JP2022502068A - レバウジオシドの高効率産生のためのＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼバリアント - Google Patents

レバウジオシドの高効率産生のためのＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼバリアント Download PDF

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Abstract

【課題】宿主細胞におけるステビオール配糖体の改善された産生のための組成物および方法が本明細書で提供される。【解決手段】一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含むように遺伝子改変されている。一部の実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞中で１つまたは複数のステビオール配糖体を産生することが可能な経路のさらなる酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載される組成物および方法は、これらに限定されないが、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭなどのステビオール配糖体の異種産生のための効率的な経路を提供する。【選択図】図５

Description

Ｉ．分野
[0001] 本発明の開示は、特定のカウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）、それを含む組成物、それを含む宿主細胞、およびステビオールならびに／またはレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭを含むレバウジオシドの産生のためのそれらの使用方法に関する。
ＩＩ．背景
[0002] 糖の高摂取の悪影響（例えば、糖尿病および肥満症）を制限するためには、自然源由来のゼロカロリー甘味料が望ましい。レバウジオシドＭ（RebM）は、ステビア植物（S. rebaudiana Bertoni）によって産生された多くの甘味化合物の１つである。全てのレバウジオシドのなかでも、ＲｅｂＭは、最大の効力を有し（スクロースより約２００〜３００倍甘い）、最もすっきりとした味である。しかしながら、ＲｅｂＭは、ステビア植物からわずかな量しか産生されず、その割合は、全ステビオール配糖体含量のうちわずかである（＜１．０％）。Ｏｈｔａら、２０１０、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、５７、１９９〜２０９（２０１０）。したがって、大量かつ高純度での産生を可能にする生物工学的な経路を使用してＲｅｂＭを産生することが望ましい。
[0003] 生物工学を使用して生成物を経済的に産生するために、供給材料からの生成物への生物変換反応における各工程は、高い変換効率（理想的には＞９０％）を有する必要がある。本発明者らのＲｅｂＭを産生するために酵母を操作するなかで、本発明者らは、カウレン酸をステビオールにする、ＲｅｂＭへの経路の初期の生合成工程における限定を確認した（図１）。
[0004] カウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）酵素は、植物Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａに見出され、通常、植物ホルモン前駆体であるカウレン酸からＣ２０イソプレノイドステビオールを産生するように作用する。Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａが、ステビオール配糖体を葉の乾燥重量のおよそ１５％まで蓄積できるとしても、ＫＡＨ酵素を介したフラックスは、商業的な製造のために酵母において大量のＲｅｂＭ産生に必要とされるものには届かない可能性がある。慣習的に、ＲｅｂＭを産生するように操作された酵母でカウレン酸をステビオールに変換するために、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ由来の野生型ＫＡＨ酵素（Sr.KAH）が使用されてきた。
[0005] ＲｅｂＭを効率的に、かつ高い純度で産生するために、高効率でステビオールを産生することが可能な改善された酵素が必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この必要性に取り組み、同様に関連の利点を提供する。
ＩＩＩ．要約
[0006] カウレン酸のステビオールへの改善された変換のための組成物および方法が本明細書で提供される。これらの組成物および方法は、著しく高い効率でカウレン酸をステビオールに変換することが可能なある特定のカウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）の産生に一部基づく。新しいＫＡＨを用いた株の性能における改善がそれほど大きくなくても（例えば、１０パーセント）、ＲｅｂＭに対する市場の需要が年間５０億トンであると仮定すれば、将来的に生産コストにおいて一千万ドルを超える節約になる可能性がある。
[0007] 本明細書に記載されるある特定のＫＡＨはまた、カウレン酸をほとんどまたはまったく残留させずにステビオールを産生することも可能である。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物および方法は、高い収量のＲｅｂＭなどのステビオール配糖体を含む組成物を得るための下流処理のコストを低減させることができる。
[0008] 一態様において、工業的に有用な化合物を産生するための、遺伝子改変された宿主細胞およびその使用方法が本明細書で提供される。一態様において、本明細書で提供されるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子改変された宿主細胞が本明細書で提供される。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することが可能な１つまたは複数の酵素に関する経路をさらに含む。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、または９８％より高い効率でカウレン酸をステビオールに変換することが可能である。
[0009] 別の態様において、異種ステビオール配糖体を産生するための方法であって、前記異種ステビオール配糖体化合物の生成に好適な条件下で、本明細書に記載される異種ステビオール配糖体を産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ステビオール配糖体を回収することを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種ステビオール配糖体は、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭからなる群から選択される。
[0010] 別の態様において、ＲｅｂＤを産生するための方法であって、前記ＲｅｂＤの生成に好適な条件下で、本明細書に記載されるＲｅｂＤを産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＤを回収することを含む方法が本明細書で提供される。
[0011] 別の態様において、ＲｅｂＭを産生するための方法であって、前記ＲｅｂＭの生成に好適な条件下で、本明細書に記載されるＲｅｂＭを産生することが可能な本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中で培養すること；および培地から前記ＲｅｂＭを回収することを含む方法が本明細書で提供される。
[0012] 別の態様において、ステビオールを産生するための方法であって、ステビオールを形成するのに好適な条件下で、カウレン酸を、カウレン酸をステビオールに変換することが可能な、本明細書に記載されるカウレン酸ヒドロキシラーゼと接触させることを含む方法が本明細書で提供される。
[0013] 一部の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。一部の実施形態において、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭを高効率で産生する。一部の実施形態において、宿主細胞は、本明細書で提供されるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含まない酵母細胞と比較して増加した量のＲｅｂＤまたはＲｅｂＭを産生する。
[0014]図１は、天然の酵母代謝産物であるファルネシルピロリン酸（FPP）からレバウジオシドＭ（RebM）への酵素的な経路を提供する。ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）、コパリルピロリン酸（CPP）、および数々のレバウジオシド（Reb）が図に示される。 [0015]図２は、酵母におけるカウレン酸からステビオールへの変換のスクリーニングのために個々のＫＡＨ酵素を挿入するのに使用される「ランディングパッド」設計の概略図を提供する。 [0016]図３は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子より高い少なくとも１つの標準偏差の活性を有する、それぞれ単一のアミノ酸変化を含有するＳｒ．ＫＡＨ突然変異体を提供する。Ｙ軸は、Ｓｒ．ＫＡＨバリアントによって産生された１９−配糖体（株１）またはＲｅｂＭ（株２）の野生型Ｓｒ．ＫＡＨのそれに対する比率を表す。 [0017]図４は、酵母株において４．３×から６．３×へのインビボの活性の改善をもたらすＳｒ．ＫＡＨタンパク質突然変異の組合せを提供し、Ｓｒ．ＫＡＨ活性は、株３バックグラウンドで測定される。Ｙ軸は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨに対する突然変異Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子の相対的な増加倍率であり、野生型Ｓｒ．ＫＡＨ活性は、１に正規化される。 [0018]図５は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨと比較して基質であるカウレン酸の低減をもたらす改善されたＫＡＨ突然変異体を提供し、これは、活性が改善されたＳｒ．ＫＡＨ対立遺伝子が、より多くの基質をステビオールに変換することを実証する。 [0019]図６は、実施例７に記載されたように総ステビオール配糖体（μＭ）のタイターを使用して、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３対立遺伝子に対する階層１のスクリーニングで測定された、縮重コドンライブラリー突然変異体のインビボにおけるＫＡＨ活性を提供する。
Ｖ．実施形態の詳細な説明
５．１ 用語
[0020] 本明細書で使用される場合、用語「異種」は、通常は天然に見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与の細胞において通常は天然に見出されないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞にとって外来であるもの（すなわち細胞にとって「外因性」であるもの）であってもよいし；（ｂ）宿主細胞において天然に見出されるもの（すなわち「内因性」）であるが細胞中に天然にはない量で（すなわち、宿主細胞において天然に見出される量より多いまたは少ない量で）存在していてもよいし；または（ｃ）宿主細胞において天然に見出されるが、その天然の遺伝子座の外側に位置するものであってもよい。
[0021] 一方で、用語「生来的な」または「内因性」は、本明細書において分子、特定には酵素および核酸に対して使用される場合、その起源になっているかまたはそれが天然に見出される生物で発現される分子を示す。組換え微生物では、生来的な酵素またはポリヌクレオチドの発現が改変される場合があることが理解される。
[0022] 用語「親細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示される遺伝子改変された宿主細胞と同一な遺伝的背景を有する細胞であって、ただし、改変された宿主細胞に組み込まれた１つまたは複数のある特定の遺伝学的改変、例えば、ステビオール経路の酵素の異種発現、ステビオール配糖体経路の酵素の異種発現、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの異種発現、コパリル二リン酸シンターゼの異種発現、カウレンシンターゼの異種発現、カウレンオキシダーゼ（例えば、Pisum sativumのカウレンオキシダーゼ）の異種発現、ステビオールシンターゼ（カウレン酸ヒドロキシラーゼ）の異種発現、シトクロムＰ４５０レダクターゼの異種発現、ＵＧＴ７４Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ７６Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ８５Ｃ２の異種発現、ＵＧＴ９１Ｄの異種発現、およびＵＧＴ４００８７またはそのバリアントの異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含まないものを指す。
[0023] 用語「天然に存在する」は、本明細書で使用される場合、天然に見出されるものであることを指す。例えば、自然界の源から単離でき、ヒトによって実験室で意図的に改変されていない、生物中に存在するカウレン酸ヒドロキシラーゼは、天然に存在するカウレン酸ヒドロキシラーゼである。逆に言えば、本明細書で使用される場合、用語「天然に存在しない」は、天然に見出されないがヒトの介入により作り出されたものを指す。
[0024] 用語「培地」は、培養培地および／または発酵培地を指す。
[0025] 用語「発酵組成物」は、遺伝子改変された宿主細胞および遺伝子改変された宿主細胞によって産生された生成物または代謝生成物を含む組成物を指す。発酵組成物の例は、全細胞液体培地であり、これは、細胞、水相、および遺伝子改変された宿主細胞から産生された化合物を包含する容器（例えば、フラスコ、プレート、または発酵槽）の内容物全体であり得る。
[0026] 本明細書で使用される場合、用語「産生量」は、一般的に、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞によって産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の量を指す。一部の実施形態において、産生量は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の収量として表される。他の実施形態において、産生量は、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生における宿主細胞の産生能として表される。
[0027] 本明細書で使用される場合、用語「産生能」は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生量を指し、経時的な（１時間当たりの）宿主細胞が培養される発酵ブロスの所定量当たりの（体積当たりの）産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の量（重量による）として表される。
[0028] 本明細書で使用される場合、用語「収量」は、宿主細胞によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生量を指し、宿主細胞により消費された炭素源の所定量当たりの産生されたステビオールまたはステビオール配糖体の重量による量として表される。
[0029] 化合物（例えば、RebM、ステビオール配糖体、または他の化合物）の「検出不可能なレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物のレベルが、化合物を測定するための標準的な技術によって測定および／または分析するには低すぎることを意味する。例えば、この用語は、当業界において公知の分析方法によって検出不可能な化合物のレベルを含む。
[0030] 用語「カウレン」は、カウレンの任意の立体異性体を含む化合物カウレンを指す。特定の実施形態において、この用語は、ｅｎｔ−カウレンとして当業界において公知の鏡像異性体を指す。特定の実施形態において、この用語は、以下の構造による化合物を指す。
Figure 2022502068
[0031] 用語「カウレノール（kaurenol）」は、カウレノールの任意の立体異性体を含む化合物カウレノールを指す。ある特定の実施形態において、この用語は、ｅｎｔ−カウレノールとして当業界において公知の鏡像異性体を指す。ある特定の実施形態において、この用語は、以下の構造による化合物を指す。
Figure 2022502068
[0032] 用語「カウレナール（kaurenal）」は、カウレナールの任意の立体異性体を含む化合物カウレナールを指す。ある特定の実施形態において、この用語は、ｅｎｔ−カウレナールとして当業界において公知の鏡像異性体を指す。ある特定の実施形態において、この用語は、以下の構造による化合物を指す。
Figure 2022502068
[0033] 用語「カウレン酸」は、カウレン酸の任意の立体異性体を含む化合物カウレン酸を指す。ある特定の実施形態において、この用語は、ｅｎｔ−カウレン酸として当業界において公知の鏡像異性体を指す。ある特定の実施形態において、この用語は、以下の構造による化合物を指す。
Figure 2022502068
[0034] 用語「ステビオール」は、ステビオールの任意の立体異性体を含む化合物ステビオールを指す。ある特定の実施形態において、この用語は、以下の構造による化合物を指す。
Figure 2022502068
[0035] 用語「ステビオール配糖体」は、本明細書で使用される場合、これらに限定されないが、天然に存在するステビオール配糖体、例えばステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、合成ステビオール配糖体、例えば酵素的にグルコシル化したステビオール配糖体およびそれらの組合せなどのステビオールの配糖体を指す。
[0036] 本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、突然変異、および／または置換によって具体的に列挙した「参照」ポリペプチド（例えば野生型配列）と異なるが、実質的に参照ポリペプチドに類似した活性を保持するポリペプチドを指す。一部の実施形態において、バリアントは、組換えＤＮＡ技術または変異誘発によって作り出される。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、ある塩基性残基の別の残基での置換（すなわちArgのLysでの置換）、ある疎水性残基の別の残基での置換（すなわちLeuのIleでの置換）、またはある芳香族残基の別の残基での置換（すなわちPheのTyrでの置換）などによってその参照ポリペプチドとは異なる。一部の実施形態において、バリアントは、参照配列との実質的な構造的類似をもたらす保存的置換が達成されている類似体を包含する。このような保存的置換の例としては、これらに限定されないが、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換およびその逆；グルタミンのアスパラギンでの置換およびその逆；セリンのスレオニンでの置換およびその逆；リシンのアルギニンでの置換およびその逆；またはイソロイシン、バリンもしくはロイシンのいずれかの互いの置換が挙げられる。
[0037] 本明細書で使用される場合、用語「配列同一性」または「同一性パーセント」は、構造中、または２つ以上の核酸またはタンパク質配列において、同一であるか、または特定されたパーセンテージの同一なアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。例えば、配列は、比較ウィンドウにわたり、または配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手作業によるアライメントおよび目視検査によって測定して指示された領域にわたり比較して最大限一致するように並べた場合、特定された領域にわたり、参照配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性パーセント、またはそれより高い同一性を有していてもよい。例えば、同一性のパーセントは、総ヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の長さから全てのギャップの長さを引いた値で、配列中の同一なヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の数を割った比率を計算することによって決定される。
[0038] 便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当業界において公知のコンピュータープログラムや数学的なアルゴリズムを使用して確認することができる。このような配列同一性パーセントを計算するアルゴリズムは、一般的に、比較領域にわたり配列ギャップおよびミスマッチを考慮に入れる。配列を比較し並べるプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Thompson et al., （1994） Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680）、ＡＬＩＧＮ（Myers et al., （1988） CABIOS, 4: 11-17）、ＦＡＳＴＡ（Pearson et al., （1988） PNAS, 85:2444-2448; Pearson （1990）, Methods Enzymol., 183: 63-98）およびギャップ有りＢＬＡＳＴ（Altschulら、（1997）Nucleic Acids Res., 25：3389-3402）は、この目的にとって有用である。配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、およびＴＢＬＡＳＴＸと併用するための、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-10, 1990）は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biological Information：NCBI）などの数種の供給元やインターネットより入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトで見出すことができる。
[0039] ある特定の実施形態において、配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、その標準的なデフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定することができる。ヌクレオチド配列アライメントおよび配列同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、そのデフォルトパラメーター（ギャップ開始ペナルティー＝５、ＧＡＰ伸長ペナルティー＝２、核酸マッチ＝２、核酸ミスマッチ＝−３、期待値＝１０．０、文字サイズ＝１１、クエリー範囲における最大マッチ＝０）で使用される。ポリペプチド配列アライメントおよび配列同一性の計算のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、そのデフォルトパラメーター（アライメントマトリックス＝BLOSUM62；ギャップコスト：存在＝１１、伸長＝１；組成調整＝条件付きの組成スコア、マトリックス調整；期待値＝１０．０；文字サイズ＝６；クエリー範囲における最大マッチ＝０）で使用される。代替として、以下のプログラムおよびパラメーター：Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＳｕｉｔｅのＡｌｉｇｎ Ｐｌｕｓソフトウェア、バージョン５（Sci-Ed Software）；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準的な直線のスコア行列、ミスマッチペナルティー＝２、オープンギャップペナルティー＝４、伸長ギャップペナルティー＝１を使用することができる。アミノ酸比較：グローバル比較、ＢＬＯＳＵＭ ６２スコア行列。本明細書に記載される実施形態において、配列同一性は、それらのデフォルトパラメーターを使用したＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して計算される。本明細書に記載される実施形態において、２つまたはそれより多くの配列の配列アライメントは、示唆されたデフォルトパラメーター（Dealign入力配列：なし；Ｍｂｅｄ様クラスタリングガイドツリー：あり；Ｍｂｅｄ様クラスタリング反復：あり；組み合わされた反復の数：デフォルト（０）；最大ガイドツリー反復：デフォルト；最大ＨＭＭ反復：デフォルト；順番：入力）を使用したＣｌｕｓｔａｌ Ｗを使用して実行される。
５．２ カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド、核酸、および宿主細胞
[0040] 一態様において、野生型カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸残基の改変を含む改変されたカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、野生型カウレン酸ヒドロキシラーゼは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼ、すなわちＳｒ．ＫＡＨである。ある特定の実施形態において、野生型カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号１に提供されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態において、実際の残基番号は、本明細書に記載されるものを含む配列番号１に対する標準的なアライメント技術によって決定することができる。特定の実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸が本明細書で提供される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、カウレン酸をステビオールに変換するカウレン酸ヒドロキシラーゼとしての活性を保持する。好ましい実施形態において、改変されたカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、例えばＳｒ．ＫＡＨと比較して、改善された活性を有する。
[0041] 本明細書で提供されるカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドまたは核酸の１つまたは複数を含む宿主細胞も本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、出発材料としてカウレン酸からステビオールを産生することができる。特定の実施形態において、宿主細胞は、培養培地中の炭素源からステビオールを産生することができる。特定の実施形態において、宿主細胞は、培養培地中の炭素源からステビオールを産生することができ、さらに、ステビオールからＲｅｂＡまたはＲｅｂＤを産生することができる。特定の実施形態において、宿主細胞はさらに、ＲｅｂＤからレバウジオシドＭ（RebM）を産生することができる。
[0042] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｍ３０８Ｌのうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個を含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、ポリペプチドの残基数は、配列番号１に従う。ある特定の実施形態において、配列番号１に相同であり、以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｍ３０８Ｌのうち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個を含む、ポリペプチドが本明細書で提供される。前の実施形態のいずれかにおいて、ポリペプチドは、異種アミノ末端ドメインを含む。
[0043] ある特定の実施形態において、配列番号１に相同なポリペプチドが本明細書で提供され、残基番号は、配列番号１に対して提供され、実際の残基番号は、本明細書に記載されるものを含む配列番号１に対する標準的なアライメント技術によって決定することができる。
[0044] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｉ１６６ＲおよびＩ３３３Ｖを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0045] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｉ３５０Ｌ、およびＧ４４７Ｖを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0046] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、および Ｉ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0047] 前の実施形態のいずれかにおいて、本明細書で提供されるカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、Ｅ４９２Ｃ、Ｍ４２７Ａ、Ｇ３０６Ｄ、Ｖ３３３Ｃ、Ｄ１９１Ｌ、Ｉ４０Ｓ、Ｌ４４５Ｉ、Ｓ１１４Ａ、Ｄ１９１Ｙ、Ｄ１９１Ｆ、Ｌ４９７Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｎ２９Ｇ、Ｔ１６７Ｇ、Ｔ１６４Ｓ、Ｑ４１５Ｈ、Ｔ８９Ａ、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｔ、およびＬ１３Ｖから選択される１つまたは複数の突然変異をさらに含む。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0048] 前の実施形態のいずれかにおいて、本明細書で提供されるカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｆ、およびＬ１３Ｖから選択される１つまたは複数の突然変異をさらに含む。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0049] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、およびＩ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0050] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３５０Ｌ、およびＧ４４７Ｖを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0051] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、およびＩ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0052] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、およびＩ３３３Ｖを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0053] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、およびＩ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0054] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、およびＩ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0055] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、およびＩ３５０Ｌを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0056] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｙ６２Ｈ、Ｔ１６４Ｒ、Ｌ７６Ｖ、Ｑ４１５Ｌ、Ａ６０Ｙ、Ｓ１８２Ｃ、Ｔ１６７Ｎ、Ｙ５２Ｈ、Ｒ２６６Ｄ、Ｔ１６７Ｈ、Ｉ１５３Ｌ、Ｋ１００Ｌ、Ｇ３０６Ｃ、Ｑ１２０Ｎ、Ｌ２３２Ｈ、Ｉ３３３Ｖ、Ｇ３５１Ｒ、Ｌ２３２Ｓ、Ｉ１６６Ｓ、Ｗ４４７Ｃ、Ｉ４４３Ｙ、Ｉ１６６Ｎ、Ｎ３５５Ｙ、Ｌ２３２Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ａ４４２Ｇ、Ｇ３０６Ｎ、Ｖ３１６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｇ４４７Ｆ、Ｇ３０６Ｉ、Ｇ３０６Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｉ１６６Ｒ、およびＧ３０６Ｌの少なくとも１つを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0057] ある特定の実施形態において、以下の突然変異：Ｅ４９２Ｃ、Ｍ４２７Ａ、Ｇ３０６Ｄ、Ｖ３３３Ｃ、Ｄ１９１Ｌ、Ｉ４０Ｓ、Ｌ４４５Ｉ、Ｓ１１４Ａ、Ｄ１９１Ｙ、Ｄ１９１Ｆ、Ｌ４９７Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｎ２９Ｇ、Ｔ１６７Ｇ、Ｔ１６４Ｓ、Ｑ４１５Ｈ、Ｔ８９Ａ、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｔ、およびＬ１３Ｖの少なくとも１つをさらに含む、前の実施形態のいずれかのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0058] ある特定の実施形態において、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、および小胞体（ER）結合タンパク質のＮ末端膜貫通ドメインを含むキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドであって、Ｎ末端膜貫通ドメインは、触媒ドメインに共有結合で連結されている、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。よりさらなる実施形態において、キメラカウレン酸ヒドロラーゼポリペプチドは、以下の突然変異：Ｙ６２Ｈ、Ｔ１６４Ｒ、Ｌ７６Ｖ、Ｑ４１５Ｌ、Ａ６０Ｙ、Ｓ１８２Ｃ、Ｔ１６７Ｎ、Ｙ５２Ｈ、Ｒ２６６Ｄ、Ｔ１６７Ｈ、Ｉ１５３Ｌ、Ｋ１００Ｌ、Ｇ３０６Ｃ、Ｑ１２０Ｎ、Ｌ２３２Ｈ、Ｉ３３３Ｖ、Ｇ３５１Ｒ、Ｌ２３２Ｓ、Ｉ１６６Ｓ、Ｗ４４７Ｃ、Ｉ４４３Ｙ、Ｉ１６６Ｎ、Ｎ３５５Ｙ、Ｌ２３２Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ａ４４２Ｇ、Ｇ３０６Ｎ、Ｖ３１６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｇ４４７Ｆ、Ｇ３０６Ｉ、Ｇ３０６Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｉ１６６Ｒ、およびＧ３０６Ｌの少なくとも１つをさらに含む。ある特定の実施形態において、残基番号は、配列番号１に従う。
[0059] ある特定の実施形態において、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、およびＡＴＲ２のＮ末端膜貫通ドメインを含むキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドであって、Ｎ末端膜貫通ドメインは、触媒ドメインに共有結合で連結されている、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。
[0060] ある特定の実施形態において、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸２３〜５００を含む、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、およびＡＴＲ２のＮ末端膜貫通ドメインであって、Ｎ末端ドメインはアミノ酸１〜７２を含む、Ｎ末端膜貫通ドメインを含むキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドであって、Ｎ末端膜貫通ドメインは、触媒ドメインに共有結合で連結されている、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼのＮ末端ドメインは、配列番号２２のアミノ酸１〜７２を含む。ある特定の実施形態において、触媒ドメインは、配列番号１のアミノ酸２３〜５００を含む。
[0061] ある特定の実施形態において、本明細書で提供される触媒ドメインは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸５〜５００を含む。
[0062] ある特定の実施形態において、本明細書で提供される触媒ドメインは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸２３〜５００を含む。
[0063] ある特定の実施形態において、本明細書で提供される触媒ドメインは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸４７〜５００を含む。
[0064] ある特定の実施形態において、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端ドメインは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＲ２タンパク質のアミノ酸１〜７２を含む。ある特定の実施形態において、Ｎ末端ドメインは、配列番号２２のアミノ酸１〜７２を含む。
[0065] ある特定の実施形態において、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端ドメインは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＲ２タンパク質のアミノ酸１〜５０を含む。ある特定の実施形態において、Ｎ末端ドメインは、配列番号２２のアミノ酸１〜５０を含む。
[0066] 前の実施形態のいずれかにおいて、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号１に従って、Ｅ４９２Ｃ、Ｍ４２７Ａ、Ｇ３０６Ｄ、Ｖ３３３Ｃ、Ｄ１９１Ｌ、Ｉ４０Ｓ、Ｌ４４５Ｉ、Ｓ１１４Ａ、Ｄ１９１Ｙ、Ｄ１９１Ｆ、Ｌ４９７Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｎ２９Ｇ、Ｔ１６７Ｇ、Ｔ１６４Ｓ、Ｑ４１５Ｈ、Ｔ８９Ａ、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｔ、およびＬ１３Ｖのうちの少なくとも１つのカウレン酸ヒドロキシラーゼの位置における突然変異をさらに含む。
[0067] ある特定の実施形態において、異種アミノ末端ドメインを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、異種アミノ末端ドメインを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドはまた、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドとしても公知である。
[0068] ある特定の実施形態において、異種アミノ末端ドメインで置換されているカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドの置換されたアミノ末端セグメントが本明細書で提供される。一部の実施形態において、配列番号１の残基位置に従って、全長カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端由来の４、２２、または４６アミノ酸を含む、置換されたアミノ末端セグメント（除去されたセグメント）が本明細書で提供される。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜４の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜５の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜１０の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜１５の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜２０の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜２２の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜２５の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜３０の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜３５の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜４０の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜４５の欠失を含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換されたアミノ末端セグメントは、配列番号１の残基位置に従って、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのＮ末端からのアミノ酸１〜４６の欠失を含む。
[0069] 一部の実施形態において、本明細書で提供される置換された異種アミノ末端ドメイン（追加されたセグメント）は、異種タンパク質由来である。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換された異種アミノ末端ドメインは、小胞体（ER）結合タンパク質のＮ末端膜貫通ドメインである。一部の実施形態において、本明細書で提供される置換された異種アミノ末端ドメインは、ＡＴＲ２（Arabidopsis thalianaのシトクロムＰ４５０レダクターゼ）、Ａａ．ＣＰＲ（Artemisia annua）、Ｓｒ．ＫＯ（Stevia rebaudianaのカウレンオキシダーゼ）、ＥＲＧ１１（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）、ＡＬＧ１１（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）、ＳＥＣ６６（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）、ＮＵＳ１（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）、ＲＣＲ１（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）、またはＵＢＰ１（Saccharomyces cerevisiaeの膜タンパク質）由来である。
[0070] ある特定の実施形態において、異種アミノ末端セグメントは、配列番号３３〜４０のいずれかのアミノ末端から選択される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜２０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜２３を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜２５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜３０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜３５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜４０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜４５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜５０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜５１を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜５２を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜５５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜６０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜６２を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜６５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜６６を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜７０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜７２を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜７５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜８０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜８５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜９０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜９５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１００を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１０５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１１０を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１１５を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。一部の実施形態において、異種タンパク質のアミノ酸１〜１１９を含む、置換された異種アミノ末端ドメインが本明細書で提供される。
[0071] ある特定の実施形態において、異種アミノ末端セグメントを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ末端セグメントは、異種アミノ末端ドメインで置換されている。一部の実施形態において、置換されたアミノ末端セグメント（除去されたセグメント）は、４〜４２アミノ酸を有する。一部の実施形態において、置換されたアミノ末端セグメントは、４、２２、３８、または４２アミノ酸を有する。一部の実施形態において、異種アミノ末端セグメント（除去したセグメントを置き換える、追加されたセグメント）は、ＡＴＲ２（Arabidopsis thalianaのシトクロムＰ４５０レダクターゼ）、ＣＹＰ８１６（Santalum album由来のシトクロムＰ４５０）、またはＳｒ．ＫＯ（Stevia rebaudianaのカウレンオキシダーゼ）由来である。ある特定の実施形態において、異種アミノ末端セグメントは、配列番号２〜６のいずれかのアミノ末端セグメントから選択される。ある特定の実施形態において、２２個のアミノ末端のアミノ酸は、配列番号２のアミノ末端セグメントで置換されている。ある特定の実施形態において、４個のアミノ末端のアミノ酸は、配列番号３のアミノ末端セグメントで置換されている。ある特定の実施形態において、４２個のアミノ末端のアミノ酸は、配列番号４のアミノ末端セグメントで置換されている。ある特定の実施形態において、４個のアミノ末端のアミノ酸は、配列番号５のアミノ末端セグメントで置換されている。ある特定の実施形態において、３８個のアミノ末端のアミノ酸は、配列番号６のアミノ末端セグメントで置換されている。ある特定の実施形態において、この段落の任意の置換は、上述した突然変異のより多くのいずれか１つと組み合わされる。
[0072] ある特定の実施形態において、上記の実施形態によるカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号１による野生型Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３．０倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４．０倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５．０倍、少なくとも５．５倍、または少なくとも６．０倍の多くのステビオールおよびステビオール配糖体を産生する。
[0073] ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、高効率でカウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、３０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、３５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、４０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、５０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、６０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、７０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、８０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、９０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、９５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、改変されたＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。
[0074] ある特定の実施形態において、宿主細胞は、３０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、３５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、４０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、４５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、５０％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、５５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、約５８％の効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である。
[0075] 変換の効率は、当業者に明らかな任意の技術によって測定することができる。ある特定の実施形態において、変換の効率は、ステビオールを形成するのに好適な条件下でカウレン酸を酵素または宿主細胞と接触させることによって測定することができる。効率は、産生されたステビオールのモル量を、得られた組成物中のカウレン酸の総量と比較することによって測定することができる。また効率は、ステビオールおよびステビオールの下流生成物の総量を、得られた組成物中のカウレン酸、ステビオール、およびステビオールの下流生成物の総量と比較することによっても測定することができる。
[0076] ある特定の実施形態において、カウレン酸をステビオールに変換することが可能な、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含み、カウレン酸の１３位の酸化が可能なカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能なカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含む宿主細胞であって、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、宿主細胞が本明細書で提供される。
[0077] 本明細書に記載される実施形態において、２つのポリペプチドの対応するアミノ酸位置または対応するループ箇所を決定するのに、任意の好適な方法を使用することができる。ある特定の実施形態において、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドの配列および配列番号１の参照配列は、そのデフォルトパラメーターを使用したＣｌｕｓｔａｌ（WまたはOmega）を使用して並べることができる。他の実施形態において、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドの配列および配列番号１の参照配列は、構造的なアライメント、例えばＥｘＰＡＳｙウェブサーバーを介して、またはＤｅｅｐＶｉｅｗプログラム（スイスのPdb-ビューワー）からアクセス可能なタンパク質構造の相同性モデル化サーバーであるスイスモデルを使用して並べることができる。
[0078] 宿主細胞のＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドまたは任意のバリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは基質としてカウレン酸を受容するが、カウレン酸の源は、当業者に好適であるとみなされた任意の源であってもよい。ある特定の実施形態において、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドまたは任意のバリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、カウレン酸と接触させてもよい。ある特定の実施形態において、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドまたはＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドの任意のバリアントは、カウレン酸を含む組成物と接触させてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの葉から単離された天然産物由来であってもよいし、またはそれから供給されてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、微生物由来であってもよいし、またはそれから供給されてもよい。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、１つまたは複数の炭素源を含む組成物と接触させてもよい。
[0079] ある特定の実施形態において、望ましい反応を触媒するのに好適な任意のＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、当業界において公知の任意の好適な方法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、好適なバリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、バリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする異種核酸を発現させ、基質の望ましい箇所（例えば、カウレン酸のＣ−１３位）で酸化を触媒することが可能な機能的なＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを産生する細胞をスクリーニングすることによってインビボでアッセイすることができる。例示的なスクリーニング方法は、以下の実施例に記載される。別の例において、好適なバリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、バリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをカウレン酸などの基質と接触させることによって、インビトロでスクリーニングすることができる。この例において、ステビオールまたはステビオール配糖体、例えばＲｅｂＤの存在をアッセイすることは、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドが好適な酵素であるかどうかを決定するための試験として使用することができる。この反応は、ＬＣ−ＭＳまたは他の当業界公知の方法によって分析することができる。例えばＷＯ２０１３／０２２９８９を参照されたい。
[0080] ある特定の実施形態において、バリアントＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、インビボで、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、または９７％より高い効率で、カウレン酸をステビオールに変換することが可能である場合、カウレン酸をステビオールに変換することにおいて好適とみなされる。
[0081] 有利な実施形態において、宿主細胞は、カウレン酸をもたらすことが可能な１つまたは複数の酵素的な経路を含んでいてもよく、前記経路は個々に、または一緒に取り入れられる。本明細書に記載されるように、宿主細胞は、カウレン酸をステビオールに変換することが可能な、本明細書で提供されるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼを含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ファルネシル二リン酸をゲラニルゲラニル二リン酸に変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸をコパリル二リン酸に変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、コパリル二リン酸をカウレンに変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ステビオールを１つまたは複数のステビオール配糖体に変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ステビオールをＲｅｂＡに変換することが可能な１、２、３、４つ、またはそれより多くの酵素を一緒にさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。有用な酵素およびその酵素をコードする核酸は、当業者公知である。特に有用である酵素および核酸は、以下の章に記載され、さらに例えば、ＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１５９１８８、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、およびＵＳ２０１６／０１９８７４８Ａ１に記載される。
[0082] さらなる実施形態において、宿主細胞は、炭素源からゲラニルゲラニル二リン酸を生成することが可能な１つまたは複数の酵素をさらに含む。これらは、ＤＸＰ経路の酵素およびＭＥＶ経路の酵素を包含する。有用な酵素およびその酵素をコードする核酸は、当業者公知である。各経路の例示的な酵素は、後述され、さらに例えばＵＳ２０１６／０１７７３４１Ａ１に記載される。
[0083] 一部の実施形態において、宿主細胞は、（ａ）アセチル補酵素Ａの２つの分子を縮合して、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素（例えば、アセチル−ｃｏＡチオラーゼ）；（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡの別の分子と縮合して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（HMG-CoA）を形成する酵素（例えば、HMG-CoAシンターゼ）；（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素（例えば、HMG-CoAレダクターゼ）；（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５−リン酸に変換する酵素（例えば、メバロン酸キナーゼ）；（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ）；（ｆ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（IPP）に変換する酵素（例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ）；（ｇ）ＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に変換する酵素（例えば、IPPイソメラーゼ）；（ｈ）ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、５個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼ；（ｉ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合して、ゲラニルピロリン酸（GPP）を形成する酵素（例えば、GPPシンターゼ）；（ｊ）ＩＰＰの２つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する酵素（例えば、FPPシンターゼ）；（ｋ）ＩＰＰをＧＰＰと縮合して、ファルネシルピロリン酸（FPP）を形成する酵素（例えば、FPPシンターゼ）；（ｌ）ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを縮合してゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）を形成する酵素；および（ｍ）ＩＰＰおよびＦＰＰを縮合してＧＧＰＰを形成する酵素からなる群から選択されるイソプレノイド経路酵素の１つまたは複数または全てを含む。
[0084] ある特定の実施形態において、追加の酵素は、生来的である。有利な実施形態において、追加の酵素は、異種である。ある特定の実施形態において、２つ以上の酵素は、１つのポリペプチド中に組み合わせることができる。
５．３ 細胞株
[0085] 本明細書で提供される組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核細胞または真核細胞が挙げられる。
[0086] 好適な原核宿主としては、これらに限定されないが、様々なグラム陽性、グラム陰性、またはグラム不定細菌の任意のものが挙げられる。例としては、これらに限定されないが、以下の属：アグロバクテリウム属、アリシクロバチルス属、アナベナ属、アナシスティス属、アルトロバクター属、アゾトバクター属（Azobacter）、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クロマチウム属、クロストリジウム、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エルウィニア属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、フォルミジウム属、シュードモナス属、ロドバクター属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、セネデスムス属（Scenedesmun）、セラチア属、シゲラ属、スタフィロコッカス属（Staphlococcus）、ストレプトマイセス属（Strepromyces）、シネココッカス属（Synnecoccus）、およびジモモナス属に属する細胞が挙げられる。原核株の例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓが挙げられる。特定の実施形態において、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。
[0087] 好適な古細菌宿主としては、これらに限定されないが、アエロピルム属、アーケオグロブス属（Archaeglobus）、ハロバクテリウム属、メタノコッカス属、メタノバクテリウム属、パイロコッカス属、スルフォロブス属、およびサーモプラスマ属に属する細胞が挙げられる。古細菌株の例としては、これらに限定されないが、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、およびＡｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘが挙げられる。
[0088] 好適な真核宿主としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の方法において有用な酵母としては、微生物受託機関（例えばIFO、ATCCなど）に寄託された酵母であって、なかでも、アシクロコニジウム属（Aciculoconidium）、アンブロシオジマ属（Ambrosiozyma）、アントロアスカス属（Arthroascus）、アルキシオジマ属（Arxiozyma）、アシュビア属、バブジェビア属（Babjevia）、ベンシングトニア属（Bensingtonia）、ボトリオアスカス属（Botryoascus）、ボトリオザイマ属（Botryozyma）、ブレッタノマイセス属（Brettanomyces）、ビュレラ属（Bullera）、ビュレロマイセス属（Bulleromyces）、カンジダ属、シテロミセス属（Citeromyces）、クラビスポラ属（Clavispora）、クリプトコックス属、シストフィロバシディウム属（Cystofilobasidium）、デバリオマイセス属、デッカラ属（Dekkara）、ディポダスコプシス属（Dipodascopsis）、ディポダスカス属（Dipodascus）、エニエラ属（Eeniella）、エンドマイコプセラ属（Endomycopsella）、エレマスカス属（Eremascus）、エレモテシウム属（Eremothecium）、エリスロバシディウム属（Erythrobasidium）、フェロマイセス属（Fellomyces）、フィロバシディウム属（Filobasidium）、ガラクトマイセス属（Galactomyces）、ゲオトリクム属（Geotrichum）、ガイラーモンデラ属（Guilliermondella）、ハンセニアスポラ属（Hanseniaspora）、ハンセヌラ属、ハセガワエア属（Hasegawaea）、ホルターマンニア属（Holtermannia）、ホルモアスカス属（Hormoascus）、ハイフォピキア属（Hyphopichia）、イッサチェンキア属（Issatchenkia）、クロエケラ属（Kloeckera）、クロエケラスポラ属（Kloeckeraspora）、クルイベロマイセス属、コンドア属（Kondoa）、クライシア属（Kuraishia）、クルツマノマイセス属（Kurtzmanomyces）、ロイコスポリジウム属（Leucosporidium）、リポマイセス属、ロデロマイセス属（Lodderomyces）、マラセジア属（Malassezia）、メトシュニコウィア属（Metschnikowia）、ムラキア属（Mrakia）、ミクソザイマ属（Myxozyma）、ナドソニア属（Nadsonia）、ナカザワエア属（Nakazawaea）、ネマトスポラ属（Nematospora）、オガタエア属（Ogataea）、オースポリディウム属（Oosporidium）、パチソレン属（Pachysolen）、ファチコスポラ属（Phachytichospora）、ファフィア属（Phaffia）、ピチア属、ロドスポリディウム属（Rhodosporidium）、ロドトルラ属（Rhodotorula）、サッカロマイセス属、サッカロマイコーデス属、サッカロマイコプシス属（Saccharomycopsis）、サイトエラ属（Saitoella）、サカグチア属（Sakaguchia）、サターノスポラ属（Saturnospora）、シゾブラストスポリオン属（Schizoblastosporion）、シゾサッカロマイセス属、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）、スポリディオボラス属（Sporidiobolus）、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）、スポロパキデミア属（Sporopachydermia）、ステファノアスカス属（Stephanoascus）、ステリグマトマイセス属（Sterigmatomyces）、ステリグマトスポリディウム属（Sterigmatosporidium）、シンビオタフリナ属（Symbiotaphrina）、シンポディオマイセス属（Sympodiomyces）、シンポディオマイコプシス属（Sympodiomycopsis）、トルラスポラ属、トリコスポリエラ属（Trichosporiella）、トリコスポロン属、トリゴノプシス属（Trigonopsis）、ツチヤエア属（Tsuchiyaea）、ウデニオマイセス属（Udeniomyces）、ワルトマイセス属（Waltomyces）、ウィカーハミア属（Wickerhamia）、ウィカーハミエラ属（Wickerhamiella）、ウィリオプシス属、ヤマダザイマ属（Yamadazyma）、ヤロウイア属、ザイゴアスカス属（Zygoascus）、チゴサッカロマイセス属、ザイゴウィリオプシス属（Zygowilliopsis）、およびザイゴザイマ属（Zygozyma）に属する酵母が挙げられる。
[0089] 一部の実施形態において、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（以前はSaccharomyces lactisと称されていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在Pichia angustaとして公知）である。一部の実施形態において、宿主微生物は、カンジダ属の株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓである。
[0090] 特定の実施形態において、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態において、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ ７９５９、ＣＢＳ ７９６０、ＣＢＳ ７９６１、ＣＢＳ ７９６２、ＣＢＳ ７９６３、ＣＢＳ ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１およびＡＬ−１からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。一部の実施形態において、宿主微生物は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、およびＳＡ−１からなる群から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＰＥ−２である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＣＡＴ−１である。他の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株は、ＢＧ−１である。
[0091] 一部の実施形態において、宿主微生物は、工業的な発酵に好適な微生物である。特定の実施形態において、微生物は、工業的な発酵環境の認識されたストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、基質利用の拡大、栄養素の制限、糖および塩による浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸塩ならびに細菌汚染、またはそれらの組合せのもとで生存するように調整されている。
５．４ ステビオールおよびステビオール配糖体の生合成経路
[0092] 一部の実施形態において、ステビオールの生合成経路および／またはステビオール配糖体の生合成経路は、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞において、経路の１つまたは複数の酵素をコードするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現するように細胞を操作することによって活性化される。図１は、例示的なステビオールの生合成経路を例示する。
[0093] したがって、一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、コパリル二リン酸シンターゼまたはｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ（CDPS；ent-コパリルピロリン酸シンターゼまたはCPSとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、カウレンシンターゼ（KS；ent-カウレンシンターゼとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、本明細書に記載されるカウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド（KO；ent-カウレン19-オキシダーゼとも称される）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、本明細書で提供される実施形態によるカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド活性を有するポリペプチド（KAH；ステビオールシンターゼとも称される）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
[0094] 一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴ９１Ｄ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＵＧＴＡＤ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。後述するように、ＵＧＴＡＤは、グルコース部分をＲｅｂＡの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位に転移してＲｅｂＤを産生することが可能なウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼを指す。
[0095] ある特定の実施形態において、宿主細胞は、バリアント酵素を含む。ある特定の実施形態において、バリアントは、関連ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、バリアントは、参照ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個の保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載される核酸のいずれも、宿主細胞に最適化することができ、例えばコドン最適化することができる。
[0096] ステビオールの生合成経路および／またはステビオール配糖体の生合成経路の例示的な核酸および酵素は後述する。
５．４．１ ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（GGPPS）
[0097] ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（EC2.5.1.29）は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＢＤ９２９２６）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号ＣＡＡ７５５６８）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓの酵素（受託番号ＡＡＨ６９９１３）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａの酵素（受託番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの酵素（受託番号ＺＰ＿０５００４５７０）、Ｓｕｌｆｕｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓの酵素（受託番号ＢＡＡ４３２００）、シネココッカス属種の酵素（受託番号ＡＢＣ９８５９６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＰ＿１９５３９９）、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａの酵素（受託番号ＡＦＣ９２７９８．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＧＧＰＰＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＧＧＰＰＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．２ コパリル二リン酸シンターゼ（CDPS）
[0098] コパリル二リン酸シンターゼ（EC5.5.1.13）は、ゲラニルゲラニル二リン酸からコパリル二リン酸への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＡＢ８７０９１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓの酵素（受託番号ＥＤＹ５１６６７）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍの酵素（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Ｚｅａ ｍａｙｓの酵素（受託番号ＡＹ５６２４９０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＭ＿１１６５１２）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの酵素（受託番号Ｑ５ＭＱ８５．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、９５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．３ カウレンシンターゼ（KS）
[0099] カウレンシンターゼ（EC4.2.3.19）は、コパリル二リン酸のカウレンおよび二リン酸塩への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍの酵素（受託番号ＡＡＣ２８８９５．１）、フェオスフェリア属（Phaeosphaeria）種の酵素（受託番号Ｏ１３２８４）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号Ｑ９ＳＡＫ２）、Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａの酵素（受託番号ＡＤＢ５５７１１．１）およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＫＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＫＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．４ 二官能性コパリル二リン酸シンターゼ（CDPS）およびカウレンシンターゼ（KS）
[00100] ＣＤＰＳ−ＫＳ二官能性酵素（EC5.5.1.13およびEC4.2.3.19）も使用することができる。酵素の説明に役立つ例としては、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｍｙｇｄａｌｉの酵素（受託番号ＢＡＧ３０９６２）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓの酵素（受託番号ＢＡＦ６１１３５）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）、ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ−ＫＳ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＰＳ−ＫＳ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．５ ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（KO）
[00101] ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（EC1.14.13.78；本明細書ではカウレンオキシダーゼとも称される）は、カウレンのカウレン酸への変換を触媒する。酵素の説明に役立つ例としては、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａの酵素（受託番号Ｑ５Ｚ５Ｒ４）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号Ｏ９４１４２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号Ｑ９３ＺＢ２）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＡＱ６３４６４．１）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍの酵素（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ６ＸＡＦ４）、およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＫＯ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＫＯ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．６ ステビオールシンターゼ（KAH）
[00102] 改変されたステビオールシンターゼ、またはカウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）（EC1.14.13.79）が本明細書で提供される。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。
５．４．７ シトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）
[00103] シトクロムＰ４５０レダクターゼ（EC1.6.2.4）は、上記のＫＯおよび／またはＫＡＨの活性に必要である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（受託番号ＡＢＢ８８８３９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの酵素（受託番号ＮＰ＿１９４１８３）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉの酵素（受託番号ＣＡＥ０９０５５）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａの酵素（受託番号ＡＢＣ４７９４６．１）、ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素、ＵＳ２０１４／０３５７５８８Ａ１の酵素、ＵＳ２０１５／０１５９１８８の酵素、およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＣＰＲ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＣＰＲ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．８ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１（UGT74G1）
[00104] ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。図１で示されるように、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９−配糖体に変換することが可能である。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールモノシドをルブソシドに変換することも可能である。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールビオシドをステビオシドに変換することが可能な場合もある。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67ならびにＵＳ２０１４／０３２９２８１およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２および受託番号ＡＡＲ０６９２０．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７４Ｇ１核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７４Ｇ１酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．９ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（UGT76G1）
[00105] ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、受容体分子であるステビオール１，２配糖体のＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’に転移することが可能である。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−Ｏ−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコース、１３−Ｏ−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールビオシドをＲｅｂＢに変換することが可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ステビオシドをＲｅｂＡに変換することも可能である。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することも可能である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67の酵素およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素および受託番号ＡＡＲ０６９１２．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７６Ｇ１核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ７６Ｇ１酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．１０ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８５Ｃ２（UGT85C2）
[00106] ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能化することが可能である。ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換することが可能であり、さらに１９−配糖体をルブソシドに変換することも可能である。酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41： 56-67の酵素およびＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１の酵素およびＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２の酵素および受託番号ＡＡＲ０６９１６．１の酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ８５Ｃ２核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ８５Ｃ２酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．１１ ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ９１Ｄ（UGT91D）
[00107] ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして機能化し、グルコース部分を、受容体分子であるステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（ステビオールモノシド）の１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移して、ステビオールビオシド（steviobioside）を産生することが可能である。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能化し、グルコース部分を受容体分子であるルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移してステビオシドを提供することも可能である。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはＵＧＴ９１Ｄ−ｌｉｋｅ３とも称される。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の説明に役立つ例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素（例えば、受託番号ＡＣＥ８７８５５．１、ＵＳ２０１４／０３２９２８１Ａ１、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、および配列番号７のＵＧＴ配列を有する酵素）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ９１Ｄ核酸の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴ９１Ｄ酵素の少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。
５．４．１２ ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することが可能なウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGTAD）
[00108] ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGTAD）は、グルコース部分をＲｅｂＡの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位に転移してＲｅｂＤを産生することが可能である。ＵＧＴＡＤはまた、グルコース部分をステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位に転移してＲｅｂＥを産生することも可能である。ＵＧＴの有用な例としては、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（Houghton-Larsen et al.、ＷＯ２０１３／０２２９８９Ａ２；XP_015629141.1では、ＥＵＧＴ１１とも称される）およびＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来のＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（Markosyan et al.、ＷＯ２０１４／１９３８８８Ａ１；XP_004250485.1では、UGTSL2とも称される）が挙げられる。さらなる有用なＵＧＴとしては、ＵＧＴ４００８７（XP_004982059.1；ＷＯ２０１８／０３１９５５に記載された通り）、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０（XP_003560669.1）、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１（BAJ94055.1）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０（XP_010230871.1）、およびＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅ（XP_006650455.1）が挙げられる。本明細書に記載される組成物および方法において、任意のＵＧＴまたはＵＧＴバリアントを使用することができる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書で提供される細胞および方法において有用である。ある特定の実施形態において、ＵＧＴの少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、これらのＵＧＴの少なくとも１つと、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を使用する細胞および方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるＵＧＴバリアントをコードする核酸が本明細書で提供される。
５．５ ＭＥＶ経路ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰ産生
[00109] 一部の実施形態において、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞は、ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰの形成に有用なＭＥＶ経路の１つまたは複数の異種酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させて、ＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリル二リン酸に変換する酵素を含む。
[00110] 一部の実施形態において、ＭＥＶ経路の１つまたは複数の酵素は、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡシンセターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびイソペンチル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ（IDIまたはIPPイソメラーゼ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、アセトアセチル−ＣｏＡの形成を触媒することが可能なＭＥＶ経路の酵素に関して、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼ；またはアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかを含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−ＣｏＡの２つの分子を縮合して、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼ；およびアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの両方を含む。
[00111] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１種より多くの酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換することができる酵素、およびメバロン酸をメバロン酸５−リン酸に変換することができる酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７種の酵素をコードする１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。
[00112] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（IPP）をジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して、ポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾して、ＦＰＰなどのイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。
５．５．１ アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの変換
[00113] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成することができる酵素、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_000913領域：2324131.2325315；Escherichia coli）、（D49362；Paracoccus denitrificans）、および（L20428；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
[00114] アセチル−ＣｏＡチオラーゼは、アセチル−ＣｏＡの２つの分子の可逆的な縮合を触媒して、アセトアセチル−ＣｏＡを生成するが、この反応は熱力学的に好ましくない。したがってアセトアセチル−ＣｏＡのチオール開裂は、アセトアセチル−ＣｏＡ合成より優先的になされる。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（AACS）（互換的にアセチル-CoA：マロニル-CoAアシルトランスフェラーゼと称される；EC2.3.1.194）は、アセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡと縮合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する。アセチル−ＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳによって触媒されるアセトアセチル−ＣｏＡ合成は、付随するマロニル−ＣｏＡの脱炭酸反応のために、本質的にエネルギー的に都合のよい反応である。加えて、ＡＡＣＳは、アセトアセチル−ＣｏＡに対するチオール開裂活性を示さないことから、この反応は、不可逆的である。
[00115] アセチル−ＣｏＡチオラーゼならびに異種ＡＤＡおよび／またはリン酸トランスアセチラーゼ（PTA）を含む宿主細胞において、アセトアセチル−ＣｏＡのチオール開裂のほうを優先的に行うアセチル−ＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆反応は、大きいアセチル−ＣｏＡプールをもたらし得る。ＡＤＡの可逆的な活性を考慮して、このアセチル−ＣｏＡプールは順に、アセチル−ＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する逆反応に向かってＡＤＡを駆動することができ、そのためアセチル−ＣｏＡ産生に対するＡＤＡによって提供される利益が減じられる。同様に、ＰＴＡの活性も可逆的であり、したがって大きいアセチル−ＣｏＡプールが、アセチル−ＣｏＡをアセチルリン酸に変換する逆反応に向かってＰＴＡを駆動し得る。それゆえに、一部の実施形態において、アセチル−ＣｏＡを強く引き寄せてＡＤＡおよびＰＴＡの正反応を駆動するために、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞のＭＥＶ経路は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを利用して、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを形成する。
[00116] 一部の実施形態において、ＡＡＣＳは、ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０由来である（Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107（25）：11265-70（2010））。ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。ストレプトマイセス属種の株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳタンパク質配列としては、受託番号Ｄ７ＵＲＶ０、ＢＡＪ１００４８が挙げられる。本明細書で提供される組成物および方法に有用な他のアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼとしては、これらに限定されないが、ストレプトマイセス属種（AB183750；KO-3988BAD86806）；Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ株９６６３（FN178498；CAX48662）；ストレプトマイセス属種ＫＯ−３９８８（AB212624；BAE78983）；アクチノプラネス属種Ａ４０６４４（AB113568；BAD07381）；ストレプトマイセス属種Ｃ（NZ_ACEW010000640；ZP_05511702）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ４３１１１（NZ_ABUI01000023；ZP_04335288）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ Ａｇｙ９９（NC_008611；YP_907152）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ（NC_010612；YP_001851502）；ストレプトマイセス属種Ｍｇ１（NZ_DS570501；ZP_05002626）；ストレプトマイセス属種ＡＡ４（NZ_ACEV01000037；ZP_05478992）；Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ＮＲＲＬ１５９９８（NZ_ABYB01000295；ZP_04696763）；ストレプトマイセス属種ＡＣＴＥ（NZ_ADFD01000030；ZP_06275834）；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ４０７３６（NZ_ACEZ01000031；ZP_05529691）；フランキア属種ＣｃＩ３（NC_007777；YP_480101）；Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（NC_018681；YP_006812440.1）；およびＡｕｓｔｗｉｃｋｉａ ｃｈｅｌｏｎａｅ（NZ_BAGZ01000005；ZP_10950493.1）が挙げられる。追加の好適なアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼとしては、その内容が参照によりそれらの全体が組み入れられる米国特許出願公開公報第２０１０／０２８５５４９号および２０１１／０２８１３１５号に記載されるものが挙げられる。
[00117] 同様に本明細書で提供される組成物および方法において有用なアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼとしてはまた、本明細書に記載されるアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」と称される分子も挙げられる。このような「誘導体」は、以下の特徴：（１）本明細書に記載されるアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を有する特徴；および（２）アセチル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとを不可逆的に縮合してアセトアセチル−ＣｏＡを形成することを触媒できる特徴を有する。アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼと「実質的な相同性」を共有すると称される。
５．５．２ アセトアセチル−ＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡへの変換
[00118] 一部の実施形態において、宿主細胞は、アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡの別の分子と縮合させて、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（HMG-CoA）を形成することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_001145.相補物19061.20536；Saccharomyces cerevisiae）、（X96617；Saccharomyces cerevisiae）、（X83882；Arabidopsis thaliana）、（AB037907；Kitasatospora griseola）、（BT007302；Homo sapiens）、および（NC_002758、遺伝子座タグSAV2546、遺伝子番号1122571；Staphylococcus aureus）が挙げられる。
５．５．３ ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への変換
[00119] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを使用するヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ−ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（EC1.1.1.34；EC1.1.1.88）は、（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロン酸への還元的な脱アシル化を触媒し、２つのクラス、すなわちクラスＩおよびクラスＩＩのＨＭＧｒに類別することができる。クラスＩは、真核生物およびほとんどの古細菌由来の酵素を包含し、クラスＩＩは、ある特定の原核生物および古細菌のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを包含する。配列の分岐に加えて、２つのクラスの酵素は、それらの補因子の特異性に関しても異なる。もっぱらＮＡＤＰＨを利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとを識別する能力の点で違いがある。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８６（７）：１９２７〜１９３２（２００４）を参照されたい。選ばれたクラスＩＩのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対する補因子の特異性を以下に示す。
Figure 2022502068
[00120] 本明細書で提供される組成物および方法にとって有用なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしては、補因子としてＮＡＤＨを利用できるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉまたはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、補因子としてＮＡＤＨのみを利用することが可能である。
[00121] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ由来である。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（EC1.1.1.88）をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列は、これまでに記載されている。ＢｅａｃｈおよびＲｏｄｗｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２９９４〜３００１（１９８９）を参照されたい。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なｍｖａＡヌクレオチド配列としては、受託番号Ｍ２４０１５が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶが挙げられる。
[00122] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉ由来である。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００６５６９．１が挙げられる。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿１６４９９４が挙げられる。
[00123] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来である。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、ＮＣ＿０１０００２領域：相補物（319980..321269）が挙げられる。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１５６１３１８が挙げられる。
[00124] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ由来である（Crane et al., J. Plant Physiol. 159：1301-1307（2002））。
[00125] 同様に本明細書で提供される組成物および方法において有用なＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしてはまた、本明細書に記載されるＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかの「誘導体」と称される分子、例えばＰ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉおよびＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のものも挙げられる。このような「誘導体」は、以下の特徴を有する：（１）本明細書に記載されるＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する；および（２）補因子として優先的にＮＡＤＨを使用しながら（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロン酸への還元的な脱アシル化を触媒できる。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有すると称される。
[00126] 「ＮＡＤＨを使用する」という句は、本明細書で使用される場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、例えばＮＡＤＰＨに比べてＮＡＤＨにより特異的な活性を有することを実証することによって、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに選択的であることを意味する。一部の実施形態において、補因子としてのＮＡＤＨへの選択性は、ｋｃａｔ （ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ （ＮＡＤＰＨ）の比率として表される。一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５より大きいｋｃａｔ （ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ （ＮＡＤＰＨ）の比率を有する。一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを使用する。例えば、ＮＡＤＨのみを使用するＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、インビトロで単独の補因子として供給されたＮＡＤＨで一定の活性を呈示するが、単独の補因子としてＮＡＤＰＨが供給される場合、検出可能な活性を呈示しない。補因子としてＮＡＤＨを選択的に用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを同定するための当業界において公知の補因子の特異性を決定するための任意の方法を利用することができ、このような方法としては、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：１２２６〜１２３４（２０００）；およびＷｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（１８）：５１４７〜５２（２０００）によって記載されたものが挙げられ、これらの内容は、本明細書にそれらの全体が取り入れられる。
[00127] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、例えば補因子結合ポケットの部位特異的変異誘発を介して、ＮＡＰＤＨよりＮＡＤＨに選択的になるように操作される。ＮＡＤＨ選択性を操作するための方法は、Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５３：３０４４〜３０５４（２００７）に記載されており、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの補因子の特異性を決定するための方法は、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．９：１２２６〜１２３４（２０００）に記載されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
[00128] 一部の実施形態において、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、生来的にメバロン酸分解経路を含む宿主種、例えば、その単独の炭素源としてメバロン酸を異化する宿主種由来である。これらの実施形態の範囲内で、通常、その生来的な宿主細胞内に内在化した（Ｒ）−メバロン酸から（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒するＮＡＤＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子改変された宿主細胞において、逆反応、すなわち（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロン酸の還元的な脱アシル化を触媒するのに利用される。単独の炭素源としてメバロン酸で増殖することが可能な原核生物は、Anderson et al., J. Bacteriol, 171（12）:6468-6472 （1989）; Beach et al., J. Bacteriol. 171:2994-3001 （1989）; Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 （1965）; Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 （1962）; Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 （1967）;およびTakatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.110:187-193 （1983）に記載されており、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
[00129] 本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態において、宿主細胞は、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧＲとＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方を含む。ＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NM_206548；Drosophila melanogaster）、（NC_002758、遺伝子座タグSAV2545、遺伝子番号1122570；Staphylococcus aureus）、（AB015627；ストレプトマイセス属種KO3988）、（短縮型HMG-CoAレダクターゼをコードする配列を提供するAX128213；Saccharomyces cerevisiae）、および（NC_001145：相補物（115734.118898；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
５．５．４ メバロン酸のメバロン酸−５−リン酸への変換
[00130] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸に変換することができる酵素、例えばメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（L77688；Arabidopsis thaliana）、および（X55875；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
５．５．５ メバロン酸−５−リン酸のメバロン酸−５−ピロリン酸への変換
[00131] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（AF429385；Hevea brasiliensis）、（NM_006556；Homo sapiens）、および（NC_001145.相補物712315.713670；Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
５．５．６ メバロン酸−５−ピロリン酸のＩＰＰへの変換
[00132] 一部の実施形態において、宿主細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（IPP）に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（X97557；Saccharomyces cerevisiae）、（AF290095；Enterococcus faecium）、および（U49260；Homo sapiens）が挙げられる。
５．５．７ ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換
[00133] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成したＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（DMAPP）に変換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（NC_000913、3031087.3031635；Escherichia coli）、および（AF082326；Haematococcus pluvialis）が挙げられる。
５．５．８ ポリプレニルシンターゼ
[00134] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して５個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
[00135] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰの１つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合してゲラニルピロリン酸（「GPP」）の１つの分子を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（AF513111；Abies grandis）、（AF513112；Abies grandis）、（AF513113；Abies grandis）、（AY534686；Antirrhinum majus）、（AY534687；Antirrhinum majus）、（Y17376；Arabidopsis thaliana）、（AE016877、遺伝子座AP11092；Bacillus cereus；ATCC14579）、（AJ243739；Citrus sinensis）、（AY534745；Clarkia breweri）、（AY953508；Ips pini）、（DQ286930；Lycopersicon esculentum）、（AF182828；Mentha x piperita）、（AF182827；Mentha x piperita）、（MPI249453；Mentha x piperita）、（PZE431697、遺伝子座CAD24425；Paracoccus zeaxanthinifaciens）、（AY866498；Picrorhiza kurrooa）、（AY351862；Vitis vinifera）、および（AF203881、遺伝子座AAF12843；Zymomonas mobilis）が挙げられる。
[00136] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰの２つの分子をＤＭＡＰＰの１つの分子と縮合する、またはＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加して、ファルネシルピロリン酸（「FPP」）の分子を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（ATU80605；Arabidopsis thaliana）、（ATHFPS2R；Arabidopsis thaliana）、（AAU36376；Artemisia annua）、（AF461050；Bos taurus）、（D00694；Escherichia coli K-12）、（AE009951、遺伝子座AAL95523；Fusobacterium nucleatum亜種nucleatum ATCC25586）、（GFFPPSGEN；Gibberella fujikuroi）、（CP000009、遺伝子座AAW60034；Gluconobacter oxydans 621H）、（AF019892；Helianthus annuus）、（HUMFAPS；Homo sapiens）、（KLPFPSQCR；Kluyveromyces lactis）、（LAU15777；Lupinus albus）、（LAU20771；Lupinus albus）、（AF309508；Mus musculus）、（NCFPPSGEN；Neurospora crassa）、（PAFPS1；Parthenium argentatum）、（PAFPS2；Parthenium argentatum）、（RATFAPS；Rattus norvegicus）、（YSCFPP；Saccharomyces cerevisiae）、（D89104；Schizosaccharomyces pombe）、（CP000003、遺伝子座AAT87386；Streptococcus pyogenes）、（CP000017、遺伝子座AAZ51849；Streptococcus pyogenes）、（NC_008022、遺伝子座YP_598856；Streptococcus pyogenes MGAS10270）、（NC_008023、遺伝子座YP_600845；Streptococcus pyogenes MGAS2096）、（NC_008024、遺伝子座YP_602832；Streptococcus pyogenes MGAS10750）、（MZEFPS；Zea mays）、（AE000657、遺伝子座AAC06913；Aquifex aeolicus VF5）、（NM_202836；Arabidopsis thaliana）、（D84432、遺伝子座BAA12575；Bacillus subtilis）、（U12678、遺伝子座AAC28894；Bradyrhizobium japonicum USDA 110）、（BACFDPS；Geobacillus stearothermophilus）、（NC_002940、遺伝子座NP_873754；Haemophilus ducreyi 35000HP）、（L42023、遺伝子座AAC23087；Haemophilus influenzae Rd KW20）、（J05262；Homo sapiens）、（YP_395294；Lactobacillus sakei亜種sakei 23K）、（NC_005823、遺伝子座YP_000273；Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130）、（AB003187；Micrococcus luteus）、（NC_002946、遺伝子座YP_208768；Neisseria gonorrhoeae FA1090）、（U00090、遺伝子座AAB91752；リゾビウム属種NGR234）、（J05091；Saccharomyces cerevisiae）、（CP000031、遺伝子座AAV93568；Silicibacter pomeroyi DSS-3）、（AE008481、遺伝子座AAK99890；Streptococcus pneumoniae R6）、および（NC_004556、遺伝子座NP779706；Xylella fastidiosa Temecula1）が挙げられる。
[00137] 一部の実施形態において、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを化合させてゲラニルゲラニルピロリン酸（「GGPP」）を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、（ATHGERPYRS；Arabidopsis thaliana）、（BT005328；Arabidopsis thaliana）、（NM_119845；Arabidopsis thaliana）、（NZ_AAJM01000380、遺伝子座ZP_00743052；Bacillus thuringiensis serovar israelensis、ATCC35646sq1563）、（CRGGPPS；Catharanthus roseus）、（NZ_AABF02000074、遺伝子座ZP_00144509；Fusobacterium nucleatum亜種vincentii、ATCC49256）、（GFGGPPSGN；Gibberella fujikuroi）、（AY371321；Ginkgo biloba）、（AB055496；Hevea brasiliensis）、（AB017971；Homo sapiens）、（MCI276129；Mucor circinelloides f. lusitanicus）、（AB016044；Mus musculus）、（AABX01000298、遺伝子座NCU01427；Neurospora crassa）、（NCU20940；Neurospora crassa）、（NZ_AAKL01000008、遺伝子座ZP_00943566；Ralstonia solanacearum UW551）、（AB118238；Rattus norvegicus）、（SCU31632；Saccharomyces cerevisiae）、（AB016095；Synechococcus elongates）、（SAGGPS；Sinapis alba）、（SSOGDS；Sulfolobus acidocaldarius）、（NC_007759、遺伝子座YP_461832；Syntrophus aciditrophicus SB）、（NC_006840、遺伝子座YP_204095；Vibrio fischeri ES114）、（NM_112315；Arabidopsis thaliana）、（ERWCRTE；Pantoea agglomerans）、（D90087、遺伝子座BAA14124；Pantoea ananatis）、（X52291、遺伝子座CAA36538；Rhodobacter capsulatus）、（AF195122、遺伝子座AAF24294；Rhodobacter sphaeroides）、および（NC_004350、遺伝子座NP_721015；Streptococcus mutans UA159）が挙げられる。
[00138] メバロン酸経路の酵素の例は上述した通りであるが、ある特定の実施形態において、ＤＸＰ経路の酵素は、本明細書に記載される宿主細胞、組成物および方法においてＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生するための代替または追加の経路として使用することができる。ＤＸＰ経路の酵素およびその酵素をコードする核酸は周知であり、当業界において、例えばＷＯ２０１２／１３５５９１Ａ２において、特徴づけられている。
５．６ ステビオール配糖体を産生する方法
[00139] 別の態様において、ステビオール配糖体を産生するための方法であって、（ａ）ステビオール配糖体化合物の生成に好適な条件下で、ステビオール配糖体を産生することが可能な本明細書に記載される遺伝子改変された宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を含む培地中で培養する工程；および（ｂ）培地から前記ステビオール配糖体化合物を回収する工程を含む方法が本明細書で提供される。
[00140] 一部の実施形態において、遺伝子改変された宿主細胞は、１つまたは複数の改変を含まない親細胞、または遺伝子改変された宿主細胞の１つまたは複数の改変の一部分のみを含むがそれ以外の点で遺伝学的に同一な親細胞と比較して、増加した量のステビオール配糖体を産生する。一部の実施形態において、増加した量は、例えば、細胞培養液１リットル当たりのグラムで、乾燥細胞重量１グラム当たりのミリグラムで、細胞培養液の単位体積当たり、単位乾燥細胞重量当たり、単位時間当たりの細胞培養液の単位体積当たり、または単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たりの、収量、産生量、および／または産生能で測定した場合、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％より大きい。
[00141] 一部の実施形態において、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１グラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部の実施形態において、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約５グラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部の実施形態において、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部の実施形態において、ステビオール配糖体は、細胞培養物１リットル当たり、約１０から約５０グラム、約１０から約１５グラム、約１５グラムより多く、約２０グラムより多く、約２５グラムより多く、または約３０グラムより多くの量で産生される。
[00142] 一部の実施形態において、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ミリグラムより多くの上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。一部のこのような実施形態において、ステビオール配糖体は、乾燥細胞重量１グラム当たり、約５０〜約１５００ミリグラム、約１００ミリグラムより多く、約１５０ミリグラムより多く、約２００ミリグラムより多く、約２５０ミリグラムより多く、約５００ミリグラムより多く、約７５０ミリグラムより多く、または約１０００ミリグラムより多くの量で産生される。
[00143] 一部の実施形態において、宿主細胞は、細胞培養液の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。
[00144] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。
[00145] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位時間当たりの細胞培養液の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。
[00146] 一部の実施形態において、宿主細胞は、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、もしくは少なくとも約１，０００倍、またはそれより高い倍率で、親細胞によって産生されたステビオール配糖体のレベルより高く上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。
[00147] ほとんどの実施形態において、宿主細胞によるステビオール配糖体の上昇したレベルの産生は、誘導化合物の存在によって誘導可能である。このような宿主細胞は、誘導化合物の非存在下で容易に操作することができる。次いで誘導化合物を添加して、宿主細胞による上昇したレベルのステビオール配糖体の産生を誘導する。他の実施形態において、宿主細胞によるステビオール配糖体の上昇したレベルの産生は、例えば増殖温度、培地成分などの培養条件を変化させることによって誘導することができる。
５．７ 培養培地および条件
[00148] 微生物培養物の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学 または発酵科学分野の当業者に周知である（例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, 第2版, McGraw Hill, New York, 1986を参照されたい）。宿主細胞、発酵、およびプロセスの具体的な必要条件に応じて、好気性、微好気性、または嫌気性条件にとって適切な培養培地、ｐＨ、温度、および必要条件の検討が必要である。
[00149] 本明細書で提供されるステビオール配糖体を産生する方法は、これらに限定されないが、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、フラスコ、または発酵槽などの好適な容器中で、好適な培養培地（例えば、パントテン酸補充有りまたは無し）中で実行することができる。さらに本方法は、微生物生成物の工業的産生を維持するために、当業界において公知の任意の発酵規模で実行することができる。撹拌タンク発酵槽、エアリフト式発酵槽、気泡式発酵槽、またはそれらの任意の組合せなどの任意の好適な発酵槽を使用することができる。宿主細胞としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを利用する特定の実施形態において、ＫｏｓａｒｉｃらによりＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版、１２巻、３９８〜４７３頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＤａＡ、ヴァインハイム、ドイツで詳細に説明されるようにして、株を発酵槽中で増殖させることができる。
[00150] 一部の実施形態において、培養培地は、ステビオール配糖体を産生することが可能な遺伝子改変された微生物が生存できる、すなわち増殖および生存を維持することができる任意の培養培地である。一部の実施形態において、培養培地は、消化可能な炭素、窒素およびホスフェート源を含む水性培地である。このような培地はまた、適切な塩、無機物質、金属および他の栄養素を包含していてもよい。一部の実施形態において、炭素源および必須の細胞栄養素のそれぞれは、少しずつ量を増やして、または連続的に発酵培地に添加され、それぞれの必要な栄養素は、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝または呼吸機能に基づき予め決定された細胞増殖曲線に従って、増殖中の細胞による効率的な同化に必要な本質的に最小限のレベルで維持される。
[00151] 微生物の培養に好適な条件および好適な培地は当業界において周知である。一部の実施形態において、好適な培地には、１種または複数の追加の物質、例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、抑制因子（例えば、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの制御下にある場合）、または選択物質（例えば、遺伝学的改変を含む微生物を選択するための抗生物質）などが補充される。
[00152] 一部の実施形態において、炭素源は、単糖類（単糖）、二糖類、多糖類、非発酵性の炭素源、またはそれらの１種または複数の組合せである。好適な単糖類の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な二糖類の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な多糖類の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびそれらの組合せが挙げられる。好適な非発酵性の炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙げられる。
[00153] 培養培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、細胞増殖を促進するのに十分であるが、使用される微生物の増殖を抑制するほど高くない。典型的には、培養は、グルコースなどの炭素源を用いて行われ、炭素源は、増殖およびバイオマスの望ましいレベルを達成するレベルで添加される。他の実施形態において、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、約１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約５ｇ／Ｌより高い。加えて、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、典型的には約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養成分の濃度への言及は、最初のおよび／または進行中の成分濃度の両方を指す可能性があることに留意されたい。一部のケースにおいて、培養中に培養培地の炭素源を枯渇させることが望ましい場合がある。
[00154] 好適な培養培地で使用できる消化可能な窒素源としては、これらに限定されないが、単純な窒素源、有機窒素源および複合的な窒素源が挙げられる。このような窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩、ならびに動物性、植物性および／または微生物起源の物質が挙げられる。好適な窒素源としては、これらに限定されないが、タンパク質加水分解物、微生物のバイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられる。培養培地中の窒素源の濃度は、典型的には約０．１ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地への窒素源の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。結果として、培養培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、一部の場合において、培養中に培養培地の窒素源を枯渇させることが望ましい場合がある。
[00155] 有効な培養培地は、無機塩、ビタミン、微量金属または増殖促進物質などの他の化合物を含有していてもよい。このような他の化合物はまた、有効な培地中の炭素、窒素または無機物質源中に存在するものでもよいし、または具体的に培地に添加されてもよい。
[00156] 培養培地はまた、好適なホスフェート源を含有していてもよい。このようなホスフェート源としては、無機および有機ホスフェート源の両方が挙げられる。好ましいホスフェート源としては、これらに限定されないが、リン酸塩、例えば一または二塩基性のリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、リン酸アンモニウムならびにそれらの混合物が挙げられる。培養培地中のホスフェート濃度は、典型的には約１．０ｇ／Ｌより高く、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのホスフェートの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のホスフェート濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。
[00157] 好適な培養培地はまた、マグネシウム源を、好ましくは生理学的に許容される塩、例えば硫酸マグネシウム七水和物の形態で包含していてもよいが、他のマグネシウム源も類似の量のマグネシウムを付与する濃度で使用することができる。培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約０．５ｇ／Ｌより高く、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約２．０ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのマグネシウムの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、一部の場合において、培養中に培養培地のマグネシウム源を枯渇させることが望ましい場合がある。
[00158] 一部の実施形態において、培養培地はまた、生物学的に許容できるキレート剤、例えばクエン酸三ナトリウムの二水和物を包含していてもよい。このような例において、培養培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより高く、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより高く、より好ましくは約１ｇ／Ｌより高い。しかしながら、培養培地へのキレート剤の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。
[00159] 培養培地はまた、最初のうちは、培養培地の望ましいｐＨを維持するために、生物学的に許容できる酸または塩基を包含していてもよい。生物学的に許容できる酸としては、これらに限定されないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸およびそれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容できる塩基としては、これらに限定されないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態において、使用される塩基は、水酸化アンモニウムである。
[00160] 培養培地はまた、これらに限定されないが、塩化カルシウムなどの生物学的に許容できるカルシウム源を包含していてもよい。培養培地中のカルシウム源、例えば塩化カルシウム二水和物の濃度は、典型的には、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。
[00161] 培養培地はまた、塩化ナトリウムを包含していてもよい。培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、典型的には約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内である。
[00162] 一部の実施形態において、培養培地はまた、微量金属を包含していてもよい。このような微量金属は、便宜上培養培地の残りから別々に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。典型的には、このような培養培地に添加される微量金属溶液の量は、約１ｍｌ／Ｌより多く、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多く、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。しかしながら、培養培地への微量金属の添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。したがって、このような培養培地に添加される微量金属溶液の量は、典型的には約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。微量金属をストック溶液で添加することに加えて、個々の成分を、それぞれ上記した微量金属溶液の範囲によって決定された成分の量に個別に対応する範囲内で別々に添加してもよいことに留意されたい。
[00163] 一部の実施形態において、培養培地は、他のビタミン、例えばパントテン酸塩、ビオチン、カルシウム、パントテン酸塩、イノシトール、ピリドキシン−ＨＣｌ、およびチアミン−ＨＣｌを含んでいてもよい。このようなビタミンは、便宜上培養培地の残りから別々に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。しかしながら、培養培地へのビタミンの添加は、ある特定の濃度を超えると、微生物の増殖に有利ではない。
[00164] 本明細書に記載される発酵方法は、従来の培養様式で実行することができ、このような様式としては、これらに限定されないが、バッチ、流加培養、細胞再循環、連続および半連続様式が挙げられる。一部の実施形態において、発酵は、流加培養様式で行われる。このようなケースにおいて、例えば発酵産生段階中のパントテン酸塩など、培養中に培地の成分の一部を枯渇させる。一部の実施形態において、開始時には、例えば産生段階の開始時には、添加が必要になる前の期間にわたり増殖および／またはステビオール配糖体産生が続くように、このような成分が比較的高い濃度で培養物に補充されていてもよい。これらの成分の好ましい範囲は、培養によってレベルが下がったときに添加を行うことによって培養中にわたり維持される。培養培地中の成分のレベルは、例えば培養培地を定期的にサンプリングし濃度をアッセイすることによってモニターすることができる。代替として、標準的な培養手順が一旦開発されたら、培養中にわたり特定の時間で、公知のレベルに対応する時間を定められたインターバルで添加を行うことができる。これは当業者には認識されるであろうが、栄養素の消費速度は、培養中、培地の細胞密度が増加するにつれて増加する。さらに、培養培地への外来微生物の導入を回避するために、添加は、当業界において公知のように、無菌の添加方法を使用して実行される。加えて、培養中に少量の消泡剤が添加されていてもよい。
[00165] 培養培地の温度は、遺伝子改変された細胞の増殖および／またはステビオール配糖体の産生に好適な任意の温度であり得る。例えば、培養培地に接種材料を植え付ける前に、培養培地は、約２０℃〜約４５℃の範囲の温度、好ましくは約２５℃〜約４０℃の範囲、より好ましくは約２８℃〜約３２℃の範囲の温度にして、その温度を維持してもよい。
[00166] 培養培地のｐＨは、培養培地への酸または塩基の添加によって制御することができる。このようなケースにおいて、ｐＨを制御するのにアンモニアが使用される場合、アンモニアも、培養培地中の窒素源として好都合に役立つ。好ましくは、ｐＨは、約３．０〜約８．０、より好ましくは約３．５〜約７．０、最も好ましくは約４．０〜約６．５に維持される。
[00167] 一部の実施形態において、培養培地の炭素源濃度、例えばグルコース濃度は、培養中にモニターされる。培養培地のグルコース濃度は、上清中のグルコース濃度、例えば培養培地の無細胞成分をモニターするのに使用することができる、例えばグルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの公知の技術を使用して、モニターすることができる。炭素源濃度は、典型的には、細胞増殖の阻害が起こるレベル未満に維持される。炭素源としてのグルコースに関してこのような濃度は生物ごとに変更できるが、細胞増殖の阻害は、約６０ｇ／Ｌより高いグルコース濃度で起こり、試験によって容易に決定することができる。したがって、グルコースが炭素源として使用される場合、好ましくは、グルコースは発酵槽にフィードされ、検出限界未満で維持される。代替として、培養培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは約２ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの範囲、その上さらにより好ましくは約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの範囲で維持される。炭素源の濃度は、例えば実質的に純粋なグルコース溶液の添加によって望ましいレベル内に維持できるが、元の培養培地のアリコートの添加によって培養培地の炭素源の濃度を維持することが許容でき、好ましい場合がある。元の培養培地のアリコートの使用は、培地中の他の栄養素（例えば窒素およびリン酸源）の濃度も同時に維持できるため望ましい。同様に、微量金属の濃度は、微量金属溶液のアリコートの添加によって培養培地中で維持することができる。
[00168] 他の好適な発酵培地および方法は、例えば、ＷＯ２０１６／１９６３２１に記載されている。
５．８ 発酵組成物
[00169] 別の態様において、本明細書に記載される遺伝子改変された宿主細胞および遺伝子改変された宿主細胞から産生されたステビオール配糖体を含む発酵組成物が本明細書で提供される。発酵組成物は、培地をさらに含んでいてもよい。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞を含み、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭをさらに含む。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞から産生されたステビオール配糖体の主成分として、ＲｅｂＭを含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを、少なくとも１：７：５０の比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭを、少なくとも１：７：５０〜１：１００：１０００の比率で含む。ある特定の実施形態において、発酵組成物は、少なくとも１：７：５０〜１：２００：２０００の比率を含む。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞および培地に関連するステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、培地中のステビオール配糖体の総含量に基づく。ある特定の実施形態において、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、およびＲｅｂＭの比率は、遺伝子改変された宿主細胞に付随するステビオール配糖体の総含量に基づく。
[00170] ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、ＲｅｂＭ２を検出不可能なレベルで含有する。ある特定の実施形態において、本明細書で提供される発酵組成物は、天然に存在しないステビオール配糖体を検出不可能なレベルで含有する。
５．９ ステビオール配糖体の回収
[00171] ステビオール配糖体が宿主細胞によって産生されたら、それを、当業界において公知の任意の好適な分離および精製方法を使用して、それに続く使用のために回収または単離することができる。一部の実施形態において、ステビオール配糖体を含む清澄化した水相は、遠心分離によって発酵物から分離される。他の実施形態において、ステビオール配糖体を含む清澄化した水相は、発酵反応物に解乳化剤を添加することによって発酵物から分離される。解乳化剤の説明に役立つ例としては、凝集剤および凝固剤が挙げられる。
[00172] これらの細胞で産生されたステビオール配糖体は、培養上清中に存在する場合もあるし、および／または宿主細胞に付随している場合もある。ステビオール配糖体の一部が宿主細胞に付随する実施形態において、ステビオール配糖体の回収は、細胞からのステビオール配糖体の放出を改善する方法を含んでいてもよい。一部の実施形態において、これは、界面活性剤有りまたは無しで、緩衝液または塩を添加して、または添加しないで、熱水または緩衝液での処理で細胞を洗浄する形態をとることができる。一部の実施形態において、温度は、ステビオール配糖体の放出に好適とみなされる任意の温度である。一部の実施形態において、温度は、４０から９５℃；または６０から９０℃；または７５から８５℃の範囲内である。一部の実施形態において、温度は、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５℃である。一部の実施形態において、宿主細胞からのステビオール配糖体の放出を強化するために、物理的または化学的な細胞破壊が使用される。代替として、および／またはその後、培養培地中のステビオール配糖体は、これらに限定されないが、溶媒抽出、膜浄化、膜濃縮、吸着、クロマトグラフィー、蒸発、化学的な誘導体化、結晶化、および乾燥などの単離ユニットの操作を使用して回収することができる。
５．１０ 遺伝子改変された細胞を生成する方法
[00173] 上述した改変の１つまたは複数、例えば、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼ、および／または生合成経路酵素、例えば、ステビオール配糖体化合物に関する生合成経路酵素をコードする１つまたは複数の核酸の異種核酸を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を産生するための方法も本明細書で提供される。宿主細胞における異種酵素の発現は、宿主細胞中での発現を許容する調節エレメントの制御下に、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することによって達成することができる。一部の実施形態において、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態において、核酸は、宿主細胞の染色体にヌクレオチド配列を組み込むことができる染色体組込み型ベクターである。他の実施形態において、核酸は、相同性を介してヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができる二本鎖ＤＮＡの直鎖状断片である。
[00174] これらのタンパク質をコードする核酸は、限定されない当業者公知の任意の方法によって宿主細胞に導入することができる（例えば、Hinnen et al.（1978）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75：1292-3；Cregg et al.（1985） Mol. Cell. Biol. 5：3376-3385；Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA；Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY；およびAusubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照）。例示的な技術としては、これらに限定されないが、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００が媒介する形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムが媒介する形質転換が挙げられる。
[00175] 宿主細胞中の酵素の量は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することによって変更することができる。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することによって（例えば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターのより多くのまたはより少ないコピー数を使用することによって、または宿主細胞のゲノムにヌクレオチド配列の追加のコピーを導入することによって、または宿主細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を欠失させるもしくは破壊することによって）、オペロンの多シストロン性ｍＲＮＡにおけるコード配列の順番を変化させるか、またはそれぞれそれ自身の制御エレメントを有する個々の遺伝子にオペロンを分解することによって、またはヌクレオチド配列が作動可能に連結するプロモーターまたはオペレーターの強度を増加させることによって達成することができる。代替として、または加えて、宿主細胞中の酵素のコピー数は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することによって変更することができる。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改変すること、リボソーム結合部位の配列を改変すること、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離または配列を改変すること、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」またはそれに隣接して配置された全体のシストロン間領域を改変すること、ヘアピンおよび特殊化した配列を使用してｍＲＮＡ転写の３’末端を安定化すること、酵素のコドン使用頻度を改変すること、酵素の生合成に使用されるまれなコドンのｔＲＮＡの発現を変更すること、および／または例えばそのコード配列の突然変異を介して酵素の安定性を増加させることによって達成することができる。
[00176] 宿主細胞における酵素の活性は、これらに限定されないが、宿主細胞において増加または減少した溶解性を呈示する酵素の改変された形態を発現すること、それを介して酵素の活性が阻害されるドメインが欠如した酵素の変更された形態を発現すること、基質に対してより高いまたはより低いＫｃａｔまたはより低いまたはより高いＫｍを有する酵素の改変された形態を発現すること、または程度の差はあるが経路中の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節の影響を受ける酵素の変更された形態を発現することなどの多数の方法で変更することができる。
[00177] 一部の実施形態において、宿主細胞を遺伝学的に改変するのに使用される核酸は、形質転換宿主細胞の選択に有用な、さらに、外来ＤＮＡを維持するために宿主細胞に選択圧力をかけるのに有用な１つまたは複数の選択可能マーカーを含む。
[00178] 一部の実施形態において、選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの説明に役立つ例としては、これらに限定されないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、およびＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡ遺伝子産物は、ベータラクタム系抗生物質（例えば、狭域スペクトルのセファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）およびテモシリンを除く全ての抗グラム陰性細菌のペニシリンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシンに対する耐性を付与し；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物は、ビアラホス（bialophos）に対する耐性を付与し；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン（Auerobasidin）Ａ（AbA）に対する耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキセートに対する耐性を付与し；クレブシェラ肺炎杆菌のＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与し；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物は、単独の窒素源としてＤ−セリンを含むプレート上での細胞の増殖を可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与し；Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。一部の実施形態において、抗生物質耐性マーカーは、本明細書で開示された遺伝子改変された宿主細胞を単離した後、除去される。
[00179] 一部の実施形態において、選択可能マーカーは、遺伝子改変された微生物における要求性（例えば、栄養要求性）をレスキューする。このような実施形態において、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能し、機能しないと、親細胞を１種または複数の栄養素が補充されていない培地中で増殖できなくする１つまたは複数の遺伝子産物における機能の破壊を、親微生物は含む。このような遺伝子産物としては、これらに限定されないが、酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次いで栄養要求性表現型は、破壊した遺伝子産物の機能的なコピーをコードする発現ベクターまたは染色体組込みコンストラクトで親細胞を形質転換することによってレスキューすることができ、生成した遺伝子改変された宿主細胞は、親細胞の栄養要求性表現型の損失に基づき選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２遺伝子の選択可能マーカーとしての利用は、陽性および陰性選択の両方が可能になるため、特に有利である。陽性選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異の栄養要求性を補うことによって行われ、それに対して陰性選択は、特異的な阻害剤に基づいており、すなわち、原栄養菌株の増殖を抑制するが、それぞれＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異体の増殖を可能にするそれぞれ５−フルオロ−オロチン酸（FOA）、５−フルオロアントラニル酸、およびアミノアジピン酸（aAA）に基づく。他の実施形態において、選択可能マーカーは、公知の選択方法によって同定できる他の非致死性の欠失または表現型をレスキューする。
[00180] 本開示の方法、組成物および生物において有用な特異的な遺伝子およびタンパク質が本明細書に記載される。しかしながら、このような遺伝子に対する絶対的な同一性は必ずしも必要ではないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドにおける変更を実行して、活性に関してスクリーニングすることができる。典型的には、このような変更は、保存的突然変異およびサイレント突然変異を含む。このような改変または突然変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当業界において公知の方法を使用して機能的な酵素の発現に関してスクリーニングすることができる。
[00181] 遺伝子コードの固有の縮重のために、実質的に同じかまたは機能的に同等なポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドも、このような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングして発現させるのに使用することができる。
[00182] これは当業者によって理解されるであろうが、コード配列を改変して、特定の宿主におけるその発現を強化することが有利な場合がある。遺伝子コードは、冗長であり６４種の可能性のあるコドンを有するが、ほとんどの生物は、典型的にはこれらのコドンの一部を使用する。ある種でほとんどの場合に利用されるコドンは、最適なコドンと称され、めったに利用されないコドンは、まれなまたは低利用のコドンと分類される。コドンは、プロセス中の宿主における好ましいコドン使用頻度を反映するように置換されてもよく、これは、「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」と称されることもある。他の宿主細胞のためのコドン最適化は、コドン使用頻度表を使用して容易に決定することができ、または市販のソフトウェア、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｏｄｏｎＯｐ（www.idtdna.com/CodonOptfrom）を使用して実行することができる。
[00183] 特定の原核または真核宿主に好ましいコドンを含有する最適化されたコード配列（Murray et al., 1989, Nucl Acids Res.17：477-508）は、例えば、翻訳速度を増加させるために、または望ましい特性、例えば最適化されていない配列から産生された転写物と比較してより長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために調製することができる。翻訳終止コドンはまた、宿主にとって好ましいように改変することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物のための典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物のための典型的な終止コドンは、ＵＧＡであるが、それに対して昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般的に、終止コドンとしてＵＡＡを使用する（Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24：216-8）。
[00184] 当業者であれば、遺伝子コードの縮退の性質のために、本開示の所与の酵素をコードするのに、ヌクレオチド配列において異なる様々なＤＮＡ分子を使用できることを認識するであろう。上述した生合成酵素をコードする生来的なＤＮＡ配列は、単に本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照されたものであり、本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を包含する。同様に、ポリペプチドは、典型的には、望ましい活性の損失または有意な損失を起こすことなくそのアミノ酸配列中に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および挿入を受け入れることができる。本開示は、改変されたまたはバリアントポリペプチドが酵素による参照ポリペプチドの同化または異化活性を有する限りは、本明細書に記載される具体的なタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列は、単に本開示の実施形態を例示したものに過ぎない。
[00185] 加えて、本明細書で提供される組成物および方法に有用な酵素の相同体は、本開示に包含される。一部の実施形態において、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的で並べられる（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよいし、比較目的のために、非相同配列を無視してもよい）。一実施形態において、比較目的で並べられた参照配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、さらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合、その分子は、その位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた配列が共通する同一な位置の数の関数である。
[00186] タンパク質またはペプチドへの言及において「相同」が使用される場合、同一ではない残基の位置がしばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認識されている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されている置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるケースにおいて、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的性質を修正するために上方調整することができる。この調整を行うための手段は当業者周知である（例えば、Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25：365-89を参照）。
[00187] 以下の６つのグループはそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
[00188] ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性パーセントとも称され、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。分子配列を異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するのに使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物由来の配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。
[00189] さらに、前述の酵素をコードする遺伝子のいずれか（または本明細書で述べられた他の任意のもの（またはそれらの発現を制御またはモジュレートする調節エレメントのいずれか））は、遺伝学的／タンパク質工学技術、例えば当業者公知の定向進化または合理的な変異誘発によって最適化することができる。このような作用は、当業者が、酵母における発現および活性に酵素を最適化することを可能にする。
[00190] 加えて、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌性および細菌種から同定することができ、この経路のモジュレーションのために発現させることができる。様々な生物がこれらの酵素の源として役立つことができ、このような生物としては、これらに限定されないが、サッカロマイセス属種、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｕｖａｒｕｍなど、クルイベロマイセス属種、例えばＫ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど、ピチア属種、ハンセヌラ属種、例えばＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなど、カンジダ属種、トリコスポロン属種、ヤマダザイマ属（Yamadazyma）種、例えばＹ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓなど、シゾサッカロマイセス種、例えばＳ．ｐｏｍｂｅなど、クリプトコックス属種、アスペルギルス種、アカパンカビ属種、または黒穂菌属種が挙げられる。嫌気性真菌由来の遺伝子の源としては、これらに限定されないが、ピロミセス属種、オルピノマイセス属（Orpinomyces）種、またはネオカリマスティクス属種が挙げられる。有用な原核性酵素の源としては、これらに限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、バチルス属種、クロストリジウム属種、コリネバクテリウム属種、シュードモナス属種、ラクトコッカス属種、エンテロバクター属種、およびサルモネラ属種が挙げられる。
[00191] 追加の相同な遺伝子および相同な酵素を同定するのに、当業者公知の技術が好適であり得る。一般的に、類似の遺伝子および／または類似の酵素は、機能的な分析によって同定することができ、機能的な類似性を有するであろう。類似の遺伝子および類似の酵素を同定するのに、当業者公知の技術が好適であり得る。例えば、相同なもしくは類似のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＫＡＨ、または任意の生合成経路の遺伝子、タンパク質、もしくは酵素を同定するための技術としては、これらに限定されないが、目的の遺伝子／酵素の公開された配列に基づくプライマーを使用したＰＣＲによって、または目的の遺伝子のなかでも保存された領域を増幅するように設計されたディジェネレートプライマーを使用したディジェネレートＰＣＲによって遺伝子をクローニングすることが挙げられる。さらに当業者は、機能的な相同性または類似性を有する相同なまたは類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技術を使用することができる。このような技術は、前記活性に関するインビトロでの酵素アッセイ（例えば本明細書に記載される通り、またはKiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970に記載のもの）によって、酵素の触媒活性に関し細胞または細胞培養物を検査すること、次いで前記活性を有する酵素を精製により単離すること、エドマン分解などの技術によって酵素のタンパク質配列を決定すること、可能性がある核酸配列に対してＰＣＲプライマーを設計すること、ＰＣＲによって前記ＤＮＡ配列を増幅すること、および前記核酸配列をクローニングすることを包含する。相同なまたは類似の遺伝子および／または相同なまたは類似の酵素、類似の遺伝子および／または類似の酵素もしくはタンパク質を同定するための技術としてはさらに、候補遺伝子または酵素に関するデータのＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣなどのデータベースとの比較も挙げられる。候補遺伝子または酵素は、本明細書に記載の教示に従って上述したデータベース内で同定することができる。
実施例１：酵母培養条件
[00192] 各ＤＮＡコンストラクトを、最適化された酢酸リチウムによる形質転換において標準的な分子生物学技術を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（CEN.PK113-7D）に組み込んだ。簡単に言えば、細胞を、酵母抽出物ペプトンデキストロース（YPD）培地中で、振盪（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させ、１００ｍＬのＹＰＤで０．１のＯＤ６００に希釈し、０．６〜０．８のＯＤ６００に増殖させた。各形質転換につき、５ｍＬの培養物を遠心分離によって回収し、５ｍＬの滅菌水中で洗浄し、再度遠沈させ、１ｍＬの１００ｍＭの酢酸リチウムに再懸濁し、マイクロ遠沈管に移した。細胞を３０秒間遠沈させ（１３，０００×ｇ）、上清を除去し、細胞を、２４０μＬの５０％ＰＥＧ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの加熱処理したサケ精子ＤＮＡ、および７４μＬのドナーＤＮＡからなる形質転換ミックスに再懸濁した。エンドヌクレアーゼＦ−Ｃｐｈ１の発現を必要とする形質転換のために、ドナーＤＮＡは、酵母ＴＤＨ３プロモーター下で発現されるＦ−ＣｐｈＩ遺伝子を有するプラスミドを包含していた。このようなようにして発現されたＦ−ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼは、宿主株中の操作された特異的な認識部位を切断して、目的の標的遺伝子の組込みを容易にする。４２℃で４０分でのヒートショック後、細胞を一晩でＹＰＤ培地中に回収し、その後、選択培地上で平板培養した。ＤＮＡ組込みは、組込みに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認した。
実施例２：ファルネシルピロリン酸（FPP）およびイソプレノイドファルネセンへの高フラックスが可能なベース株の生成
[00193] ファルネセン産生株を、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（CEN.PK113-7D）から、天然のＧＡＬプロモーターの制御下でメバロン酸経路の遺伝子を発現させることによって作り出した。この株は、染色体に組み込まれたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の以下のメバロン酸経路遺伝子：アセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼを含んでいた。加えて、この株は、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ由来のファルネセンシンターゼの複数のコピーを含有しており、天然ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下でもあった。本明細書に記載される全ての異種遺伝子は、公共的に利用可能なまたは他の好適なアルゴリズムを使用してコドン最適化された。この株はまたＧＡＬ８０遺伝子の欠失も含有していた。スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子は、天然プロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターで置き換えることによって下方調節される。イソプレノイドへの高フラックスを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を作り出す方法の例は、それらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第８，４１５，１３６号および米国特許第８，２３６，５１２号に記載される。
実施例３：新規のカウレン酸ヒドロキシラーゼＰ４５０酵素の迅速スクリーニングのための一連の株の構築
[00194] 図１は、カウレン酸中間体を含むＦＰＰからＲｅｂＭへの例示的な生合成経路を示す。上述したファルネセンベース株を、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（GGPPS）の６コピー、コパリル二リン酸シンターゼの１コピー、およびカウレンシンターゼの４コピーをゲノムに組み込むことによって、Ｃ２０イソプレノイドカウレンへの高フラックスを有するようにさらに操作した。その後、ファルネセンシンターゼの全てのコピーを株から除去し、株がｅｎｔ−カウレンを産生するがファルネセンを産生しないことを確認した。
[00195] カウレン酸ヒドロキシラーゼ（KAH）は、ＲｅｂＭの産生に必要なステビオールを産生するためにカウレン酸の酸化を触媒するシトクロムＰ４５０酵素である（図１を参照）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、インビボのＫＡＨ活性に関して新規のＰ４５０酵素をスクリーニングするために、ＫＡＨ遺伝子のコピーをまったく含んでいないことを除きＲｅｂＭを産生するのに必要な全ての遺伝子を含有する数々の株を生成した。表１に、使用された全てのＲｅｂＭ経路の遺伝子およびプロモーターを列挙する。表１に記載される全ての遺伝子を含有する株は主として、ＫＡＨの基質であるカウレン酸を産生する。
Figure 2022502068
[00197] Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるインビボのＫＡＨバリアントの活性を測定するために、最初にＫＡＨ遺伝子のコピーをまったく含んでいないことを除きモノグリコシル化したステビオール代謝産物１９−配糖体を産生するのに必要な全ての遺伝子（表１および図１）を含有する第１のスクリーニング株を構築した。代わりに、それは、ＫＡＨバリアントの迅速な挿入を可能にするためのランディングパッドを含有する（図２）。ランディングパッドは、コンストラクトの両末端に、選ばれた酵母遺伝子座の上流および下流のゲノム領域（上流遺伝子座および下流遺伝子座）に対する５００ｂｐの遺伝子座標的化ＤＮＡ配列からなっており、それによりランディングパッドが酵母染色体に組み込まれるとき、遺伝子座を欠失させる。その内部に、ランディングパッドは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ３または酵母ＧＡＬレギュロンの他の任意のプロモーターであり得るプロモーター（Promoter）、およびエンドヌクレアーゼ認識部位（F-CphI）の端部にある選ばれた酵母ターミネーター（ターミネーター）を含有する。Ｓｒ．ＫＡＨ（配列番号１）のＤＮＡバリアントを使用して、エンドヌクレアーゼＦ−ＣｐｈＩを発現するプラスミドと共に株を形質転換させた。このエンドヌクレアーゼＦ−ＣｐｈＩは、認識配列を切断し、ランディングパッドに二本鎖破断を作り出すものであり、その部位におけるＳｒ．ＫＡＨ ＤＮＡバリアントの相同組換えを容易にする。
[00198] 第２のスクリーニング株を、最終的にＲｅｂＭを産生するのに必要な全ての遺伝子を含有するように追加の遺伝子を導入することによって機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいない第１のスクリーニング株から得た（表１および図１）。第１のスクリーニング株の場合と同様に、第２のスクリーニング株は、ＫＡＨ遺伝子のコピーをまったく含んでおらず、その代わりに切断可能なランディングパッドを含有する（図２）。
[00199] Ｓｒ．ＫＯをＰｓ．ＫＯ（配列番号１０）で置き換えたことを除き第２のスクリーニング株と同じ操作を有する第３のスクリーニング株を生成した。Ｐｓ．ＫＯ酵素は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４６３５９（PISUM SATIVUM KAURENE OXIDASE FOR HIGH EFFICIENCY PRODUCTION OF REBAUDIOSIDES、２０１８年８月１０日に出願）に記載され、カウレンをカウレン酸に変換することにおいてより顕著に高く活性である（図１）。それゆえに第３のスクリーニング株は、ＫＡＨ Ｐ４５０の基質であるカウレン酸へのより高い炭素フラックスを有する。第２および第３のスクリーニング株は、機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母と称される。
実施例４：酵母培養条件
[00200] 期待されるＫＡＨ遺伝子を含有すると確認された酵母コロニーを、２０ｇ／Ｌスクロース、３７．５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、および１〜５ｇ／Ｌのリシンを含むバードシード培地（Bird Seed Media：BSM、元はvan Hoek et al., Biotechnology and Bioengineering 68（5）, 2000, pp. 517-523に記載されている）を含有する９６−ウェルマイクロタイタープレートに採取した。１０００ｒｐｍで振盪する高容量マイクロタイタープレートインキュベーター中、３０℃、８０％湿度で３日間、培養物が炭素を消費しつくすまで細胞を培養した。増殖が飽和した培養物から１４．４μＬをとり、３６０μＬの新しい培地に希釈することによって、その飽和した培養物を、４０ｇ／Ｌスクロース、１５０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、および１ｇ／Ｌリシンを含むＢＳＭを含有する新しいプレートに継代培養した。産生培地中の細胞を、抽出および分析前の追加の３日間、１０００ｒｐｍおよび８０％湿度で、高容量マイクロタイタープレート振盪機で３０℃で培養した。
実施例５：ファルネソールからレバウジオシドＭへの経路中間体を分析するための酵母サンプル調製条件
[00201] 培養が終わったら、細胞によって生成された全てのステビオール配糖体を抽出するために（図１を参照）、全細胞液体培地を６２８μＬの１００％エタノールで希釈し、ホイルシールで密封し、１２５０ｒｐｍで３０秒振盪した。３１４μＬの水を各ウェルに添加して抽出物を直接希釈した。プレートを短時間遠心分離して、固体をペレット化した。０．４８ｍｇ／ＬレバウジオシドＮ（内部標準として使用される）を含有する１９８μＬの５０：５０のエタノール：水を新しい２５０μＬのアッセイプレートに移し、２μＬの培養物／エタノール混合物をアッセイプレートに添加した。分析のためにホイルシールをプレートに適用した。
[00202] 細胞によって生成されたファルネソールからステビオールへの経路中間体（図１を参照）を抽出するために、培養が終わったら、全細胞の液体培地を１００μＬの１００％メタノール、および５００μＬの１００％酢酸エチルで希釈し、ホイルシールで密封し、１０００ｒｐｍで３０分振盪して目的の分析物を酢酸エチルに抽出した。混合物を遠心分離して、全ての固体をペレット化した。１５０μＬの酢酸エチル層を新しい１．１ｍＬのアッセイプレートに添加し、１５０μＬの新しい酢酸エチル層をアッセイプレートに添加し、続いてＧＣ−ＦＩＤ分析を行う。
実施例６：分析方法
[00203] ステビオール配糖体測定のためのサンプルを、Ｃ８カートリッジを備えたＲａｐｉｄＦｉｒｅ ３６５システムオートサンプラーを用いた質量分析計（Agilent 6470-QQQ）によって分析した。
Figure 2022502068
Figure 2022502068
[00204] 質量分析計からのクロマトグラムからのピーク領域を使用して、信頼できる標準を使用した検量線を生成した。関連化合物のモル比を、信頼できる標準を使用した外部補正によって量を各化合物のモルで定量し、次いで適切な比率をとることによって決定した。
[00205] ステビオール配糖体上流（すなわちファルネソールからステビオール、図１）のサンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＢ−１７ＭＳ（２０ｍ×０．１８ｍｍ×０．１８μｍ、P/N121-4722）を５０のスプリット比のスプリットモードで使用した水素炎イオン化検出（GC-FID、Agilent 7890A）を用いたガスクロマトグラフィーによって分析した。以下の温度およびフロー勾配を使用した。
Figure 2022502068
Figure 2022502068
[00206] 各分析物を、信頼できる標準から決定された保持時間によって同定した。クロマトグラムからのピーク領域を使用して、検量線を作成する。カウレン、カウレノール、カウレナール、カウレン酸、およびステビオールのモル比を、信頼できる標準を使用した外部補正によって量を各化合物のモルで定量し、次いで適切な比率をとることによって決定した。
実施例７：部位特異的飽和突然変異誘発を介したＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの進化
[00207] この実施例において、Ｐ４５０酵素（植物Stevia rebaudiana由来のカウレン酸ヒドロキシラーゼ、Sr.KAH）およびステビオール配糖体およびＲｅｂＭを産生するためのインビボにおいてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現されるＳｒ．ＫＡＨ活性を改善する特異的突然変異に関する活性データが提供される。
[00208] ＫＡＨは、カウレン酸のステビオールへの酸化を触媒するシトクロムＰ４５０酵素であり（図１）、これは、ＲｅｂＭの形成に必要である。Ｓｒ．ＫＡＨにおける各アミノ酸残基を、縮重コドンＮＤＴ（式中、Ｎは、任意（ヌクレオチドアデニン、チミン、グアニンおよびシトシン）を意味し；Ｄは、アデニン、グアニンおよびチミンを意味し；Ｔは、チミンを意味する）によってコードされる１２種の異なるアミノ酸（Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、およびＶ）に突然変異させた。Ｓｒ．ＫＡＨ遺伝子バリアントのＮＤＴライブラリーを、望ましい位置にＮＤＴ縮重コドンを含有するプライマーを使用したＰＣＲを介して構築した。各ＰＣＲ産物は、１２種の可能性のある異なるアミノ酸が、単一のタンパク質残基に対応する特定の位置にコードされるように、遺伝子バリアントの混合物を含有する。各ＰＣＲ産物において、Ｓｒ．ＫＡＨ遺伝子バリアントのプールは、両方の末端に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主株の特定の遺伝子座に組み込まれたランディングパッドのプロモーター（遺伝子の５’における）およびターミネーター（遺伝子の３’における）領域に相同な４０ｂｐの配列が隣接している（図２を参照）。
[00209] インビボでのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける部位飽和突然変異誘発の第１のラウンドで生成したＫＡＨバリアントの活性を測定するために、突然変異したＳｒ．ＫＡＨバリアントを使用して、機能的なＫＡＨ遺伝子を含まない１９−配糖体産生酵母またはＲｅｂＭ産生酵母のいずれかを形質転換した。野生型Ｓｒ．ＫＡＨを、対照として使用した。インビボにおけるＫＡＨ活性を、それぞれ１９−配糖体またはＲｅｂＭのいずれかのタイターとして最初の階層１のスクリーニングで測定した。階層１のスクリーニングにおいて、Ｎ＝１で２倍のカバー率と仮定して、突然変異したコドン位置１つ当たり２４個の分離株をスクリーニングした。
[00210] １９−配糖体産生酵母におけるスクリーニングのために、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異対立遺伝子を含有する株で産生された１９−配糖体の量を、野生型Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子を含有する株によって産生された１９−配糖体の量に正規化することによって、各突然変異の作用を計算した。ＲｅｂＭ産生酵母におけるスクリーニングのために、株によって産生された全てのステビオール配糖体を抽出し、質量分析を介した測定した。全てのステビオール配糖体の合計を計算した（μＭで）；この測定値は、「ステビオール当量」と呼ばれる。Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異対立遺伝子を含有する株のステビオール当量を、野生型Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子を含有する株のステビオール当量に正規化することによって、突然変異の作用を計算した。
[00211] インビボでＳｒ．ＫＡＨ酵素の活性を増加するようにみえる階層１における突然変異を見出したら、改善を確認するために、上記と同じ計算を使用して、階層２のスクリーニングを目的の特定の突然変異体を含有する株のより多くの複製（Ｎ＝１２）を用いて実行した。野生型Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子より高い少なくとも１つの標準偏差の活性を有する、得られたそれぞれ単一のアミノ酸変化を含有するＳｒ．ＫＡＨ突然変異体は、図３および表６で、野生型親Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子に対するステビオール当量での増加倍率として報告されている。例えば、突然変異株が２倍（２×）高い活性を有する場合、それは、野生型Ｓｒ．ＫＡＨを有する株と比べて２倍の量（または１００％多く）の測定されたステビオール配糖体（ステビオール当量）を産生した。部位特異的飽和突然変異誘発ＮＤＴライブラリー（G306L）からの最良の突然変異体は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨと比較してインビボにおけるＫＡＨ活性の２．７倍の改善を提供する。
Figure 2022502068
実施例８：Ｓｒ．ＫＡＨ活性を改善するための単一の突然変異のコンビナトリアルライブラリー
[00212] 固有なＮＤＴライブラリーヒットから１２種の突然変異の２つのセットを選択して、完全要因組合せ（full factorial combination）ライブラリーを構築した。各セットは、セット１つ当たり、同じ突然変異のうち９つおよび３つの固有な突然変異を含有していた。第１のコンビナトリアルライブラリーは、突然変異Ｋ１００Ｌ、Ｑ１２０Ｎ、Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ａ４４２Ｇ、Ｇ４４７Ｖを含有し、第２のライブラリーは、突然変異Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｎ３５５Ｙ、Ａ４４２Ｇ、Ｉ４４３Ｙ、Ｇ４４７Ｖを含有していた。インビボでＳｒ．ＫＡＨの最大活性をもたらす組合せを見出すために、１２種の突然変異のなかから全ての可能な組合せを作り出すようにライブラリーを設計した。ピースが配列中でオーバーラップするように各ピースの末端にオーバーラップする相同性を有する特注で構築したｇＢｌｏｃｋ（Integrated DNA Technologies, Inc.）の混合物から遺伝子をアセンブルした；全てのピースを一緒にアセンブルすることにより全長ＫＡＨ対立遺伝子を再構成した。末端の５’および３’ピースは、機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母におけるランディングパッド配列のプロモーターおよびターミネーターに対しても相同性を有していた。ピースを酵母に形質転換し、内因性相同組換えに頼ってピースを一緒にアセンブルした。
[00213] 階層１のコンビナトリアルライブラリーＤＮＡを、ＲｅｂＭ産生酵母において、２×のカバー率でスクリーニングした。組合せライブラリースクリーニングからの上位１０種のＫＡＨ対立遺伝子をＰＣＲで増幅し、そのＤＮＡを使用して、Ｎ＝４の複製で階層２の確認として、ＲｅｂＭ産生酵母を形質転換した。最も簡単な改善されたＫＡＨコンビナトリアルバリアントは、Ｉ１６６ＲおよびＩ３３３Ｖに２つの突然変異を含有しており、野生型Ｓｒ．ＫＡＨと比較して４．３倍改善された。上位のコンビナトリアルＫＡＨ突然変異体は、総ステビオール産生を、野生型Ｓｒ．ＫＡＨに対して５倍および６．３倍改善した（図４および表７）。アミノ酸置換の最良の組合せ（ＲｅｂＭ産生酵母において野生型Ｓｒ．ＫＡＨに対して６．３倍の改善）は、突然変異Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、およびＩ３５０Ｌを含んでいた。
[00214] 改善されたＫＡＨ突然変異体は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨと比較して基質であるカウレン酸の低減を示し（図５）、ここでも活性が改善されたＳｒ．ＫＡＨ対立遺伝子は、インビボで、酵母において、より多くの基質をステビオールに変換し、それによってＲｅｂＭ産生を増加させることが実証された。図５において、カウレン酸の量は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨを含有する株におけるカウレン酸（１００％）に正規化される。改善されたＳｒ．ＫＡＨ対立遺伝子を含有する酵母におけるカウレン酸レベルの低減は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨにおけるカウレン酸レベルのパーセントとして示される。最も改善された活性を有するＳｒ．ＫＡＨ対立遺伝子は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨを有する株で観察されるカウレン酸の量の４０％であるカウレン酸レベルを有する。
Figure 2022502068
実施例９：野生型Ｓｒ．ＫＡＨのインビボの活性を改善するためのＮ末端ドメイン交換
[00215] この実施例は、改善された活性を示す、置換されたＮ末端ドメインを有する改変されたカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを提供する。
[00216] カウレン酸ヒドロキシラーゼは、シトクロムＰ４５０酵素である。ほとんどの真核生物のＰ４５０は、膜結合タンパク質であり、膜結合型シトクロムＰ４５０酵素の高レベルのドメイン構造は高度に保存されている。植物のシトクロムＰ４５０酵素は、およそ３０〜５０アミノ酸の長いＮ末端ポリペプチド鎖が膜への標的化を媒介することで小胞体（ＥＲ）に組み込まれる。Ｐ４５０酵素の触媒ドメインは、小胞体細胞質内の側に面している。ＥＲ膜に挿入されるＮ末端の領域は、およそ２０アミノ酸残基を有する疎水性ストレッチの末端で終わり、触媒ドメインの前にある。一般的に正電荷を有する残基を含有する短い領域は、触媒ドメインを、構造的に保存されたＰ４５０フォールドのＮ末端における保存されたプロリンリッチモチーフに連結させる。Ｎ末端ＥＲ標的化ドメインは、触媒ドメインと密接に会合する可能性が低く、Ｎ末端ドメインは、機能に必要ではない。しかしながら、Ｐ４５０触媒ドメインとＥＲ膜との相互作用は、タンパク質活性にとって重要である。例えば、ＥＲ膜との相互作用は、膜から触媒部位への疎水性基質の移動を促進することができ、さらにシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）との相互作用を容易にするようにタンパク質を配向させることもでき、これは活性に必要である。
[00217] いずれの作用の理論に縛られる意図はないが、本発明者らは、Ｐ４５０タンパク質のＥＲと会合しているＮ末端を他のＮ末端膜貫通ドメインと交換することは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて異種発現された植物Ｐ４５０活性における改善をもたらす可能性があることを発見した。Ｎ末端膜貫通ドメインを交換することは、ＥＲ標的化を乱したり、触媒ドメインの特異性を変化させたりしないと予想されるが、触媒ドメインのＥＲ膜との相互作用を改善するために、異種タンパク質のＥＲ局在化に役立つ可能性があり、および／またはタンパク質コンフォメーションを変更する可能性もある。この後者の作用は、ＥＲ結合基質またはＥＲ結合ＣＰＲとの改善された相互作用をもたらすことができる。
[00218] この実施例は、天然Ｎ末端膜貫通ドメインが、これらに限定されないが、他のシトクロムＰ４５０酵素およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（CPR）などの他のＥＲ結合タンパク質のＮ末端膜貫通ドメインと交換された植物Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（Sr.KAH）由来の野生型カウレン酸ヒドロキシラーゼに関する活性データを提供する。
[00219] キメラタンパク質を生成するために、（１）プロリンリッチ領域、（２）ＴＭＨＭＭサーバー（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/で利用可能）から予測された膜貫通ドメイン部位、（３）およそＮ末端のアミノ酸数３０〜５０の周辺に埋め込まれた、正電荷を有する残基などの様々な位置で、または（４）配列アライメントに基づいて、野生型Ｓｒ．ＫＡＨおよび候補ＥＲ結合タンパク質を短縮化した。次いで候補タンパク質からのＮ末端領域を、触媒ドメインを含有する短縮化したＳｒ．ＫＡＨタンパク質に付加した。
[00220] 活性に関してスクリーニングするために、キメラタンパク質の遺伝子を使用して、上述した機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母を形質転換した；野生型Ｓｒ．ＫＡＨ（配列番号１、これは、ＥＰ３００９５０８における配列同定番号１６４に対応する）を、対照として使用した。
[00221] ２つの別々の方法を使用して、ＫＡＨ Ｐ４５０機能を計算した。第１の方法は、キメラタンパク質を含む細胞で生成した総ＲｅｂＭの野生型Ｓｒ．ＫＡＨを含む細胞で生成した総ＲｅｂＭに対する比率をとることであった。Ｐ４５０機能を計算するための第２の方法は、キメラタンパク質を含む細胞で生成した全てのステビオール配糖体をμＭの単位で合計したものを、野生型Ｓｒ．ＫＡＨを含む細胞で生成したμＭの単位での総ステビオール配糖体で割ることであった。この後者の「ステビオール当量」の測定は、細胞で生成した全てのステビオールを計算するため、一部の中間体が残っており、最後までＲｅｂＭに全て変換されなかったとしても、より正確である。
[00222] 各キメラを、その総ステビオール当量の野生型Ｓｒ．ＫＡＨに対する比率によってランク付けした。植物ＣＰＲ ＡＴＲ２および植物Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレンオキシダーゼ（Ｓｒ．ＫＯ）由来のＮ末端ドメインは、野生型Ｓｒ．ＫＡＨと比べて等しいかまたは改善された活性を示した（表８）。
Figure 2022502068
実施例１０：Ｓｒ．ＫＡＨの最良の進化したバリアント、突然変異体＃１０のインビボにおける活性を改善するためのＮ末端ドメイン交換
[00223] 実施例８におけるほとんどの改善されたコンビナトリアルＳｒ．ＫＡＨバリアントに見出されるアミノ酸突然変異である突然変異体＃１０を、総ステビオール当量を増加させた実施例９、表８における３つのＮ末端ドメイン交換と組み合わせた。野生型Ｓｒ．ＫＡＨのＤＮＡ配列を使用する代わりに、実施例８からの突然変異体＃１０のＤＮＡ配列を使用したこと以外は、正確に実施例９に記載された通りにキメラを生成した。Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０における全ての突然変異は、得られたＮ末端ドメインを交換したキメラで保持された。新しいキメラ遺伝子は、進化したアミノ酸突然変異を含有しており、これをＲｅｂＭ産生酵母に形質転換した。進化したＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０を、実験対照として使用した。Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０の活性に対するＮ末端ドメイン交換の作用を、正確に実施例９に記載された通りに計算した。２つの遺伝子、すなわちＡｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ由来のＣＰＲ（Ａａ．ＣＰＲ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＣＰＲ（ＡＴＲ２）由来のＮ末端配列を、Ｎ末端が短縮化されたＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０に融合させることにより、ＫＡＨ酵素活性の６０％もの改善がもたらされた（表９）。
Figure 2022502068
実施例１１：Ｓｒ．ＫＡＨ、突然変異体＃３の進化したバリアントのインビボにおける活性を改善するためのＮ末端ドメイン交換
[00224] 実施例９および１０で同定された有益なＮ末端ドメイン交換を他のＳｒ．ＫＡＨバリアントの活性を改善するのに利用できるかどうかを試験するために、別の改善されたバリアント、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３（実施例８）からの有益なアミノ酸突然変異を、実施例１０で同定された２つの最良のＮ末端ドメイン交換と組み合わせた。得られたキメラ遺伝子を使用して、機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母を形質転換し、ＲｅｂＭおよび総ステビオール配糖体のタイターを分析した（表１０）。２つの遺伝子、すなわちＡｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ由来のＣＰＲ（Ａａ．ＣＰＲ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＣＰＲ（ＡＴＲ２）由来のＮ末端配列を、２２アミノ酸のＮ末端が短縮化されたＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３に融合させることにより、この株においてバックグラウンドからおよそ２５％の改善がみられた。
Figure 2022502068
実施例１２：Ｓｒ．ＫＡＨ、突然変異体＃１０の進化したバリアントのインビボにおける活性を改善するための、天然酵母ＥＲタンパク質とのＮ末端ドメイン交換
[00225] 実施例１０および１１におけるＡａ．ＣＰＲおよびＡＴＲ２由来の２つの有益な膜貫通ドメインが共通する形態の特徴の１つは、第１の膜貫通へリックスの前の小胞体（ＥＲ）内腔の内部であると予測されるおよそ５０アミノ酸の長さの配列である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、それらのＮ末端に単一へリックスの膜貫通ドメインを有する、メンブレノーム（Membranome）データベース（membranome.org/で利用可能）で文書化された１５種のタンパク質がある。ＴＭＨＭＭサーバー（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/で利用可能）を使用してこれらの１５種のタンパク質配列をスキャンすることにより、Ａａ．ＣＰＲおよびＡＴＲ２由来の膜貫通ドメインに共通するパターンに似た数々のこのようなＮ末端配列が明らかになった。これらとしては、ＥＲＧ１１（１ａ：８０ａ）、ＥＲＧ１１（１ａ：５１ａ）、ＡＬＧ１１（１ａ：４５ａ）、ＳＥＣ６６（１ａ：５０ａ）、ＮＵＳ１（１ａ：１１９ａ）、ＲＣＲ１（１ａ：６２ａ）、およびＵＢＰ１（１ａ：５２ａ）が挙げられる。
[00226] これらのＮ末端の天然酵母配列の、Ｎ末端が短縮化されたＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０への融合体を作り出した。キメラ遺伝子配列を、機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母に挿入し、ＲｅｂＭおよび総ステビオール配糖体のタイターを、実施例８に記載されたように分析した。
[00227] 試験された７つのキメラ遺伝子のなかでも、ＳＥＣ６６（１ａ：５０ａ）およびＵＢＰ１（１ａ：５２ａ）を含有する２つのキメラは、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃１０と比較しておよそ２０％改善された。３つのＮ末端配列、ＥＲＧ１１（１ａ：８０ａ）、ＮＵＳ１（１ａ：１１９ａ）、およびＲＣＲ１（１ａ：６２ａ）は明らかにＫＡＨの機能を破壊したが、それに対して２つのＮ末端配列、ＡＬＧ１１（１ａ：４５ａ）およびＥＲＧ１１（１ａ：５１ａ）は、活性に対して著しい作用を有していなかった（表１１）。
Figure 2022502068
[00228] 重要なことに、実施例９、１０、１１、および１２の結果は、シトクロムＰ４５０酵素のＮ末端のＥＲ会合タンパク質ドメインを交換することが、異種宿主中でＰ４５０酵素が発現されると、シトクロムＰ４５０の酵素活性を改善することを実証する。
実施例１３：部位特異的飽和突然変異誘発を介したＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３のさらなる改善
[00229] Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３（実施例８）の活性をさらに改善するために、部位特異的飽和突然変異誘発の別のラウンドを適用し、カウレン酸のステビオールへの変換においてより一層高い活性を有する突然変異バリアント（図１）を単離した。Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３配列における１７５個の選択された位置（Ｅ２、Ａ３、Ｓ４、Ｙ５、Ｌ６、Ｙ７、Ｉ８、Ｉ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ａ１５、Ｓ１６、Ｙ１７、Ｌ１８、Ｆ１９、Ｔ２０、Ｔ２１、Ｑ２２、Ｌ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｋ２６、Ｓ２７、Ａ２８、Ｎ２９、Ｌ３０、Ｆ３５、Ｓ３７、Ｉ３８、Ｉ４０、Ｉ４１、Ｈ４３、Ｌ４６、Ｌ４７、Ｋ４９、Ｙ５２、Ｔ５４、Ｋ５７、Ｉ５８、Ａ６０、Ｙ６２、Ｌ６６、Ｑ６７、Ｌ６８、Ｌ７０、Ｇ７１、Ｙ７２、Ｒ７４、Ｌ７６、Ｓ８０、Ｐ８１、Ｓ８２、Ｅ８５、Ｃ８７、Ｔ８９、Ｎ９１、Ｖ９３、Ｉ９４、Ｆ９５、Ｎ９７、Ｋ１００、Ｌ１０２、Ｋ１０５、Ｉ１０６、Ｖ１０７、Ｔ１１０、Ｓ１１４、Ｓ１１６、Ｄ１１９、Ｑ１２０、Ｎ１２３、Ｖ１２７、Ｓ１２９、Ｉ１３０、Ｉ１３２、Ｖ１３５、Ｈ１３６、Ｎ１３９、Ｄ１４３、Ｒ１４５、Ｎ１４９、Ｒ１５０、Ｌ１５１、Ｌ１５３、Ｒ１５７、Ｄ１５８、Ｓ１６０、Ｓ１６１、Ｔ１６４、Ｌ１６５、Ｒ１６６、Ｔ１６７、Ｖ１６８、Ｌ１７２、Ｌ１７４、Ｉ１７７、Ｓ１８２、Ｄ１９１、Ｒ１９２、Ｓ２１５、Ｇ２１８、Ｉ２２３、Ｌ２２７、Ｖ２２９、Ｋ２３０、Ｄ２３２、Ｋ２３５、Ｉ２３７、Ｇ２４９、Ｒ２５８、Ｇ２５９、Ａ２６０、Ｋ２６１、Ｖ２６２、Ｇ２６３、Ｋ２６４、Ｇ２６５、Ｒ２６６、Ｇ２９５、Ｇ３０６、Ｍ３０８、Ｖ３１６、Ｖ３３３、Ｎ３３６、Ｉ３３９、Ｉ３４４、Ｇ３４５、Ｌ３５０、Ｇ３５１、Ｎ３５５、Ｓ３７３、Ａ３７４、Ｓ３７９、Ｎ３８２、Ｉ３８３、Ｇ３８６、Ｌ３８９、Ｖ３９１、Ｈ３９７、Ｔ４０８、Ｑ４１５、Ｇ４１６、Ｌ４１７、Ｇ４１９、Ｔ４２０、Ｒ４２１、Ｄ４２２、Ｇ４２３、Ｆ４２４、Ｋ４２５、Ｌ４２６、Ｍ４２７、Ｓ４３１、Ｇ４３２、Ｒ４３３、Ｇ４４０、Ａ４４２、Ｉ４４３、Ｌ４４５、Ｇ４４７、Ｍ４４８、Ｖ４５３、Ｖ４６２、Ｌ４７３、Ｖ４８４、Ｐ４８９、Ｓ４９１、Ｅ４９２、Ｔ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９６、Ｌ４９７、およびＳ４９８）のそれぞれを、縮重コドンＮＮＴ（式中、Ｎは、任意のヌクレオチド、すなわちアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンを意味し、Ｔは、チミンを意味する）によってコードされる１５種の異なるアミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ（これは２つのコドンによってコードされる）、Ｔ、Ｖ、およびＹ）に突然変異させた。Ｓｒ．ＫＡＨ遺伝子バリアントのＮＮＴライブラリーを、実施例７に記載されたように望ましい位置にＮＮＴ縮重コドンを含有するプライマーを使用したＰＣＲを介して構築し、これを使用して、ＫＡＨの発現のためのランディングパッドでの組込みのために機能的なＫＡＨ遺伝子を含んでいないＲｅｂＭ産生酵母を形質転換した。
[00230] ＮＮＴライブラリー突然変異体のインビボにおけるＫＡＨ活性を、実施例７に記載されたように総ステビオール配糖体（μＭ）のタイターを使用して、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３対立遺伝子に対する階層１のスクリーニングで測定した。３９個の分離株を、各固有なバリアントにつきＮ＝１でおよそ２．５倍のカバー率と仮定して、タンパク質配列中の突然変異した位置ごとにスクリーニングした。インビボにおいて酵素の活性を増加させるようにみえるＳｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３における突然変異が見出されたら、改善を確認するために、実施例７に記載されたのと同じ計算を使用して、階層２のスクリーニングを目的の特定の突然変異体を含有する株のより多くの複製（Ｎ＝１０）を用いて実行した。図６および表１２において、得られたＮＮＴ由来の突然変異体Ｓｒ．ＫＡＨ対立遺伝子の活性は、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３に対する増加倍率で報告される。
Figure 2022502068
[00231] Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３に対して１７％から４倍の範囲の活性の改善をもたらす２０種の突然変異を同定した。この部位特異的飽和突然変異誘発ＮＮＴライブラリーからの最良の突然変異体（Ｌ１３Ｖ）は、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３（これはすでに、野生型Ｓｒ．ＫＡＨ、実施例８に対して５倍改善されている）と比較して、インビボにおけるＫＡＨ活性の４．３倍の改善を提供する。興味深いことに、この保存的突然変異（ロイシンおよびバリンの両方が、小さい疎水性側鎖を有する）は、タンパク質のＮ末端にあり、この場合、ドメイン交換を介した変更は、タンパク質活性に対して有意な作用を有していた（実施例９〜１２）。また別の有益な突然変異、Ｎ２９Ｇも、Ｓｒ．ＫＡＨのＮ末端ドメインに属する。また興味深いことに、野生型Ｓｒ．ＫＡＨの活性を改善する突然変異（実施例７）の組成が、Ｓｒ．ＫＡＨ突然変異体＃３の活性を改善するもの（この実施例）と非常に異なっている。突然変異体＃３は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨとは６つのアミノ酸によって異なっており、Ｇ３０６Ｌは、両方の酵素バリアント：野生型の上位のヒットおよびＳｒ．ＫＡＨの突然変異体＃３の９番目に良好なものにとって有益な唯一の突然変異である。
[00232] 本明細書で引用された全ての公報、特許および特許出願は、それぞれ個々の公報または特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられることが示されたかのように、参照により本明細書に組み入れられる。特許請求の範囲は、理解しやすくするために例証および例示としていくらか詳細に説明されているが、それらに添付の特許請求の範囲の本質または範囲から逸脱することなくある特定の変更および改変がなされ得ることが、この開示の教示に照らして当業者にとって容易に明らかであろう。

Claims (54)

  1. 配列番号１に従う残基番号で、以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、およびＭ３０８Ｌのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個を含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  2. 以下の突然変異：Ｉ１６６ＲおよびＩ３３３Ｖを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  3. 以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、１３５０Ｌ、およびＧ４４７Ｖを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  4. 以下の突然変異：Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、およびＩ３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  5. 以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、および１３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  6. 以下の突然変異：Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、１３５０Ｌ、およびＧ４４７Ｖを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  7. 以下の突然変異：Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、およびＩ３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  8. 以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、およびＩ３３３Ｖを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  9. 以下の突然変異：Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｉ３３３Ｖ、および１３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  10. 以下の突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、および１３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  11. 以下の突然変異：Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、および１３５０Ｌを含む、請求項１に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  12. 異種アミノ末端ドメインをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  13. 配列番号１に従う残基番号で、以下の突然変異：Ｙ６２Ｈ、Ｔ１６４Ｒ、Ｌ７６Ｖ、Ｑ４１５Ｌ、Ａ６０Ｙ、Ｓ１８２Ｃ、Ｔ１６７Ｎ、Ｙ５２Ｈ、Ｒ２６６Ｄ、Ｔ１６７Ｈ、Ｉ１５３Ｌ、Ｋ１００Ｌ、Ｇ３０６Ｃ、Ｑ１２０Ｎ、Ｌ２３２Ｈ、Ｉ３３３Ｖ、Ｇ３５１Ｒ、Ｌ２３２Ｓ、Ｉ１６６Ｓ、Ｗ４４７Ｃ、Ｉ４４３Ｙ、Ｉ１６６Ｎ、Ｎ３５５Ｙ、Ｌ２３２Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ａ４４２Ｇ、Ｇ３０６Ｎ、Ｖ３１６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｇ４４７Ｆ、Ｇ３０６Ｉ、Ｇ３０６Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｉ１６６Ｒ、およびＧ３０６Ｌの少なくとも１つを含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  14. （ｉ）Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、および
    （ｉｉ）小胞体（ＥＲ）結合タンパク質のＮ末端膜貫通ドメイン
    を含むキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドであって、前記Ｎ末端膜貫通ドメインは、前記触媒ドメインに共有結合で連結されている、キメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  15. 以下のカウレン酸ヒドロラーゼ突然変異：Ｉ１６６Ｒ、Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ３０６Ｌ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｖ３１６Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、およびＭ３０８Ｌの少なくとも１つをさらに含み、残基番号は、配列番号１に従う、請求項１４に記載のキメラカウレン酸ヒドロラーゼポリペプチド。
  16. Ｙ６２Ｈ、Ｔ１６４Ｒ、Ｌ７６Ｖ、Ｑ４１５Ｌ、Ａ６０Ｙ、Ｓ１８２Ｃ、Ｔ１６７Ｎ、Ｙ５２Ｈ、Ｒ２６６Ｄ、Ｔ１６７Ｈ、Ｉ１５３Ｌ、Ｋ１００Ｌ、Ｇ３０６Ｃ、Ｑ１２０Ｎ、Ｌ２３２Ｈ、Ｉ３３３Ｖ、Ｇ３５１Ｒ、Ｌ２３２Ｓ、Ｉ１６６Ｓ、Ｗ４４７Ｃ、Ｉ４４３Ｙ、Ｉ１６６Ｎ、Ｎ３５５Ｙ、Ｌ２３２Ｄ、Ｓ１５８Ｄ、Ａ４４２Ｇ、Ｇ３０６Ｎ、Ｖ３１６Ｌ、Ｍ３０８Ｌ、Ｇ４４７Ｆ、Ｇ３０６Ｉ、Ｇ３０６Ｖ、Ｉ３５０Ｌ、Ｇ４４７Ｖ、Ｉ１６６Ｒ、およびＧ３０６Ｌから選択されるカウレン酸ヒドロラーゼ突然変異の少なくとも１つをさらに含み、残基番号は、配列番号１に従う、請求項１４または１５に記載のキメラカウレン酸ヒドロラーゼポリペプチド。
  17. （ｉ）Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、および
    （ｉｉ）ＡＴＲ２のＮ末端膜貫通ドメイン
    を含み、前記Ｎ末端膜貫通ドメインは、前記触媒ドメインに共有結合で連結されている、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  18. （ｉ）Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸２３〜５００を含む、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼの触媒ドメイン、および
    （ｉｉ）ＡＴＲ２のアミノ酸１〜７２を含む、ＡＴＲ２のＮ末端膜貫通ドメイン
    を含み、
    前記Ｎ末端膜貫通ドメインは、前記触媒ドメインに共有結合で連結されている、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  19. 前記触媒ドメインが、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸５〜５００を含む、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  20. 前記触媒ドメインが、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸２３〜５００を含む、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  21. 前記触媒ドメインが、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａのカウレン酸ヒドロキシラーゼのアミノ酸４７〜５００を含む、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  22. 前記Ｎ末端ドメインが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＲ２タンパク質のアミノ酸１〜７２を含む、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  23. 前記Ｎ末端ドメインが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのＡＴＲ２タンパク質のアミノ酸１〜５０を含む、請求項１７に記載のキメラカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  24. Ｅ４９２Ｃ、Ｍ４２７Ａ、Ｇ３０６Ｄ、Ｖ３３３Ｃ、Ｄ１９１Ｌ、Ｉ４０Ｓ、Ｌ４４５Ｉ、Ｓ１１４Ａ、Ｄ１９１Ｙ、Ｄ１９１Ｆ、Ｌ４９７Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｎ２９Ｇ、Ｔ１６７Ｇ、Ｔ１６４Ｓ、Ｑ４１５Ｈ、Ｔ８９Ａ、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｔ、およびＬ１３Ｖのうちの少なくとも１つのカウレン酸ヒドロキシラーゼの位置における突然変異をさらに含み、残基番号は、配列番号１に従う、請求項２から１１のいずれか一項に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  25. 以下の突然変異Ｉ１５３Ｌ、Ｓ１５８Ｄ、Ｉ１６６Ｒ、Ｌ２３２Ｄ、Ｉ３３３Ｖ、およびＩ３５０Ｌを含む、配列番号１のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  26. Ｅ４９２Ｃ、Ｍ４２７Ａ、Ｇ３０６Ｄ、Ｖ３３３Ｃ、Ｄ１９１Ｌ、Ｉ４０Ｓ、Ｌ４４５Ｉ、Ｓ１１４Ａ、Ｄ１９１Ｙ、Ｄ１９１Ｆ、Ｌ４９７Ｒ、Ｇ３０６Ｌ、Ｎ２９Ｇ、Ｔ１６７Ｇ、Ｔ１６４Ｓ、Ｑ４１５Ｈ、Ｔ８９Ａ、Ｌ１３Ｄ、Ｒ２５８Ｔ、およびＬ１３Ｖから選択される１つまたは複数の突然変異をさらに含む、請求項２５に記載のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  27. 突然変異Ｌ１３Ｄをさらに含む、請求項２６に記載のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  28. 突然変異Ｒ２５８Ｆをさらに含む、請求項２６に記載のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  29. 突然変異Ｌ１３Ｖをさらに含む、請求項２６に記載のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。
  30. 前記請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  31. 請求項１から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項３０に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  32. ステビオールを産生することが可能である、請求項３１に記載の宿主細胞。
  33. １つまたは複数のステビオール配糖体を産生することが可能である、請求項３２に記載の宿主細胞。
  34. ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭを産生することが可能である、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  35. ＲｅｂＭを産生することが可能である、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  36. ステビオールを生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  37. ステビオール配糖体を生成するための経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の核酸をさらに含む、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  38. ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする核酸を含む、請求項３１から３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  39. コパリル二リン酸シンターゼをコードする核酸を含む、請求項３１から３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  40. ｅｎｔ−カウレンシンターゼをコードする核酸を含む、請求項３１から３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  41. カウレンオキシダーゼをコードする核酸を含む、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  42. シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含む、請求項３１から４１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  43. １つまたは複数のウリジン５’−二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする１つまたは複数の核酸を含む、請求項３１から４２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  44. ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴＡＤ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ９１Ｄをコードする１つまたは複数の核酸を含む、請求項３１から４３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  45. １つまたは複数の核酸が、異種である、請求項３１から４４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  46. 経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の核酸が、単一の転写調節因子の制御下である、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  47. 経路の１つまたは複数の酵素をコードする１つまたは複数の核酸が、複数の転写調節因子の制御下である、請求項３１から４６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  48. 細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、請求項３１から４７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  49. 酵母細胞である、請求項３１から４８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  50. 酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４９に記載の宿主細胞。
  51. ステビオールまたは１つまたは複数のステビオール配糖体を産生するための方法であって、
    （ａ）請求項３１から５０のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を、ステビオールまたは１つまたは複数のステビオール配糖体を生成するのに好適な条件下で、炭素源を含む培地中で培養して、培養液体培地を得る工程；および
    （ｂ）前記培養液体培地から、前記ステビオールまたは１つまたは複数のステビオール配糖体を回収する工程
    を含む方法。
  52. ＲｅｂＤを産生するための方法であって、
    （ａ）請求項３１から５０のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を、ＲｅｂＤを生成するのに好適な条件下で、炭素源を含む培地中で培養して、培養液体培地を得る工程；および
    （ｂ）前記培養液体培地から、前記ＲｅｂＤ化合物を回収する工程
    を含む方法。
  53. ＲｅｂＭを産生するための方法であって、
    （ａ）請求項３１から５０のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を、ＲｅｂＭを生成するのに好適な条件下で、炭素源を含む培地中で培養して、培養液体培地を得る工程；および
    （ｂ）前記培養液体培地から、前記ＲｅｂＭ化合物を回収する工程
    を含む方法。
  54. （ａ）ｉ．カウレン酸をステビオールに変換することが可能な、請求項１から２９のいずれか一項に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞；および
    （ｂ）前記宿主細胞から産生されたステビオール配糖体
    を含む発酵組成物。
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