瓶中，置于4 ℃冰箱过夜使孢子充分吸水膨胀。将锥形瓶置于30 ℃，250 rpm的摇床培养至孢子萌发。1100rpm离心后用5mL pH 6.5的PS缓冲液[18.22 g山梨醇与20 mL PBS缓冲液（NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na2HPO4 10 mM，KH2PO4 2 mM）]洗两次，将培养基洗去。用5ml PS缓冲液重悬，并加入终浓度为4 mg/mL的裂解酶和0.06 U/mL的壳聚糖酶，置于30 ℃，60 rpm的摇床孵育90 min以除去细胞壁。100×g离心后用0.5 M 4 ℃预冷的山梨醇洗两次，加入800 μL 0.5 M的山梨醇轻轻吹吸重悬沉淀，得到原生质体，分装100 μL/管以备使用。
实施例4：重组菌株Mu-C4mt构建：取100 μL上述制备好的原生质体与1 μg质粒pMAT1552-C4mt或pMAT1552混匀电击转化，电击结束后立即加入1 mL预冷的YPGS（0.5 mol/L 山梨醇，酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L），26 ℃，100 rpm孵育1 h，100×g离心除去YPGS，以YNBS[山梨醇91.1 g/L，谷氨酸1.5 g/L，(NH4)2SO4 1.5 g/L，酵母基本氮源0.5 g/L，葡萄糖10 g/L，调pH 4.5，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]重悬后均匀涂布于MMC选择培养基上[酪蛋白氨基酸10 g/L，酵母基本氮源0.5 g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L调pH 3.2，灭菌后加入硫胺素和烟酸至终浓度为1 μg/mL]，28℃避光培养3~4天。随机挑取8个选择性平板上长出的单菌落菌丝于新的MMC平板，28℃培养2-3天收集孢子，将大约200-300个孢子分别接种于MMC和含尿嘧啶的MMC平板中，28℃培养2-3天计数，重复上述筛选步骤直到两个平板中孢子生长数量基本相同则说明得到稳定遗传的转化子。稳定遗传的转化子菌丝在YPG培养基平板，30 ℃培养5~7天后收取孢子，调整孢子浓度为1×107个/mL，-80 ℃保存于30%甘油管中。最终获得了卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt和对照菌株Mc1552。将涂布后摇瓶培养的剩余菌体用布氏漏斗真空抽滤分离得到，提取卷枝毛霉基因组DNA（参照植物快捷DNA提取试剂盒说明书进行），以此为模板以1552-F和1552-R为引物(该对引物为质粒中插入目的基因位点上下游600bp位置)，进行PCR验证。
1552-F: 5’– CCTCGGCGTCATGATGTTTTTGTGTACCT–3’
1552-R：5’– GGGATGTCTGCTGCTACCATGTCTCAT–3’
反应体系及扩增条件，95℃预变性3min，95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，循环数30，72℃补偿延伸10min。PCR验证结果如图1，卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt得到的片段为1713bp，而对照菌株Mc1552在相应位置片段为600bp，说明质粒已成功转化进入卷枝毛霉中。
实施例5：卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt发酵及待测样品制备
在2 L发酵罐中采用Kendrick培养基培养卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt。发酵条件为 28℃，700 rpm，进气量1 v/v min-1，pH维持6.0。根据卷枝毛霉产油规律，收集全发酵液样品，用布氏漏斗真空抽滤，分离发酵液和菌体，收集发酵液于-20℃保存待用，用蒸馏水洗涤菌体3遍，然后冷冻干燥备用。
实施例6：碳四二羧酸转运体（c4mt）基因表达水平测定
参照Trizol使用说明书提取3、24、48、27h发酵样品的mRNA, 并用ReverTra Ace qPCRRT Kit (Roche)反转为cDNA, 利用RT-qPCR 方法测定碳四二羧酸转运体的表达水平，利用专业方法处理数据，测定过程采用的试剂盒为SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Roche)，扩增引物序列为：
WJ11-c4mt-F 5’–TTATTTTTATCGTTTGGTGGTACACAAACTGC–3’，
WJ11-c4mt-R 5’–GTAACCCCACAGAAATAGAGCCATAAGG–3’。
内参基因为actin，其扩增引物序列为：
actin-F 5’–GATGAAGCCCAATCCAAGA–3’，
actin-R 5’–TTCTCACGGTTGGACTTGG–3’。
扩增条件为：95ºC 预热10min, 之后 95 ºC 30s，59ºC 10s, 72ºC 30s(45循环)。C4mt基因表达结果如图2所示。在Mu-C4mt 中，c4mt基因成功表达，24h后基因表达量降低，但是与对照相比基因表达水平仍处于较高水平。
实施例7：卷枝毛霉重组菌株Mu-C4mt脂肪酸组成及含量测定
采用酸处理与反复冻融结合的破壁方式，用有机溶剂提取重组菌Mc-C4mt干菌体中油脂，参照方法（Folch J, Lees M, Sloane-Stanley G, et al. A simple method for theisolation and purification of total lipids from animal tissues. Biol Chem,1957, 226, 497-509），并作适当修改，具体方法如下：①将冷冻干燥后的菌体研磨后，称取20 mg干重菌体于5 mL的玻璃瓶中，加入2 mL 4 M盐酸；②80 ℃水浴1 h，-80 ℃15 min，重复一次；③恢复至室温后，加入1 mL甲醇和1 mL氯仿，并用微量进样器加入100 μL浓度为2.02 μg/μL内标C15:0；④置于混匀仪中旋转萃取0.5 h，3000 rpm离心3 min，收集氯仿层于新的5 mL的玻璃瓶中；⑤向原玻璃瓶中再次加入1 mL氯仿，重复④的过程并合并氯仿层；⑥氮气吹干；⑦加入1 mL 10%的盐酸甲醇溶液，60℃水浴3 h，期间每隔半小时震荡30 sec；⑧冷却至室温后加入2 mL正己烷和1 mL饱和NaCl溶液，漩涡震荡混匀，4000 rpm离心3min，吸取正己烷层1 mL，转移至气相瓶得到脂肪酸甲酯溶液。
采用气相色谱分析，以商业化的脂肪酸甲酯标准品（37种脂肪酸甲酯混标）为标样来对脂肪酸甲酯进行分析。气相色谱为美国安捷伦的GC-6890N，测量条件：气相色谱条件：不分流进样，色谱柱是DM-FFAP（30m×0.32mm，0.22μm），氢离子火焰检测器，载气为氮气，气化室温度和检测器温度均为250℃，进样量1μL。升温程序：初温80℃，先以8℃/min的升温速率升至200℃，再以1℃/min升温速率升至205℃，最后以4℃/min的升温速率升至240℃，保持5min。以十五烷酸（C15：0）作为参照，记录各个脂肪酸组成峰面积的大小，计算总脂肪酸的含量。结果如表1，过表达菌株Mu-C4mt胞内油脂脂肪酸组成变化不大，但在过表达菌株Mu-C4mtt菌株油脂总脂肪酸含量提高了25.30%，胞内油脂含量最多可以达到总脂肪酸的16.34%。
表1 发酵培养对照型和Mu-C4mt过表达型菌株油脂含量
由此可确定卷枝毛霉WJ11中00018.48基因所编码的蛋白质为碳四二羧酸转运体，该基因在重组菌株Mu-C4mt成功表达，并且，该蛋白质参与卷枝毛霉油脂合成过程，过表达该转运体可以有效提高该菌株胞内油脂的产量。
序列表
<110> 山东理工大学
<120> 一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1112
<212> DNA
<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)
<400> 1
atgggcgaaa aattaaaacg caagagcctc aaagaggtgg taaggcactt tacaccgtca 60
tggtttagtg ttattatggg aacaggcatt ctgtcaattc tgctgcacgt ctttcctttc 120
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tgggctggtg ggctttaact ttcccattgg gcgtatttac tactgctacc ttaagtattg 960
gcaacatcct cgactccatg ttctttttgg tattgggagc catctttaca tgcatgttag 1020
ttttgatatg gttggccgtc atggcaaaaa cactgaaggg aatatttact ggcgaaatgt 1080
tttatgctcc ttgcttatct cctgtaactt ta 1112
<210> 2
<211> 371
<212> PRT
<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)
<400> 2
Met Gly Glu Lys Leu Lys Arg Lys Ser Leu Lys Glu Val Val Arg His
1 5 10 15
Phe Thr Pro Ser Trp Phe Ser Val Ile Met Gly Thr Gly Ile Leu Ser
20 25 30
Ile Leu Leu His Val Phe Pro Phe Gln Phe Arg Gly Leu Gln Thr Ile
35 40 45
Ala Leu Val Val Tyr Ile Met Asn Val Val Met Phe Cys Ile Phe Leu
50 55 60
Ile Val Ser Ile Ala Arg Tyr Thr Ile Trp Pro Ser Ile Ile Arg Leu
65 70 75 80
Val Leu Glu His Ser Asn Gln Ser Leu Phe Ile Gly Thr Met Pro Met
85 90 95
Gly Leu Thr Thr Ile Thr Asn Phe Thr Thr Leu Val Ile Val Asp Lys
100 105 110
Phe Ala Trp Gly Leu Asp Leu Ala Phe Val Leu Trp Ile Ile Glu Tyr
115 120 125
Val Leu Thr Ile Ala Thr Val Leu Val Val Pro Tyr Phe Val Ile Val
130 135 140
His His Asn His Ala Leu Glu Ser Met Asn Gly Thr Trp Leu Leu Pro
145 150 155 160
Ile Val Pro Cys Val Val Ala Ser Ala Ser Gly Gly Leu Leu Ala Gln
165 170 175
Tyr Leu Asp Gln Gly Arg Ala Val Val Val Leu Phe Ile Ser Ile Ile
180 185 190
Thr Met Gly Met Gly Leu Leu Leu Ala Phe Ser Val Ile Val Ile Tyr
195 200 205
Phe Tyr Arg Leu Val Val His Lys Leu Pro Pro Arg Glu Val Ile Ile
210 215 220
Ser Ser Phe Leu Pro Leu Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ala Tyr Gly Val
225 230 235 240
Ile Gln Leu Gly Ile Ala Ser Lys Thr Val Leu Gly Asp Arg Tyr Ile
245 250 255
Ala Gly Leu Gly Asp Val Ala His Ser Val Gly Phe Leu Met Ala Leu
260 265 270
Phe Leu Trp Gly Tyr Gly Ile Trp Phe Leu Val Val Ala Thr Phe Ser
275 280 285
Val Gly Ile Thr Thr Lys Gln Gly Ile Pro Phe Asn Met Gly Trp Trp
290 295 300
Ala Leu Thr Phe Pro Leu Gly Val Phe Thr Thr Ala Thr Leu Ser Ile
305 310 315 320
Gly Asn Ile Leu Asp Ser Met Phe Phe Leu Val Leu Gly Ala Ile Phe
325 330 335
Thr Cys Met Leu Val Leu Ile Trp Leu Ala Val Met Ala Lys Thr Leu
340 345 350
Lys Gly Ile Phe Thr Gly Glu Met Phe Tyr Ala Pro Cys Leu Ser Pro
355 360 365
Val Thr Leu
370

Claims (5)

1.一种用于提高卷枝毛霉产油量的碳四二羧酸转运体基因（c4mt），其特征是，如SEQID NO: 1所示的核酸，其特征在于编码一种卷枝毛霉碳四二羧酸转运体。
2.含有权利要求1所述核酸的表达载体，其特征是，能够表达卷枝毛霉碳四二羧酸转运体，所述载体为卷枝毛霉表达载体。
3.含有权利要求2所述载体的重组微生物，其特征是，能够表达卷枝毛霉碳四二羧酸转运体。
4.根据权利要求3所述重组微生物，其特征是，所述微生物为卷枝毛霉。
5.一种来源于卷枝毛霉的碳四二羧酸转运体（C4mt），其特征是，蛋白质序列如SEQ IDNO: 2所示。
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