CN116262929A - 一种工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents

一种工程菌的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116262929A
CN116262929A CN202111539688.7A CN202111539688A CN116262929A CN 116262929 A CN116262929 A CN 116262929A CN 202111539688 A CN202111539688 A CN 202111539688A CN 116262929 A CN116262929 A CN 116262929A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
host strain
introducing
promoter
sclareol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111539688.7A
Other languages
English (en)
Inventor
周雍进
曹选
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN202111539688.7A priority Critical patent/CN116262929A/zh
Publication of CN116262929A publication Critical patent/CN116262929A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/07—Diphosphoric monoester hydrolases (3.1.7)
    • C12Y301/07004—Sclareol cyclase (3.1.7.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请公开一种工程菌的构建方法及其应用。所述构建方法包括以下步骤：在宿主菌株中导入DNA片段I，得到所述工程菌；所述DNA片段I从上游到下依次包括：启动子、融合基因、终止子；所述融合基因从上游到下依次包括：TPS基因、连接肽I的编码基因、LPPS基因；所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。所述构建方法优化了宿主菌株的香紫苏醇合成酶，有利于提高香紫苏醇的产率。

Description

一种工程菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物代谢工程及工业生物技术领域，涉及一种工程菌的构建方法及其应用。
背景技术
香紫苏醇(sclareol)又称硬尾醇，作为一种半日花烷型二萜叔醇，最初在鼠尾草属唇形香料植物香紫苏(Salvia sclarea)中提取并由此得名。香紫苏醇是龙涎香替代品——龙涎醚合成最普遍的原料。龙涎香是抹香鲸分泌的一种蜡质物质，自古以来因其麝香和甜土气味被用作高端香水的固定成分。然而，抹香鲸濒临灭绝的现状造就了龙涎醚不可再生的宝贵性，因此利用香紫苏醇合成龙涎醚已经成为香水工业生产天然龙涎香替代品的主要方法。香紫苏醇在医药和农药上同样具有重要的生物活性。如香紫苏醇具有很强的抗菌活性以及在真菌生长调节和植物生长抑制方面起作用，并且对人类的白血病细胞(Dimas et al.,Leuk Res,1999,23:217-234)、肿瘤细胞株 (Mahaira et al.,Eur JPharmacol,2011,666:173-182)、结肠癌细胞及异种移植物(Dimas et al.,Apoptosis,2007,12:685-694；Mahaira et al., Eur J Pharmacol,2011,666:173-182)具有细胞毒性。最近，有研究以香紫苏醇和香紫苏醇内酯为原料，将生物催化与自由基反应相结合，成功合成八种氧化型混源萜天然产物及一种类似物，说明香紫苏醇对混源萜类天然产物合成也至关重要(Li et al.,Nat.Chem.,2020,12: 173-179)。
目前，香紫苏醇的生产大多以植物香紫苏花序及茎叶提油后的香紫苏浸膏为原料，根据AFNOR指令(NFT75-255)和工业水平，从1000kg干植物中获得的精油中含有20-260g香紫苏醇，即香紫苏醇得率为0.002％-0.026％。植物香紫苏的生长周期长，且受限于土地、环境及气候因素的影响，不能完全满足工业化生产的需求。微生物是一种非常理想的“细胞工厂”，具有生长周期短、可高密度培养、不受外界环境干扰等优势。2009年，瑞士日内瓦芬美意有限公司的Schalk克隆出植物香紫苏中香紫苏醇合成的两个关键基因，一是，焦磷酸赖百当烯二醇酯(labdenediol diphosphate,LPP)合酶(SsLpps，Ⅱ型萜类合酶)，催化二萜类化合物前体物质GGPP生成 LPP；二是，香紫苏醇合酶(SsTps，Ⅰ型萜类合酶)，催化LPP生成香紫苏醇(US patent 9267155)。在大肠杆菌Escherichia coli中表达这两个酶，并优化异戊二烯(MEP)途径，批式补料发酵香紫苏醇产量达到1.5g/L(Schalk et al.,J.Am.Chem.Soc.,2012,134(46): 18900-18903)。2013年，杨薇等人在酿酒酵母中表达焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)合酶基因SsLPPS和香紫苏醇合酶基因SsTPS，并过表达截断型羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1及融合表达GGPP合成酶基因和法尼烯合成酶基因BTS1-ERG20，使得香紫苏醇产量达到9mg/L(杨薇等.,生物工程学报,2013(08):152-159)。2015年，Ignea等人在酿酒酵母底盘细胞AM205中通过表达来自岩蔷薇的8-羟丙基二磷酸(8OH-CPP)合成酶基因CcCLS和来自香紫苏的香紫苏醇合成酶基因SsTPS并对ERG20定点突变为 ERG20F96C，使得香紫苏醇产量提高至403mg/L(Ignea et al.,MetabolicEngineering,2015:65-75)。同一年，Trikka等人在酿酒酵母中利用类胡萝卜素显色筛选到6个敲除靶点ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w和YGR259c，在底盘细胞AM238中对其进行敲除后，香紫苏醇产量在摇瓶中达到750mg/L(Trikka et al.,Microb.Cell Fact.,2015,14(1):60-79)。目前所构建工程菌株产量还比较低，难以满足市场需求。
本发明从全局代谢构建酵母细胞工厂，实现香紫苏醇高效合成。首先优化香紫苏醇合成酶基因，提高其生物合成效率；并将细胞初级代谢和香紫苏醇生物合成途径整合并分成三个模块：1)初级代谢模块提供前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH；2)甲羟戊酸生物合成模块；3)转录因子调控模块。分别优化三个模块，并实现模块间协同合作，使得酿酒酵母中香紫苏醇产量在摇瓶中达到1.1g/L，批式补料发酵达到11.4g/L。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服目前酵母工程菌的中萜类生物合成酶的活性低和代谢不匹配等难题，从萜类合成酶优化和全局代谢模块优化增加香紫苏醇等二萜的生物合成效率，提供一种产香紫苏醇的酵母基因工程菌及其应用。
根据本申请的一个方面，提供一种工程菌的构建方法，所述构建方法优化了宿主菌株的香紫苏醇合成酶，有利于提高香紫苏醇的产率。
一种工程菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
在宿主菌株中导入DNA片段I，得到所述工程菌；
所述DNA片段I从上游到下依次包括：启动子、融合基因、终止子；
所述融合基因从上游到下依次包括：TPS基因、连接肽I基因、LPPS基因；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
可选地，所述融合基因从上游到下依次包括：
MBP基因、连接肽II基因、TPS基因、连接肽I基因、LPPS基因；
或
所述融合基因从上游到下依次包括：
TPS基因、连接肽I的编码基因、LPPS基因、连接肽II的编码基因、MBP基因。
可选地，所述LPPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述TPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述MBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述连接肽I的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述连接肽II的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述启动子选自PeTDH3、PGAL7中的任意一种；
所述终止子选自TPYX212、TADH1中的任意一种。
可选地，所述在宿主菌株中导入DNA片段I为将DNA片段I整合到宿主的XI-3基因位点。
可选地，所述构建方法还包括优化MVA的合成途径，包括(a)～(h)中的至少一种：
(a)敲除宿主菌株的GAL80的编码基因；
(b)将tHMG1基因导入宿主菌株；
(c)将SpHMGR基因导入宿主菌株；
(d)将宿主菌株基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C基因；
(e)将HMG2K6R基因和ERG10基因导入宿主菌株；
(f)将含有2个拷贝HMG2K6R基因的DNA片段导入宿主菌株；
(g)将宿主菌株中ERG9基因的启动子替换为PHXT1；
(h)将含有BTS1和PaGGPPS基因的DNA片段导入宿主菌株；
所述(a)～(h)不分先后顺序。
可选地，包括(a)～(h)中的至少一种：
(a)敲除宿主菌株的GAL80基因；
(b)将含有FAA4-TAHD1-PTHD3-tHMG1的DNA片段整合到宿主菌株的FAA4基因位点；
(c)将含有POX1-TTDH2-PtHXT7-SpHMGR的DNA片段整合到宿主菌株的POX1基因位点；
(d)将宿主菌株基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C基因；
(e)将含有TENO2-HMG2K6R-PGAL10-1-ERG10-TPYK1的DNA片段整合到宿主菌株的XII-2基因位点；
(f)将含有TPDC1-HMG2K6R-PGAL10-1-HMG2K6R-TENO2的DNA片段整合到宿主菌株的XII-3基因位点；
(g)将宿主菌株中ERG9基因的启动子替换为PHXT1；
(h)将含有PGAL7-BTS1-PaGGPPS-TTDH2的DNA片段整合到宿主菌株的XI-2基因位点；
所述(a)～(h)不分先后顺序。
可选地，所述构建方法还包括优化中心代谢途径，包括(A)～(N)中的至少一种：
(A)将MmACL基因导入宿主菌株；
(B)将RtME基因导入宿主菌株；
(C)将‘MDH3基因导入宿主菌株；
(D)将CTP1基因导入宿主菌株；
(E)将宿主菌株的PYC1基因启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；
(F)将MPC1基因导入宿主菌株；
(G)将MPC3基因导入宿主菌株；
(H)将AnACLa基因、AnACLb基因导入宿主菌株；
(I)将RtCIT1基因导入宿主菌株；
(J)将IDP2基因导入宿主菌株；
(K)将YHM2基因导入宿主菌株；
(L)将宿主菌株的PGI1基因的启动子替换为启动子PCOX9；
(M)将GND1基因、TKL1基因、TAL1基因、ZWF1基因导入宿主菌株；
(N)将宿主菌株的IDH2基因的启动子替换为启动子PGSY1；
所述(A)～(N)不分先后顺序。
可选地，所述构建方法还包括优化中心代谢途径，包括(A)～(G)中的至少一种：
(A)将含有HIS3-PTPI1-MmACL-TFBA1-PTDH3-RtME-TCYC1-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-PPGK1-CTP1-TADH1的DNA片段整合到宿主菌株的HIS3 基因位点；
(B)将宿主菌株的PYC1基因的启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；
(C)将含有PtHXT7-MPC3-TDIT1-TMPC1-MPC1-PTPI1的DNA片段整合到宿主菌株的XI-4位点；
(D)将含有TCYC1-AnACLa-PGAL1-PGAL10-AnACLb-TADH1的DNA片段整合到宿主菌株的X2位点；
(E)将含有PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTHD3-PTEF1-YHM2的DNA片段整合到宿主菌株的GAL1、GAL7、GAL10位点；
(F)将含有PCOX9-TCYC1-GND1-PTHD3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1的DNA片段整合到宿主菌株的PGI1 位点；
(G)将宿主菌株的IDH2基因的启动子替换为启动子PGSY1；
所述(A)～(G)不分先后顺序。
可选地，所述构建方法还包括靶点调控，包括：
敲除宿主菌株的ROX1基因、DOS2基因、VBA5基因、YER134c基因、YNR063w基因、YGR259c基因中的至少一种。
可选地，所述构建方法还包括以下的至少一种：
(I)在宿主菌株中导入ANB1基因、DAN1基因、HUG1基因、PYK1基因、LAC1基因、CYB5基因、YCL021W-A基因、YCL074W 基因、OYE3基因、OYE2基因、HSP31基因、BLI1基因中的至少一种；
和/或
(II)敲除宿主菌株的SPS4基因、YOR314W基因、SUL1基因、CDA2基因、ERV15基因、ZRT1基因、DSE1基因、ANB1基因中的至少一种。
可选地，所述构建方法通过采用CRISPR/Cas9技术进行构建。
可选地，所述构建方法还包括细胞融合形成双倍体。
根据本申请的另一个方面，提供根据上述任一项所述的构建方法构建得到的工程菌。
根据本申请的另一个方面，提供根据上述任一项所述的构建方法构建得到的工程菌、上述所述的工程菌中的至少一种在制备香紫苏醇中的应用。
作为一种实施方案，本申请提供一种产香紫苏醇的酿酒酵母基因工程菌，优化了香紫苏醇合成酶，将催化香紫苏醇合成的两个酶进行串联表达，并且在N端融合了麦芽糖结合蛋白MBP
可选地，在酵母中将中心代谢模块、异戊二烯生物合成途径模块和调控模块进行优化后构建而成；
可选地，强化表达了异戊二烯生物合成途径限速酶基因，包括截断型羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，突变型 HMG2K6R，来源于Silicibacter pomeroyi NADH依赖型SpHMGR，乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10，内源GGPP合成酶与来自 Phomopsis amygdali的GGPP合成酶融合蛋白基因BTS1-PaGGPPS并突变了基因组中FPP合成酶基因为ERG20F96C及采用PHXT1替换 ERG9启动子动态调控ERG9表达；
可选地，强化了中心代谢途径增加了前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供给，包括表达来自Mus musculus的ATP依赖型柠檬酸裂解酶基因MmACL，来自Rhodospuridiumtoruloides的NADP+依赖型苹果酸合成酶基因RtME和柠檬酸合成酶1基因RtCIT1，去除过氧化物酶体信号肽的苹果酸脱氢酶基因’MDH3，柠檬酸转运蛋白基因CTP1，丙酮酸羧化酶1基因PYC1，丙酮酸转运蛋白1和3基因MPC1和MPC3，来自Aspergillus nidulans的ATP依赖型柠檬酸裂解酶a和b基因AnACLa和AnACLb，NADP特异性异柠檬酸脱氢酶2基因IDP2，柠檬酸、α-酮戊二酸转运蛋白基因YHM2，磷酸葡萄糖脱氢酶异构体1基因GND1，转酮酶基因TKL1，转醛缩酶基因 TAL1，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因ZWF1，线粒体NAD+依赖异柠檬酸脱氢酶基因IDH2并采用PGSY1替换PGI1启动子弱化PGI1表达；
可选地，敲除了调控因子基因，包括ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c；
可选地，构建了二倍体菌株，将构建的α菌株配型转换为a型菌株，然后两者融合获得二倍体菌株。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌的构建方法包括：将SEQ ID NO：2所示的 TPS基因与SEQ ID NO：1所示的LPPS基因融合，连接肽为GGGS，获得融合基因1；融合基因1的N端与SEQ ID NO：3所示的麦芽糖结合蛋白编码基因融合，获得融合基因2；融合基因2连同质粒pgRNA-XI-3转入出发菌株中，获得产香紫苏醇的酿酒酵母基因工程菌。
可选地，所述质粒pgRNA-XI-3的靶向基因组位点是XI-3。
作为一种实施方案，本申请提供一种融合基因，所述融合基因的序列中含有SEQID NO：1所示的LPPS基因序列、SEQ ID NO： 2所示的TPS基因序列；
可选地，所述融合基因的序列含有以下片段中的任一种：
融合基因1：SEQ ID NO：2所示的TPS基因通过连接肽GGGS与SEQ ID NO：1所示的LPPS基因融合，按照TPS基因-连接肽 GGGGS-LPPS基因排列，获得融合基因1；
融合基因2：SEQ ID NO：1所示的LPPS基因通过连接肽GGGS与SEQ ID NO：2所示的TPS基因融合，获得融合基因2；
融合基因3：将SEQ ID NO：1所示的LPPS基因和终止子TPYK1融合成长片段一，将启动子PeTDH3、SEQ ID NO：2所示的TPS 基因和终止子TPRM9融合成长片段二，将长片段一和长片段二融合，获得融合基因3；
可选地，所述连接肽GGGS的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
可选地，所述融合基因还含有SEQ ID NO：3所示的麦芽糖结合蛋白编码基因序列；
可选地，所述融合基因的序列含有以下片段：
SEQ ID NO：2所示的TPS基因与SEQ ID NO：1所示的LPPS基因融合，连接肽为GGGS，获得融合基因1；融合基因1的N端与SEQ ID NO：3所示的麦芽糖结合蛋白编码基因MBP融合，连接肽为Gly6；
可选地，所述Gly6的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
可选地，所述酿酒酵母基因工程菌通过用含有融合基因的片段替换出发菌株中的XI-3基因得到。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌的构建方法包括：将SEQ ID NO：2所示的 TPS基因与SEQ ID NO：1所示的LPPS基因融合，连接肽为GGGS，获得融合基因1；融合基因1的N端与SEQ ID NO：3所示的麦芽糖结合蛋白编码基因融合，获得融合基因2；融合基因2连同质粒pgRNA-XI-3转入出发菌株，无缝敲除GAL80基因，获得产香紫苏醇的酿酒酵母基因工程菌。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，通过在出发菌株强化表达了异戊二烯生物合成途径限速酶基因得到，包括截断型羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，突变型HMG2K6R，来源于Silicibacter pomeroyi NADH依赖型SpHMGR，乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10，HMG2K6R，内源GGPP合成酶与来自Phomopsis amygdali的GGPP合成酶融合蛋白基因 BTS1-PaGGPPS并突变了基因组中FPP合成酶基因为ERG20F96C及采用PHXT1替换ERG9启动子动态调控ERG9表达中的至少一种。
可选地，包括截断型羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1，突变型HMG2K6R，来源于Silicibacter pomeroyi NADH依赖型 SpHMGR，乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10，HMG2K6R，内源GGPP合成酶与来自Phomopsis amygdali的GGPP合成酶融合蛋白基因BTS1-PaGGPPS(连接肽为GGGS)并突变了基因组中FPP合成酶基因为ERG20F96C及采用PHXT1替换ERG9启动子动态调控ERG9 表达。
可选地，所述出发菌株为酿酒酵母基因工程菌CXM01*。
可选地，所述SpHMGR的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
可选地，所述PaGGPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，通过在出发菌株中强化了中心代谢途径得到，包括增加了前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供给，包括表达来自Mus musculus的ATP依赖型柠檬酸裂解酶基因MmACL，来自Rhodospuridium toruloides 的NADP+依赖型苹果酸合成酶基因RtME和柠檬酸合成酶1基因RtCIT1，去除过氧化物酶体信号肽的苹果酸脱氢酶基因’MDH3，柠檬酸转运蛋白基因CTP1，丙酮酸羧化酶1基因PYC1，丙酮酸转运蛋白1和3基因MPC1和MPC3，来自Aspergillus nidulans的ATP依赖型柠檬酸裂解酶a和b基因AnACLa和AnACLb，NADP特异性异柠檬酸脱氢酶2基因IDP2，柠檬酸、α-酮戊二酸转运蛋白基因YHM2，磷酸葡萄糖脱氢酶异构体1基因GND1，转酮酶基因TKL1，转醛缩酶基因TAL1，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因ZWF1，线粒体NAD+依赖异柠檬酸脱氢酶基因IDH2并采用PGSY1替换PGI1启动子弱化PGI1表达中的至少一种。
可选地，包括增加了前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供给，包括表达来自Musmusculus的ATP依赖型柠檬酸裂解酶基因 MmACL，来自Rhodospuridium toruloides的NADP+依赖型苹果酸合成酶基因RtME和柠檬酸合成酶1基因RtCIT1，去除过氧化物酶体信号肽的苹果酸脱氢酶基因’MDH3，柠檬酸转运蛋白基因CTP1，丙酮酸羧化酶1基因PYC1，丙酮酸转运蛋白1和3基因MPC1和MPC3，来自Aspergillus nidulans的ATP依赖型柠檬酸裂解酶a和b基因AnACLa和AnACLb，NADP特异性异柠檬酸脱氢酶2基因IDP2，柠檬酸、α-酮戊二酸转运蛋白基因YHM2，磷酸葡萄糖脱氢酶异构体1基因GND1，转酮酶基因TKL1，转醛缩酶基因TAL1，6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因ZWF1，线粒体NAD+依赖异柠檬酸脱氢酶基因IDH2并采用PGSY1替换PGI1启动子弱化PGI1表达。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，在出发菌株中敲除了调控因子基因，所述调控因子基因包括ROX1、 DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c中的至少一种；
可选地，所述调控因子基因包括ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c；
可选地，所述出发菌株为酿酒酵母基因工程菌SCX38。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母二倍体菌株，将产香紫苏醇的酿酒酵母基因工程菌SCX42由MATa转换为MATα得到SCX42-α，将SCX42由缺陷型ura3-、his3-转变为ura3-、met3得到SCX42*，然后将SCX42*与SCX42-α共培养获得二倍体菌株。
作为一种实施方案，本申请提供一种酿酒酵母基因工程菌，所述酿酒酵母基因工程菌通过在出发菌株过表达：ANB1，DAN1，HUG1， PYK1，LAC1，CYB5，YCL021W-A，YCL074W，OYE3，OYE2，HSP31，BLI1中的至少一种；
或敲除：SPS4，YOR314W，SUL1，CDA2，ERV15，ZRT1，DSE1，ANB1中的至少一种得到；
可选地，所述出发菌株选自CXM01*、CXM17、CXM18、SCX38和SCX42中的任一种；
可选地，所述CXM18由CXM17敲除转录因子ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c获得；
可选地，所述酿酒酵母基因工程菌通过在出发菌株过表达：ANB1，DAN1，HUG1，PYK1，LAC1，CYB5，YCL021W-A，YCL074W， OYE3，OYE2，HSP31，BLI1，和敲除：SPS4，YOR314W，SUL1，CDA2，ERV15，ZRT1，DSE1，ANB1得到。
作为一种实施方案，提供上述任一项所述的酿酒酵母基因工程菌或上述任一项所述的酿酒酵母二倍体菌株在合成香紫苏醇中的应用；
可选地，所述香紫苏醇的制备方法，将上述任一项所述的酿酒酵母工程菌采用基础成分培养基，添加20-25g/L葡萄糖，初始pH 为5-6，室温震荡培养；转接于含有发酵培养基的容器中，室温震荡发酵培养96-120h，发酵液中即包含了香紫苏醇。
本申请可产生的有益效果包括：
(1)本申请所提供的工程菌的构建方法，优化了宿主菌株的香紫苏醇合成酶，有利于提高香紫苏醇的产率。
(2)本申请所提供的工程菌的构建方法，通过强化酿酒酵母MVA途径、强化中心代谢、转录因子调控提高香紫苏醇产量。
附图说明
图1示出了代谢工程改造策略促进酿酒酵母香紫苏醇合成示意图。
图2示出了优化香紫苏醇合成酶时的香紫苏醇产量情况。
图3示出了强化酿酒酵母MVA途径、强化中心代谢、转录因子调控提高香紫苏醇产量情况。
图4示出了转录组测序筛出的靶点改造香紫苏醇产量情况，其中A为过表达靶点基因香紫苏醇产量情况；B为敲除靶点基因香紫苏醇产量情况。
图5示出了摇瓶批式补料发酵香紫苏醇的产量情况，其中A为补料时间；B为生长情况；C为香紫苏醇产量情况。
图6示出了发酵罐批式补料发酵香紫苏醇的产量情况；A为香紫苏醇产量情况；B为生长情况。
图7示出了酿酒酵母合成香紫苏醇的气相色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请实施例中基于Euroscarf(Oberursel,Germany)公司的CEN.PK113-11C菌株(MATa MAL2-8c SUC2 his3Δ1ura3-52)进行改造。本申请的基因改造借助CRISPR/Cas9系统完成(可参考文献Mans R,van Rossum HM,Wijsman M,Backx A,Kuijpers NG,van denBroek M,Daran-Lapujade P,Pronk JT,van Maris AJ,Daran JM.CRISPR/Cas9:amolecular Swiss army knife for simultaneous introduction of multiple geneticmodifications in Saccharomyces cerevisiae.FEMS Yeast Res.2015Mar；15(2):fov004.)
本申请代谢工程改造策略促进酿酒酵母香紫苏醇合成示意图如图所示。
表1.本申请实施例中优化MVA合成途径涉及到的基因相关信息
Figure BDA0003413608140000041
表2.本申请实施例强化中心代谢途径涉及到的基因相关信息
Figure BDA0003413608140000051
表3.本申请实施例涉及到的部分位点靶向序列
Figure BDA0003413608140000052
表4.本申请实施例中培养基中的组分组成
Figure BDA0003413608140000053
Figure BDA0003413608140000061
作为一种实施方案，本申请提供一种产香紫苏醇的酿酒酵母菌株的构建方法，能够显著增加香紫苏醇的产量。
所述构建方法包括：香紫苏醇合成酶的优化，甲羟戊酸途径(MVA)强化，中心代谢途径优化、全局调控以及二倍体优化。
在一个具体实施方案中，分别构建质粒pYX312-L+T，pYX312-LT和pYX312-TL。pYX312质粒由本实验室构建，将pYX212质粒上PTPI启动子替换为增强型PeTDH3启动子获得，其中PeTDH3启动子参考文献(Blazeck et al.Biotechnol Bioeng,2012,109(11): 2884-2895.)扩增融合获得。为了构建pYX312-L+T，LPPS基因和TPS基因由密码子优化后全基因合成获得。PeTDH3以pYX312为模板扩增获得。终止子TPYK1和TPRM9以CEN.PK113-11C基因组(野生型酿酒酵母)为模板扩增获得。将LPPS基因和TPYK1用OE-PCR 方法(融合片段构建过程参考Zhou et al.J Am Chem Soc 2012,134:3234-3241)融合成长片段一，将PeTDH3、TPS和TPRM9用OE-PCR 方法融合成长片段二；为了构建pYX312-LT，将LPPS基因和TPS基因用OE-PCR方法融合成LT基因。为了构建pYX312-TL，将TPS 基因和LPPS基因用OE-PCR方法融合成TL基因。将pYX312(EcoRI/HindIII)分别与长片段一、二，LT融合基因，TL融合基因用无缝克隆方法连接，并转化大肠杆菌感受态。经菌落PCR验证和测序正确的质粒分别命名为pYX312-L+T，pYX312-LT和pYX312-TL。
进一步地，将质粒PYX312-L+T，PYX312-LT和PYX312-TL转入工程菌XC07，基因型(MATa；MAL2-8c；SUC2；his3Δ1； ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1；XI-3::PGAL7-MBP-TL-TADH1；gal80Δ；X4::PTDH3-SpHMGR-TPRM9；X2::PTPI1-BTS1- ERG20-TFBA1；PERG9::PHXT1)，经过发酵提取香紫苏醇并检测得出结论：TPS～LPPS融合方式最有利于香紫苏醇合成(图2)。
进一步地，在TL融合基因基础上，融合麦芽糖结合蛋白编码基因MBP。具体实施方式如下：将MBP基因分别与TL基因的N端和C端融合，获得融合基因MBP-TL和TL-MBP。将TL、融合基因MBP-TL和TL-MBP分别与启动子PGAL7和终止子TADH1及XI-3位点的上下游同源臂融合获得供体DNA。
进一步地，借助CRISPR/Cas9系统，将融合基因MBP-TL、TL-MBP和TL整合到工程菌SCX22(基因型：MATa；MAL2-8c；SUC2；ura3Δ； hfd1Δ；gal80Δ；gal1Δ；gal7Δ；his3Δ::(PTPI-MmACL-TFBA1)+(PTDH3-RtME-TCYC1)+(PtHXT7-’MDH3-TTDH2)+(PPGK1-CTP1-THIS3)；X1-5::PTEF1-Cas9-T CYC1；pyc1::PTEF1-PYC1；X1-4::(PTPI1-MPC1)+(PPGK1-MPC3-TDIT1)；X1-2::(PGAL1-AnACLa-TCYC1)+(PGAL10-AnACLb-TADH1)；gal10Δ::(PTPI1-RtCIT1 -TFBA1)+(PTDH3-IDP2-TCYC1)+(PTEF1-YHM2-TGAL1)；pgi1Δ::(PCOX9-PGI1)+(PTDH3-GND1-TCYC1)+(PtHXT7-TKL1-TTDH2)+(PPGK1-TAL1-TADH1)+(PTE F1-ZWF1)；idh2Δ::PGSY1-IDH2；ERG20::PTDH3-ERG20(F96C)；FAA4::FAA4+PTDH3-tHMG1-TFAA4；POX1::POX1+PtHXT7-SpHMGR-TPOX1；’tesAΔ；Rtf as1Δ；Rtfas2Δ；PACC1-ACC1)基因组中。CRISPR/Cas9系统构建的具体步骤是：通过融合PCR方法获得完整同源重组片段包含整合位点的上下游序列、启动子PTEF1、终止子TCYC1的Cas9基因及筛选抗性KanMX基因，将同源重组片段500ng转化入酿酒酵母出发菌株 CENPK113-11C，获得带有Cas9蛋白的酿酒酵母菌株。
进一步地，构建靶向染色体整合位点XI-3的sgRNA表达载体；随后，将sgRNA表达载体和供体DNA(各500ng)，通过化学转化法转化到SCX22中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株分别命名为工程菌SCX23、SCX24和SCX25。
进一步地，经过发酵提取香紫苏醇并检测确认MBP-TL融合方式(SCX23)最有利于香紫苏醇合成(图2)。
进一步地，将MBP-TL融合基因整合到出发菌株CENPK113-11C并敲除GAL80基因获得工程菌CXM01*。
进一步地，优化MVA合成途径。借助CRISPR/Cas9系统，将甲羟戊酸相关限速基因采用不同启动子和终止子构建表达盒，并整合到基因组不同位点(位点选择参考文献Mikkelsen et al.,Metab.Eng.2012,14:104-111)，获得MVA途径优化工程菌CXM17。其主要基因及位点(不限于)如表1所示。
进一步地，MVA途径相关基因表达盒构建和基因组整合的具体步骤是：首先，构建靶向染色体整合位点的sgRNA表达载体和基因表达盒；然后，分别扩增整合位点上下游各300bp序列、基因阅读框、启动子和终止子并通过融合PCR方法(融合片段构建过程参考J AmChem Soc 2012,134:3234-3241)获得完整供体DNA片段；随后，将sgRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。下文中酿酒酵母其它基因组编辑工作均遵循相似流程。以整合 HMG2K6R和ERG10基因到染色体XII-2位点为例：构建靶向染色体XII-2位点的sgRNA表达载体；与此同时，构建HMG2K6R和ERG10 基因表达盒，分别扩增基因XII-2位点上下游各300bp序列，基因HMG2K6R，ERG10，双向启动子PGAL10-1，终止子TPYK1和终止子TENO2，通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；随后经上述方法转化、验证，获得正确转化子。
进一步地，经过发酵提取并检测，工程菌CXM17香紫苏醇单位OD600产量达到13.37mg/L/OD600(图3)。
进一步地，强化中心代谢途径，借助CRISPR/Cas9系统，将中心代谢相关限速基因采用不同启动子和终止子构建表达盒(表2)，并整合到基因组不同位点上，获得MVA途径和中心代谢途径优化的工程菌SCX38。
进一步地，经过发酵提取并检测，工程菌SCX38香紫苏醇产量达到26.29mg/L/OD600(图3)。
进一步地，敲除影响萜类合成的转录因子ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c，获得工程菌SCX42。
进一步地，具体实施方法以ROX1基因为例：首先，构建靶向ROX1基因ORF框的sgRNA表达载体；然后，分别扩增ROX1基因上下游各300bp序列并通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；随后，将gRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。其它5个转录因子靶点敲除均遵循上述过程，实现无缝敲除。
进一步地，经过发酵提取并检测，工程菌SCX42香紫苏醇产量达到75.38mg/L/OD600(图3)。
本发明的第二方面，构建一株能高效生物合成香紫苏醇的二倍体。
所述构建方法包括：工程菌配型由MATa转换为MATα，以及MATa和MATα实现二倍体交配。
在一个具体实施方案中，将工程菌SCX42由MATa转换为MATα，借助CRISPR/Cas9系统，首先，构建靶向MATa区域的sgRNA 表达载体；然后，以MATα基因组为模板，扩增基因组配型区域；随后，将gRNA表达载体和供体DNA(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR扩增后送测序显示配型为α型的转化子，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株命名为SCX42-α。
进一步地，将SCX42由缺陷型ura3-、his3-转变为ura3-、met3-，具体实施方案是：构建靶向MET3基因区域的sgRNA表达载体，然后扩增MET3基因上下游各300bp及HIS3基因ORF框，并通过融合PCR获得供体DNA。随后，将gRNA表达载体和基因表达盒 (各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株命名为SCX42*。
进一步地，将工程菌SCX42-α与SCX42*分别在YPD培养基中单独培养，然后各取0.5mL菌液混合接种于20mL YPD培养基，培养48h。取发酵液离心，水洗两遍后适当稀释并涂布于SD-URA3固体培养基，长出的单菌落即为二倍体。
本发明的第三方面，对工程菌实施转录组测序分析，获得能进一步提高香紫苏醇产量的基因靶点。
所述方法包括：对工程菌CXM01*、CXM17、CXM18(由工程菌CXM17敲除转录因子ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、 YGR259c获得)、SCX38和SCX42进行转录组测序，并分析获得可能有利于香紫苏醇合成的改造靶点，并通过过表达或者敲除方式找到能进一步提高香紫苏醇合成的靶点。
在一个具体实施方案中，将工程菌CXM01*、CXM17、CXM18、SCX38和SCX42发酵培养后分别取发酵液中葡萄糖残余6-10g/L 和乙醇利用时期的菌体进行转录组测序，并通过对比上述五株菌基因表达差异获得过表达和敲除改造靶点。
进一步地，对上述靶点进行过表达或者敲除分析。具体实施方案是：借助CRISPR/Cas9系统，将基因过表达靶点分别与启动子PGAL7和终止子TENO2融合，并整合到工程菌XI-6位点。对于基因敲除靶点，则实施基因无缝敲除。
进一步地，经过发酵提取并检测工程菌香紫苏醇产量。如图4所示，靶点基因DAN1，HUG1，LAC1，OYE3和OYE2过表达及靶点基因SUL1，CDA2，ERV15，ZRT1，DSE1和ANB1敲除对香紫苏醇合成都能起到促进作用。其中最高产量为1.1g/L。
本申请具体实施例中，染色体整合位点序列XI-3，XI-1，XII-2，XII-3，XI-2参考文献(Mikkelsen et al.,Metab.Eng.2012,14:104-111) 获得。染色体整合位点靶向序列参考表3。培养基配方参考表4。
实施例1香紫苏醇合成酶基因的优化
分别构建质粒pYX312-L+T，pYX312-LT和pYX312-TL。pYX312质粒由本实验室构建，将pYX212质粒(购于Addgene)上PTPI启动子替换为增强型PeTDH3启动子获得，其中PeTDH3启动子参考文献(Blazeck et al.Biotechnol Bioeng,2012,109(11):2884-2895.)扩增融合获得。为了构建pYX312-L+T，LPPS基因和TPS基因经密码子优化后全基因合成获得，LPPS基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，TPS基因优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。PeTDH3以PYX312为模板扩增获得。终止子TPYK1和TPRM9以 CEN.PK113-11C基因组为模板扩增获得。将LPPS基因和TPYK1用OE-PCR方法(融合片段构建过程参考J Am Chem Soc 2012,134:3234-3241)融合成长片段一，将PeTDH3、TPS和TPRM9用OE-PCR方法融合成长片段二。为了构建pYX312-LT，将LPPS基因和 TPS基因用OE-PCR方法融合成LT基因(连接肽为GGGS，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)；为了构建pYX312-TL，将TPS基因和LPPS基因用OE-PCR方法融合成TL基因(连接肽为GGGS)。将pYX312(EcoRI/HindIII)分别与长片段一、二，LT融合基因，TL融合基因用无缝克隆方法连接，并转化大肠杆菌感受态。经菌落PCR验证和测序正确的质粒分别命名为pYX312-L+T， pYX312-LT和pYX312-TL。
将质粒pYX312-L+T，pYX312-LT和pYX312-TL转入工程菌XC07，工程菌XC07为在CEN.PK-113-11C的基础上改造，基因型为(MATa；MAL2-8c；SUC2；his3Δ1；ura3-52；XI-5::PTEF1-Cas9-TCYC1；XI-3::PGAL7-MBP-TL-TADH1；gal80Δ；X4::PTDH3-SpHMGR-TPRM9；X2::PTPI1-BTS1-ERG20-TFBA1；PERG9::PHXT1)，经过发酵提取香紫苏醇并检测确认TPS～LPPS融合方式最有利于香紫苏醇合成(图2)，发酵条件：活化后的菌株于培养基中，30℃，220rpm震荡培养24h，转接于15mL Delft-D发酵培养基/100mL摇瓶，初始OD600＝0.1，30℃，220 rpm条件下发酵96h，测定生物量及香紫苏醇产量。
在TL融合基因基础上，融合麦芽糖结合蛋白编码基因MBP。具体实施方式如下：将MBP基因分别与TL基因的5’端和3’端融合 (连接肽为Gly6，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：7所示)，获得融合基因MBP-TL和TL-MBP。将TL、融合基因MBP-TL 和TL-MBP分别与PGAL7和终止子TADH1及XI-3位点的上下游同源臂融合获得供体DNA。参考CRISPR/Cas9系统(Mans R,et al.FEMS Yeast Res.2015Mar；15(2):fov004.)，将融合基因整合到工程菌SCX22的基因组中，工程菌SCX22为在CEN.PK-113-11C的基础上改造，基因型：MATa；MAL2-8c；SUC2；ura3Δ；hfd1Δ；gal80Δ；gal1Δ；gal7Δ；his3Δ::(PTPI-MmACL-TFBA1)+(PTDH3-RtME-TCYC1)+(PtHXT7-’MDH3- TTDH2)+(PPGK1-CTP1-THIS3)；X1-5::PTEF1-Cas9-TCYC1；pyc1::PTEF1-PYC1；X1-4::(PTPI1-MPC1)+(PPGK1-MPC3-TDIT1)；X1-2::(PGAL1-AnACLa-TCYC1) +(PGAL10-AnACLb-TADH1)；gal10Δ::(PTPI1-RtCIT1-TFBA1)+(PTDH3-IDP2-TCYC1)+(PTEF1-YHM2-TGAL1)；pgi1Δ::(PCOX9-PGI1)+(PTDH3-GND1-TCYC1)+( PtHXT7-TKL1-TTDH2)+(PPGK1-TAL1-TADH1)+(PTEF1-ZWF1)；idh2Δ::PGSY1-IDH2；Erg20::PTDH3-Erg20(F96C)；FAA4::FAA4+PTDH3-tHMG1-TFAA4；POX1::POX1+PtHXT7-SpHMGR-TPOX1；’tesAΔ；Rtfas1Δ；Rtfas2Δ；PACC1-ACC1。整合方法如下：构建靶向染色体整合位点XI-3的sgRNA表达载体；随后，将sgRNA表达载体和供体DNA(XI-3up-PGAL7-MBP-TL-TADH1-XI-3dw；XI-3up-PGAL7-TL-MBP-TADH1-XI-3dw； XI-3up-PGAL7-TL-TADH1-XI-3dw)各500ng，通过化学分别转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。质粒丢失后的菌株分别命名为工程菌SCX23、SCX24和SCX25。经过发酵提取香紫苏醇并检测确认MBP-TL融合方式(SCX23)最有利于香紫苏醇合成(图2)。
实施例2MVA途径供给对酿酒酵母合成香紫苏醇的影响
以CEN.PK113-11C为出发菌，在XI-3位点整合MBP-TL融合基因(整合方法同实施例1)，敲除GAL80基因，获得工程菌CXM01*。在工程菌CXM01*中过表达截断型tHMG1基因于FAA4位点(供体DNA为FAA4up-FAA4-TAHD1-kanMX-PTHD3-tHMG1-FAA4dw)；过表达SpHMGR基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)于POX1位点(供体DNA为POX1up-POX1-TTDH2-kanMX-PtHXT7-SpHMGR-POX1dw)。将基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C即将碱基TTC突变为TGT。将HMG2K6R和ERG10基因整合到XII-2位点(供体DNA为 XII-2up-TENO2-HMG2K6R-PGAL10-1-ERG10-TPYK1-XII-2dw)；在XII-3位点整合两个拷贝的HMG2K6R(供体DNA为XII-3up-TPDC1-HMG2K6R-PGAL10-1-HMG2K6R-TENO2-XII-3dw)；将ERG9基因启动子替换为PHXT1；将BTS1和PaGGPPS(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)基因通过蛋白融合表达方式连接并整合到XI-2位点(供体DNA为XI-2up-PGAL7-BTS1-PaGGPPS-TTDH2-XI-2dw)，获得工程菌CXM17。
MVA途径相关基因表达盒构建和基因组整合的具体步骤以整合tHMG1到FAA4位点为例，首先分别扩增FAA4up-FAA4、TAHD1、 kanMX、PTHD3、tHMG1、TFAA4并通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段FAA4up-FAA4-TAHD1-kanMX-PTHD3-tHMG1-TFAA4；随后，将供体DNA片段500ng通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体YPD+G418培养基培养后，通过菌落PCR验证正确的，继续转化pgRNA-kanMX和供体TAHD1-PTHD3以丢失KanMX筛选抗性基因。经验证正确的转化子涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。下文中酿酒酵母其它基因组编辑工作均遵循相似流程。其中HMG2K6R基因采用引物(F：ATGTCACTTCCCTTAAGAACGATAGTACATTTG；R：TAATAATGCTGAGGTTTTACAGGGGGG)以 CEN.PK113-11C为模板扩增获得。
工程菌发酵过程采用15mL Delft-D发酵培养基/100mL摇瓶，初始pH为5.6。初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定生物量及香紫苏醇产量。如图3所示，通过强化MVA途径获得CXM17，单位OD600香紫苏醇产量达到13.4mg/L/OD600。
实施例3强化中心代谢提高香紫苏醇合成效率
在MVA优化菌株CXM17的基础上，优化酿酒酵母中心代谢途径以强化前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH的供应，得到工程菌 SCX38。详细过程如下所示。将ATP依赖的柠檬酸裂解酶MmACL基因、苹果酸合成酶RtME基因、去除信号肽的苹果酸脱氢酶’MDH3 基因和柠檬酸转运蛋白编码基因CTP1整合到HIS3基因位点(供体DNA为 HIS3up-HIS3-PTPI1-MmACL-TFBA1-PTDH3-RtME-TCYC1-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-PPGK1-CTP1-TADH1-PTEF1-‘tesA-THIS3)；将丙酮酸羧化酶基因启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；过表达丙酮酸转运蛋白编码基因MPC1和MPC3于XI-4位点(供体DNA为 XI-4up-PtHXT7-MPC3-TDIT1-TMPC1-MPC1-PTPI1-XI-4dw)；将AnACL基因(AnACLa和AnACLb)整合到X2位点(供体DNA为 X2up-TCYC1-AnACLa-PGAL1-PGAL10-AnACLb-TADH1-X2dw)；将柠檬酸合成酶基因RtCIT1、异柠檬酸脱氢酶基因IDP2和柠檬酸、草酰乙酸和α-酮戊二酸转运蛋白编码基因YHM2基因整合到GAL1、GAL7和GAL10位点(供体DNA为 TGAL7-PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTHD3-PTEF1-YHM2-TGAL1)，即整合该DNA片段的同时敲除GAL1、GAL7、GAL10三个基因；将6 磷酸葡萄糖异构酶PGI1基因启动子替换为启动子PCOX9并过表达磷酸戊糖途径GND1、TKL1、TAL1和ZWF1基因，供体DNA为 PGI1-PCOX9-TCYC1-GND1-PTHD3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1-PGI1up；将异柠檬酸脱氢酶IDH2基因启动子PIDH2替换为启动子PGSY1。
本实施例工程菌具体改造方法均可参考文献(Yu et al.,Cell,2018:174:1549-1558e1514.)获得。工程菌发酵过程采用15mL Delft-D 发酵培养基/100mL摇瓶，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm条件下发酵96h，测定生物量及香紫苏醇产量。香紫苏醇采用正己烷萃取，并以香紫苏内酯作为内标，利用GC-MS检测。如图3所示，香紫苏醇产量显著提高至26.2mg/L/OD600。
实施例4靶点调控对酿酒酵母合成香紫苏醇的影响
工程菌SCX38敲除基因ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c，获得工程菌SCX42。具体实施方法以ROX1基因为例：首先，构建靶向ROX1基因ORF框的sgRNA表达载体；然后，分别扩增ROX1基因上下游各300bp序列并通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；随后，将gRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。其它5个转录因子靶点敲除均遵循上述过程，实现无缝敲除。
工程菌发酵过程采用工程菌发酵过程采用15mL Delft-D发酵培养基/100mL摇瓶，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm 条件下发酵96h，测定生物量及香紫苏醇产量。香紫苏醇采用正己烷萃取，并以香紫苏内酯作为内标，利用GC-MS检测。如图3所示，通过对相关靶点基因进一步敲除，香紫苏醇产量达到934mg/L，单位OD600产量为75.4mg/L/OD600，是迄今为止的最高产量，证明了酿酒酵母作为细胞工厂生产香紫苏醇的巨大潜力。所得的香紫苏醇峰图如图7所示。
实施例5香紫苏醇合成的酿酒酵母二倍体菌株构建
将工程菌SCX42由MATa转换为MATα，借助CRISPR/Cas9系统，首先，构建靶向MATa区域的sgRNA表达载体；然后，以MATα基因组为模板，扩增基因组配型区域；随后，将gRNA-HMRa表达载体和供体DNA(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR扩增后送测序显示配型为α型的转化子，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株命名为SCX42-α。配型转换改造方法可参考专利(天津大学.一种转换酵母交配型的方法:CN201610102424.8[P].2016-04-13.)获得。
将SCX42由缺陷型ura3-、his3-转变为ura3-、met3-，具体实施方案是：构建靶向MET3基因区域的sgRNA表达载体，然后扩增 MET3基因上下游各300bp及HIS3基因ORF框，并通过融合PCR获得供体DNA。随后，将gRNA表达载体和基因表达盒(各500ng)，通过化学转化法转化到酿酒酵母中，涂布到筛选平板于30℃静置培养3天，转化子经液体SD培养基培养后，通过菌落PCR验证正确，涂布于含有5-氟乳清酸的平板进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株命名为SCX42*。
将工程菌SCX42-α与SCX42*分别在YPD培养基中单独培养，然后各取0.5mL菌液混合接种于20mL YPD培养基，培养48h。取发酵液离心，水洗两遍后适当稀释并涂布于SD-URA3固体培养基，长出的单菌落即为二倍体。
实施例6
工程菌转录组测序分析并实施改造获得过表达或敲除靶点
将工程菌CXM01*、CXM17、CXM18(CXM18由工程菌CXM17敲除转录因子ROX1、DOS2、VBA5、YER134c、YNR063w、YGR259c 获得)、SCX38和SCX42于基础成分培养基((Delft-D中加入葡萄糖浓度为20g/L)发酵培养，并分别在葡萄糖剩余浓度为10g/L时间点及葡萄糖耗完乙醇利用时期取菌体进行转录组测序，分析获得可能有利于香紫苏醇合成的改造靶点，其中过表达靶点：ANB1， DAN1，HUG1，PYK1，LAC1，CYB5，YCL021W-A，YCL074W，OYE3，OYE2，HSP31，BLI1；敲除靶点：SPS4，YOR314W，SUL1， CDA2，ERV15，ZRT1，DSE1，ANB1。改造靶点均可在Saccharomyces Genome Database(https://www.yeastgenome.org/)中查找。
借助CRISPR/Cas9系统，将基因过表达靶点分别与启动子PGAL7和终止子TENO2融合，并整合到工程菌XI-6位点。对于基因敲除靶点，则实施ORF无缝敲除。
工程菌发酵过程采用工程菌发酵过程采用15mL Delft-D发酵培养基/100mL摇瓶，初始pH为5.6，初始OD600＝0.1，30℃，220rpm 条件下发酵96h，测定生物量及香紫苏醇产量。香紫苏醇采用正己烷萃取，并以香紫苏内酯作为内标，利用GC-MS检测。
如图4所示，在SCX42中，靶点基因DNA1，HUG1，LAC1，OYE3和OYE2过表达及靶点基因SUL1，CDA2，ERV15，ZRT1， DSE1和ANB1敲除对香紫苏醇合成都能起到促进作用。其中过表达LAC1基因使得香紫苏醇达到最高产量，1.1g/L(图4)。
实施例7
香紫苏醇批式补料发酵
(1)工程菌摇瓶批试补料发酵
摇瓶批试补料发酵采用50mL发酵液/250mL锥形瓶培养体系，选取工程菌SCX42和二倍体。批试发酵时采用基础成分培养基(Delft-A和Delft-D)，体积为50mL，接种OD600＝0.2，pH为5.6。补料培养时采用3ⅹDelft-A培养基(Delft-A培养基中加入500g/L 的葡萄糖)或者3ⅹDelft-D培养基(Delft-D培养基中加入500g/L的葡萄糖)待批试发酵葡萄糖消耗完即添加1mL的3ⅹDelft-A 培养基或2mL的3ⅹDelft-D培养基，并且每24h用4M氢氧化钾调pH到5.6。补料时间点(即对应图中的补糖时间点)如图5A 所示，其中，二倍体在黑点和灰点所示的时间点补料，而其他的工程菌仅在黑点所示的时间点补料。在30℃，220rpm条件下发酵8d，测定生物量及香紫苏醇产量。香紫苏醇采用正己烷萃取，并以香紫苏内酯作为内标，利用GC-MS检测。如图5B和5C所示，工程菌 SCX42在补Delft-D时生长情况略微优于Delft-A培养基，而香紫苏醇含量显著优于Delft-A(2.2g/L)，达到4.5g/L；在同样补Delft-A 的情况下，SCX42生长较二倍体更快，但二倍体香紫苏醇含量略高于工程菌SCX42，为2.4g/L。以上结果说明Delft-D培养基相比Delft-A 培养基更适合用于工程菌发酵生产香紫苏醇。
(2)工程菌平行生物反应器批试补料发酵
为了获得更高产量的工程菌，我们在工程菌SCX42中过表达LAC1和OYE2基因，获得工程菌SCX42-LAC1-OYE2。批试补料发酵采用1L的DasGip平行生物反应器系统，批试发酵体积为0.4L。批试发酵采用基础成分培养基(Delft-D中加入葡萄糖浓度为20g/L)，体积为0.4L，接种OD600＝0.4，pH为5.6。补料培养基采用4ⅹD培养基(Delft-D中加入葡萄糖浓度为500g/L)。补料方式采用指数补料，μ＝0.05。批试发酵中葡萄糖耗完，即开始指数补料。在发酵过程中存在香紫苏醇颗粒及菌体黏附在发酵罐罐壁、电极等的现象。最终香紫苏醇产量需将所有黏附的颗粒悬浮到发酵液中定量。
如图6所示，工程菌SCX42-LAC1-OYE2最高产量为11.4g/L。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 一种工程菌的构建方法及其应用
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2358
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacttctg ttaacttgtc tagagctcca gctgctatca ctagaagaag attgcaattg 60
caaccagaat tccatgctga atgttcttgg ttgaagtctt cttctaagca tgctccattg 120
actttgtctt gtcaaatcag accaaagcaa ttgtctcaaa tcgctgaatt gagagttact 180
tctttggacg cttctcaagc ttctgaaaag gacatctctt tggttcaaac tccacataag 240
gttgaagtta acgaaaagat cgaagaatct atcgaatacg ttcaaaactt gttgatgact 300
tctggtgacg gtagaatctc tgtttctcca tacgacactg ctgttatcgc tttgatcaag 360
gacttgaagg gtagagacgc tccacaattc ccatcttgtt tggaatggat cgctcatcat 420
caattggctg acggttcttg gggtgacgaa ttcttctgta tctacgacag aatcttgaac 480
actttggctt gtgttgttgc tttgaagtct tggaacttgc attctgacat catcgaaaag 540
ggtgttactt acatcaagga aaacgttcat aagttgaagg gtgctaacgt tgaacataga 600
actgctggtt tcgaattggt tgttccaact ttcatgcaaa tggctactga cttgggtatc 660
caagacttgc catacgacca tccattgatc aaggaaatcg ctgacactaa gcaacaaaga 720
ttgaaggaaa tcccaaagga cttggtttac caaatgccaa ctaacttgtt gtactctttg 780
gaaggtttgg gtgacttgga atgggaaaga ttgttgaagt tgcaatctgg taacggttct 840
ttcttgactt ctccatcttc tactgctgct gttttgatgc atactaagga cgaaaagtgt 900
ttgaagtaca tcgaaaacgc tttgaagaac tgtgacggtg gtgctccaca tacttaccca 960
gttgacatct tctctagatt gtgggctatc gacagattgc aaagattggg tatctctaga 1020
ttcttccaac atgaaatcaa gtacttcttg gaccatatcg aatctgtttg ggaagaaact 1080
ggtgttttct ctggtagata cactaagttc tctgacatcg acgacacttc tatgggtgtt 1140
agattgttga agatgcatgg ttacgacgtt gacccaaacg ttttgaagca tttcaagcaa 1200
caagacggta agttctcttg ttacatcggt caatctgttg aatctgcttc tccaatgtac 1260
aacttgtaca gagctgctca attgagattc ccaggtgaag aagttttgga agaagctact 1320
aagttcgctt tcaacttctt gcaagaaatg ttggttaagg acagattgca agaaagatgg 1380
gttatctctg accatttgtt cgacgaaatc aagttgggtt tgaagatgcc atggtacgct 1440
actttgccaa gagttgaagc tgcttactac ttggaccatt acgctggttc tggtgacgtt 1500
tggatcggta agtctttcta cagaatgcca gaaatctcta acgacactta caaggaattg 1560
gctatcttgg acttcaacag atgtcaaact caacatcaat tggaatggat ccatatgcaa 1620
gaatggtacg acagatgttc tttgtctgaa ttcggtatct ctaagagaga attgttgaga 1680
tcttacttct tggctgctgc tactatcttc gaaccagaaa gaactcaaga aagattgttg 1740
tgggctaaga ctagaatctt gtctaagatg atcacttctt tcgttaacat ctctggtact 1800
actttgtctt tggactacaa cttcaacggt ttggacgaaa tcatctcttc tgctaacgaa 1860
gaccaaggtt tggctggtac tttgttggct actttccatc aattgttgga cggtttcgac 1920
atctacactt tgcatcaatt gaagcatgtt tggtctcaat ggttcatgaa ggttcaacaa 1980
ggtgaaggtt ctggtggtga agacgctgtt ttgttggcta acactttgaa catctgtgct 2040
ggtttgaacg aagacgtttt gtctaacaac gaatacactg ctttgtctac tttgactaac 2100
aagatctgta acagattggc tcaaatccaa gacaacaaga tcttgcaagt tgttgacggt 2160
tctatcaagg acaaggaatt ggaacaagac atgcaagctt tggttaagtt ggttttgcaa 2220
gaaaacggtg gtgctgttga cagaaacatc agacatactt tcttgtctgt ttctaagact 2280
ttctactacg acgcttacca tgacgacgaa actactgact tgcatatctt caaggttttg 2340
ttcagaccag ttgtttga 2436
<210> 2
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctttgg ctttcaacgt tggtgttact ccattctctg gtcaaagagt tggttctaga 60
aaggaaaagt tcccagttca aggtttccca gttactactc caaacagatc tagattgatc 120
gttaactgtt ctttgactac tatcgacttc atggctaaga tgaaggaaaa cttcaagaga 180
gaagacgaca agttcccaac tactactact ttgagatctg aagacatccc atctaacttg 240
tgtatcatcg acactttgca aagattgggt gttgaccaat tcttccaata cgaaatcaac 300
actatcttgg acaacacttt cagattgtgg caagaaaagc ataaggttat ctacggtaac 360
gttactactc atgctatggc tttcagattg ttgagagtta agggttacga agtttcttct 420
gaagaattgg ctccatacgg taaccaagaa gctgtttctc aacaaactaa cgacttgcca 480
atgatcatcg aattgtacag agctgctaac gaaagaatct acgaagaaga aagatctttg 540
gaaaagatct tggcttggac tactatcttc ttgaacaagc aagttcaaga caactctatc 600
ccagacaaga agttgcataa gttggttgaa ttctacttga gaaactacaa gggtatcact 660
atcagattgg gtgctagaag aaacttggaa ttgtacgaca tgacttacta ccaagctttg 720
aagtctacta acagattctc taacttgtgt aacgaagact tcttggtttt cgctaagcaa 780
gacttcgaca tccatgaagc tcaaaaccaa aagggtttgc aacaattgca aagatggtac 840
gctgactgta gattggacac tttgaacttc ggtagagacg ttgttatcat cgctaactac 900
ttggcttctt tgatcatcgg tgaccatgct ttcgactacg ttagattggc tttcgctaag 960
acttctgttt tggttactat catggacgac ttcttcgact gtcatggttc ttctcaagaa 1020
tgtgacaaga tcatcgaatt ggttaaggaa tggaaggaaa acccagacgc tgaatacggt 1080
tctgaagaat tggaaatctt gttcatggct ttgtacaaca ctgttaacga attggctgaa 1140
agagctagag ttgaacaagg tagatctgtt aaggaattct tggttaagtt gtgggttgaa 1200
atcttgtctg ctttcaagat cgaattggac acttggtcta acggtactca acaatctttc 1260
gacgaataca tctcttcttc ttggttgtct aacggttcta gattgactgg tttgttgact 1320
atgcaattcg ttggtgttaa gttgtctgac gaaatgttga tgtctgaaga atgtactgac 1380
ttggctagac atgtttgtat ggttggtaga ttgttgaacg acgtttgttc ttctgaaaga 1440
gaaagagaag aaaacatcgc tggtaagtct tactctatct tgttggctac tgaaaaggac 1500
ggtagaaagg tttctgaaga cgaagctatc gctgaaatca acgaaatggt tgaataccat 1560
tggagaaagg ttttgcaaat cgtttacaag aaggaatcta tcttgccaag aagatgtaag 1620
gacgttttct tggaaatggc taagggtact ttctacgctt acggtatcaa cgacgaattg 1680
acttctccac aacaatctaa ggaagacatg aagtctttcg ttttctga 1784
<210> 3
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctaaaa ttgaagaagg taaattggtt atttggatca acggagacaa aggatacaac 60
ggtttggccg aggtcggaaa gaagttcgag aaggataccg gtatcaaggt caccgtcgag 120
cacccagaca agttggagga gaaattccca caagttgctg ccactggtga cggtccagac 180
attatcttct gggcccatga tagatttggt ggatacgccc aatctggatt gttggccgag 240
attaccccag ataaggcctt ccaagataag ttgtacccat ttacttggga cgccgtcaga 300
tacaacggta agttgatcgc ctatcctatc gccgtcgagg ccttgagttt gatctacaac 360
aaagatttgt tgcctaaccc accaaagact tgggaagaga tcccagcttt ggacaaggag 420
ttgaaggcca agggaaagtc tgcccttatg ttcaacttgc aagaaccata cttcacttgg 480
ccacttatcg ctgctgacgg tggttacgcc ttcaagtacg agaacggtaa atacgacatc 540
aaggacgtcg gtgtcgataa tgctggtgcc aaggctggat tgaccttctt ggtcgacctt 600
attaaaaata agcacatgaa tgccgatacc gactactcta tcgccgaagc cgccttcaac 660
aagggtgaaa ccgccatgac catcaacggt ccatgggctt ggtctaacat cgacaccagt 720
aaggtcaact acggtgtcac cgtccttcct accttcaagg gtcagccaag taagcctttc 780
gtcggtgtcc tttctgccgg tatcaatgcc gcttctccta acaaagagct tgccaaagag 840
ttcttggaga attacttgtt gaccgacgag ggattggagg ccgtcaacaa agataagcca 900
cttggtgccg tcgcccttaa gtcttacgag gaggagttgg ccaaggatcc aagaatcgcc 960
gctactatgg agaacgccca gaagggagaa atcatgccaa acatcccaca gatgtctgcc 1020
ttctggtacg ctgtcagaac tgccgttatc aacgccgcta gtggtagaca aaccgttgac 1080
gaggccttga aggatgccca aactagaatt accaaatga 1155
<210> 4
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgctttcta ccggtctttc tttgtctcca gtccactcta acgagggaaa ggaccttcag 60
agggtcgata ctgaccacat cttcttcgag aaggccgtct tggaggctcc ttacgactac 120
atcgcctcta tgccttctaa gggagttaga gaccaattca tcgacgcctt gaacgactgg 180
ttgagggtcc cagatgtcaa ggtcggtaaa atcaaggacg ccgttagagt cttgcataac 240
tcttctttgt tgttggacga cttccaagat aactctcctt tgaggagggg taagccatct 300
acccacaata tcttcggttc tgcccagacc gttaacaccg ccacctacag tatcattaag 360
gccatcggtc agatcatgga gttctctgct ggtgagtctg tccaagaagt catgaacagt 420
atcatgattt tgttccaagg tcaagctatg gacttgttct ggacctacaa cggacacgtc 480
ccttctgagg aggagtacta tagaatgatc gaccagaaga ccggacagtt gttcagtatc 540
gccaccagtt tgcttcttaa cgccgctgac aacgagatcc caaggaccaa gatccagagt 600
tgcttgcaca gattgactag attgcttggt aggtgcttcc agattagaga cgactatcag 660
aacttggtca gtgccgacta caccaagcag aagggtttct gcgaagactt ggacgaggga 720
aagtggtctt tggccttgat ccacatgatc cacaaacaaa gaagtcacat ggccttgctt 780
aacgtcttgt ctaccggtag gaagcacggt ggtatgactt tggagcagaa gcaatttgtt 840
ttggatatta ttgaagaaga aaagtctttg gattatacta ggagtgtcat gatggacttg 900
cacgtccagc ttagggctga gatcggtagg atcgagatct tgcttgactc tcctaaccca 960
gctatgaggt tgttgttgga gcttttgagg gtccaccatc accaccacca ttaa 1046
<210> 5
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgactggta aaacaggtca tattgatggt ttaaattcta ggattgaaaa aatgagagat 60
ttagacccag cacaaagatt agttagagtt gctgaagcgg caggtttgga accagaagct 120
atttcagctt tggcaggtaa tggtgctttg cctttgtctt tggctaatgg tatgattgaa 180
aatgttattg gtaaatttga attaccattg ggtgttgcaa caaattttac tgttaatggt 240
agggattatt taattccaat ggcagttgaa gaaccatctg ttgttgcagc tgcatcttat 300
atggctagga ttgcaagaga aaatggtggt tttactgctc atggtactgc tcctttaatg 360
agggctcaaa ttcaagttgt tggtttgggt gatccagaag gtgcaagaca aagattatta 420
gcacataaag cagcatttat ggaagcagct gatgcagttg atcctgtttt agttggtttg 480
ggtggtggtt gtagggatat tgaagttcat gtttttagag atactcctgt tggtgctatg 540
gttgttttac atttaattgt tgatgttaga gatgcaatgg gtgctaatac agttaatact 600
atggcagaaa gattggctcc agaagttgaa aggattgctg gtggtacagt tagattaagg 660
attttgtcta atttagctga tttaagatta gttagggcta gagttgaatt ggctccagaa 720
actttaacaa ctcaaggtta tgatggtgca gatgttgcta ggggtatggt tgaagcatgt 780
gcattagcaa ttgttgatcc ttatagggca gctacacata ataaaggtat tatgaatggt 840
attgatcctg ttgttgttgc tacaggtaat gattggaggg ctattgaagc aggtgcacat 900
gcttatgctg ctaggacagg tcattatact tctttaacta gatgggaatt agcaaatgat 960
ggtaggttag ttggtactat tgaattacca ttagctttgg gtttagttgg tggtgcaact 1020
aaaactcatc caacagcaag ggcagctttg gcattaatgc aagttgaaac tgcaacagaa 1080
ttagctcaag ttacagctgc tgttggtttg gcacaaaata tggctgcaat tagagcatta 1140
gctactgaag gtattcaaag gggtcacatg actttacatg caaggaatat tgcaattatg 1200
gcaggtgcta caggtgctga tattgatagg gttactagag ttattgttga agcaggtgat 1260
gtttcagttg ctagagctaa acaagttttg gaaaatacat aa 1344
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggtggtt ct 12
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtggtggtg gtggtggt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggcag cttttcaaag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttagaatac ctcacactgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaagcgttag acgcagtaca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgagagagt cgccgatagt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctttatgcat agagctaatt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctcgttaat agtcaatgta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acaagactag gcaaaagcca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
accagttgat cagttgaggg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
taaatggaaa gttaggacag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaaagacga agagcagaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaacttaccg aattgtagcg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tagtaaatac aactattgga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caccagtgtg tgccaaacct 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtcttggca tcaccaacat 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acaaaaatat ttctaacaat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acaaaaatat ttctaacaat 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctgggaaaat ctagcggaga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcaaaccact gtctcacacc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tctttatagc tgattttatg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tctgtagttt cattgctaat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aattttaaaa gacttatgaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagccagtta aaagtagtaa 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tacaaagtaa gatttttcaa 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tatattgcgt tcctacaagg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctttccaga cttgttcaac 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tacccatggt tgtttatgtt 20

Claims (10)

1.一种工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
在宿主菌株中导入DNA片段I，得到所述工程菌；
所述DNA片段I从上游到下依次包括：启动子、融合基因、终止子；
所述融合基因从上游到下依次包括：TPS基因、连接肽I的编码基因、LPPS基因；
所述宿主菌株选自酿酒酵母中的任一种。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述融合基因从上游到下依次包括：
MBP基因、连接肽II的编码基因、TPS基因、连接肽I的编码基因、LPPS基因；
或
所述融合基因从上游到下依次包括：
TPS基因、连接肽I的编码基因、LPPS基因、连接肽II的编码基因、MBP基因；
优选地，所述LPPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述TPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述MBP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述连接肽I的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述连接肽II的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
所述启动子选自PeTDH3、PGAL7中的任意一种；
所述终止子选自TPYX212、TADH1中的任意一种；
优选地，所述在宿主菌株中导入DNA片段I为将DNA片段I整合到宿主的XI-3基因位点。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括优化MVA的合成途径，包括(a)～(h)中的至少一种：
(a)敲除宿主菌株的GAL80基因；
(b)将tHMG1基因导入宿主菌株；
(c)将SpHMGR基因导入宿主菌株；
(d)将宿主菌株基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C基因；
(e)将HMG2K6R基因和ERG10基因导入宿主菌株；
(f)将含有2个拷贝HMG2K6R基因的DNA片段导入宿主菌株；
(g)将宿主菌株中ERG9基因的启动子替换为PHXT1；
(h)将含有BTS1和PaGGPPS基因的DNA片段导入宿主菌株；
所述(a)～(h)不分先后顺序；
优选地，包括(a)～(h)中的至少一种：
(a)敲除宿主菌株的GAL80基因；
(b)将含有FAA4-TAHD1-PTHD3-tHMG1的DNA片段整合到宿主菌株的FAA4基因位点；
(c)将含有POX1-TTDH2-PtHXT7-SpHMGR的DNA片段整合到宿主菌株的POX1基因位点；
(d)将宿主菌株基因组上ERG20基因突变为ERG20F96C基因；
(e)将含有TENO2-HMG2K6R-PGAL10-1-ERG10-TPYK1的DNA片段整合到宿主菌株的XII-2基因位点；
(f)将含有TPDC1-HMG2K6R-PGAL10-1-HMG2K6R-TENO2的DNA片段整合到宿主菌株的XII-3基因位点；
(g)将宿主菌株中ERG9基因的启动子替换为PHXT1；
(h)将含有PGAL7-BTS1-PaGGPPS-TTDH2的DNA片段整合到宿主菌株的XI-2基因位点；
所述(a)～(h)不分先后顺序。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括优化中心代谢途径，包括(A)～(N)中的至少一种：
(A)将MmACL基因导入宿主菌株；
(B)将RtME基因导入宿主菌株；
(C)将‘MDH3基因导入宿主菌株；
(D)将CTP1基因导入宿主菌株；
(E)将宿主菌株的PYC1基因启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；
(F)将MPC1基因导入宿主菌株；
(G)将MPC3基因导入宿主菌株；
(H)将AnACLa基因、AnACLb基因导入宿主菌株；
(I)将RtCIT1基因导入宿主菌株；
(J)将IDP2基因导入宿主菌株；
(K)将YHM2基因导入宿主菌株；
(L)将宿主菌株的PGI1基因的启动子替换为启动子PCOX9；
(M)将GND1基因、TKL1基因、TAL1基因、ZWF1基因导入宿主菌株；
(N)将宿主菌株的IDH2基因的启动子替换为启动子PGSY1；
所述(A)～(N)不分先后顺序；
优选地，所述构建方法还包括优化中心代谢途径，包括(A)～(G)中的至少一种：
(A)将含有HIS3-PTPI1-MmACL-TFBA1-PTDH3-RtME-TCYC1-PtHXT7-’MDH3-TTDH2-PPGK1-CTP1-TADH1的DNA片段整合到宿主菌株的HIS3基因位点；
(B)将宿主菌株的PYC1基因的启动子PPYC1替换为启动子PTEF1；
(C)将含有PtHXT7-MPC3-TDIT1-TMPC1-MPC1-PTPI1的DNA片段整合到宿主菌株的XI-4位点；
(D)将含有TCYC1-AnACLa-PGAL1-PGAL10-AnACLb-TADH1的DNA片段整合到宿主菌株的X2位点；
(E)将含有PTPI1-RtCIT1-TFBA1-TCYC1-IDP2-PTHD3-PTEF1-YHM2的DNA片段整合到宿主菌株的GAL1、GAL7、GAL10位点；
(F)将含有PCOX9-TCYC1-GND1-PTHD3-PtHXT7-TKL1-TTDH2-TADH1-TAL1-PPGK1-PTEF1-ZWF1-TZWF1的DNA片段整合到宿主菌株的PGI1位点；
(G)将宿主菌株的IDH2基因的启动子替换为启动子PGSY1；
所述(A)～(G)不分先后顺序。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括靶点调控，包括：
敲除宿主菌株的ROX1基因、DOS2基因、VBA5基因、YER134c基因、YNR063w基因、YGR259c基因中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括以下的至少一种：
(I)在宿主菌株中导入ANB1基因、DAN1基因、HUG1基因、PYK1基因、LAC1基因、CYB5基因、YCL021W-A基因、YCL074W基因、OYE3基因、OYE2基因、HSP31基因、BLI1基因中的至少一种；
和/或
(II)敲除宿主菌株的SPS4基因、YOR314W基因、SUL1基因、CDA2基因、ERV15基因、ZRT1基因、DSE1基因、ANB1基因中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法通过采用CRISPR/Cas9技术进行构建。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括细胞融合形成双倍体。
9.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的工程菌。
10.根据权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的工程菌、权利要求9所述的工程菌中的至少一种在制备香紫苏醇中的应用。
CN202111539688.7A 2021-12-15 2021-12-15 一种工程菌的构建方法及其应用 Pending CN116262929A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111539688.7A CN116262929A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种工程菌的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111539688.7A CN116262929A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种工程菌的构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116262929A true CN116262929A (zh) 2023-06-16

Family

ID=86723543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111539688.7A Pending CN116262929A (zh) 2021-12-15 2021-12-15 一种工程菌的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116262929A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103387944A (zh) * 2012-05-09 2013-11-13 中国科学院大连化学物理研究所 高产香紫苏醇菌株的构建方法
CN104846020A (zh) * 2008-02-15 2015-08-19 弗门尼舍有限公司 生产香紫苏醇的方法
CN105002203A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 北京嘉万生物技术有限公司 Pgi与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用
CN110669712A (zh) * 2019-10-18 2020-01-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种产r-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104846020A (zh) * 2008-02-15 2015-08-19 弗门尼舍有限公司 生产香紫苏醇的方法
CN103387944A (zh) * 2012-05-09 2013-11-13 中国科学院大连化学物理研究所 高产香紫苏醇菌株的构建方法
CN105002203A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 北京嘉万生物技术有限公司 Pgi与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用
CN110669712A (zh) * 2019-10-18 2020-01-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种产r-(+)-紫苏醇的基因工程菌及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨薇: "构建酿酒酵母工程菌合成香紫苏醇", 生物工程学报, vol. 29, no. 8, 25 August 2013 (2013-08-25), pages 1 - 2 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111434773B (zh) 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用
CN110484572B (zh) 一种提高酿酒酵母橙花叔醇产量的方法
CN102016024B (zh) 突变体酵母及使用其的物质生产方法
CN106367361B (zh) 一种酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用
JP4573365B2 (ja) 改良された性質を有する形質転換微生物
EP2220234A1 (en) Dicarboxylic acid production in a recombinant yeast
CN113234610B (zh) 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用
US10731184B2 (en) Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts
JP2023156360A (ja) キシリトールを生産するメチニコビア種
CN113755354B (zh) 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN112175848B (zh) 一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用
Kim et al. Production of (−)-α-bisabolol in metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae
CN115927436A (zh) 一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用
KR20200040585A (ko) 고활성의 말산 탈수소효소가 도입된 숙신산 생성용 변이 미생물 및 이를 이용한 숙신산 제조방법
CN114717124B (zh) 一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用
WO2023168244A1 (en) Genetically modified yeast and fermentation processes for the production of 3-hydroxypropionate
CN116262929A (zh) 一种工程菌的构建方法及其应用
CN113832087B (zh) 一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法
WO2023108503A1 (zh) 一种工程菌的构建方法及其应用
CN114410492A (zh) 一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用
Lee et al. Enantiopure meso-2, 3-butanediol production by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae expressing 2, 3-butanediol dehydrogenase from Klebsiella oxytoca
CN115305254A (zh) 一种萜类底盘微生物与工程菌及其构建方法和应用
JP2022502068A (ja) レバウジオシドの高効率産生のためのＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼバリアント
CN112920959B (zh) 一种提高酵母菌中l-薄荷醇产量的方法
US20240352494A1 (en) Heterologous production of cytokinins in yeasts

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination