RU2777901C2 - Udp-зависимая гликозилтрансфераза для высокоэффективного продуцирования ребаудиозидов - Google Patents
Udp-зависимая гликозилтрансфераза для высокоэффективного продуцирования ребаудиозидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777901C2 RU2777901C2 RU2019104496A RU2019104496A RU2777901C2 RU 2777901 C2 RU2777901 C2 RU 2777901C2 RU 2019104496 A RU2019104496 A RU 2019104496A RU 2019104496 A RU2019104496 A RU 2019104496A RU 2777901 C2 RU2777901 C2 RU 2777901C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- host cell
- genetically modified
- udp
- Prior art date
Links
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000001419 dependent Effects 0.000 title description 5
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 title 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 411
- RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N Rebaudioside D Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RPYRMTHVSUWHSV-CUZJHZIBSA-N 0.000 claims abstract description 376
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 142
- 235000019202 steviosides Nutrition 0.000 claims abstract description 141
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 137
- 239000004383 Steviol glycoside Substances 0.000 claims abstract description 116
- 235000019411 steviol glycoside Nutrition 0.000 claims abstract description 112
- 150000008144 steviol glycosides Chemical class 0.000 claims abstract description 110
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 250
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 250
- 239000001512 FEMA 4601 Substances 0.000 claims description 182
- HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N Rebaudioside A Natural products O=C(O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HELXLJCILKEWJH-SEAGSNCFSA-N 0.000 claims description 182
- 235000019203 rebaudioside A Nutrition 0.000 claims description 182
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N Stevioside A3 Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 claims description 180
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 128
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 123
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 114
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 102
- QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N Steviol Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N 0.000 claims description 72
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 71
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 63
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 54
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 54
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 54
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 38
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 claims description 36
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 30
- UEDUENGHJMELGK-VESORUSYSA-N Stevioside Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 UEDUENGHJMELGK-VESORUSYSA-N 0.000 claims description 29
- 229940013618 stevioside Drugs 0.000 claims description 29
- UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N Stevioside Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UEDUENGHJMELGK-HYDKPPNVSA-N 0.000 claims description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 26
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 claims description 24
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 claims description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 101710015783 UGT76G1 Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 17
- 101710012101 UGT74G1 Proteins 0.000 claims description 16
- -1 RebD compound Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 101710011320 UGT85C2 Proteins 0.000 claims description 13
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 13
- 108010064741 ent-kaurene synthetase A Proteins 0.000 claims description 12
- ONVABDHFQKWOSV-HPUSYDDDSA-N (5β,8α,9β,10α,13α)-kaur-16-ene Chemical compound C1C[C@H](C2)C(=C)C[C@@]32CC[C@@H]2C(C)(C)CCC[C@@]2(C)[C@@H]31 ONVABDHFQKWOSV-HPUSYDDDSA-N 0.000 claims description 11
- 108010045510 NADPH-Ferrihemoprotein Reductase Proteins 0.000 claims description 10
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- RLLCWNUIHGPAJY-RYBZXKSASA-N Rebaudioside E Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)[C@]1(C)[C@@H]2[C@@](C)([C@@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@@H]5[C@@H](O[C@@H]6[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 RLLCWNUIHGPAJY-RYBZXKSASA-N 0.000 claims description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 claims description 6
- 108030004885 EC 4.2.3.19 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010007508 Farnesyltranstransferase Proteins 0.000 claims description 5
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 108010067758 ent-kaurene oxidase Proteins 0.000 claims description 5
- NIKHGUQULKYIGE-OTCXFQBHSA-N Kaurenoic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@]2(CC1=C)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 NIKHGUQULKYIGE-OTCXFQBHSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UCVXFZOQSA-N Uridine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UCVXFZOQSA-N 0.000 claims description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 3
- 229940045145 Uridine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims description 3
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal Effects 0.000 claims description 2
- NIKHGUQULKYIGE-YOSWYUEISA-N kaurenoicacid Chemical compound C([C@@H]1C[C@]2(CC1=C)CC1)CC2[C@@]2(C)C1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 NIKHGUQULKYIGE-YOSWYUEISA-N 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 102000007317 Farnesyltranstransferase Human genes 0.000 claims 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 51
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 376
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 95
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 92
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 67
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 63
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 58
- 239000000386 donor Substances 0.000 description 46
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 44
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 44
- 239000002609 media Substances 0.000 description 43
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 39
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N Acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 30
- ZSLZBFCDCINBPY-ZZSFXRQLSA-N Acetyl-CoA Natural products S(C(=O)C)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(CO[P@@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C ZSLZBFCDCINBPY-ZZSFXRQLSA-N 0.000 description 29
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 26
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 108091022077 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 23
- 102000019483 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N Acetoacetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OJFDKHTZOUZBOS-CITAKDKDSA-N 0.000 description 21
- OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N Geranylgeranyl diphosphate Natural products [P@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\CC/C=C(\C)/C)/C)/C)/C)O OINNEUNVOZHBOX-XBQSVVNOSA-N 0.000 description 20
- QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N Glucosilsteviol Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QSIDJGUAAUSPMG-CULFPKEHSA-N 0.000 description 20
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M (R)-mevalonate Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC([O-])=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M 0.000 description 19
- 108030002854 EC 2.3.1.194 Proteins 0.000 description 18
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 18
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 240000001132 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 17
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 16
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N Rubusoside Chemical compound O([C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YWPVROCHNBYFTP-OSHKXICASA-N 0.000 description 14
- VWFJDQUYCIWHTN-YFVJMOTDSA-N 2-trans,6-trans-farnesyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O VWFJDQUYCIWHTN-YFVJMOTDSA-N 0.000 description 13
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 description 13
- 230000001851 biosynthetic Effects 0.000 description 13
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 13
- 229930000007 farnesylpyrophosphate Natural products 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 12
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N Dimethylallyl pyrophosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 11
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N Steviolbioside Natural products O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OMHUCGDTACNQEX-OSHKXICASA-N 0.000 description 10
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 10
- CABVTRNMFUVUDM-SJBCKIPMSA-N 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-SJBCKIPMSA-N 0.000 description 9
- 102100017545 GGPS1 Human genes 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 8
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 241001453299 Pseudomonas mevalonii Species 0.000 description 8
- 102000002932 Thiolase family Human genes 0.000 description 8
- 108060008225 Thiolase family Proteins 0.000 description 8
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 8
- OKZYCXHTTZZYSK-ZCFIWIBFSA-N (R)-5-phosphomevalonic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@](O)(C)CCOP(O)(O)=O OKZYCXHTTZZYSK-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 7
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 7
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 7
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 7
- 108091022188 Adenosine deaminases Proteins 0.000 description 6
- 102000009914 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 241000221778 Fusarium fujikuroi Species 0.000 description 6
- 108010066605 Geranylgeranyl-Diphosphate Geranylgeranyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 6
- 229930009668 farnesenes Natural products 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- JSNRRGGBADWTMC-UHFFFAOYSA-N (6E)-7,11-dimethyl-3-methylene-1,6,10-dodecatriene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(=C)C=C JSNRRGGBADWTMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102100005410 LINE-1 retrotransposable element ORF2 protein Human genes 0.000 description 5
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M Lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 229940071257 Lithium acetate Drugs 0.000 description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 108091022052 Phosphate Acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 241000030574 Ruegeria pomeroyi Species 0.000 description 5
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 5
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 125000001185 polyprenyl group Polymers 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-M 3-[[(2R)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-M 0.000 description 4
- 102100000059 AASDH Human genes 0.000 description 4
- 101710024911 AASDH Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 101700068367 LYS2 Proteins 0.000 description 4
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 101710017470 NT5C3B Proteins 0.000 description 4
- 101710042137 PRSS1 Proteins 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 101710027506 Rv0998 Proteins 0.000 description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 4
- 101700000513 TYRP1 Proteins 0.000 description 4
- 101710042194 Trpgamma Proteins 0.000 description 4
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 4
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 4
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 4
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 4
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 4
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 4
- 229920001550 polyprenyl Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 101710035147 ura3 Proteins 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 4
- 240000000310 Abies grandis Species 0.000 description 3
- 235000017894 Abies grandis Nutrition 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 102000012994 Diphosphomevalonate decarboxylases Human genes 0.000 description 3
- 108060002261 Diphosphomevalonate decarboxylases Proteins 0.000 description 3
- 102000002284 EC 2.3.3.10 Human genes 0.000 description 3
- 108010000775 EC 2.3.3.10 Proteins 0.000 description 3
- 102100012694 GAL Human genes 0.000 description 3
- 101700002119 GAL Proteins 0.000 description 3
- 101700014301 GALK1 Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 3
- 241001479543 Mentha x piperita Species 0.000 description 3
- 108091022079 Mevalonate kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000002678 Mevalonate kinases Human genes 0.000 description 3
- 210000000214 Mouth Anatomy 0.000 description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108020005203 Oxidases Proteins 0.000 description 3
- 241000235003 Saccharomycopsis Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000000511 arginine group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 3
- 101700021616 catA1 Proteins 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 3
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 235000006678 peppermint Nutrition 0.000 description 3
- 235000007735 peppermint Nutrition 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000019527 sweetened beverage Nutrition 0.000 description 3
- 238000007079 thiolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- FVIYEKRCCSJZFZ-UHFFFAOYSA-M (1-$l^{1}-oxidanyl-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)-trimethylazanium;iodide Chemical compound [I-].CC1(C)CC([N+](C)(C)C)CC(C)(C)N1[O] FVIYEKRCCSJZFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-Fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JCAIWDXKLCEQEO-ATPOGHATSA-N 5α,9α,10β-labda-8(20),13-dien-15-yl diphosphate Chemical compound CC1(C)CCC[C@]2(C)[C@@H](CCC(/C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(=C)CC[C@H]21 JCAIWDXKLCEQEO-ATPOGHATSA-N 0.000 description 2
- 101710024516 ABCG32 Proteins 0.000 description 2
- 101710024522 ABCG37 Proteins 0.000 description 2
- 101710024464 ABCG40 Proteins 0.000 description 2
- 102100014487 ALG1 Human genes 0.000 description 2
- 101700078158 ALG1 Proteins 0.000 description 2
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 241000205042 Archaeoglobus fulgidus Species 0.000 description 2
- 235000001405 Artemisia annua Nutrition 0.000 description 2
- 240000000011 Artemisia annua Species 0.000 description 2
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 2
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 2
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 2
- 241000722885 Brettanomyces Species 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- 102100009150 CLC Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 2
- JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N Copalyl diphosphate Natural products [P@@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC[C@H]1C(=C)CC[C@H]2C(C)(C)CCC[C@@]12C)/C)O JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241001527609 Cryptococcus Species 0.000 description 2
- 101710007887 DHFR Proteins 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Chemical compound CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108030001631 EC 2.5.1.29 Proteins 0.000 description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 2
- 241001465321 Eremothecium Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101700058973 GAL4 Proteins 0.000 description 2
- 101700040475 GIT1 Proteins 0.000 description 2
- 102100012611 GIT1 Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 2
- 240000008528 Hevea brasiliensis Species 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102100011539 LGALS4 Human genes 0.000 description 2
- 101710015850 LGALS4 Proteins 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 241001149698 Lipomyces Species 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M Lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000000894 Lupinus albus Species 0.000 description 2
- 235000010649 Lupinus albus Nutrition 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101700057002 NAPA Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229940116542 OTHER NUTRIENTS in ATC Drugs 0.000 description 2
- 102100003792 PMVK Human genes 0.000 description 2
- 241001495453 Parthenium argentatum Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108091000117 Phosphomevalonate kinases Proteins 0.000 description 2
- 241000235645 Pichia kudriavzevii Species 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N Rebaudioside C Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@]1(CC[C@H]2[C@@]3(C)[C@@H]([C@](CCC3)(C)C(=O)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC3)C(=C)C[C@]23C1 QSRAJVGDWKFOGU-WBXIDTKBSA-N 0.000 description 2
- 241000191025 Rhodobacter Species 0.000 description 2
- 241000191023 Rhodobacter capsulatus Species 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 108060007761 SLC6A2 Proteins 0.000 description 2
- 102100000046 SLC6A2 Human genes 0.000 description 2
- 101710012186 SLC7A1 Proteins 0.000 description 2
- 101700009353 SMR1 Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 206010039447 Salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 2
- 229940076156 Streptococcus pyogenes Drugs 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000223230 Trichosporon Species 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K Tripotassium phosphate Chemical class [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-L UDP-α-D-glucose(2-) Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-L 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 241000311098 Yamadazyma Species 0.000 description 2
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 101700041767 ctxA Proteins 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 101700051660 gal10 Proteins 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 2
- 239000000348 glycosyl donor Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical group 0.000 description 2
- 101710004442 ilv1 Proteins 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QYDYPVFESGNLHU-KHPPLWFESA-N methyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC QYDYPVFESGNLHU-KHPPLWFESA-N 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101700057694 mvaA Proteins 0.000 description 2
- 239000002667 nucleating agent Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 101710041071 pgal-1 Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 2
- 101700039886 ptr-4 Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N α-Aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2S)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2S)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2S,3S)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 description 1
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- FPQMGQZTBWIHDN-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroanthranilic acid Chemical compound NC1=CC=C(F)C=C1C(O)=O FPQMGQZTBWIHDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100228 Acetyl Coenzyme A Drugs 0.000 description 1
- 241000159572 Aciculoconidium Species 0.000 description 1
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 description 1
- 102000019632 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108091022082 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000567147 Aeropyrum Species 0.000 description 1
- 241000567139 Aeropyrum pernix Species 0.000 description 1
- 101710026905 AgnL7 Proteins 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241001147780 Alicyclobacillus Species 0.000 description 1
- 241001508809 Ambrosiozyma Species 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 1
- BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N Artemisinin Chemical compound C([C@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2OC(=O)[C@@H]4C BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N 0.000 description 1
- 241001638540 Arthroascus Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241001508785 Arxiozyma Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001446312 Austwickia chelonae Species 0.000 description 1
- 101710004980 BQ2027_MB3431C Proteins 0.000 description 1
- 229940075612 Bacillus cereus Drugs 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 229940097012 Bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000235114 Bensingtonia Species 0.000 description 1
- 241000235553 Blakeslea trispora Species 0.000 description 1
- 241000680806 Blastobotrys adeninivorans Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 229960001561 Bleomycin Drugs 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000178289 Botryozyma Species 0.000 description 1
- 241000274790 Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 Species 0.000 description 1
- 235000006463 Brassica alba Nutrition 0.000 description 1
- 244000140786 Brassica hirta Species 0.000 description 1
- 241000995051 Brenda Species 0.000 description 1
- 240000003665 Brettanomyces bruxellensis Species 0.000 description 1
- 235000000287 Brettanomyces bruxellensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235172 Bullera Species 0.000 description 1
- 241000033328 Bulleromyces Species 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N CERULENIN Chemical compound C\C=C\C\C=C\CCC(=O)[C@H]1O[C@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N 0.000 description 1
- 229960005069 Calcium Drugs 0.000 description 1
- 229940041011 Carbapenems Drugs 0.000 description 1
- 101700015466 Cat-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 description 1
- OLVCFLKTBJRLHI-AXAPSJFSSA-N Cefamandole Chemical compound CN1N=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](O)C=3C=CC=CC=3)[C@H]2SC1 OLVCFLKTBJRLHI-AXAPSJFSSA-N 0.000 description 1
- 229960003012 Cefamandole Drugs 0.000 description 1
- GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N Cefoperazone Chemical compound O=C1C(=O)N(CC)CCN1C(=O)N[C@H](C=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2C(C(O)=O)=C(CSC=3N(N=NN=3)C)CS[C@@H]21 GCFBRXLSHGKWDP-XCGNWRKASA-N 0.000 description 1
- 229960004682 Cefoperazone Drugs 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N Chitin Chemical compound O[C@@H]1C(NC(=O)C)[C@H](O)OC(CO)[C@H]1COC[C@H]1C(NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](COC[C@H]2C([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)O2)NC(C)=O)C(CO)O1 DJHJJVWPFGHIPH-OODMECLYSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 Chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N Chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 241000190831 Chromatium Species 0.000 description 1
- 241001508787 Citeromyces Species 0.000 description 1
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 1
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241001508790 Clarkia breweri Species 0.000 description 1
- 241001508811 Clavispora Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241001135265 Cronobacter sakazakii Species 0.000 description 1
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 description 1
- 241000222039 Cystofilobasidium Species 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-Threitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 241000235035 Debaryomyces Species 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Destomysin Chemical compound OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241001306278 Diaporthe amygdali Species 0.000 description 1
- 241001123630 Dipodascopsis Species 0.000 description 1
- 241001123635 Dipodascus Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 101710021566 E. coli bla Proteins 0.000 description 1
- 108010006229 EC 2.3.1.9 Proteins 0.000 description 1
- 102000005345 EC 2.3.1.9 Human genes 0.000 description 1
- 108010065958 EC 5.3.3.2 Proteins 0.000 description 1
- 108030000409 EC 5.5.1.12 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241000235167 Eremascus Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 229940009714 Erythritol Drugs 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N Erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101700056500 F11 Proteins 0.000 description 1
- 102100007210 FDFT1 Human genes 0.000 description 1
- 101700047058 FDFT1 Proteins 0.000 description 1
- 101710021343 FDPS Proteins 0.000 description 1
- 102100002033 FDPS Human genes 0.000 description 1
- 239000001776 FEMA 4720 Substances 0.000 description 1
- 108010022535 Farnesyl-Diphosphate Farnesyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000187808 Frankia sp. Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 241001408548 Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586 Species 0.000 description 1
- 241000009790 Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii Species 0.000 description 1
- 101700075304 GAL80 Proteins 0.000 description 1
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N Geranyl diphosphate Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N 0.000 description 1
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N Geranyl pyrophosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 1
- 240000002883 Ginkgo biloba Species 0.000 description 1
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 description 1
- 241001121139 Gluconobacter oxydans 621H Species 0.000 description 1
- 229940096919 Glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N Glycogen Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O1 BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N 0.000 description 1
- 101710007246 H3-3A Proteins 0.000 description 1
- 101700009603 HIS3 Proteins 0.000 description 1
- CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N HMG-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C[C@@](O)(CC(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CABVTRNMFUVUDM-VRHQGPGLSA-N 0.000 description 1
- 102100010498 HMGCR Human genes 0.000 description 1
- 241000168517 Haematococcus lacustris Species 0.000 description 1
- 241001235200 Haemophilus influenzae Rd KW20 Species 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 241000205062 Halobacterium Species 0.000 description 1
- 241000204942 Halobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 240000006669 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241001236629 Holtermannia Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229940097277 Hygromycin B Drugs 0.000 description 1
- 241000376403 Hyphopichia Species 0.000 description 1
- 102100008564 IDI1 Human genes 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N Inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 Inositol Drugs 0.000 description 1
- JUZNIMUFDBIJCM-ANEDZVCMSA-N Invanz Chemical compound O=C([C@H]1NC[C@H](C1)SC=1[C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1 JUZNIMUFDBIJCM-ANEDZVCMSA-N 0.000 description 1
- 241001473007 Ips pini Species 0.000 description 1
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-K Isopentenyl pyrophosphate Chemical compound CC(=C)CCOP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000235644 Issatchenkia Species 0.000 description 1
- 241000204082 Kitasatospora griseola Species 0.000 description 1
- 201000008225 Klebsiella pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241001489120 Kondoa Species 0.000 description 1
- 241001304304 Kuraishia Species 0.000 description 1
- 241000222661 Kurtzmanomyces Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000003290 L-leucino group Chemical class [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101710010014 LYS21 Proteins 0.000 description 1
- 241000481961 Lachancea thermotolerans Species 0.000 description 1
- 229940039696 Lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241001273393 Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 241000111269 Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130 Species 0.000 description 1
- 241000221479 Leucosporidium Species 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241001508815 Lodderomyces Species 0.000 description 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 description 1
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 1
- 101700071295 MET3 Proteins 0.000 description 1
- 229940061634 Magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 241000555676 Malassezia Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 1
- 241000970829 Mesorhizobium Species 0.000 description 1
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 description 1
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 1
- 241000202974 Methanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 1
- 241000203353 Methanococcus Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000589323 Methylobacterium Species 0.000 description 1
- 241001123674 Metschnikowia Species 0.000 description 1
- 241000235048 Meyerozyma guilliermondii Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 description 1
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 1
- 241001149967 Mrakia Species 0.000 description 1
- 241001149947 Mucor circinelloides f. lusitanicus Species 0.000 description 1
- 241001607431 Mycobacterium marinum M Species 0.000 description 1
- 241001414632 Mycobacterium ulcerans Agy99 Species 0.000 description 1
- 241000529863 Myxozyma Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 241001503696 Nocardia brasiliensis Species 0.000 description 1
- 241000452197 Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43111 Species 0.000 description 1
- 108091005503 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000159576 Oosporidium Species 0.000 description 1
- 241001502335 Orpinomyces Species 0.000 description 1
- 102100004073 PTCRA Human genes 0.000 description 1
- 101700044144 PTCRA Proteins 0.000 description 1
- 241000235652 Pachysolen Species 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 1
- 241000589597 Paracoccus denitrificans Species 0.000 description 1
- 241001557897 Phaeosphaeria sp. Species 0.000 description 1
- 241001542817 Phaffia Species 0.000 description 1
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 241000192608 Phormidium Species 0.000 description 1
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 description 1
- 240000000020 Picea glauca Species 0.000 description 1
- 235000008127 Picea glauca Nutrition 0.000 description 1
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 206010035717 Pneumonia klebsiella Diseases 0.000 description 1
- 229940055023 Pseudomonas aeruginosa Drugs 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000432378 Pseudomonas pudica Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J Pyrophosphate Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- BLUAFEHZUWYNDE-OWBKAPBLSA-N Quing hau sau Natural products O=C1[C@H](C)[C@H]2[C@@]34OO[C@@](C)(O[C@H]3O1)CC[C@H]4[C@@H](C)CC2 BLUAFEHZUWYNDE-OWBKAPBLSA-N 0.000 description 1
- DRSKVOAJKLUMCL-UHFFFAOYSA-N Rebaudioside B Chemical compound C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(O)=O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC(C1OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)OC(CO)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O DRSKVOAJKLUMCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYLAUKAHEAUVFE-XKDJHBDXSA-N Rebaudioside F Natural products O=C(O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@@]1(C)[C@@H]2[C@](C)([C@H]3[C@@]4(CC(=C)[C@@](O[C@H]5[C@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO6)[C@@H](O[C@H]6[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)(C4)CC3)CC2)CCC1 HYLAUKAHEAUVFE-XKDJHBDXSA-N 0.000 description 1
- HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N Rebaudioside F Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HYLAUKAHEAUVFE-AVBZULRRSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000191043 Rhodobacter sphaeroides Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000190967 Rhodospirillum Species 0.000 description 1
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 241001026379 Ruegeria pomeroyi DSS-3 Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 241001489223 Saccharomycodes Species 0.000 description 1
- 241000222838 Saitoella Species 0.000 description 1
- 241001514651 Sakaguchia Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241001149673 Saturnispora Species 0.000 description 1
- 241000159586 Schizoblastosporion Species 0.000 description 1
- 241000311088 Schwanniomyces Species 0.000 description 1
- 240000003705 Senecio vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 229940007046 Shigella dysenteriae Drugs 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 206010040550 Shigella infection Diseases 0.000 description 1
- 229940115939 Shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 240000001016 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000228389 Sporidiobolus Species 0.000 description 1
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 description 1
- 241000193640 Sporopachydermia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000222665 Sterigmatomyces Species 0.000 description 1
- 241000040567 Sterigmatosporidium Species 0.000 description 1
- OMHUCGDTACNQEX-UHFFFAOYSA-N Steviobioside Chemical compound C1CC2C3(C)CCCC(C)(C(O)=O)C3CCC2(C2)CC(=C)C21OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O OMHUCGDTACNQEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203644 Streptoalloteichus hindustanus Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241001521783 Streptococcus mutans UA159 Species 0.000 description 1
- 241000694196 Streptococcus pneumoniae R6 Species 0.000 description 1
- 241000103155 Streptococcus pyogenes MGAS10270 Species 0.000 description 1
- 241000103154 Streptococcus pyogenes MGAS2096 Species 0.000 description 1
- 241000187310 Streptomyces noursei Species 0.000 description 1
- 241000813219 Streptomyces sp. KO-3988 Species 0.000 description 1
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 1
- 241000267323 Streptomyces viridochromogenes DSM 40736 Species 0.000 description 1
- 241000205101 Sulfolobus Species 0.000 description 1
- 241000205098 Sulfolobus acidocaldarius Species 0.000 description 1
- FZMKKCQHDROFNI-UHFFFAOYSA-N Sulfometuron Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(O)=O)=N1 FZMKKCQHDROFNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000122237 Symbiotaphrina Species 0.000 description 1
- 241000159597 Sympodiomyces Species 0.000 description 1
- 241001523623 Sympodiomycopsis Species 0.000 description 1
- 241000192560 Synechococcus sp. Species 0.000 description 1
- 241000557627 Syntrophus aciditrophicus SB Species 0.000 description 1
- BVCKFLJARNKCSS-DWPRYXJFSA-N Temocillin Chemical compound N([C@]1(OC)C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C(C(O)=O)C=1C=CSC=1 BVCKFLJARNKCSS-DWPRYXJFSA-N 0.000 description 1
- 241001491687 Thalassiosira pseudonana Species 0.000 description 1
- 241000204667 Thermoplasma Species 0.000 description 1
- 241000204673 Thermoplasma acidophilum Species 0.000 description 1
- 241000489996 Thermoplasma volcanium Species 0.000 description 1
- 241000235006 Torulaspora Species 0.000 description 1
- 241001495125 Torulaspora pretoriensis Species 0.000 description 1
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 241000400381 Trichosporiella Species 0.000 description 1
- 241001480014 Trigonopsis Species 0.000 description 1
- 241000222671 Tsuchiyaea Species 0.000 description 1
- DQQDLYVHOTZLOR-OCIMBMBZSA-N UDP-α-D-xylose Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@H]([C@@H](O1)N1C(NC(=O)C=C1)=O)O)O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DQQDLYVHOTZLOR-OCIMBMBZSA-N 0.000 description 1
- 101710005410 UGT91D2 Proteins 0.000 description 1
- 101700010958 US12 Proteins 0.000 description 1
- 101700005383 US14 Proteins 0.000 description 1
- 241000145580 Udeniomyces Species 0.000 description 1
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 description 1
- 241001253549 Vibrio fischeri ES114 Species 0.000 description 1
- 210000003135 Vibrissae Anatomy 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000193620 Wickerhamia Species 0.000 description 1
- 241000193624 Wickerhamiella Species 0.000 description 1
- 241000235152 Williopsis Species 0.000 description 1
- 241000204362 Xylella fastidiosa Species 0.000 description 1
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N Zeocin Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(=O)NCCCCN=C(N)N)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1[N]C=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222676 Zygoascus Species 0.000 description 1
- 241000235017 Zygosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000685534 Zygowilliopsis Species 0.000 description 1
- 241000193645 Zygozyma Species 0.000 description 1
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 1
- 241000634340 [Haemophilus] ducreyi 35000HP Species 0.000 description 1
- DRDCJEIZVLVWNC-YUJZQKNVSA-N [[(2R,3S,4R)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl] hydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 DRDCJEIZVLVWNC-YUJZQKNVSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic Effects 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229960004191 artemisinin Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- PPBAJDRXASKAGH-UHFFFAOYSA-O azanium;urea Chemical compound [NH4+].NC(N)=O PPBAJDRXASKAGH-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atoms Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N cephamycin Chemical class S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](C)[C@]21OC UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N 0.000 description 1
- 229950005984 cerulenin Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 1
- 229920003211 cis-1,4-polyisoprene Polymers 0.000 description 1
- 101700071570 claF Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulant Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000005712 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 101710027907 cys-11 Proteins 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 101700024295 encB Proteins 0.000 description 1
- 229960002770 ertapenem Drugs 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 101710009507 fccA Proteins 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 101700005736 fppS Proteins 0.000 description 1
- 101700007096 fps Proteins 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001423 gas--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 101700030084 gedB Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000000381 ginkgo Nutrition 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000937 glycosyl acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 235000002532 grape seed extract Nutrition 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-UHFFFAOYSA-N hydrogen atom Chemical compound [H] YZCKVEUIGOORGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 101700072735 lys-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 101700009721 mdpF Proteins 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229940073769 methyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000005445 natural product Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural products Natural products 0.000 description 1
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000021231 nutrient uptake Nutrition 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000000238 one-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002436 one-dimensional nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000406 phosphotungstic acid polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003148 prolines Chemical group 0.000 description 1
- 125000001116 prolino group Chemical group [H]OC(=O)C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229960002862 pyridoxine Drugs 0.000 description 1
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000004202 respiratory function Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 101700034878 setA Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004296 sodium metabisulphite Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 235000019605 sweet taste sensations Nutrition 0.000 description 1
- 229960001114 temocillin Drugs 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 101700069926 tpcB Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000002495 two-dimensional nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 101700061348 vrtD Proteins 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- 101710025069 yplQ Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой генетически модифицированную клетку-хозяин для производства одного или более стевиоловых гликозидов, содержащую гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 не менее 80%. Способы, описанные здесь, обеспечивают эффективный путь гетерологичного получения стевиоловых гликозидов, включая, но не ограничиваясь, ребаудиозид D и ребаудиозид М. 8 н. и 48 з.п. ф-лы, 9 ил., 12 табл., 12 пр.
Description
1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущества предварительной заявки США №62/374408, поданной 12 августа 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
2. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к определенным уридиндифосфат-зависимым гликозилтрансферазам (UGT), содержащим их композициям, содержащим их клеткам-хозяевам и способам их применения для получения ребаудиозидов, включая ребаудиозид D и ребаудиозид М.
3. ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Желательно, чтобы подсластители с нулевой калорийностью, полученные из натуральных источников, ограничивали вредные последствия потребления большого количества сахара (например, диабет и ожирение). Ребаудиозид М (RebM), является одним из многих соединений со сладким вкусом, производимых растением стевии (Stevia rebaudiana Bertoni). Из всех ребаудиозидов RebM обладает самой высокой эффективностью (примерно в 200-300 раз слаще, чем сахароза) и является самым чистым по вкусу. Тем не менее, RebM производится растением стевия только в незначительных количествах и составляет лишь небольшую долю от общего содержания стевиоловых гликозидов (<1,0%). Ohta и др., 2010, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209 (2010). По этой причине желательно производить RebM с использованием биотехнологических путей, позволяющих получать его в больших количествах и с высокой степенью чистоты.
[0004] Предпочтительно, для экономичного производства продукта с использованием биотехнологии каждый этап биоконверсии от сырья к продукту должен иметь высокую эффективность преобразования (в идеале >90%). При разработке дрожжей для получения RebM было выявлено ограничение на предпоследней стадии биосинтеза, а именно преобразование Ребаудиозида A (RebA) в Ребаудиозид D (RebD). См. ФИГ. 1А. Наблюдалось, что нативный фермент (Ono, ЕР 2826861 A1, UGT91D_like3 или близкий гомолог) преобразует около 3% RebA в RebD. Были идентифицированы два других фермента UGT, которые способны преобразовывать RebA в RebD. Одним из них является Os_UGT_91C1 из Oryza sativa (также называемый EUGT11 в патентной заявке Houghton-Larsen и др., WO 2013/022989 А2), а другим является Sl_UGT_101249881 из Solarium lycopersicum (также называемый UGTSL2 в патентной заявке Markosyan и др., WO 2014 / 193888 А1). Однако авторы настоящего изобретения первоначально наблюдали, что и Os_UGT_91C1, и Sl_UGT_101249881 имели более низкие, чем желаемые, коэффициенты преобразования, составляющие примерно 53% и 70% соответственно. Все три этих фермента, UGT91D_like3, Os_UGT_91C1 и SL_UGT_101249881, представляют собой уридиндифосфат-зависимые гликозилтрансферазы (UGT), которые переносят глюкозный фрагмент в положение С-2'остатка 19-О-глюкозы через образование бета(1->2) связи (ФИГ. 1А).
[0005] Для эффективного получения RebM с высокой чистотой необходимы улучшенные ферменты, способные преобразовывать RebA в RebD с высокой эффективностью. Композиции и способы, представленные здесь, удовлетворяют эту потребность и обеспечивают соответствующие преимущества.
4. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Здесь представлены композиции и способы для улучшенного преобразования RebA в RebD и для улучшенного производства RebD и/или RebM. Эти композиции и способы частично основаны на неожиданном открытии некоторых уридиндифосфат-зависимых гликозилтрансфераз (UGT), способных преобразовывать RebA в RebD с необычно высокой эффективностью. Даже незначительное улучшение характеристик штамма (например, на десять процентов) с новыми UGT может в будущем сэкономить более десяти миллионов долларов на производственных затратах, если предположить, что рыночный спрос на RebM составляет 5000 миллионов тонн в год.
[0007] Определенные UGT, описанные здесь, также способны продуцировать RebM с небольшим содержанием ненатуральных гликозидов, таких как побочный продукт RebM2 (то есть изомер RebM), или без них. См. списка известных в настоящее время стевиоловых гликозидов в работе Ceunen S. et al. Steviol Glycosides: Chemical Diversity, Metabolism, and Function. J. Nat. Prod., 76, 1201-1228 (2013). Как таковые, в определенных вариантах осуществления композиции и способы, описанные здесь, могут снизить стоимость последующей обработки для получения композиции с высокой чистотой RebM.
[0008] Здесь также представлены композиции и способы для альтернативных ферментов, которые способны продуцировать стевиоловые гликозиды с субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности ранее известных UGT. Новые альтернативные ферменты могут потенциально продуцировать разные смеси или пропорции стевиоловых гликозидов по сравнению с теми, которые вырабатываются другими известными ферментами. Композиции с различными смесями или пропорциями стевиоловых гликозидов могут потенциально придавать альтернативные профили сладкого вкуса, которые могут быть полезны при разработке рецептур различных потребительских или пищевых продуктов.
[0009] Таким образом, здесь представлены генетически модифицированные клетки-хозяева и способы их использования для получения промышленно полезных соединений. В одном аспекте здесь представлена генетически модифицированная клетка-хозяин, содержащая: гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу (UGT40087, также называемую Si_UGT_40087). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментативных путей, способных продуцировать стевиол и/или стевиоловые гликозиды.
[0010] В некоторых вариантах осуществления здесь представлены генетически модифицированные клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с последовательностью UGT40087 по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% (например, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 90%, 95%, 96% или 97%. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, содержащую акцепторный домен сахара, где аминокислотная последовательность акцепторного домена сахара по меньшей мере 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, которая содержит аминокислотную последовательность loop1, вариантную аминокислотную последовательность loop1, аминокислотную последовательность loop2, вариантную аминокислотную последовательность loop2, аминокислотную последовательность loop3_1, вариантную аминокислотная последовательность loop3_1, аминокислотную последовательность loop3_2, вариантную аминокислотную последовательность loop3_2, аминокислотную последовательность loop4_1, вариантную аминокислотную последовательность loop4_1, аминокислотную последовательность loop4_2 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%) идентична последовательности акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0011] В некоторых вариантах осуществления здесь представлены генетически модифицированные клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 85%, 90% или 95% с последовательностью SEQ ID NO: 2, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% или 97%. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, содержащую акцепторный домен сахара, где аминокислотная последовательность акцепторного домена сахара по меньшей мере на 84%, 85%, 86%о, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 2, 5 или 6. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, которая содержит аминокислотную последовательность loop1, вариантную аминокислотную последовательность loop1, аминокислотную последовательность loop2, вариантную аминокислотную последовательность loop2, аминокислотную последовательность loop3_1, вариантную аминокислотную последовательность loop3_1, аминокислотную последовательность loop3_2, вариантную аминокислотную последовательность loop3_2, аминокислотную последовательность loop4_1, вариантную аминокислотную последовательность loop4_1, аминокислотную последовательность loop4_2 или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 2, 5 или 6 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_1 SEQ ID NO: 2, 5 или 6.
[0012] В другом аспекте здесь предлагаются способы получения гетерологичного стевиолового гликозида, причем способ включает в себя культивирование популяции генетически модифицированных клеток-хозяев, представленных здесь, способных продуцировать стевиоловый гликозид, как описано здесь, в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения указанного соединения стевиолового гликозида; и извлечение указанного стевиолового гликозида из среды. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный стевиоловый гликозид выбран из группы, состоящей из RebD и RebM.
[0013] В другом аспекте здесь предлагается способ увеличения продукции стевиол-гликозидного соединения в клетке-хозяине, включающий в себя экспрессию в клетке-хозяине гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей UGT40087; и культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования стевиолового гликозида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин не содержит фермента UGT91D_like3, фермента Os_UGT_91C1 или фермента Sl_UGT_101249881.
[0014] В другом аспекте здесь представлены способы получения RebD, причем способ включает в себя культивирование популяции генетически модифицированных клеток-хозяев, представленных здесь, способных продуцировать RebD, как описано здесь, в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения указанного RebD; и восстановление указанного RebD из среды.
[0015] В другом аспекте здесь предлагаются способы получения RebM, причем способ включает в себя культивирование популяции генетически модифицированных клеток-хозяев, представленных здесь, способных продуцировать RebM, как описано здесь, в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения указанного RebM; и восстановление указанного RebM из среды.
[0016] В другом аспекте здесь представлены способы получения RebD, причем способ включает в себя контактирование RebA с глюкозой и описанной здесь UDP-гликозилтрансферазой, способной преобразовывать RebA в RebD, в условиях, подходящих для образования RebD.
[0017] В другом аспекте здесь представлены способы получения RebM, причем способ включает в себя контактирование RebA с глюкозой и описанной здесь UDP-гликозилтрансферазой, способной преобразовывать RebA в RebD, в условиях, подходящих для образования RebD, и с описанной здесь UDP-гликозилтрансферазой, способной преобразовывать RebD в RebM.
[0018] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку. В некоторых вариантах осуществления дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует RebD или RebM с высокой эффективностью. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенное количество RebD или RebM по сравнению с дрожжевой клеткой, не содержащей фермент UGT40087. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенное количество RebM относительно RebM2 по сравнению с дрожжевой клеткой, не содержащей фермент UGT40087.
[0019] В другом аспекте другие представленные здесь UDG-гликозилтрансферазы могут использоваться в дополнение или в качестве альтернативы UGT40087. К ним относятся, например, sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840, Hv_UGT_V1, Bd_UGT10850 и Ob_UGT91B1_like. 5.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ
[0020] ФИГ. 1А - схематическое представление преобразования RebA в RebD в RebM.
[0021] ФИГ. 1В - структура RebM2.
[0022] ФИГ. 1С - принципиальная схема мевалонатного пути.
[0023] ФИГ. 2А - примерный путь фарнезилпирофосфата (FPP) к стевиолу.
[0024] ФИГ. 2В - примерный путь стевиола к RebM.
[0025] ФИГ. 2С - примерный путь ферментативного производства RebM.
[0026] ФИГ. 3 - отношение конверсии RebA к RebD in vivo, измеренное по микромолям Reb (D + М) / микромолям Reb (А + D + М). Родительский контрольный штамм обозначен как 91D_like3 (от Stevia rebaudiana; этот штамм содержит только UGT: 85С2, 74G1, 91D_like3 и 76G1, в дополнение к пустой посадочной площадке. Отмечается, что 91D_like3 имеет очень низкий процент преобразования RebA в RebD (~3% см. Таблицу 5). Одна копия каждого фермента UGT была вставлена в родительский контрольный штамм и проверена на предмет улучшенной конверсии RebA в RebD. Показано, что шесть ферментов UGT имеют конверсию RebA в RebD, которая эквивалентны или лучше, чем у предыдущих известных ферментов Os_UGT_91C1 и Sl_UGT_101249881. Три фермента UGT (Si_UGT_40087, Ob_UGT91B1_like и Hv_UGT_V1 преобразуют RebA в RebD лучше, чем оба ранее идентифицированных фермента UGT. «Усы» отображают стандартную ошибку.
[0027] ФИГ. 4 - принципиальная схема конструкции «посадочной площадки», используемой для введения отдельных ферментов UGT для скрининга на преобразование RebA в RebD у дрожжей.
[0028] ФИГ. 5a-h - иллюстрация хроматограмм RebA, RebD, RebM, RebM2, полученных in vivo для каждого гена UGT, используемого для получения данных, описанных в Таблице 5 и на ФИГ. 3. Пики хроматограммы выбраны таким образом, чтобы показать пики, связанные с RebA, RebD, RebM и RebM2. На каждом рисунке показано время удерживания в зависимости от процента интенсивности для аутентичных стандартов, контрольного исходного штамма Y31062 и Y31062 с дополнительным ферментом UGT. Y31062 является родительским контрольным штаммом и содержит UGT74G1, UGT85C2, UGT91D_like3 и UGT76G1 с пустой посадочной площадкой. ФИГ. 5а: данные для Si_UGT_40087; этот рисунок также включает хроматограмму для аутентичного стандарта RebE. ФИГ. 5b: данные для Ob_UGT91B1_like. ФИГ. 5с: данные для Hv_UGT_V1. ФИГ. 5d: данные для Sl_UGT_101249881. ФИГ. 5е: данные для UGT_g252778. ФИГ. 5f: данные для Os_UGT_91C1. ФИГ. 5g: данные для Bd_UGT10850. ФИГ. 5h: данные для Bd_UGT10840. ФИГ. 5i показывает увеличенное изображение хроматограммы только для пика RebE Si_UGT_40087 по сравнению с аутентичным стандартом, чтобы подтвердить, что этот пик является RebE.
[0029] ФИГ. 6 - иллюстрация модели гомологии структуры UGT40087. Его N- и С-концевые домены показаны светло-серым и темно-серым; четыре петли, использованные в эксперименте по замене петель, также помечены на структуре.
[0030] ФИГ. 7 - иллюстрация схематичного обзора конструкций замены UGT-доменов.
[0031] ФИГ. 8 - иллюстрация выравнивания последовательностей четырех UDP-гликозилтрансфераз (UGT40087 (SEQ ID NO: 1); Os_UGT_91C1 (SEQ ID NO: 8); 91Dlike3 (SEQ ID NO: 7); Si91Dlike (SEQ ID NO: 12)).
[0032] ФИГ. 9a - иллюстрация хроматограмм стевиоловых гликозидов, полученных in vivo для родительской контрольной клетки (включающей UGT74G1, UT85C2, UGT76G1 и UGT91D_like3). ФИГ. 9b - иллюстрация хроматограммы стевиоловых гликозидов, полученных in vivo для родительского контрольного штамма с UGT40087. На ФИГ. 9с представлена хроматограмма стевиоловых гликозидов, полученных in vivo для родительского контрольного штамма с Ob_UGT91B1_like.
6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
6.1 Терминология
[0033] Используемый здесь термин «гетерологичный» относится к тому, что обычно не встречается в природе. Термин «гетерологичная нуклеотидная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, обычно не встречающейся в данной клетке в природе. Как таковая, гетерологичная нуклеотидная последовательность может (а) быть чужеродной для ее клетки-хозяина (то есть «экзогенной» для клетки); (b) естественным образом обнаруживаться в клетке-хозяине (то есть «эндогенной»), но присутствовать в неестественном количестве в клетке (то есть в большем или меньшем количестве, чем в естественном состоянии в клетке-хозяине); или (с) обнаруживаться в природе в клетке-хозяине, но распологаться вне ее естественного локуса. Термин «гетерологичный фермент» относится к ферменту, который обычно не обнаруживается в данной клетке в природе. Термин охватывает фермент, который: (а) является экзогенным для данной клетки (то есть кодируется нуклеотидной последовательностью, которая не присутствует в природе в клетке-хозяине или не присутствует в данном контексте в клетке-хозяине); и (b) естественным образом обнаруживается в клетке-хозяине (например, фермент кодируется нуклеотидной последовательностью, которая является эндогенной для клетки), но продуцируется в неестественном количестве (например, больше или меньше, чем в естественном состоянии) в клетке-хозяине.
[0034] С другой стороны, термин «нативный» или «эндогенный», используемый здесь применительно к молекулам и, в частности, к ферментам и нуклеиновым кислотам, обозначает молекулы, которые экспрессируются в организме, в котором они возникли или встречаются в природе, независимо от уровня экспрессии, который может быть ниже, равен или выше уровня экспрессии молекулы в нативном микроорганизме. При этом понимается, что экспрессия нативных ферментов или полинуклеотидов может быть модифицирована в рекомбинантных микроорганизмах.
[0035] Используемый здесь термин «родительская клетка» относится к клетке, которая имеет идентичный генетический фон, как описанная здесь генетически модифицированная клетка-хозяин, за тем исключением, что она не содержит одну или несколько конкретных генетических модификаций, встроенных в модифицированную клетку-хозяина, например, одну или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из гетерологичной экспрессии фермента пути стевиола, гетерологичной экспрессии фермента пути стевиолового гликозида, гетерологичной экспрессии геранилгеранилдифосфатсинтазы, гетерологичной экспрессии копалилдифосфатсинтазы, гетерологичной экспрессии каурен-синтазы, гетерологичной экспрессии кауреноксидазы, гетерологичной экспрессии стевиол-синтазы (гидроксилаза кауреновой кислоты), гетерологичной экспрессии цитохром-Р450-редуктазы, гетерологичной экспрессии UGT74G1, гетерологичной экспрессии гетерогенного UGT76G1, UGT85C2, гетерологичной экспрессии UGT91D и гетерологичной экспрессии UGT40087.
[0036] Используемый здесь термин «встречающийся в природе» относится к тому, что встречается в природе. Например, UDP-гликозилтрансфераза, которая присутствует в организме, которая может быть выделена из источника в природе и которая не была преднамеренно изменена человеком в лаборатории, является встречающейся в природе UDP-гликозилтрансферазой. И наоборот, используемый здесь термин «не встречающийся в природе» относится к тому, что не встречается в природе, но создается благодаря вмешательству человека.
[0037] Термин «среда» относится к культуральной среде и/или ферментационной среде.
[0038] Термин «ферментационная композиция» относится к композиции, которая содержит генетически модифицированные клетки-хозяева и продукты или метаболиты, продуцируемые генетически модифицированными клетками-хозяевами. Примером ферментационной композиции является цельноклеточный бульон, который может представлять собой все содержимое сосуда (например, колбы, чашки или ферментера), включая клетки, водную фазу и соединения, полученные из генетически модифицированных клеток-хозяев.
[0039] Используемый здесь термин «продукция», как правило, относится к количеству стевиола или стевиолового гликозида, продуцируемых представленной здесь генетически модифицированной клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления продукция выражается в виде продуцирования стевиола или стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином. В других вариантах осуществления продуцирование выражается как продуктивность клетки-хозяина в продуцировании стевиола или стевиолового гликозида.
[0040] Используемый здесь термин «продуктивность» относится к выработке стевиола или стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином, выраженной как количество произведенного стевиола или стевиоловых гликозидов (по массе) на количество ферментативного бульона, в котором культивируется клетка-хозяин (по объему) с течением времени (в час).
[0041] Используемый здесь термин «выход» относится к выработке стевиола или стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином, выраженной в количестве произведенного стевиола или стевиоловых гликозидов на количество источника углерода, потребляемого клеткой-хозяином, по массе.
[0042] Используемый здесь термин «неопределяемый уровень» соединения (например, RebM2, стевиолгликозиды или другие соединения) означает уровень соединения, который слишком низок, чтобы его можно было измерить и/или проанализировать с помощью стандартной методики для измерения состава. Например, термин включает уровень соединения, который не обнаруживается аналитическими методами, описанными в Примере 7.
[0043] Используемый здесь термин «стевиоловый гликозид(-ы)» относится к стевиолу, ферментативно измененному добавлением одной или нескольких сахарных групп, таких как стевиоловый гликозид, включая, в том числе, встречающиеся в природе стевиоловые гликозиды например, стевиолмонозид, стевиолбиозид, рубусозид, дуклозид В, дуклозид А, ребаудиозид В, ребаудиозид G, стевиозид, ребаудиозид С, ребаудиозид F, ребаудиозид А, ребаудиозид I, ребаудиозид Е, ребаудиозид Н, ребаудиозид L, ребаудиозид К, ребаудиозид J, ребаудиозид М, ребаудиозид D, ребаудиозид N, ребаудиозид О, синтетические стевиоловые гликозиды, например ферментативно глюкозилированные стевиоловые гликозиды и их комбинации.
[0044] Используемый здесь термин «уридиндифосфат (UDP)-гликозилтрансфераза» или «UDP-зависимая гликозилтрансфераза» относится к ферменту, который обладает активностью переноса моносахаридного фрагмента от гликозильного донора к гликозильному акцептору, в частности, к ферменту, который использует UDP-caxap в качестве донора гликозила. Термин «UDP-гликозилтрансфераза» может использоваться взаимозаменяемо с «UGT».
[0045] Используемый здесь термин «функциональный домен» означает либо «акцепторный домен сахара», либо «донорный домен сахара» UDP-гликозилтрансферазы. Растительная UDP-гликозилтрансфераза (UGT) принадлежит к семейству 1 суперсемейства гликозилтрансфераз. Они принимают структурную складку GT-B. Эта общая структурная особенность UGT состоит из двух доменов, С-концевого и N-концевого домена, с похожими Rossmann-подобными складками, разделенными междоменным линкером. С-концевой домен связывает UDP-глюкозу («донор сахара») и, таким образом, также называется донорным доменом сахара, в то время как N-концевой домен связывает несахарный субстрат («акцептор») и поэтому также называется в качестве домена-акцептора.
[0046] Используемый здесь термин «вариант» относится к полипептиду, отличающемуся от конкретно указанного «эталонного» полипептида (например, последовательности дикого типа) аминокислотными вставками, делециями, мутациями и/или заменами, но сохраняет активность, которая по существу аналогична эталонному полипептиду. Например, вариант UGT40087 сохраняет активность, которая по существу аналогична эталонному UGT40087, имеющему последовательность SEQ ID NO: 11, в том, что вариант UGT40087 также способен катализировать реакцию преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE. В некоторых вариантах осуществления этот вариант создается методами рекомбинантной ДНК, такими как мутагенез. В некоторых вариантах вариантный полипептид отличается от своего эталонного полипептида заменой одного основного остатка другим (т.е. заменой Arg на Lys), заменой одного гидрофобного остатка другим (т.е. заменой Leu на Ile) или заменой одного ароматического остатка для другого (то есть заменой Phe на Tyr) и т.д. В некоторых вариантах осуществления варианты включают аналоги, в которых получены консервативные замены, приводящие к существенной структурной аналогии эталонной последовательности. Примеры таких консервативных замен, в том числе, включают глутаминовую кислоту для аспарагиновой кислоты и наоборот; глютамин для аспарагина и наоборот; серии для треонина и наоборот; лизин для аргинина и наоборот; или изолейцин, валин или лейцин друг для друга соответственно.
[0047] Используемый здесь термин «вариантная аминокислотная последовательность loopl» относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 (или модифицированной последовательности loop1 UGT40087, имеющей последовательность SEQ ID NO: 28), включающей одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен, но допускает наличие UDP-гликозилтрансферазы, содержащий вариантную аминокислотную последовательност loop1, вставленную в позиции, которая соответствует местоположению аминокислотной последовательности loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно, для катализа преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE.
[0048] Используемый здесь термин «вариантная аминокислотная последовательность loop2 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 на одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop2, вставленную в позиции, которая соответствует местоположению аминокислотной последовательности loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно, для катализа преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE.
[0049] Используемый здесь термин «вариантная аминокислотная последовательность loop3_1» относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 на одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop3_1, вставленную в позиции, которая соответствует расположению аминокислотной последовательности loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, для катализа преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE. Используемый здесь термин «вариантная аминокислотная последовательность loop3_2» относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 на одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop3_2, вставленную в позиции, которая соответствует местоположению аминокислотной последовательности loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно, для катализа преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE. В некоторых вариантах осуществления вариантная аминокислотная последовательность loop3_2 отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop3_2 на одну, две, три, четыре, пять шесть, семь, восемь, девять, десять или до тридцати аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен.
[0050] Используемый здесь термин «вариантная аминокислотная последовательность loop4_1» относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 на одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять или до 30 аминокислотных вставок, делеций, мутаций и/или замен, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную последовательность loop4_1, вставленную в позиции, которая соответствует местоположению аминокислотной последовательности loop4_1 SEQ ID NO: 11, для катализа преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE. Используемый здесь термин «идентичность последовательности» или «процентная идентичность» в контексте или двух или более последовательностей нуклеиновой кислоты или белка относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков, или к нуклеотидам, которые являются одинаковыми. Например, последовательность может иметь процент идентичности, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91% по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более высокую идентичность, чем указанный диапазон, по отношению к последовательности при сравнении и выравнивании для максимального соответствия по диапазону сравнения или заданной области, измеренной с использованием алгоритма сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального контроля. Например, процент идентичности определяется путем расчета отношения количества идентичных нуклеотидов (или аминокислотных остатков) в последовательности, деленного на длину всех нуклеотидов (или аминокислотных остатков), минус длины любых разрывов.
[0051] Для удобства степень идентичности между двумя последовательностями можно установить с использованием компьютерной программы и математических алгоритмов, известных в данной области техники. Такие алгоритмы, которые вычисляют процент идентичности последовательности, как правило, учитывают разрывы последовательности и несовпадения в области сравнения. Для этой цели полезны программы, которые сравнивают и выравнивают последовательности, такие как Clustal W (Thompson и др., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), Clustal Omega (Sievers и др., (2011) Molecular Systems Biology., 7:539), ALIGN (Myers и dp, (1988) CABIOS, 4: 11-17), FASTA (Pearson и др., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol, 183: 63-98) и BLAST (Altschul и др., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402). Программа BLAST или BLAST 2.0 (Altschul и др., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) доступна из нескольких источников, включая Национальный центр биологической информации (NCBI) и в Интернете, и используется вместе с программами анализа последовательностей BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN и TBLASTX. Дополнительную информацию можно найти на вебсайте NCBI.
[0052] В некоторых вариантах осуществления выравнивания последовательностей и вычисления процентной идентичности могут производиться с использованием программы BLAST с использованием ее стандартных параметров по умолчанию. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и вычисления идентичности последовательностей используется программа BLASTN с параметрами по умолчанию (штраф на внесение делеций в выравнивание = 5, штраф на продолжение делеции = 2, совпадение нуклеотидов = 2, несовпадение нуклеотидов = -3, ожидаемая величина = 10.0, размер слова = 11, Максимальное число совпадений в диапазоне запросов = 0). В некоторых вариантах осуществления для выравнивания нуклеотидной последовательности и вычисления идентичности последовательности программа BLASTN используется с этими параметрами (штраф на внесение делеций в выравнивание = 5, штраф на продолжение делеции = 2, совпадение нуклеотидов = 1, несовпадение нуклеотидов = -3, ожидаемая величина = 10,0, размер слова = 11). Для выравнивания полипептидной последовательности и вычисления идентичности последовательностей используется программа BLASTP с параметрами по умолчанию (матрица выравнивания = BLOSUM62; разрывные затраты: существование = 11, расширение = 1; композиционные корректировки = условный композиционный балл, матричная корректировка; ожидаемая величина = 10,0; размер слова = 6; максимальное количество совпадений в диапазоне запросов = 0. В качестве альтернативы используются следующие программы и параметры: программное обеспечение Align Plus из пакета Clone Manager Suite версии 5 (программное обеспечение Sci-Ed), сравнение ДНК: глобальное сравнение, стандартная матрица линейных оценок, штраф на несовпадение = 2, штраф на внесение делеций в выравнивание = 4, штраф на продолжение делеций = 1. В описанных здесь вариантах осуществления, идентичность последовательности вычисляется с использованием программ BLASTN или BLASTP с использованием их параметров по умолчанию. В описанных здесь вариантах осуществления, выравнивание последовательности из двух или более последовательностей выполняется с использованием прогрммного обеспечения Clustal Omega с применением предложенных параметров по умолчанию (снять выравнивание входных последовательностей: нет; Mbed-подобное руководство по кластеризации: да; Mbed-подобная итерация кластеризации: да; количество комбинированных итераций: по умолчанию (0); максимальное количество итераций направляющего дерева: по умолчанию; максимум итераций НММ: по умолчанию; порядок: выровнен).
6.2 Клетки-хозяева
[0053] Здесь представлены клетки-хозяева, способные продуцировать ребаудиозид D (RebD) из ребаудиозида A (RebA) с высокой эффективностью. В определенных вариантах осуществления клетки-хозяева могут продуцировать RebD из RebA в качестве исходного материала. В предпочтительных вариантах осуществления клетки-хозяева могут продуцировать RebA из источника углерода в культуральной среде и могут дополнительно продуцировать RebD из RebA. В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева могут дополнительно продуцировать ребаудиозид М (RebM) из RebD.
[0054] В конкретных вариантах осуществления клетки-хозяева содержат ферментативную активность уридиндифосфатгликозилтрансферазы 87 (UGT40087). Фермент UGT40087 способен с высокой эффективностью преобразовывать RebA в RebD. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 80%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 85%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 90%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 95%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 96%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать RebA в RebD с эффективностью около 97%. В некоторых вариантах осуществления фермент UGT40087 способен преобразовывать стевиозид в RebE.
[0055] В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 80%. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 85%. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 90%. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 95%. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 96%. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать RebA в RebD с эффективностью около 97%. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин способна преобразовывать стевиозид в RebE.
[0056] Эффективность преобразования может быть измерена любым методом, очевидным для специалистов в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления эффективность преобразования может быть измерена путем контакта RebA с ферментом или клеткой-хозяином в подходящих условиях для образования RebD. Эффективность может быть измерена путем сравнения молярного количества произведенного RebD с общим количеством RebA и RebD в полученной композиции. Эффективность также можно измерить, сравнивая общее количество RebD и продуктов RebD дальнейшего предела с общим количеством RebA, RebD и продуктов RebD дальнейшего предела в полученной композиции. Например, эффективность также может быть измерена путем сравнения общего количества RebD, RebM и RebM2 по сравнению с общим количеством RebA, RebD, RebM и RebM2 в полученной композиции.
[0057] В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UGT40087, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, по существу, идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая, не менее чем на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 99% или, не менее чем на любой процент от 60% до 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ. ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0058] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, описанную здесь, и способную преобразовывать RebA в RebD. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, описанную здесь, и способную к бета-1,2-гликозилированию положения С2 '19-O глюкозы стевиолового гликозида. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, способную преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 90%, 95%, 96% или 97%, где UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичности последовательности не менее 95% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0059] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую UGT40087, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу, идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 65% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 99% или любой процент от 60% до 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ. ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0060] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 13, которая кодирует UGT40087, имеющий последовательность SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 13. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 99% или любой процент между 60% и 99% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0061] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие функциональный домен UGT40087, где UGT40087 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий N-концевой акцепторный домен сахара UGT40087, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий С-концевой донорный домен сахара UGT40087, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления акцепторный домен сахара в UGT40087 содержит положения аминокислот примерно от 1 до 214 последовательности SEQ ID NO: 11 (которые соответствуют положениям аминокислот от 1 до 215 последовательности SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления донорный домен сахара UGT40087 содержит положения аминокислот примерно от 215 до 435 последовательности SEQ ID NO: 11 (которые соответствуют положениям аминокислот от 216 до 436 последовательности SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления акцепторный домен сахара UGT40087 содержит положения аминокислот примерно от 1 до 215 SEQ ID NO: 1. В определенных вариантах осуществления донорный домен сахара содержит положения аминокислот примерно от 216 до 436 последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления акцепторный домен сахара и донорный домен сахара UGT40087 содержат более узкий диапазон аминокислотных остатков, чем от 1 до 214 или от 215 до 435, соответственно, по отношению к SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления акцепторный домен сахара и донорный домен сахара UGT40087 содержат более узкий диапазон аминокислотных остатков, чем от 1 до 215 или от 216 до 436, соответственно, по отношению к SEQ ID NO: 1.
[0062] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 96% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 98% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь предоставлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60%, не менее чем на 99% или любой процент от 60% до 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого сахара акцепторный домен SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0063] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую UGT40087, содержащую аминокислотную последовательность N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу, идентичную аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 65% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 70% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 75% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 85% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 90% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 95% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 96% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 97% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 98% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0064] В некоторых вариантах осуществления при сравнении и анализе трехмерных смоделированных структур UGT40087 и другой UDP-гликозилтрансферазы выявили четыре петли (то есть, loop1, loop2, loop3 и loop4), которые обладают значительными конформационными различиями N-концевого акцепторного домена сахара. См. ФИГ. 6 и Пример 12. Экспериментальные результаты замен соответствующих последовательностей петель между двумя UGT показали, что loop1, loop2, loop3_1, loop3_2 и loop4_1 UGT40087 могут быть заменены соответствующими им последовательностями петель из других UDP-гликозилтрансфераз, которые способны преобразовывать RebA в RebD. В этих вариантах осуществления две версии loop3 (то есть loop3_1 и loop3_2) и loop_4 (то есть loop4_1 и loop4_2) были разработаны для учета двух возможных длин петли.
[0065] Таким образом, в определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%о, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loopl UGT40087 (то есть SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в местоположении UDP-гликозилтрансферазы, которое соответствует местоположению loop1 SEQ ID. NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В определенных вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop1 имеет последовательность SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит вариантную аминокислотную последовательность loop1 в положении UDP-гликозилтрансферазы, которое соответствует местоположению loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Вариантная аминокислотная последовательность loop1 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или аминокислотной последовательности loop1, имеющей SEQ ID NO: 28, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop1 для сохранения своей активности по преобразованию RebA в RebD и/или по преобразованию стевиозида в RebE.
[0066] В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop2 UGT40087 (то есть SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которое соответствует местоположению loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит вариантную аминокислотную последовательность loop2 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Вариантная аминокислотная последовательность loop2 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop2, для сохранения своей активности по преобразованию RebA в RebD и/или преобразованию стевиозида в RebE.
[0067] В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop3_1 UGT40087 (то есть SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит вариантную аминокислотную последовательность loop3_1 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует расположению loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Вариантная аминокислотная последовательность loop3_1 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop3_1, для сохранения своей активности по преобразованию RebA в RebD и/или преобразованию стевиозида в RebE.
[0068] В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop3_2 UGT40087 (т.е. SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит вариантную аминокислотную последовательность loop3_2 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Вариантная аминокислотная последовательность loop3_2 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop3_2, для сохранения своей активности по преобразованию RebA в RebD и/или преобразованию стевиозида в RebE.
[0069] В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_1 UGT40087 (то есть SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит вариантную аминокислотную последовательность loop4_1 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Вариантная аминокислотная последовательность loop4_1 относится к аминокислотной последовательности, которая отличается от эталонной аминокислотной последовательности loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, но допускает UDP-гликозилтрансферазу, содержащую вариантную аминокислотную последовательность loop4_1, для сохранения своей активности по преобразованию RebA в RebD и/или преобразованию стевиозида в RebE.
[0070] В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_2 UGT40087 (то есть SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11) в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop4_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно. Аминокислотная последовательность loop4_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
[0071] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую ее UDP-гликозилтрансферазу, и дополнительно содержащую любую комбинацию следующего:
(a) Аминокислотная последовательность loop1 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 28 или вариантная аминокислотная последовательность loop1 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop1 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(b) аминокислотная последовательность loop2 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантная аминокислотная последовательность loop2 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop2 в SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(c) аминокислотная последовательность loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, или вариантная аминокислотная последовательность loop3_1, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(d) аминокислотная последовательность loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантная аминокислотная последовательность loop3_2 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_2 SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(e) аминокислотная последовательность loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, или вариантная аминокислотная последовательность loop4_1, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop4_1 в SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 11 соответственно; а также
(f) аминокислотная последовательность loop4_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop4_2 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно.
[0072] В некоторых вариантах осуществления при сравнении и анализе трехмерных смоделированных структур UDP-гликозилтрансфераз, способных преобразовывать RebA в RebD, было обнаружено, что loop4_1 UGT40087 при включении в соответствующее местоположение loop4_1 другой UDP-гликозилтрансферазы (и замене ее природной аминокислотной последовательностью loop4_1) привела к превосходной активности вариантной UDP-гликозилтрансферазы с точки зрения ее способности преобразовывать RebA в RebD. См. Пример 12. Эти результаты показывают, что аминокислотная последовательность loop4_1 любой подходящей UDP-гликозилтрансферазы может быть заменена аминокислотной последовательностью loop4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 для преобразования RebA в RebD.
[0073] Следовательно, в определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_1 (т.е. SEQ ID NO: 22) UGT40087 (т.е., SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11). В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 61%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 и дополнительно содержит аминокислотную последовательность loop4_1 (например, SEQ ID NO: 22) SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления любая подходящая UDP-гликозилтрансфераза, которая содержит аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% до SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 может использоваться для интеграции аминокислотной последовательности loop4_1 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 в соответствующем местоположении loop4_1 (заменяя ее нативную аминокислотную последовательность loop4_1). Например, Ob_UGT91B_like, Hv_UGT_V1, Sl_UGT_101249881, Sr.UGT_g252778, Os_UGT_91C1, Bd_UGT10840, Bd_UGT10850 или Si91Dlike могут использоваться в качестве базы для интеграции аминокислотной последовательности loop4_1. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
[0074] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 65% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 70% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 75% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 85% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 90% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 95% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 96% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 97% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 98% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 99% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0075] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую UGT40087, содержащую аминокислотную последовательность С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 65% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 70% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 75% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 80% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 85% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 90% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 95% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 96% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 97% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 98% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 99% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
[0076] В некоторых вариантах осуществления N-концевые акцепторные домены сахара и С-концевые донорные домены сахара рекомбинировали для изменения либо специфичности субстрата, либо каталитической активности. Как подробно описано в Примере 11, было определено, что когда донорный домен сахара из другой UDP-гликозилтрансферазы, способной преобразовывать RebA в RebD, рекомбинировали с акцепторным доменом сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, химерные UDP-гликозилтрансферазы сохранили свою способность преобразовывать RebA в RebD.
[0077] Таким образом, в определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична аминокислотной последовательности С-концевого донорного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11. Как показано в Примере 11, С-концевой донорный домен сахара является относительно взаимозаменяемым с другой UDP-гликозилтрансферазой с последовательностью идентичной не менее чем на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза дополнительно содержит С-концевой донорный домен сахара из другой UDP-гликозилтрансферазы. Примеры других UDP-гликозилтрансфераз с подходящими С-концевыми донорными доменами сахара включают Ob_UGT91B_like, Hv_UGT_V1, SI_UGT_101249881, Sr.UGT_g252778, Os_UGT_91C1, Bd_UGT10840, Bd_UGT10850 или Si91D.
[0078] В определенных вариантах осуществления было обнаружено, что определенные аминокислотные остатки в N-концевом акцепторном домене сахара могут восстанавливать каталитическую активность нефункциональной, предполагаемой UDP-гликозилтрансферазы в активную UDP-гликозилтрансферазу. Следовательно, здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности N-концевого акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, и дополнительно содержат один или более из следующих аминокислотных остатков:
(a) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 11 SEQ ID NO: 11;
(b) изолейцин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 12 SEQ ID NO: 11;
(c) пролин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 55 SEQ ID NO: 11;
(d) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 90 SEQ ID NO: 11;
(e) серии в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 203 SEQ ID NO: 11;
(f) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 223 SEQ ID NO: 11; или же
(g) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 413 SEQ ID NO: 11,
где позиции аминокислот UDP-гликозилтрансферазы, которые соответствуют позициям аминокислот SEQ ID NO: 11, определяются выравниванием последовательностей.
[0079] В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
[0080] В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вариант полипептида UGT40087, описанный выше. В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных замен относительно полипептида UGT40087. В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативных аминокислотных замен относительно полипептида UGT40087. В определенных вариантах осуществления любая из нуклеиновых кислот, описанных здесь, может быть оптимизирована для клетки-хозяина, например, оптимизирована по ко донам.
[0081] В описанных здесь вариантах осуществления может быть использован любой подходящий способ для определения соответствующих позиций аминокислот или соответствующих позиций петли двух полипептидов. В некоторых вариантах осуществления последовательности UDP-гликозилтрансферазы и эталонной последовательности SEQ ID NO: 11 могут быть выровнены с использованием прогрммного обеспечения Clustal Omega с применением параметров по умолчанию. В другом варианте осуществления последовательности UDP-гликозилтрансферазы и эталонной последовательности SEQ ID NO: 11 могут быть выровнены с использованием структурных выравниваний, таких как SWISS-MODEL, который является сервером моделирования гомологии белковой структуры, доступным через веб-сервер ExPASy, или из программы DeepView (Swiss Pdb-Viewer).
[0082] Хотя SEQ ID NO: 11 упоминается как эталонная последовательность для определения соответствующих позиций аминокислот или позиций петли для UDP-гликозилтрансферазы, в некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 1 также может использоваться в качестве эталонной последовательности для выравнивания.
[0083] В некоторых вариантах осуществления RebA является таким, как показано на ФИГ. 1А. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 способен катализировать реакцию остатка сахара, образующего β-связь, до позиции С-2' 19-О-глюкозы в RebA с образованием RebD, как показано на ФИГ. 1А. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 способен катализировать реакцию гексозного остатка в Р-образовании до позиции С-2'19-О-глюкозы RebA. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 способен катализировать реакцию остатка глюкозы в β-образовании с позицией С-2' 19-О-глюкозы RebA.
[0084] В некоторых вариантах осуществления RebE является таким, как показано на ФИГ. 2В. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 способен катализировать реакцию остатка сахара, образующего β-связь, до позиции С-2'19-О-глюкозы стевиозида с образованием RebE, как показано на ФИГ. 2В. В определенных вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 способен катализировать реакцию остатка гексозы в β-образовании до позиции С-2'19-О-глюкозы стевиозида. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 способен катализировать реакцию остатка глюкозы в β-образовании до позиции С-2'19-О-глюкозы стевиозида.
[0085] В определенных вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 не катализирует реакцию добавления второго сахарного фрагмента к стевиолмонозиду (то есть 13-О-стевиолгликозиду) на определяемом уровне. В некоторых вариантах осуществления UGT40087 или вариант UGT40087 не катализирует реакцию добавления второго сахарного фрагмента к рубусозиду (то есть 19-О-стевиолгликозиду) на определяемом уровне.
[0086] В некоторых вариантах осуществления RebD является таким, как показано на ФИГ. 1А. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит один или несколько ферментов, способных преобразовывать RebA в RebD. В определенных вариантах осуществления ячейка-хозяин содержит UGT40087 и/или вариант UGT40087 для преобразования RebA в RebD.
[0087] В определенных вариантах осуществления UGT76G1 способен катализировать реакцию остатка сахара с преобразованием RebD в RebM, как показано на ФИГ. 1А. В определенных вариантах осуществления клетки-хозяева дополнительно содержат один или несколько ферментов, способных преобразовывать RebD в RebM. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит UGT76G1, способный преобразовывать RebD в RebM.
[0088] В некоторых вариантах осуществления RebM2 показан на ФИГ. 1B. RebM2 представляет собой изомер RebM с единственной неправильной глюкозной связью, как показано на ФИГ. 1B. RebM2 имеет Glcβ (1-2) [Glcβ (1-6)] Glcβ1 - в позиции углерода 19 (СООН) вместо желаемого Glcβ (1-2) [Glcβ (1-3)] Glcβ1 - для RebM.
[0089] Специалистам понятно, что в определенных приложениях RebM2 может быть нежелательным побочным продуктом. Преимущественно, в определенных вариантах осуществления UGT40087 (или вариант UGT40087) и представленные здесь клетки-хозяева, способны продуцировать RebM2 в малых количествах или вообще не способны продуцировать RebM2. Количество RebM2 может быть выражено как отношение RebM к RebM2. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет не менее 2:1. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет не менее 3:1. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет не менее 4:1. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет не менее 5:1. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет не менее 10:1. В определенных вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет, не менее 100:1. В некоторых вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет, не менее 1000:1. В некоторых вариантах осуществления отношение RebM к RebM2 составляет, не менее 10000:1. В определенных вариантах осуществления UGT40087 (или вариант UGT40087) и представленные здесь клетки-хозяева, продуцируют необнаружимый уровень RebM2.
[0090] В то время как UGT40087 или любой вариант UGT40087 клеток-хозяев принимает RebA в качестве субстрата, источником RebA может быть любой источник, который считается подходящим для специалистов. В определенных вариантах осуществления UGT40087 или любой вариант UGT40087 могут связываться с RebA. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин может связываться с RebA. В определенных вариантах осуществления UGT40087 или любой вариант UGT40087 можно связать с композицией, содержащей один или несколько стевиоловых гликозидов. В определенных вариантах осуществления композиция содержит RebA. В определенных вариантах осуществления композиция содержит стевиозид. В определенных вариантах осуществления композиция получена из натуральных продуктов, выделенных из листьев Stevia rebaudiana. В определенных вариантах осуществления композиция является производной микробов. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин может контактировать с композицией, содержащей один или несколько стевиоловых гликозидов.
[0091] В определенных вариантах осуществления любой вариант UGT40087, подходящий для катализа желаемой реакции, может быть подвергнут скринингу любыми подходящими способами, известными в данной области. Например, подходящий вариант UGT40087 можно анализировать in vivo путем экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант UGT40087, и скрининга клеток, которые продуцируют функциональный вариант UGT40087, способный добавлять сахар в желаемом месте субстрата (например, позиция С2' 19-О-глюкозы из стевиоловых гликозидов или других субстратов). Примерные способы скрининга описаны в Примерах 3-7 ниже. В другом примере подходящий вариант UGT40087 может быть подвергнут скринингу in vitro путем контакта варианта UGT40087 с субстратом, таким как RebA. В этом примере анализ на наличие RebD можно использовать в качестве теста, чтобы определить, является ли вариант UGT40087 подходящим ферментом. Реакция может быть проанализирована с помощью LC-MS или других известных в данной области способов. См., например, патентную завку WO 2013/022989.
[0092] В определенных вариантах осуществления вариант UGT40087 считается подходящим для преобразования RebA в RebD (или из любого подходящего субстрата в его продукт путем гликозилирования), если он способен конвертировать RebA в RebD с эффективностью более 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96% или 97% in vivo.
[0093] В некоторых вариантах осуществления другие подходящие UDP-гликозилтрансферазы, обнаруженные в настоящей заявке, могут использоваться в дополнение или в качестве альтернативы UGT40087. К ним относятся, например, UDP-гликозилтрансферазы sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840, Hv_UGT_V1, Bd_UGT10850 и Ob_UGT91B1_like. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза sr.UGT_9252778 содержит SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза Bd_UGT10840 содержит SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза Hv_UGT_V1 содержит SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза Bd_UGT10850 содержит SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления UDP-гликозилтрансфераза Ob_UGT91B1_like содержит SEQ ID NO: 6. Любые обсуждения, касающиеся композиций и способов, относящихся к описанному здесь UGT40087, могут также применяться к этим другим UDP-гликозилтрансферазам.
[0094] Например, в некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева содержат ферментативную активность уридиндифосфат-гликозилтрансферазы sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840, Hv_UGT_V1, Bd_UGT10850 и/или Ob_UGT91B1_like. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 40%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 45%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 50%. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 55%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью более 60%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 65%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 70%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 75%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 80%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 85%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 90%. В определенных вариантах осуществления один или несколько из этих ферментов способны преобразовывать RebA в RebD с эффективностью, превышающей 95%.
[0095] В определенных вариантах осуществления здесь предоставлены клетки-хозяева, содержащие любой один или несколько из sr.UGT_9252778, Bd_UGT10840, Hv_UGT_V1, Bd_UGT10850 и/или Ob_UGT91B1_like, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, или 6 соответственно. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки-хозяева, содержащие полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая не менее чем на 60%, не менее чем на 70%, не менее чем на 75%, не менее чем на 80%, не менее чем на 85%, не менее чем на 90%, не менее чем на 95%, не менее чем на 96%, не менее чем на 97%, не менее чем на 98%, не менее чем на 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 или 6.
[0096] В предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин может содержать один или несколько ферментативных путей, способных продуцировать RebA, причем указанные пути взяты по отдельности или вместе. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева содержат один или несколько ферментов, способных преобразовывать геранилгеранилдифосфат в RebA. Пригодные ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, известны специалистам в данной области. Особенно полезные ферменты и нуклеиновые кислоты описаны в разделах ниже и дополнительно описаны, например, в патентных заявках US 2014/0329281 А1, US 2014/0357588 A1, US 2015/0159188, WO 2016/038095 A2 и US 2016/0198748 A1.
[0097] В других вариантах осуществления клетки-хозяева дополнительно содержат один или несколько ферментов, способных производить геранилгеранилдифосфат из источника углерода. К ним относятся ферменты пути DXP и ферменты пути MEV. Пригодные ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты, известны специалистам в данной области. Примерные ферменты каждого пути описаны ниже и дополнительно описаны, например, в патентной заявке US 2016/0177341 A1. Путь MEV также показан на ФИГ. 1С.
[0098] В определенных вариантах осуществления дополнительные ферменты являются нативными. В предпочтительных вариантах дополнительные ферменты являются гетерологичными. В определенных вариантах осуществления два фермента могут быть объединены в один полипептид.
6.3 Не встречающиеся в природе полипептиды UDP-гликозилтрансферазы и нуклеиновые кислоты
[0099] В другом аспекте здесь представлены не встречающиеся в природе вариантные UDP-гликозилтрансферазы, которые включают модификацию (и) аминокислотных остатков по сравнению с эталонной последовательностью (например, SEQ ID NO: 1) и при этом сохраняют активность как UDP-гликозилтрансфераза для преобразования RebA в RebD и/или стевиозида в RebE. В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе вариантные UDP-гликозилтрансферазы могут включать до 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных замен, делеций дополнения и/или вставки в определенных позициях или позициях аминокислот по сравнению с эталонной последовательностью (например, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе вариантные UDP-гликозилтрансферазы включают любую из описанных здесь вариантных UDP-гликозилтрансфераз, в частности те, которые описаны в разделе 6.2.
[0100] В других аспектах здесь представлены не встречающиеся в природе варианты UDP-гликозилтрансфераз, которые включают модификацию (и) остатков нуклеиновой кислоты по сравнению с эталонной последовательностью (например, SEQ ID NO: 26), и, тем не менее, при трансляции в белок, белок сохраняет активность в качестве UDP-гликозилтрансферазы для преобразования RebA в RebD и/или для преобразования стевиозида в RebE. В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе вариантные UDP-гликозилтрансферазы могут кодировать любую описанную здесь вариантную UDP-гликозилтрансферазу, в частности те, которые описаны в разделе 6.2.
6.4 Клеточные штаммы
[0101] Представленные здесь клетки-хозяева, полезные композиции и способы, включают в себя клетки археи, прокариотические или эукариотические клетки.
[0102] Подходящие прокариотические хозяева включают, в том числе, любую из множества грамположительных, грамотрицательных или грамотрицательных бактерий. Примеры включают, в том числе, клетки, принадлежащие к родам: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonella, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synnecoccus, и Zymomonas. Примеры прокариотических штаммов включают, в том числе: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, and Staphylococcus aureus. В конкретном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli.
[0103] Подходящие архейные хозяева включают, в том числе, клетки, принадлежащие к родам: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobacterium, Pyrococcus, Sulfolobus, и Thermoplasma. Примеры штаммов архей включают, в том числе: Archaeoglobus fulgidus, Halobacterium sp., Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, и Aeropyrum pernix.
[0104] Подходящие эукариотические хозяева включают, в том числе, клетки грибов, клетки водорослей, клетки насекомых и клетки растений. В некоторых вариантах осуществления дрожжи, используемые в представленных способах, включают дрожжи, которые были депонированы в хранилищах микроорганизмов (например, IFO, АТСС и т.д.) и принадлежат, помимо прочих, к родам, Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassezia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis, и Zygozyma.
[0105] В некоторых вариантах осуществления микроб хозяина представляет собой Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis (прежнее название Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans, или Hansenula polymorpha (текущее название Pichia angusta). В некоторых вариантах осуществления микроб хозяина представляет собой штамм рода Candida, например, Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, или Candida utilis.
[0106] В конкретном варианте осуществления микробом-хозяином является штамм Saccharomyces cerevisiae. В некоторых вариантах осуществления хозяином является штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный из группы, состоящей из пекарских дрожжей, СВ8 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, ТА, BG-1, CR-1, SA-1, М-26, Y-904, РЕ-2, РЕ-5, VR-1, BR-1, BR-2, МЕ-2, VR-2, МА-3, МА-4, САТ-1, СВ-1, NR-1, ВТ-1, и AL-1. В некоторых вариантах осуществления микробом-хозяином является штамм Saccharomyces cerevisiae, выбранный из группы, состоящей из РЕ-2, САТ-1, VR-1, BG-1, CR-1 и SA-1. В конкретном варианте осуществления штаммом Saccharomyces cerevisiae является РЕ-2. В другом конкретном варианте осуществления штаммом Saccharomyces cerevisiae является САТ-1. В другом конкретном варианте осуществления штаммом Saccharomyces cerevisiae является BG-1.
[0107] В некоторых вариантах осуществления микроб-хозяин представляет собой микроб, который подходит для промышленной ферментации. В конкретных вариантах осуществления микроб кондиционируется для существования при высокой концентрации растворителя, высокой температуре, расширенном использовании субстрата, ограничении питательных веществ, осмотическом стрессе из-за сахара и солей, кислотности, сульфитного и бактериального загрязнения или их комбинациях, которые являются признанными стрессовыми условиями промышленной ферментативной среды.
6.5 Пути биосинтеза стевиола и стевиолового гликозида
[0108] В некоторых вариантах осуществления путь биосинтеза стевиола и/или путь биосинтеза стевиолового гликозида активируется в предоставленных здесь генетически модифицированных клетках-хозяевах путем конструирования клеток для экспрессии полинуклеотидов и/или полипептидов, кодирующих один или несколько ферментов пути. ФИГ. 2А иллюстрирует примерный путь биосинтеза стевиола. На ФИГ. 2В показан пример пути биосинтеза стевиолового гликозида, начиная со стевиола и заканчивая различными стевиолового гликозидами.
[0109] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью геранилгеранилдифосфатсинтазы (GGPPS). В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью копалилдифосфатсинтазы или энт-копалилпирофосфатсинтазы (CDPS; также называемой энт-копалилпирофосфат-синтазой или CPS). В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью каурен-синтазы (KS; также называемой энт-кауренсинтазой). В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью кауреноксидазы (KO; также называемой энт-каурен-19-оксидазой). В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью стевиолсинтазы (также называемой энт-кауреновой кислотой 13-гидроксилазой или KAH). В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью цитохром-Р450-редуктазы (CPR).
[0110] В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT74G1. В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT76G1. В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT85C2. В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT91D. В некоторых вариантах осуществления представленные здесь генетически модифицированные клетки-хозяева содержат гетерологичный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий активностью UGT40087.
[0111] В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вариант. В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных замен относительно соответствующего полипептида. В некоторых вариантах осуществления вариант может содержать до 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 консервативных аминокислотных замен относительно эталонного полипептида. В определенных вариантах осуществления любая из описанных здесь нуклеиновых кислот может быть оптимизирована для клетки-хозяина, например, оптимизирована по кодонам.
[0112] Типичные нуклеиновые кислоты и ферменты пути биосинтеза стевиола и/или пути биосинтеза стевиолового гликозида описаны ниже.
6.5.1 Геранилгеранилдифосфатсинтазы (GGPPS)
[0113] Геранилгеранилдифосфатсинтазы (ЕС 2.5.1.29) катализируют преобразование фарнезилпирофосфата в геранилгеранилдифосфат (также известный как геранилгеранилпирофосфат). Иллюстративными примерами ферментов являются ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ABD92926), Gibberella fujikuroi (учетный номер САА75568), Mus musculus (учетный номер ААН69913), Thalassiosira pseudonana (учетный номер ХР_002288339), Streptomyces clavuligerus (учетный номер ZP_05004570), Sulfulobus acidocaldarius (учетный номер ВАА43200), Synechococcus sp. (учетный номер АВС98596), Arabidopsis thaliana (учетный номер NP_195399), Blakeslea trispora (учетный номер AFC92798.1) и US 2014/0329281 A1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот GGPPS. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид с последовательностью, идентичной последовательности одного из этих ферментов GGPPS не менее чем на 80%, 85%, 90%, 95%.
6.5.2 Копалилдифосфатсинтазы (CDPS)
[0114] Копалилдифосфатсинтазы (ЕС 5.5.1.13) катализируют преобразование геранилгеранилдифосфата в копалилдифосфат. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ААВ87091), Streptomyces clavuligerus (учетный номер EDY51667), Bradyrhizobium japonicum (учетный номер ААС28895.1), Zea mays (учетный номер AY562490). NM_116512), Arabidopsis thaliana (учетный номер NM_116512), Oryza sativa (учетный номер Q5MQ85.1) и US 2014/0329281 A1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот CDPS. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид с последовательностью, идентичной последовательности одного из этих ферментов CDPS не менее чем на 80%, 95%, 90% или 95%.
6.5.3 Каурен-синтазы (KS)
[0115] Каурен-синтазы (ЕС 4.2.3.19) катализируют преобразование копалилдифосфата в каурен и дифосфат. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Bradyrhizobium japonicum (учетный номер ААС28895.1), Phaeosphaeria sp. (учетный номер 013284), Arabidopsis thaliana (учетный номер Q9SAK2), Picea glauca (учетный номер ADB55711.1) и US 2014/0329281 A1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны представленных здесь в клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот KS. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов KS не менее чем на 80%, 85%, 85%, 90%.
6.5.4 Бифункциональная копалидифосфат-синтаза (CDPS) и каурен-синтаза (KS)
[0116] CDPS-KS бифункциональные ферменты (ЕС 5.5.1.13 и ЕС 4.2.3.19) также могут быть использованы. Наглядные примеры ферментов включают ферменты Phomopsis amygdali (учетный номер BAG30962), Physcomitrella patens (учетный номер BAF61135), Gibberella fujikuroi (учетный номер Q9UVY5.1) и US 2014/0329281 A1, US 2014/0357588 A1, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны представленных здесь в клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%о, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот CDPS-KS. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов CDPS-KS не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%.
6.5.5 Энтакауреноксидазы (KO)
[0117] Энтакауреноксидазы (ЕС 1.14.13.78; также именуемые здесь кауреноксидазами) катализируют преобразование каурена в кауреновую кислоту. Иллюстративные примеры энзимов включают ферменты Oryza sativa (учетный номер Q5Z5R4), Gibberella fujikuroi (учетный номер O94142), Arabidopsis thaliana (учетный номер Q93ZB2), Stevia rebaudiana (учетный номер AAQ63464.1), Pisum sativum (Unip notivot (Unip). Q6XAF4) и US 2014/0329281 A1, US 2014/0357588 A1, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот КО. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов KO не менее чем на 80%, 85%, 90%.
6.5.6 Стевиолсинтазы (KAH)
[0118] Стевиолсинтазы или гидроксилазы кауреновой кислоты (KAH) (ЕС 1.14.13) катализируют преобразование кауреновой кислоты в стевиол. Иллюстративные примеры ферментов включают в себя ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер ACD93722), Stevia rebaudiana (учетный номер 10), Arabidopsis thaliana (учетный номер NP_197872), Vitis vinifera (учетный номер ХР_002282091), Medicago trunculata (учетный номер76С90) и US 2014/0329281 A1, US 2014/0357588 A1, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в клетках и способах, представленных здесь. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот KAH. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов KAH не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%.
6.5.7 Цитохром Р450 редуктазы (CPR)
[0119] Цитохром Р450 редуктазы (ЕС 1.6.2.4) способны содействовать или облегчать описанную выше активность KO и/или KAH. Иллюстративными примерами ферментов являются ферменты Stevia rebaudiana (учетный номер АВВ88839) Arabidopsis thaliana (учетный номер NP_194183), Gibberella fujikuroi (учетный номер САЕ09055), Artemisia annua (учетный номер АВС47946.1) и US 2014/0329281 A1, US 2014/0357588 A1, US 2015/0159188 и WO 2016/038095 A2. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот CPR. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов CPR не менее чем на 80%, 85%, 90%.
6.5.8 UDP гликозилтрансфераза 74G1 (UGT74G1)
[0120] UGT74G1 способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил: стевиол-19-СООН-трансфераза и как уридин-5'-дифосфоглюкозил : стевиол-13-O-глюкозид-19-СООН-трансфераза. Как показано на ФИГ. 2В, UGT74G1 способен преобразовывать стевиол в 19-гликозид. UGT74G1 также способен преобразовывать стевиолмонозид в рубусозид. UGT74G1 также может преобразовывать стевиолбиозид в стевиозид. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты Richman и др., 2005, Plant J. 41: 56-67 и US 2014/0329281 и WO 2016/038095 А2 и учетный номер AAR06920.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот UGT74G1. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов UGT74G1 не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%.
6.5.9 UDP гликозилтрансфераза 76G1 (UGT76G1)
[0121] UGT76G1 способен переносить глюкозный фрагмент в позицию С-3'С-13-О-глюкозы акцепторной молекулы, стевиоловых гликозидов 1,2. Таким образом, UGT76G1 способен функционировать как 5'-дифосфоглюкозил уридин:стевиол-13-O-1,2-глюкозид-С-3'-глюкозилтрансфераза и 5'-дифосфоглюкозил уридин:стевиол-19-O-глюкоза, 13-O-1,2 биозид С-3' глюкозилтрансфераза. Как показано на ФИГ. 2A, UGT76G1 способен преобразовывать стевиолбиозид в RebB. UGT76G1 также способен преобразовывать стевиозид в RebA. UGT76G1 также способен конвертировать RebD в RebM. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты Richman и др., 2005, Plant J. 41: 56-67 и US 2014/0329281 A1 и WO 2016/038095 А2 и учетный номер AAR06912.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот UGT76G1. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов UGT76G1 не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%.
6.5.10 UDP гликозилтрансфераза 85С2 (UGT85C2)
[0122] UGT85C2 способен функционировать как уридин-5'-дифосфоглюкозил: стевиол-13-ОН-трансфераза и уридин-5'-дифосфоглюкозил : стевиол-19-O-глюкозид-13-ОН-трансфераза. Таким образом, как показано на ФИГ. 2В, UGT85C2 способен преобразовывать стевиол в стевиолмонозид, а также способен преобразовывать 19-гликозид в рубусозид. Иллюстративные примеры ферментов включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты Richman и др., 2005, Plant J. 41: 56-67 и US 2014/0329281 A1 и WO 2016/038095 А2 и учетный номер AAR06916.1). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот UGT85C2. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов UGT85C2 не менее чем на 80%), 85%, 90% или 95%.
6.5.11 UDP- гликозилтрансфераза 91D (UGT91D)
[0123] UGT91D способен функционировать в качестве уридин-5'-дифосфоглюкозил : стевиол-13-O-глюкозидтрансферазы, перенося глюкозный фрагмент в позицию С-2 '13-0-глюкозы акцепторной молекулы, стевиол-13-О-глюкозид (стевиолмонозид) для получения стевиобиозида. UGT91D также способен функционировать в качестве уридин-5'-дифосфоглюкозил:рубусозидтрансферазы, перенося глюкозную составляющую в позицию С-2'13-О-глюкозы акцепторной молекулы рубусозида, для получения стевиозида, как показано на ФИГ. 2В. UGT91D также способен переносить глюкозный фрагмент в позицию С-2'19-О-глюкозы RebA, для получения RebD, как показано на ФИГ. 2В. UGT91D также упоминается как UGT91D2, UGT91D2e или UGT91D-like3. Иллюстративные примеры ферментов UGT91D включают ферменты Stevia rebaudiana (например, ферменты UGT с номером доступа АСЕ87855.1, US 2014/0329281 A1, WO 2016/038095 А2 и SEQ ID NO: 7). Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одной из этих нуклеиновых кислот UGT91D. В определенных вариантах осуществления здесь представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов UGT91D не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%.
6.5.12 UDP-гликозилтрансфераза 40087 (UGT40087)
[0124] UGT40087 способен переносить глюкозный фрагмент в позицию С-2'19-О-глюкозы RebA, для получения RebD, как показано на ФИГ. 2В. UGT40087 также способен переносить глюкозный фрагмент в позицию С-2'19-О-глюкозы стевиозида с образованием RebE. Иллюстративные примеры UGT40087 описаны выше в разделе 5.2. Любой описанный здесь вариант UGT40087 может быть использован в описанных здесь композициях и способах. Нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, полезны в представленных здесь клетках и способах. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, последовательность которой не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности одного из ферментов UGT40087. В определенных вариантах осуществления в настоящем документе представлены клетки и способы, использующие нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, с последовательнстью, идентичной последовательности одного из этих ферментов UGT40087 не менее чем на 80%, 85%, 90% или 95%. В конкретных вариантах осуществления в данном документе представлена нуклеиновая кислота, которая кодирует описанный здесь вариант UGT40087.
6.6 Путь MEV для производства FPP и/или GGPP
[0125] В некоторых вариантах осуществления представленная здесь генетически модифицированная клетка-хозяин содержит один или несколько гетерологичных ферментов пути MEV, полезных для образования фарнезилпирофосфата (FPP) и/или геранилгеранил пирофосфата (GGPP). В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который конденсирует ацетоацетил-КоА с ацетил-КоА с образованием HMG-КоА. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который преобразует HMG-КоА в мевалонат. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который фосфорилирует мевалонат до мевалоната 5-фосфата. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который преобразует мевалонат-5-фосфат в мевалонат-5-пирофосфат. В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV содержат фермент, который преобразует мевалонат-5-пирофосфат в изопентенил-пирофосфат.
[0126] В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов пути MEV выбирают из группы, состоящей из ацетил-КоА-тиолазы, ацетоацетил-КоА-синтетазы, HMG-КоА-синтазы, HMG-КоА-редуктазы, мевалонат-киназы, фосфомавалонат-киназы и мевалонат пирофосфат декарбоксилазы. В некоторых вариантах осуществления в отношении фермента пути MEV, способного катализировать образование ацетоацетил-КоА, генетически модифицированная клетка-хозяин содержит либо фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетил-КоА тиолазы; или фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например ацетоацетил-КоА-синтазы. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит фермент, который конденсирует две молекулы ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетил-КоА-тиолазы; и фермент, который конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетоацетил-КоА-синтазы.
[0127] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих более одного фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих два фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих фермент, который может преобразовывать HMG-КоА в мевалонат, и фермент, который может преобразовывать мевалонат в мевалонат 5-фосфат. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих три фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих четыре фермента пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих пять ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих шесть ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или несколько гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих семь ферментов пути MEV. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит множество гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих все ферменты пути MEV.
[0128] В некоторых вариантах генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может преобразовывать изопентенилпирофосфат (IPP) в диметилаллилпирофосфат (DMAPP). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может конденсировать молекулы IPP и/или DMAPP с образованием полипренильного соединения. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который может модифицировать IPP или полипренил, с образованием изопреноидного соединения, такого как фарнезен.
6.6.1 Преобразование ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА
[0129] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать две молекулы ацетил-кофермента А с образованием ацетоацетил-КоА, например, ацетил-КоА-тиолазы. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) и (L20428; Saccharomyces cerevisiae).
[0130] Ацетил-КоА-тиолаза катализирует обратимую конденсацию двух молекул ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, но эта реакция термодинамически неблагоприятна; тиолиз ацетоацетил-КоА предпочтительнее синтеза ацетоацетил-КоА. Ацетоацетил-КоА-синтаза (AACS) (называемая либо ацетил-КоА, либо малонил-КоА-ацилтрансфераза; ЕС 2.3.1.194) конденсирует ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. В отличие от ацетил-КоА-тиолазы, катализируемый AACS синтез ацетоацетил-КоА является по существу благоприятной для энергии реакцией вследствие ассоциированного декарбоксилирования малонил-КоА. Кроме того, AACS не проявляет активности тиолиза против ацетоацетил-КоА, и, таким образом, реакция необратима.
[0131] В клетках-хозяевах, содержащих ацетил-СоА-тиолазу и гетерологичный фермент аденозиндеаминаза (ADA) и/или фосфотрансацетилазу (РТА), обратимая реакция, катализируемая ацетил-СоА-тиолазой, которая способствует тиолизу ацетоацетил-КоА, может привести к большому пулу ацетил-КоА. Ввиду обратимой активности ADA, этот пул ацетил-КоА может, в свою очередь, приводить ADA в направлении обратной реакции преобразования ацетил-КоА в ацетальдегид, тем самым уменьшая преимущества, предоставляемые ADA, по отношению к образованию ацетил-КоА. Точно так же активность РТА обратима, и, таким образом, большой пул ацетил-КоА может стимулировать РТА в направлении обратной реакции преобразования ацетил-КоА в ацетилфосфат. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления, чтобы обеспечить сильное притяжение ацетил-КоА для стимулирования прямой реакции ADA и РТА, в пути MEV генетически модифицированной клетки-хозяина, представленной здесь, используется ацетоацетил-КоА-синтаза для образования ацетоацетил-КоА из ацетил-КоА и малонил-КоА.
[0132] В некоторых вариантах осуществления AACS относится к Streptomyces sp. штамм CL190 (Okamura и др., Proc Natl Acad Sci USA 107 (25): 11265-70 (2010). Репрезентативные нуклеотидные последовательности AACS штамма Streptomyces sp. CL190 включают регистрационный номер АВ540131.1. Репрезентативные последовательности белка AACS Streptomyces sp.штамма CL190 включают регистрационные номера D7URV0, BAJ10048. Другие ацетоацетил-СоА-синтазы, полезные представленных здесь для композиций и способов, включают, в том числе, Streptomyces sp.(АВ183750; KO-3988 BAD86806); S. anulatus strain 9663 (FN178498; САХ48662); Streptomyces sp KO-3988 (AB212624; BAE78983); Actinoplanes sp A40644 (AB113568; BAD07381); Streptomyces sp. С (NZ_ACEW010000640; ZP_05511702); Nocardiopsis dassonvillei DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); Mycobacterium ulcerans Agy99 (NC 008611; YP_907152); Mycobacterium marinum M (NC_010612; YP_001851502); Streptomyces sp. Mg1 (NZ_DS570501; ZP_05002626); Streptomyces sp. AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); S roseosporus NRRL 15998 (NZ_ABYB01000295; ZP_04696763); Streptomyces sp ACTE (NZ_ADFD01000030; ZP_06275834); S. viridochromogenes DSM 40736 (NZ_ACEZ01000031; ZP_05529691); Frankia sp. CcI3 (NC_007777; YP_480101); Nocardia brasiliensis (NC_018681; YP_006812440.1); и Austwickia chelonae (NZ_BAGZ01000005; ZP_10950493.1). Дополнительные подходящие ацетоацетил-КоА-синтазы включают те, которые описаны в публикациях патентных заявок США №2010/0285549 и №2011/0281315, содержание которых полностью включено в качестве ссылки.
[0133] Ацетоацетил-СоА-синтазы, также полезные в представленных здесь композициях и способах, включают те молекулы, которые называются «производными» любой из описанных здесь ацетоацетил-СоА-синтаз. Такое «производное» имеет следующие характеристики: (1) имеет существенную гомологию с любой из описанных здесь ацетоацетил-СоА-синтаз; и (2) способно катализировать необратимую конденсацию ацетил-КоА с малонил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА. Считается, что производное ацетоацетил-СоА-синтазы имеет «существенную гомологию» с ацетоацетил-СоА-синтазой, если аминокислотные последовательности производного составляют не менее чем на 80% и, более предпочтительно, не менее чем на 90% и, наиболее предпочтительно, не менее чем на 95% аналогичны последовательности ацетоацетил-КоА-синтазы.
6.6.2 Преобразование ацетоацетил-КоА в HMG-КоА
[0134] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать ацетоацетил-КоА с другой молекулой ацетил-КоА с образованием 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА (HMG-КоА), например, HMG-КоА-синтазы. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (NC_001145. Комплемент 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (Х96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), и (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphylococcus aureus).
6.6.3 Преобразование ГМГ-КоА в мевалонат
[0135] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать HMG-КоА в мевалонат, например, HMG-КоА-редуктазу. В некоторых вариантах осуществления HMG-КоА-редуктаза представляет собой NADH-использующую гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазу-КоА-редуктазу. Редуктазы HMG-КоА (ЕС 1.1.1.34; ЕС 1.1.1.88) катализируют восстановительное деацилирование (S) -HMG-КоА до (R)-мевалоната и могут быть разделены на два класса, HMGrs класса I и класса II. Класс I включает ферменты эукариотов и большинства архей, а класс II включает редуктазы HMG-КоА некоторых прокариотов и архей. Помимо расхождения в последовательностях, ферменты двух классов также различаются в отношении их специфичности кофактора. В отличие от ферментов класса I, которые используют исключительно NADPH, редуктазы HMG-КоА класса II различаются по способности различать NADPH и NADH. См., например, Hedl и др., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004). Особенности кофакторов для избранных редуктаз HMG-КоА класса II представлены ниже.
[0136] Используемые HMG-КоА редуктазы для представленных здесь композиций и способов включают HMG-КоА редуктазы, которые способны использовать NADH в качестве кофактора, например, HMG-КоА редуктазу из P. mevalonii, A.fulgidus или S. aureus. В конкретных вариантах осуществления HMG-КоА редуктаза способна использовать в качестве кофактора только NADH, например, HMG-КоА редуктазу из P. mevalonii, S. pomeroyi или D. acidovorans.
[0137] В некоторых вариантах осуществления использующая NADH HMG-КоА редуктаза происходит из Pseudomonas mevalonii. Последовательность гена mvaA дикого типа Pseudomonas mevalonii, который кодирует HMG-КоА редуктазу (ЕС 1.1.1.88), была описана ранее. См. Beach and Rodwell, J. Bacteriol. 171: 2994-3001 (1989). Репрезентативные нуклеотидные последовательности mvaA из Pseudomonas mevalonii включают регистрационный номер М24015. Типичные последовательности белка HMG-КоА редуктазы Pseudomonas mevalonii включают регистрационные номера ААА25837, Р13702, MVAA_PSEMV.
[0138] В некоторых вариантах осуществления использующая NADH HMG-КоА редуктаза происходит от Silicibacter pomeroyi. Репрезентативные нуклеотидные последовательности HMG-КоА-редуктазы Silicibacter pomeroyi включают регистрационный номер NC_006569.1. Типичные последовательности белка HMG-КоА редуктазы в Silicibacter pomeroyi включают регистрационный номер YP_164994.
[0139] В некоторых вариантах осуществления использующая NADH HMG-КоА редуктаза происходит от Delftia acidovorans. Типичные нуклеотидные последовательности HMG-КоА-редуктазы Delftia acidovorans включают NC_010002 REGION: комплемент (319980…321269). Типичные последовательности белка HMG-КоА редуктазы Delftia acidovorans включают регистрационный номер YP_001561318.
[0140] В некоторых вариантах осуществления использующая NADH HMG-КоА редуктаза получена из Solanum tuberosum. (Crane и др., J. Plant Physiol. 159:1301-1307 (2002)).
[0141] Использующие NADH HMG-KoA-редуктазы, также полезные в представленных здесь композициях и способах, включают те молекулы, которые называют «производными» любой из описанных здесь использующих NADH HMG-KoA-редуктаз, например, из P. mevalonii. S. pomeroyi и D. acidovorans. Такое «производное» имеет следующие характеристики: (1) имеет существенную гомологию с любой из описанных здесь NDH-использующих HMG-КоА редуктаз; и (2) способно катализировать восстановительное деацилирование (S)-HMG-КоА до (R)-мевалоната, предпочтительно используя в качестве кофактора NADH. Считается, что производное NADH-использующей HMG-КоА-редуктазы имеет «существенную гомологию» с NADH-использующей HMG-КоА-редуктазой, если аминокислотные последовательности производного не менее чем на 80% и, более предпочтительно, не менее чем на 90% и, наиболее предпочтительно, не менее чем на 95% аналогичны последовательности NADH-использующей HMG-КоА редуктазы.
[0142] Используемое здесь выражение «использование NADH» означает, что HMG-КоА-редуктаза, использующая NADH, является селективной в отношении NADH по сравнению с NADPH в качестве кофактора, например, демонстрируя более высокую специфическую активность для NADH, чем для NADPH. В некоторых вариантах осуществления селективность в отношении NADH в качестве кофактора выражается в виде отношения kcat (NADH)/ kcat (NADPH). В некоторых вариантах осуществления NDH-использующая HMG-KoA редуктаза имеет отношение kcat (NADH)/ kcat (NADPH), не менее 5, 10, 15, 20, 25 или более 25. В некоторых вариантах осуществления NADH-использующая HMG-КоА редуктаза использует исключительно NADH. Например, NADH-использующая HMG-КоА редуктаза, которая использует исключительно NADH, отображает некоторую активность с NADH, поставляемым в качестве единственного кофактора in vitro, и не обнаруживает определяемой активности, когда в качестве единственного кофактора предоставляется NADPH. Любой метод определения специфичности кофактора, известный в данной области, может быть использован для идентификации редуктаз HMG-КоА, предпочитающих в качестве кофактора NADH, включая те, которые описаны Kim и др., Protein Science 9: 1226-1234 (2000); и Wilding и др., J. Bacteriol. 182 (18): 5147-52 (2000), содержание которого полностью включено в настоящий документ.
[0143] В некоторых вариантах осуществления изобретения NADH-использующая HMG-КоА редуктаза сконструирована так, чтобы она была селективной в отношении NADH по сравнению с NAPDH, например, посредством сайт-направленного мутагенеза кофактор-связывающего кармана. Методы конструирования NADH-селективности описаны в Watanabe и др., Microbiology 153: 3044-3054 (2007), а методы определения кофакторной специфичности редуктаз HMG-КоА описаны в Kim и др., Protein Sci. 9: 1226-1234 (2000), содержание которого полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0144] В некоторых вариантах осуществления NMH-использующая HMG-КоА редуктаза получена из видов-хозяев, которые нативно включают путь деградации мевалоната, например, из вида-хозяина, который катаболизирует мевалонат в качестве его единственного источника углерода. В этих вариантах осуществления NADH-использующая HMG-КоА-редуктаза, которая обычно катализирует окислительное ацилирование интернализованного (R)-мелоната до (S)-HMG-КоА в его нативной клетке-хозяине, используется для каталитической обратной реакции, то есть восстановительного деацилирования (S)-HMG-КоА до (R)-мевалоната в генетически модифицированной клетке-хозяине, содержащей путь биосинтеза мевалоната. Прокариоты, способные расти на мевалонате как их единственном источнике углерода, были описаны в работах Anderson и др., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach и др., J. Bacteriol. 171:2994- 3001 (1989); Bensch и др., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari и др., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi и др., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi и др., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); и Takatsuji и др., Biochem. Biophys. Res. Commun 10:187-193 (1983), содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0145] В некоторых вариантах осуществления представленных здесь композиций и способов, клетка-хозяин содержит как HMGr, использующий NADH, так и HMG-КоА редуктазу, использующую NADPH. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих NADPH-использующую HMG-КоА редуктазу, включают, в том числе: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphylococcus aureus), (AB015627; Streptomyces sp. KO 3988), (AX128213, предоставление последовательности, кодирующей усеченную HMG-КоА-редуктазу; Saccharomyces cerevisiae), и (NC_001145: комплемент (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae).
6.6.4 Преобразование мевалоната в мевалонат-5-фосфат
[0146] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать мевалонат в мевалонат-5-фосфат, например мевалонат-киназу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (L77688; Arabidopsis thaliana) и (Х55875; Saccharomyces cerevisiae).
6.6.5 Преобразование мевалонат-5-фосфата в мевалонат-5-пирофосфат
[0147] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать мевалонат-5-фосфат в мевалонат-5-пирофосфат, например, фосфомевалонат-киназу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), и (NC_001145. комплемент 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).
6.6.6 Преобразование мевалонат-5-пирофосфата в IPP
[0148] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать мевалонат-5-пирофосфат в изопентенилдифосфат (IPP), например, мевалонат-пирофосфатдекарбоксилазу. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (Х97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium), и (U49260; Homo sapiens).
6.6.7 Преобразование IPP в DMAPP
[0149] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может преобразовывать IPP, генерируемый посредством пути MEV, в диметилаллилпирофосфат (DMAPP), например, изомеразу IPP. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli), и (AF082326; Haematococcuspluvialis).
6.6.8 Полипренильные синтазы
[0150] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипренилсинтазу, которая может конденсировать молекулы IPP и/или DMAPP с образованием полипренильных соединений, содержащих более пяти атомов углерода.
[0151] В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать одну молекулу IPP с одной молекулой DMAPP с образованием одной молекулы геранилпирофосфата («GPP»), например, синтазы GPP. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих такой фермент, включают, в том числе: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AE016877, Locus API 1092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pini), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), и (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).
[0152] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может конденсировать две молекулы IPP с одной молекулой DMAPP или добавлять молекулу IPP к молекуле GPP, чтобы образовать молекулу фарнезилпирофосфата («FPP»), например, синтаза FPP. Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, которые кодируют такой фермент, включают, в том числе: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans 621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens), (KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argentatum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp.sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC_002946, Locus YP 208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), и (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosa Temeculal).
[0153] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который может объединять IPP и DMAPP или IPP и FPP с образованием геранилгеранилпирофосфата (GGPP). Иллюстративные примеры нуклеотидных последовательностей, которые кодируют такой фермент, включают, в том числе: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (ВТ005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus), (AB016044; Mus musculus), (ААВХ01000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa), (NCU20940; Neurospora crassa), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (AB016095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acidocaldarius), (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC_006840,Locus YP 204095; Vibrio fischeri ES114), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides), и (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159).
[0154] Хотя примеры ферментов мевалонатного пути описаны выше, в некоторых вариантах осуществления ферменты пути DXP могут использоваться в качестве альтернативного или дополнительного пути для продуцирования DMAPP и IPP в описанных здесь клетках-хозяевах, композициях и способах. Ферменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты пути DXP, хорошо известны и охарактеризованы в данной области. WO 2012/135591 А2.
6.7 Методы производства стевиоловых гликозидов
[0155] В другом аспекте здесь представлен способ получения стевиолового гликозида путем преобразования одного стевиолового гликозида в другой стевиоловый гликозид с использованием любых описанных здесь UDP-гликозилтрансфераз (например, UGT40087 или любого варианта UGT40087). В определенных вариантах осуществления здесь представлен способ получения RebD, включающий преобразование RebA в RebD с использованием любой из описанных здесь UDP-гликозилтрансфераз, способных преобразовывать RebA в RebD. В определенных вариантах осуществления здесь представлен способ получения RebM, включающий: преобразование RebA в RebD с использованием любой из описанных здесь UDP-гликозилтрансфераз, способных преобразовывать RebA в RebD; и преобразование RebD в RebM с использованием UDP-гликозилтрансферазы, способной преобразовывать RebD в RebM.
[0156] В определенных вариантах осуществления стевиоловый гликозид (например, RebA или RebD) или композиция, содержащая стевиоловый гликозид, может связываться в подходящих условиях с любой описанной здесь UDP-гликозилтрансферазой и UDP-сахаром для получения желаемого стевиолового гликозида (например, RebM). Такие методы могут быть выполнены in vivo или in vitro. Типичные UDP-caxapa включают UDP-гликозу, UDP-ксилозу или UDP-рамнозу.
[0157] В другом аспекте здесь предложен способ получения стевиолового гликозида, включающий стадии: (а) культивирования популяции любой из описанных здесь генетически модифицированных клеток-хозяев, которые способны продуцировать стевиоловый гликозид в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения стевиол-гликозидного соединения; и (b) извлечение указанного стевиол-гликозидного соединения из среды. [0158] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин продуцирует повышенное количество стевиолового гликозида по сравнению с родительской клеткой, не содержащей одну или несколько модификаций, или родительской клеткой, содержащей только поднабор из одной или нескольких модификаций генетически модифицированная клетка-хозяин, но в остальном генетически идентична. В некоторых вариантах осуществления увеличенное количество составляет не менее 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более 100%, как измерено, например, по выходу, производству, продуктивности, в граммах на литр клеточной культуры, миллиграммах на грамм массы сухих клеток, на единицу объема культуры клеток, на единицу массы сухих клеток, на единицу объема культуры клеток в единицу времени или на единицу массы сухих клеток в единицу времени.
[0159] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 10 г на литр ферментационной среды. В некоторых таких вариантах осуществления стевиоловый гликозид получают в количестве от около 10 до около 50 г на литр клеточной культуры, более 15 г на литр клеточной культуры, более 20 г на литр клеточной культуры, более чем 25 г на литр клеточной культуры, более 30 г на литр клеточной культуры, более 35 г на литр клеточной культуры, более 40 г на литр клеточной культуры, более 45 г на литр клеточная культура, или более чем 50 г на литр клеточной культуры.
[0160] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который превышает примерно 50 миллиграммов на грамм массы сухих клеток. В некоторых таких вариантах осуществления стевиоловый гликозид получают в количестве от около 50 до около 1500 миллиграммов, более чем около 100 миллиграммов, более чем около 150 миллиграммов, более чем около 200 миллиграммов, более чем около 250 миллиграммов, более чем около 500 миллиграммов более чем около 750 миллиграммов или более чем около 1000 миллиграммов на грамм массы сухих клеток.
[0161] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет, не менее чем около 10%, не менее чем около 15%, не менее чем около 20%, не менее чем около 25%, не менее чем около 30%, не менее чем около 35%о, не менее чем около 40%, не менее чем около 45%, не менее чем около 50%, не менее чем около 60%, не менее чем около 70%, не менее чем около 80%, не менее чем около 90%, не менее чем примерно в 2 раза, не менее чем примерно в 2,5 раза, не менее чем примерно в 5 раз, не менее чем примерно в 10 раз, не менее чем примерно в 20 раз, не менее чем примерно в 30 раз, не менее чем примерно в 40 раз, не менее чем примерно в 50 раз, не менее чем примерно в 75 раз, не менее чем примерно в 100 раз, не менее чем примерно в 200 раз, не менее чем примерно в 300 раз, не менее чем примерно в 400 раз, не менее чем примерно в 500 раз, или не менее чем примерно в 1000 раз или более выше, чем уровень стевиолового гликозида, продуцируемого родительской клеткой, на единицу объема культуры клеток.
[0162] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет, не менее чем примерно 10%, не менее чем примерно 15%, не менее чем примерно 20%, не менее чем примерно 25%, не менее чем примерно 30%, не менее чем примерно 35%, не менее чем примерно 40%, не менее чем примерно 45%, не менее чем примерно 50%, не менее чем примерно о 60%, не менее чем примерно 70%, не менее чем примерно 80%, не менее чем примерно 90%, не менее чем примерно в 2 раза, не менее чем примерно в 2,5 раза, не менее чем примерно в 5 раз, не менее чем примерно в 10 раз, не менее чем примерно в 20 раз, не менее чем примерно в 30 раз, не менее чем примерно в 40 раз, при не менее чем примерно в 50 раз, не менее чем примерно в 75 раз, не менее чем примерно в 100 раз, не менее чем примерно в 200 раз, не менее чем примерно в 300 раз, не менее чем примерно о в 400 раз, не менее чем примерно в 500 раз, или при не менее чем примерно в 1000 раз или более выше, чем уровень стевиолового гликозида, продуцируемого родительской клеткой, на единицу массы сухих клеток.
[0163] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет, не менее чем примерно 10%, не менее чем примерно 15%о, не менее чем примерно 20%, не менее чем примерно 25%, не менее чем примерно 30%, не менее чем приблизительно 35%, не менее чем приблизительно 40%, не менее чем приблизительно 45%, не менее чем приблизительно 50%, не менее чем приблизительно 60%, не менее чем приблизительно 70%, не менее чем приблизительно 80%, не менее чем приблизительно 90%, не менее чем примерно в 2 раза, не менее чем примерно в 2,5 раза, не менее чем примерно в 5 раз, не менее чем примерно в 10 раз, не менее чем примерно в 20 раз, не менее чем примерно в 30 раз, не менее чем примерно в 40 раз, при не менее чем примерно в 50 раз, не менее чем примерно в 75 раз, не менее чем примерно в 100 раз, не менее чем примерно в 200 раз, не менее чем примерно в 300 раз, не менее чем примерно в 400 раз, не менее чем примерно в 500 раз, или при не менее чем примерно в 1000 раз или более выше, чем уровень стевиолового гликозида, продуцируемого родительской клеткой, на единицу объема культуры клеток в единицу времени.
[0164] В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин продуцирует повышенный уровень стевиолового гликозида, который составляет, не менее чем примерно 10%, не менее чем примерно 15%, не менее чем примерно 20%, не менее чем примерно 25%, не менее чем примерно 30%, не менее чем приблизительно 35%, не менее чем приблизительно 40%, не менее чем приблизительно 45%, не менее чем приблизительно 50%, не менее чем приблизительно 60%, не менее чем приблизительно 70%, не менее чем приблизительно 80%, не менее чем приблизительно 90%, не менее чем примерно в 2 раза, не менее чем примерно в 2,5 раза, не менее чем примерно в 5 раз, не менее чем примерно в 10 раз, не менее чем примерно в 20 раз, не менее чем примерно в 30 раз, не менее чем примерно в 40 раз, при не менее чем примерно в 50 раз, не менее чем примерно в 75 раз, не менее чем примерно в 100 раз, не менее чем примерно в 200 раз, не менее чем примерно в 300 раз, не менее чем примерно в 400 раз, не менее чем примерно в 500 раз, или при не менее чем примерно в 1000 раз или более выше, чем уровень стевиолового гликозида, продуцируемого родительской клеткой, на единицу массы сухих клеток на единицу времени.
[0165] В большинстве вариантов осуществления производство повышенного уровня стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином контролируется репрессирующим соединением. Такой клеткой-хозяином можно легко манипулировать в присутствии репрессирующего соединения. Затем репрессирующее соединение удаляют, чтобы индуцировать продуцирование повышенного уровня стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином. В других вариантах воплощения продуцирование повышенного уровня стевиоловых гликозидов клеткой-хозяином индуцируется изменением условий культивирования, таких как, например, температура роста, составляющие среды и тому подобное.
6.8 Культуральные среды и условия
[0166] Материалы и методы для поддержания и роста микробных культур хорошо известны специалистам в области науки о микробиологии или ферментации (см., например, Bailey и др., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986). Необходимо учитывать подходящую культуральную среду, рН, температуру и требования к аэробным, микроаэробным или анаэробным условиям в зависимости от конкретных требований клетки-хозяина, ферментации и процесса.
[0167] Представленные здесь способы получения стевиоловых гликозидов, можно осуществлять в подходящей культуральной среде (например, с добавлением пантотената или без него) в подходящем контейнере, включая, в том числе, планшет для культивирования клеток, колбу или ферментер. Кроме того, способы могут быть выполнены в любом масштабе ферментации, известном в данной области техники, для поддержания промышленного производства микробных продуктов. Может быть использован любой подходящий ферментер, включая ферментер с мешалкой, ферментер с воздушным транспортом, пузырьковый ферментер или любую их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления с использованием Saccharomyces cerevisiae в качестве клетки-хозяина штаммы можно выращивать в ферментере, как подробно описано у Kosaric, и др., В Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, pages 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germany.
[0168] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда представляет собой любую культуральную среду, в которой может существовать генетически модифицированный микроорганизм, способный продуцировать стевиоловый гликозид, то есть поддерживать рост и жизнеспособность. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда представляет собой водную среду, содержащую ассимилируемые источники углерода, азота и фосфата. Такая среда может также включать соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества. В некоторых вариантах осуществления источник углерода и каждое из основных питательных веществ для клеток добавляют постепенно или непрерывно в ферментационную среду, и каждое требуемое питательное вещество поддерживается по существу на минимальном уровне, необходимом для эффективного усвоения растущими клетками, например, в соответствии с заданной кривой роста клеток, основанной на метаболической или дыхательной функции клеток, которые преобразуют источник углерода в биомассу.
[0169] Подходящие условия и подходящие среды для культивирования микроорганизмов хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах подходящая среда дополняется одним или несколькими дополнительными агентами, такими как, например, индуктор (например, когда одна или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих продукт гена, находятся под контролем индуцибельного промотора), репрессор (например, когда одна или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих продукт гена, находятся под контролем репрессируемого промотора), или селективный агент (например, антибиотик для отбора микроорганизмов, содержащих генетические модификации).
[0170] В некоторых вариантах осуществления источником углерода является моносахарид (простой сахар), дисахарид, полисахарид, неферментируемый источник углерода или одна или несколько их комбинаций. Неограничивающие примеры подходящих моносахаридов включают глюкозу, маннозу, фруктозу, ксилозу, рибозу и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих дисахаридов включают сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, трегалозу, целлобиозу и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих полисахаридов включают крахмал, гликоген, целлюлозу, хитин и их комбинации. Неограничивающие примеры подходящих неферментируемых источников углерода включают ацетат и глицерин.
[0171] Концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде должна способствовать росту клеток, но не должна быть настолько высокой, чтобы подавлять рост используемого микроорганизма. Как правило, ферментационные культуры используют с источником углерода, таким как глюкоза, добавляемым на уровнях для достижения желаемого уровня роста и биомассы, но на неопределяемых уровнях (с пределами обнаружения, составляющими около <0,1 г/л). В других вариантах осуществления концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде составляет более чем примерно 1 г/л, предпочтительно, более чем примерно 2 г/л и, более предпочтительно, более чем примерно 5 г/л. Кроме того, концентрация источника углерода, такого как глюкоза, в культуральной среде обычно составляет менее чем примерно 100 г/л, предпочтительно, менее чем примерно 50 г/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 20 г/л. Отмечается, что ссылки на концентрации компонентов культуры могут относиться как к начальным, так и/или к текущим концентрациям компонентов. В некоторых случаях может оказаться желательным позволить обеднению питательной среды источником углерода во время культивирования.
[0172] Источники ассимилируемого азота, которые можно использовать в подходящей культуральной среде, включают, в том числе, простые источники азота, источники органического азота и сложные источники азота. Такие источники азота включают безводный аммиак, соли аммония и вещества животного, растительного и/или микробного происхождения. Подходящие источники азота включают, в том числе, гидролизаты белка, гидролизаты микробной биомассы, пептон, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, мочевину и аминокислоты. Как правило, концентрация источников азота в культуральной среде составляет более примерно 0,1 г/л, предпочтительно более чем примерно 0,25 г/л и более предпочтительно более чем примерно 1,0 г/л. Однако, помимо определенных концентраций, добавление источника азота в культуральную среду не выгодно для роста микроорганизмов. В результате концентрация источников азота в культуральной среде составляет менее чем примерно 20 г/л, предпочтительно, менее чем примерно 10 г/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 5 г/л. Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно позволить питательной среде исчерпывват источники во время культивирования.
[0173] Эффективная культуральная среда может содержать другие соединения, такие как неорганические соли, витамины, микроэлементы или стимуляторы роста. Такие другие соединения могут также присутствовать в источниках углерода, азота или минеральных веществ в эффективной среде или могут добавляться конкретно в среду.
[0174] Культуральная среда также может содержать подходящий источник фосфата. Такие источники фосфатов включают как неорганические, так и органические источники фосфатов. Предпочтительные источники фосфатов включают, в том числе, фосфатные соли, такие как одно-или двухосновные фосфаты натрия и калия, фосфат аммония и их смеси. Как правило, концентрация фосфата в культуральной среде превышает примерно 1,0 г/л, предпочтительно превышает примерно 2,0 г/л и, более предпочтительно, превышает примерно 5,0 г/л. Однако, помимо определенных концентраций, добавление фосфата в культуральную среду не выгодно для роста микроорганизмов. Соответственно, концентрация фосфата в культуральной среде обычно составляет менее чем примерно 20 г/л, предпочтительно менее чем примерно 15 г/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 10 г/л.
[0175] Подходящая культуральная среда также может включать источник магния, предпочтительно в форме физиологически приемлемой соли, такой как гептагидрат сульфата магния, хотя можно использовать другие источники магния в концентрациях, которые вносят аналогичные количества магния. Как правило, концентрация магния в культуральной среде превышает примерно 0,5 г/л, предпочтительно превышает примерно 1,0 г/л и, более предпочтительно, превышает примерно 2,0 г/л. Однако, помимо определенных концентраций, добавление магния в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов. Соответственно, концентрация магния в культуральной среде обычно составляет менее чем примерно 10 г/л, предпочтительно менее чем примерно 5 г/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 3 г/л. Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно позволить питательной среде исчерпывать источники магния во время культивирования.
[0176] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда может также включать биологически приемлемый хелатирующий агент, такой как дигидрат тринатрийцитрата. В таком случае концентрация хелатирующего агента в культуральной среде превышает примерно 0,2 г/л, предпочтительно превышает примерно 0,5 г/л и, более предпочтительно, превышает примерно 1 г/л. Однако, помимо определенных концентраций, добавление хелатирующего агента в культуральную среду не выгодно для роста микроорганизмов. Соответственно, концентрация хелатирующего агента в культуральной среде обычно составляет менее чем примерно 10 г/л, предпочтительно менее чем примерно 5 г/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 2 г/л.
[0177] Культуральная среда также может изначально включать биологически приемлемую кислоту или основание для поддержания желаемого рН культуральной среды. Биологически приемлемые кислоты включают, в том числе, соляную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и их смеси. Биологически приемлемые основания включают, в том числе, гидроксид аммония, гидроксид натрия, гидроксид калия и их смеси. В некоторых вариантах осуществления используемым основанием является гидроксид аммония.
[0178] Культуральная среда может также включать биологически приемлемый источник кальция, включая, в том числе, хлорид кальция. Как правило, концентрация источника кальция, такого как хлорид кальция, дигидрат, в культуральной среде находится в диапазоне от около 5 мг/л до около 2000 мг/л, предпочтительно в диапазоне от около 20 мг/л до около 1000 мг/л и, более предпочтительно, в диапазоне от около 50 мг/л до около 500 мг/л.
[0179] Культуральная среда также может включать хлорид натрия. Как правило, концентрация хлорида натрия в культуральной среде находится в диапазоне от около 0,1 г/л до около 5 г/л, предпочтительно в диапазоне от около 1 г/л до около 4 г/л, и более предпочтительно в диапазоне от примерно 2 г/л до примерно 4 г/л.
[0180] В некоторых вариантах осуществления культуральная среда также может включать следовые металлы. Такие микроэлементы можно добавлять в культуральную среду в виде исходного раствора, который для удобства можно приготовить отдельно от остальной культуральной среды. Как правило, количество такого раствора микроэлементов, добавляемого в культуральную среду, превышает примерно 1 мл/л, предпочтительно превышает примерно 5 мл/л и более предпочтительно превышает примерно 10 мл/л. Однако, помимо определенных концентраций, добавление микроэлементов в культуральную среду не выгодно для роста микроорганизмов. Соответственно, количество такого раствора микроэлементов, добавляемого в культуральную среду, обычно составляет менее чем примерно 100 мл/л, предпочтительно менее примерно 50 мл/л и, более предпочтительно, менее чем примерно 30 мл/л. Отмечается, что кроме добавления микроэлементов в исходный раствор некоторые компоненты могут добавляться отдельно, каждый в пределах диапазонов, каждый независимо от количеств компонентов, определяемых вышеуказанными диапазонами раствора микроэлементов.
[0181] Питательная среда может включать другие витамины, такие как пантотенат, биотин, кальций, пантотенат, инозит, пиридоксин-HCl и тиамин-HCl. Такие витамины можно добавлять в культуральную среду в виде исходного раствора, который для удобства можно приготовить отдельно от остальной культуральной среды. Однако, помимо определенных концентраций, добавление витаминов в культуральную среду не способствует росту микроорганизмов.
[0182] Описанные здесь способы ферментации могут быть реализованы в обычных режимах культивирования, которые включают, в том числе, периодический, подпиточный, рециркуляцию клеток, непрерывный и полунепрерывный режимы. В некоторых вариантах осуществления ферментация проводится в периодическом режиме с подпиткой. В таком случае некоторые компоненты среды истощаются во время культивирования, в том числе пантотенат во время производственной стадии ферментации. В некоторых вариантах осуществления культура может быть дополнена относительно высокими концентрациями таких компонентов на начальном этапе, например, на стадии производства, так что рост и/или продуцирование стевиолового гликозида поддерживается в течение периода времени, прежде чем потребуются добавления. Предпочтительные диапазоны этих компонентов поддерживаются во всей культуре путем внесения дополнений по мере истощения уровней культурой. Уровни компонентов в культуральной среде могут контролироваться, например, путем периодического отбора проб культуральной среды и анализа концентраций. Альтернативно, после того как разработана стандартная процедура культивирования, дополнения могут делаться через определенные интервалы времени, соответствующие известным уровням в определенные моменты времени во всей культуре. Как будет понятно специалистам в данной области, скорость потребления питательного вещества увеличивается во время культивирования с увеличением плотности клеток среды. Кроме того, чтобы избежать введения чужеродных микроорганизмов в культуральную среду, добавление выполняют с использованием методов асептического добавления, известных в данной области. Кроме того, во время культивирования может быть добавлено небольшое количество антипенного агента.
[0183] Температура культуральной среды может быть любой температурой, подходящей для роста генетически модифицированных клеток и/или производства стевиолового гликозида. Например, перед инокуляцией культуральной среды инокулятом культуральную среду можно довести до температуры и поддерживать при температуре в диапазоне от около 20°С до около 45°С, предпочтительно до температуры в диапазоне от около 25°С до около 40°С и, более предпочтительно, в диапазоне от около 28°С до около 32°С.
[0184] рН культуральной среды можно контролировать путем добавления в культуральную среду кислоты или основания. В таких случаях, когда аммиак используется для контроля рН, он также удобно служит источником азота в культуральной среде. Предпочтительно рН поддерживают на уровне от около 3,0 до около 8,0, более предпочтительно от около 3,5 до около 7,0 и, наиболее предпочтительно, от около 4,0 до около 6,5.
[0185] В некоторых вариантах осуществления концентрация источника углерода, такая как концентрация глюкозы, в культуральной среде контролируется во время культивирования. Концентрация глюкозы в культуральной среде может контролироваться с использованием известных методов, таких как, например, использование ферментного теста с глюкозооксидазой или жидкостная хроматография высокого давления, которые можно использовать для контроля концентрации глюкозы в супернатанте, например, безклеточный компонент питательной среды. Как указывалось ранее, концентрация источника углерода должна поддерживаться ниже уровня, при котором происходит ингибирование роста клеток. Хотя такая концентрация может варьироваться от организма к организму, для глюкозы в качестве источника углерода ингибирование роста клеток происходит при концентрациях глюкозы, превышающих примерно 60 г/л, и может быть легко определено путем испытания. Соответственно, когда глюкоза используется в качестве источника углерода, глюкоза предпочтительно подается в ферментер и поддерживается в количестве ниже пределов обнаружения. Альтернативно, концентрация глюкозы в культуральной среде поддерживается в диапазоне от около 1 г/л до около 100 г/л, более предпочтительно в диапазоне от около 2 г/л до около 50 г/л и, еще больше предпочтительно, в диапазоне от около 5 г/л до около 20 г/л. Хотя концентрация источника углерода может поддерживаться в желаемых уровнях путем добавления, например, по существу чистого раствора глюкозы, приемлемо и может быть предпочтительным поддерживать концентрацию источника углерода в культуральной среде путем добавления аликвот исходного культуральная среда. Использование аликвот исходной культуральной среды может быть желательным, поскольку концентрации других питательных веществ в среде (например, источников азота и фосфата) могут поддерживаться одновременно. Аналогично, концентрации микроэлементов можно поддерживать в культуральной среде путем добавления аликвот раствора микроэлементов.
[0186] Другие подходящие ферментационные среды и способы описаны, например, в материалах патентной заявки WO 2016/196321.
6.9 Ферментационные композиции
[0187] В другом аспекте здесь представлены ферментационные композиции, содержащие генетически модифицированную клетку-хозяина, описанную здесь, и стевиоловые гликозиды, полученные из генетически модифицированной клетки-хозяина. Ферментационные композиции могут дополнительно содержать среду. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат генетически модифицированную клетку-хозяина и дополнительно содержат RebA, RebD и RebM. В определенных вариантах осуществления предлагаемые здесь ферментационные композиции содержат RebM в качестве основного компонента стевиоловых гликозидов, полученных из генетически модифицированной клетки-хозяина. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebA, RebD и RebM в соотношении не менее 1:7:50. В других вариантах осуществления ферментационные композиции содержат (RebA + RebD) и RebM в соотношении не менее 8:50. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebA, RebD и RebM в соотношении не менее от 1:7:50 до 1:100:1000. В других вариантах осуществления ферментационные композиции содержат (RebA + RebD) и RebM в соотношении не менее от 8:50 до 101:1000. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции содержат соотношение не менее от 1:7:50 до 1:200:2000. В других вариантах осуществления ферментационные композиции содержат (RebA + RebD) и RebM в соотношении не менее от 8:50 до 201:2000. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA, RebD и RebM основано на общем содержании этих трех стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином и средой. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA, RebD и RebM основано на общем содержании этих трех стевиоловых гликозидов в среде. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA, RebD и RebM основано на общем содержании этих трех стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином.
[0188] В других вариантах осуществления ферментационные композиции содержат генетически модифицированную клетку-хозяина и дополнительно содержат RebA и RebM. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebA и RebM при соотношении RebA: RebM не менее 1:50. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebA и RebM при соотношении RebA : RebM, не менее от 1:50 до 1:1000. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebA и RebM при соотношении RebA : RebM, не менее от 1:50 до 1:2000. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином и средой. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов в среде. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином.
[0189] В дополнительном варианте осуществления ферментационные композиции содержат генетически модифицированную клетку-хозяина и дополнительно содержат RebD и RebM. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebD и RebM при соотношении RebD : RebM не менее 7:50. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebD и RebM при соотношении RebD : RebM, не менее от 7:50 до 7:100. В некоторых вариантах осуществления ферментационные композиции содержат RebD и RebM при соотношении RebD : RebM, не менее от 7:50 до 7:200. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebA, RebD и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином и средой. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebD и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов в среде. В некоторых вариантах осуществления соотношение RebD и RebM основано на общем содержании этих двух стевиоловых гликозидов, которые связаны с генетически модифицированной клеткой-хозяином.
[0190] В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции, представленные здесь, содержат RebM2 на неопределяемом уровне. В определенных вариантах осуществления ферментационные композиции, представленные здесь, содержат не встречающиеся в природе стевиоловые гликозидына необнаруживаемом уровне. В определенных вариантах осуществления предлагаемые здесь ферментационные композиции, когда они подвергаются ГХ-хроматографии, не дают пика «стевиол + 2 глюкоза» между пиком RebA и RebB на детектируемом уровне.
6.10 Восстановление стевиоловых гликозидов
[0191] Как только стевиоловый гликозид продуцируется клеткой-хозяином, он может быть извлечен или выделен для последующего использования с использованием любых подходящих способов разделения и очистки, включая любые подходящие способы выделения и очистки стевиолового гликозида, известные в данной области техники. Подходящие способы описаны, например, в патентах США №№7,838,044 и 8,981,081; Патентные заявки США №№14/603,941, 14/033,563, 14/362,275, 14/613,615, 14/615,888; Заявки РСТ №PCT/US12/070562 и PCT/US14/031129. Содержание этих документов включено в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте. В некоторых вариантах осуществления водную фазу, содержащую стевиоловый гликозид, отделяют от ферментации центрифугированием. В других вариантах осуществления водная фаза, содержащая гликозид стевиола, самопроизвольно отделяется от ферментации. В других вариантах осуществления водную фазу, содержащую стевиолгликозид, отделяют от ферментации путем добавления деэмульгатора и/или зародышеобразователя в реакцию ферментации. Иллюстративные примеры деэмульгаторов включают флокулянты и коагулянты. Иллюстративные примеры зародышеобразователей включают капли самого стевиоловых гликозидови органические растворители, такие как додекан, изопропилмиристрат и метилолеат.
[0192] Стевиоловый гликозид, продуцируемый в этих клетках, может присутствовать в супернатанте культуры и/или ассоциироваться с клетками-хозяевами. В вариантах осуществления, где стевиоловый гликозид связан с клеткой-хозяином, извлечение стевиолового гликозида может включать способ пермеабилизации или лизиса клеток. Альтернативно или одновременно стевиоловый гликозид в культуральной среде может быть извлечен с использованием процесса восстановления, включающего, в том числе этим, хроматографию, адсорбционную хроматографию, экстракцию, экстракцию растворителем, мембранное разделение, электродиализ, обратный осмос, дистилляцию, химическую дериватизацию и кристаллизацию.
[0193] В некоторых вариантах осуществления стевиоловый гликозид отделяют от других продуктов, которые могут присутствовать в водной фазе. В некоторых вариантах осуществления разделение достигается с использованием адсорбции, дистилляции, газожидкостной экстракции (отгонки), жидкостной экстракции (экстракции растворителем), вакуумной экстракции, выпаривания, ультрафильтрации и стандартных хроматографических методов. Другие подходящие ферментационные среды и способы описаны, например, в публикациях патентных заявок США №2016/0185813, 2017/0190728, WO/2017/093895. Другие подходящие способы описаны, например, в патентах США №№7,838,044 и 8,981,081; Патенты США №№14/603,941, 14/033,563, 14/362,275, 14/613,615 и 14/615,888; Заявки РСТ №PCT/US 12/070562 и PCT/US 14/031129. Содержание этих документов включено в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.
[0194] В определенных вариантах осуществления извлеченный гликозид (ы) стевиола можно использовать в различных конечных продуктах. Например, очищенное соединение RebM или композицию, содержащую RebM, можно использовать в любых потребляемых продуктах, таких как пищевые продукты, фармацевтические продукты, диетические добавки или пищевые добавки. В конкретных вариантах осуществления расходный материал, содержащий RebM, получают путем культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebM; и извлечение указанного соединения RebM из среды.
[0195] Композиции подсластителей, используемые в данном описании, означают композиции, которые содержат, не менее один сладкий компонент в комбинации, не менее с одним другим веществом, таким как, например, другой подсластитель или добавка.
[0196] Используемые здесь подслащивающие композиции означают вещества, которые контактируют с полостью рта человека или животного, включая вещества, которые попадают в рот и впоследствии выбрасываются изо рта, и вещества, которые пьют, едят, проглатывают или проглатывают иным образом, и безопасны для употребления человеком или животными при использовании в общепринятом диапазоне.
[0197] Термин «подслащенные композиции», как он используется здесь, означает вещества, которые содержат как подслащивающую композицию, так и композицию подсластителя или подсластителя. Например, напиток без подсластителя является типом подслащиваемой композиции. Композицию подсластителя, содержащую RebM, полученную способом по настоящему изобретению, и эритрит можно добавлять в подслащенный напиток, тем самым обеспечивая подслащенный напиток. Подслащенный напиток представляет собой разновидность подслащенной композиции. Подходящие подслащивающие композиции, подслащенные композиции и способы их получения описаны, например, в заявке PCT/US 12/070562, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0198] В одном варианте осуществления подсластитель, содержащий RebM, получают путем культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebM; и извлечение указанного соединения RebM из среды. В другом варианте осуществления композицию подсластителя, содержащую, не менее одно другое вещество и RebM, получают путем культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebM; и извлечение указанного соединения RebM из среды. В другом варианте осуществления подслащенную композицию, содержащую RebM, получают путем культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebM; и извлечение указанного соединения RebM из среды. Один из вариантов осуществления включает способ получения композиции подсластителя, включающий объединение не менее одного другого вещества с RebM, полученным в результате культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для делая РебМ; и извлечение указанного соединения RebM из среды. Другой вариант осуществления включает способ получения подслащенной композиции, включающий объединение, не менее одной подслащенной композиции с RebM, полученным в процессе культивирования популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для делая РебМ; и извлечение указанного соединения RebM из среды.
6.11 Способы изготовления генетически модифицированных клеток
[0199] Также здесь предоставлены способы получения клетки-хозяина, которая была генетически сконструирована таким образом, чтобы включать одну или несколько описанных выше модификаций, например, одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих UGT40087, и/или ферменты пути биосинтеза, например, для стевиол-гликозидного соединения. Экспрессия гетерологичного фермента в клетке-хозяине может быть достигнута путем введения в клетки-хозяева нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент под контролем регуляторных элементов, которые допускают экспрессию в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой внехромосомную плазмиду. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому клетки-хозяина.
[0200] Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, могут быть введены в клетку-хозяина любым способом, известным специалисту в данной области, без ограничения, (см., например, Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel и др., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). Типичные способы включают, в том числе, сферопластирование, электропорацию, опосредованную PEG 1000 трансформацию и опосредованную ацетатом лития или хлоридом лития трансформацию.
[0201] Активность фермента в клетке-хозяине может быть изменена путем модификации транскрипции гена, который кодирует фермент.Это может быть достигнуто, например, путем изменения числа копий нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент (например, путем использования вектора экспрессии с большим или меньшим числом копий, содержащего нуклеотидную последовательность, или путем введения дополнительных копий нуклеотидной последовательности в геном клетки-хозяина или путем удаления или разрушения нуклеотидной последовательности в геноме клетки-хозяина), путем изменения порядка кодирования последовательностей на полицистронной мРНК оперона или расщепления оперона на отдельные гены, каждый из которых имеет свои собственные элементы управления, или путем увеличения силы промотора или оператора, с которым функционально связана нуклеотидная последовательность. Альтернативно или в дополнение, активность фермента в клетке-хозяине может быть изменена путем изменения уровня трансляции мРНК, которая кодирует фермент. Это может быть достигнуто, например, путем изменения стабильности мРНК, изменения последовательности сайта связывания рибосомы, изменения расстояния или последовательности между сайтом связывания рибосомы и стартовым кодоном последовательности, кодирующей фермент, модификации всей межцистронной области, расположенной «выше» или ближе к 5'-стороне стартового кодона области, кодирующей фермент, стабилизации 3'-конца транскрипта мРНК с помощью шпилек и специализированных последовательностей, модификации использования фермента кодоном, изменения экспрессии используемых тРНК редких кодонов в биосинтезе фермента и/или повышении стабильности фермента, например, посредством мутации его кодирующей последовательности.
[0202] Активность фермента в клетке-хозяине можно изменять несколькими способами, включая, в том числе, экспрессию модифицированной формы фермента, которая проявляет повышенную или пониженную растворимость в клетке-хозяине, экспрессию модифицированной формы фермента, в котором отсутствует домен, через который ингибируется активность фермента, экспресси экспрессию модифицированной формы фермента, который имеет более высокую или более низкую Kcat или более низкую или более высокую Km для субстрата, или экспрессию модифицированной формы фермента, который более или менее подвержен влиянию обратной связи или регуляции прямой связи другой молекулой в пути.
[0203] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, используемая для генетической модификации клетки-хозяина, содержит один или несколько селектируемых маркеров, полезных для отбора трансформированных клеток-хозяев и для оказания селективного давления на клетку-хозяина для поддержания чужеродной ДНК.
[0204] В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер представляет собой маркер устойчивости к антибиотику. Иллюстративные примеры маркеров устойчивости к антибиотикам включают, в том числе, BLA, NAT1, PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, продукт гена dhfr мыши, НРН, DSDA, KANR, и продукты гена SH BLE. Продукт гена BLA из E.coli придает устойчивость к бета-лактамным антибиотикам (например, цефалоспоринам узкого спектра, цефамицинам и карбапенемам (эртапенем), цефамандолу и цефоперазону) и ко всем антиграм-отрицательным бактериальным пенициллинам, кроме темоциллина; продукт гена NAT1 из S. noursei придает устойчивость к нурсеотрицину; продукт гена PAT из S. viridochromogenes Tu94 придает устойчивость к биалофосу; продукт гена AUR1-C из Saccharomyces cerevisiae придает устойчивость к ауэробазидину А (AbA); продукт гена PDR4 придает устойчивость к церуленину; продукт гена SMR1 придает устойчивость к сульфометурон метилу; генный продукт CAT из транспозона Tn9 придает устойчивость к хлорамфениколу; продукт гена dhfr мыши придает устойчивость к метотрексату; генный продукт HPH Klebsiella pneumonia придает устойчивость к гигромицину В; генный продукт DSDA E.coli позволяет клеткам расти на чашках с D-серином в качестве единственного источника азота; ген KANR транспозона Tn903 придает устойчивость к G418; и продукт гена SH BLE из Streptoalloteichus hindustanus придает устойчивость к зеоцину (блеомицину). В некоторых вариантах осуществления маркер устойчивости к антибиотику удаляют после выделения описанной здесь генетически модифицированной клетки-хозяина.
[0205] В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер спасает ауксотрофию (например, ауксотрофию питания) в генетически модифицированном микроорганизме. В таких вариантах осуществления родительский микроорганизм включает функциональное нарушение в одном или нескольких генных продуктах, которые функционируют в пути биосинтеза аминокислоты или нуклеотида, и нефункциональные, которые делают родительскую клетку неспособной к росту в среде без добавления одного или нескольких питательных веществ. Такие генные продукты включают, в том числе, генные продукты HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, МЕТ15, TRP1, ADE2 и URA3 в дрожжах. Ауксотрофный фенотип может быть затем спасен путем трансформации родительской клетки с помощью экспрессионного вектора или конструкции хромосомной интеграции, кодирующей функциональную копию разрушенного генного продукта, и генерируемая генетически модифицированная клетка-хозяин может быть выбрана на основе потери ауксотрофного фенотипа родительской клетки. Использование генов URA3, TRP1 и LYS2 в качестве селектируемых маркеров имеет заметное преимущество, поскольку возможны как положительный, так и отрицательный отбор. Положительный отбор осуществляется ауксотрофной комплементацией мутаций URA3, TRP1 и LYS2, тогда как отрицательный отбор основывается на специфических ингибиторах, а именно, на 5-фтор-оротовой кислоте (FOA), 5-фторантраниловой кислоте и аминоадипиновой кислоте (аАА), которые, соответственно, предотвращают рост прототрофных штаммов, но допускают рост мутантов URA3, TRP1 и LYS2 соответственно. В других вариантах осуществления селектируемый маркер устраняет другие нелетальные недостатки или фенотипы, которые могут быть идентифицированы известным способом отбора.
[0206] Здесь описаны конкретные гены и белки, используемые в излагаемых здесь способах, композициях и организмах; однако следует признать, что абсолютная идентичность таким генам не является необходимой. Например, изменения в конкретном гене или полинуклеотиде, содержащем последовательность, кодирующую полипептид или фермент, могут быть выполнены и проверены на активность. Обычно такие изменения включают консервативные мутации и молчащие мутации. Такие модифицированные или мутированные полинуклеотиды и полипептиды могут быть подвергнуты скринингу на экспрессию функционального фермента с использованием способов, известных в данной области.
[0207] Из-за врожденной дегенерации генетического кода другие полинуклеотиды, которые кодируют по существу те же или функционально эквивалентные полипептиды, также могут быть использованы для клонирования и экспрессии полинуклеотидов, кодирующих такие ферменты.
[0208] Как будет понятно специалистам в данной области техники, может быть выгодно модифицировать кодирующую последовательность для усиления ее экспрессии в конкретном хозяине. Генетический код избыточен с 64 возможными кодонами, но большинство организмов обычно используют подмножество этих кодонов. Кодоны, которые чаще всего используются у вида, называются оптимальными кодонами, а те, которые не используются очень часто, классифицируются как редкие или малоиспользуемые кодоны. Кодоны могут быть заменены, чтобы отразить предпочтительное использование кодонов хозяина, в процессе, который иногда называют «оптимизацией кодонов» или «контролем смещения кодонов видов». Оптимизацию кодонов для других клеток-хозяев можно легко определить с помощью таблиц использования кодонов или можно выполнить с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, такого как CodonOp (www.idtdna.com/CodonOptfrom) от Integrated DNA Technologies.
[0209] Оптимизированные кодирующие последовательности, содержащие кодоны, предпочтительные для конкретного прокариотического или эукариотического хозяина (Murray и др., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508), могут быть получены, например, для увеличения скорости трансляции или для получения рекомбинантных РНК-транскриптов, имеющих желательные свойства, такие как более длительный период полураспада, по сравнению с транскриптами, полученными из неоптимизированной последовательности. Стоп-кодоны трансляции также могут быть изменены, с тем чтобы отражать предпочтения хозяина. Например, типичными стоп-кодонами для S. cerevisiae и млекопитающих являются UAA и UGA соответственно. Типичным стоп-кодоном для однодольных растений является UGA, тогда как насекомые и кишечная палочка обычно используют UAA в качестве стоп-кодона. (Dalphin и др., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).
[0210] Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что из-за вырожденной природы генетического кода множество молекул ДНК, различающихся по своим нуклеотидным последовательностям, могут быть использованы для кодирования данного фермента в раскрытии сущности изобретения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая описанные выше биосинтетические ферменты, упоминается здесь просто для иллюстрации варианта осуществления изобретения, и раскрытие включает молекулы ДНК любой последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности полипептидов и белки ферментов, используемых в раскрытии сущности изобретения. Подобным образом, полипептид обычно может переносить одну или несколько аминокислотных замен, делеций и вставок в своей аминокислотной последовательности без потери или значительной потери желаемой активности. Раскрытие сущности изобретения включает такие полипептиды с аминокислотными последовательностями, отличными от описанных здесь специфических белков, при условии, что модифицированные или вариантные полипептиды обладают ферментативной анаболической или катаболической активностью эталонного полипептида. Кроме того, аминокислотные последовательности, кодируемые показанными здесь последовательностями ДНК, просто иллюстрируют варианты осуществления изобретения.
[0211] Кроме того, настоящим раскрытием сущности изобретения охватываются гомологи ферментов, полезных для представленных здесь композиций и способов. В некоторых вариантах осуществления два белка (или область белков) являются по существу гомологичными, когда аминокислотные последовательности имеют идентичность не менее чем приблизительно 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Чтобы определить процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают под оптимальные цели сравнения (например, могут быть введены пробелы в одной или обеих первой и второй аминокислотной или нуклеиновой кислотной последовательности для оптимального выравнивания, а негомологичные последовательности могут не учитываться для целей сравнения). В одном варианте осуществления длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет не менее 30%, обычно не менее 40%, более типично не менее 50%, еще более типично не менее 60% и еще более типично не менее 70%, 80%, 90%, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных позициях или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция во второй последовательности, тогда молекулы в этой позиции являются идентичными (в данном контексте, «идентичность» аминокислоты или нуклеиновой кислоты эквивалентна «гомология» аминокислоты или нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций, совместно используемых последовательностями, с учетом количества промежутков и длины каждого промежутка, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.
[0212] Когда термин «гомологичный» используется в отношении белков или пептидов, признается, что позиции остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой такую замену, в которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В целом, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процентная идентичность последовательности или степень гомологии могут быть скорректированы в сторону увеличения, с тем чтобы скорректировать консервативный характер замены. Средства для выполнения этой регулировки хорошо известны специалистам в данной области техники, (см., например, Pearson W.R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89).
[0213] Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) серии (S), треонин (Т); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), аланин (А), валин (V) и 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).
[0214] Гомология последовательности для полипептидов, которая также упоминается как процент идентичности последовательности, обычно измеряется с использованием программного обеспечения для анализа последовательности. Типичным алгоритмом сравнения последовательности молекул с базой данных, содержащей большое количество последовательностей из разных организмов, является компьютерная программа BLAST. При поиске в базе данных, содержащей последовательности из большого числа различных организмов, обычно сравнивают аминокислотные последовательности.
[0215] Кроме того, любой из генов, кодирующих вышеуказанные ферменты (или любые другие, упомянутые здесь (или любые регуляторные элементы, которые контролируют или модулируют их экспрессию), может быть оптимизирован методами генной / белковой инженерии, такими как направленная эволюция или рациональный мутагенез, которые известны специалистам в данной области. Такое действие позволяет специалистам в данной области техники оптимизировать ферменты для экспрессии и активности в дрожжах.
[0216] Кроме того, гены, кодирующие эти ферменты, могут быть идентифицированы из других видов грибов и бактерий и могут быть экспрессированы для модуляции этого пути. Разнообразные организмы могут служить источниками для этих ферментов, включая, в том числе, Saccharomyces spp., включая S. cerevisiae и S. uvarum, Kluyveromyces spp., включая K. thermotolerans, K. lactis, и K. marxianus, Pichia spp., Hansenula spp., включая H. polymorpha, Candida spp., Trichosporon spp., Yamadazyma spp., включая Y. spp. stipitis, Torulaspora pretoriensis, Issatchenkia orientalis, Schizosaccharomyces spp., включая S. pombe, Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., или Ustilago spp. Источники генов от анаэробных грибов включают, в том числе, Piromyces spp., Orpinomyces spp., или Neocallimastix spp. Источники прокариотических ферментов, которые полезны, включают, в том числе, Escherichia. coli, Zymomonas mobilis, Staphylococcus aureus, Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Lactococcus spp., Enterobacter spp., и Salmonella spp.
[0217] Способы, известные специалистам в данной области, могут быть пригодны для идентификации дополнительных гомологичных генов и гомологичных ферментов. Как правило, аналогичные гены и/или аналогичные ферменты могут быть идентифицированы с помощью функционального анализа и будут иметь функциональные сходства. Методы, известные специалистам в данной области, могут подходить для идентификации аналогичных генов и аналогичных ферментов. Например, методы для идентификации гомологичных или аналогичных UDP-гликозилтрансфераз, РТА или любых генов, белков или ферментов биосинтетического пути могут включать, в том числе, клонирование гена с помощью ПЦР с использованием праймеров на основе опубликованной последовательности гена / представляющего интерес фермента или путем вырожденной ПЦР с использованием вырожденных праймеров, предназначенных для амплификации консервативной области среди представляющего интерес гена. Кроме того, специалист в данной области может использовать методы для идентификации гомологичных или аналогичных генов, белков или ферментов с функциональной гомологией или сходством. Методы включают исследование клетки или клеточной культуры на предмет каталитической активности фермента с помощью ферментных анализов in vitro в отношении указанной активности (например, как описано здесь или в работе Kiritani, K. Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970), затем выделение фермента с указанной активностью посредством очистки, определение белковой последовательности фермента с помощью таких методов, как деградация Эдмана, конструирование праймеров ПЦР с вероятной последовательностью нуклеиновой кислоты, амплификация указанной последовательности ДНК посредством ПЦР и клонирование указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Методы для идентификации гомологичных или сходных генов и/или гомологичных или сходных ферментов, аналогичных генов и/или аналогичных ферментов или белков также включают сравнение данных, касающихся гена-кандидата или фермента, с базами данных, такими как BRENDA, KEGG или MetaCYC. Ген-кандидат или фермент-кандидат могут быть идентифицированы в вышеупомянутых базах данных в соответствии с приведенными здесь идеями.
7. ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение основного штамма дрожжей, способного к высокому потоку фарнезилпирофосфата (FPP) и изопреноида фарнезена.
[0218] Штамм-продуцент фарнезена был создан из штамма Saccharomyces cerevisiae дикого типа (CEN.PK2) путем экспрессии генов мевалонатного пути (ФИГ. 1С) под контролем промоторов GAL1 или GAL10. Этот штамм включал в себя следующие хромосомно интегрированные гены мевалонатного пути из S. cerevisiae: ацетил-КоА-тиолазу, HMG-КоА-синтазу, HMG-КоА-редуктазу, мевалонат-киназу, фосфомевалонат-киназу, мевалонат-пирофосфат-декарбоксилазу и IP-IP-фосфолазу: IPP. Все описанные здесь гены были оптимизированы по кодонам с использованием общедоступных или других подходящих алгоритмов. Кроме того, штамм содержал шесть копий фарнезен-синтазы из Artemisinin annua, также под контролем промоторов GAL1 или GAL10. Штамм также содержал делецию гена GAL80 и дополнительную копию GAL4 под промотором GAL4oc, где кодирующая последовательность гена GAL4 Saccharomyces cerevisiae находится под регуляторным контролем «оперативно-конститутивной» версии его нативного промотора (PGAL4oc; см. например, Griggs & Johnston (1991) PNAS 88 (19): 8597-8601). Наконец, ген ERG9, кодирующий сквален-синтазу, подавляется путем замены нативного промотора промотором дрожжевого гена МЕТ3 (Westfall et al. PNAS 2012).
Пример 2. Генерация базового штамма дрожжей, способного к высокому потоку RebA.
[0219] На ФИГ. 2А показан типичный путь биосинтеза от FPP до стевиола. На ФИГ. 2В показан типичный путь биосинтеза от стевиола до гликозида RebM. Чтобы преобразовать описанный выше штамм фарнезенового основания с высоким потоком в изопреноидный каурен С-20, в геном интегрировали шесть копий геранилгеранилпирофосфат синтазы (GGPPS), а затем по четыре копии копалилдифосфатсинтазы и кауренсинтазы. На этом этапе шесть копий фарнезен-синтазы удаляли из штамма. Как только было подтверждено, что новый штамм вырабатывает энткаурен, в геном встраивали оставшиеся гены для преобразования энткаурена в RebA. В таблице 4 перечислены все гены и промоторы, используемые для преобразования FPP в RebA. Каждый ген после каурен-синтазы объединяли с одной копией, за исключением фермента Sr.KAH, который имел две копии (таблица 4). Штамм, содержащий все гены, описанные в Таблице 1, в основном продуцировал RebA. Фермент UGT91D_like3 обладает низкой активностью по преобразованию RebA в Ребаудиозид D (RebD). Измерили, что одна копия UGT91D_like3 способна преобразовывать приблизительно (3%) RebA в штамме в RebD in vivo в дрожжевом штамме, описанном выше (ФИГ. 3 и таблица 5). UGT76G1 затем может преобразовывать RebD в конечный продукт RebM.
Пример 3. Получение штамма для скрининга новых ферментов UDP-гликозилтрансферазы (UGT) для преобразования RebA в RebD.
[0220] Для создания штамма скрининга для быстрого скрининга на преобразование RebA в RebD in vivo в описанный выше штамм RebA вставили посадочную площадку. Посадочная площадка состояла из 500 п.н. последовательностей ДНК, нацеленных на локус, на обоих концах конструкции до геномной области ниже открытой рамки считывания ALG1 (ФИГ. 4). Внутри посадочная площадка содержала промотор PGAL1 и дрожжевой терминатор, фланкирующий сайт узнавания эндонуклеазы (F-CphI).
Пример 4. Скрининг генов UGT, которые с высокой эффективностью преобразуют RebA в RebD in vivo
[0221] Более ста ферментов UGT, полученных из банка Genbank, оптимизировали по ко донам для оптимальной экспрессии в S. cerevisiae и синтезировали с последовательностью 60 п.н., гомологичной PGAL1, и дрожжевым терминатором, фланкирующим последовательности F-CphI в описанной выше посадочной площадке. Каждый синтезированный ген UGT тестировали индивидуально, с одной копией, на предмет способности преобразовывать RebA в RebD in vivo в описанном выше штамме дрожжей. Дрожжи трансформировали донорской ДНК UGT и плазмидой, содержащей эндонуклеазу F-CphI, для разрезания ДНК в посадочной площадке. Правильные интеграции проверяли с помощью ПЦР колоний с использованием обратного праймера, внутреннего по отношению к конкретному гену UGT в каждой трансформации, и универсального прямого праймера в конце ORF ALG1.
Пример 5. Методы дрожжевой трансформации
[0222] Каждую ДНК-конструкцию интегрировали в Saccharomyces cerevisiae (CEN.PK2) с помощью стандартных методов молекулярной биологии с оптимизированной трансформацией в ацетат лития (LiAc). Вкратце, клетки выращивали в течение ночи в среде пептондекстрозы (YPD) дрожжевого экстракта при 30°С при встряхивании (200 об./мин), разбавляли до OD600 0,1 в 100 мл YPD и выращивали до OD600 0,6-0,8. Для каждой трансформации 5 мл культуры собирали центрифугированием, промывали в 5 мл стерильной воды, снова центрифугировали, ресуспендировали в 1 мл 100 мМ LiAc и переносили в пробирку для микроцентрифугирования. Клетки центрифугировали (13000 мкг) в течение 30 секунд, супернатант удаляли, и клетки ресуспендировали в трансформирующей смеси, состоящей из 240 мкл 50% ПЭГ, 36 мкл 1 М LiAc, 10 мкл ДНК вареной спермы лосося и 74 мкл. донорской ДНК. Для трансформаций, которые требовали экспрессии эндонуклеазы F-Cph1, донорская ДНК включала плазмиду, несущую ген F-CphI, экспрессированный под промотором дрожжевого TDH3. Таким образом сайт узнавания эндонуклеазы F-CphI в посадочной площадке разрезается, чтобы облегчить интеграцию гена UGT. После теплового шока при 42°С в течение 40 минут клетки извлекали в течение ночи в среде YPD перед посевом на селективные среды. Интеграцию ДНК подтверждали с помощью ПЦР колоний с праймерами, специфичными для интеграции.
Пример 6. Условия культивирования дрожжей
[0223] Колонии дрожжей, которые, как было установлено, содержат ожидаемый ген UGT, отбирали в 96-луночные микротитрационные планшеты, содержащие среду Bird Seed Media (BSM, первоначально описанные van Hoek и др., Biotechnology and Bioengineering 68 (5), 2000, pp. 517-523) с 20 г/л сахарозы и 37,5 г/л сульфата аммония. Клетки культивировали при 30°С в высокотемпературном микропланшетном инкубаторе, встряхивая при 1000 об./мин, при влажности 80% в течение 3 дней, пока культуры не достигли истощения углерода. Насыщенные ростом культуры субкультивировали в свежие чашки, содержащие BSM с 40 г/л сахарозы и 150 г/л сульфата аммония, отбирая 14,4 мкл из насыщенных культур и разбавляя в 360 мкл свежей среды. Клетки в производственной среде культивировали при 30°С в высокопроизводительном микротитровальном шейкере при 1000 об./мин и влажности 80% в течение дополнительных 3 дней перед экстракцией и анализом. По завершении весь клеточный бульон разбавляли 360 мкл 100% этанола, герметично закрывали фольгой и встряхивали при 1250 об./мин в течение 30 минут для экстракции стевиоловых гликозидов. В новую пробирку для анализа объемом 1,1 мл добавляли 490 мкл смеси 50:50 этанол : вода и 10 мкл смеси культа/этанол. Смесь центрифугировали для осаждения любых твердых веществ, 400 мкл раствора переносили на новую пластину объемом 1,1 мл и анализировали с помощью LC-MS.
Пример 7. Аналитические методы
[0224] Образцы анализировали с помощью LC-MS масс-спектрометра (АВ QTrap 4000) с использованием Sigma Ascentis Express Peptide ES-C18 (5 см, 2,1 мм, 2,7 мкм; часть №53301-U) со следующим градиентом (подвижная фаза А: 0,1% муравьиная кислота в Н2О; подвижная фаза В: 0,1%) муравьиная кислота в ацетонитриле):
[0225] Масс-спектрометр работал в режиме мониторинга множественных реакций с отрицательными ионами. Каждый изомер ребаудиозида идентифицировали по времени удерживания, определенному по аутентичному стандарту, и переходу MRM:
[0226] Площади пиков на хроматограмме от масс-спектрометра использовали для получения калибровочной кривой. Молярное отношение соответствующих соединений (то есть RebA, RebD, RebM) определяли путем количественного определения количества в молях каждого соединения посредством внешней калибровки с использованием аутентичного стандарта и затем с использованием соответствующих соотношений.
[0227] ЯМР-анализ проводили для подтверждения того, что RebM продуцировали из генетически модифицированных штаммов. После ферментации штаммы удаляли из ферментационного бульона. Стевиоловые гликозиды очищали от оставшейся жидкой среды. Могут быть использованы любые подходящие методы для анализа ЯМР, включая те, которые описаны, например, в материалах патентных заявок WO / 2017/093895 и WO / 2016/028899.
Пример 8. Установлено, что ферменты UGT обладают высокой активностью по преобразованию RebA в RebD.
[0228] Было обнаружено, что шесть UGT-ферментов обладают высокой активностью по преобразованию RebA в RebD (ФИГ. 3). Эффективность этих ферментов сравнивали с двумя другими ферментами UGT, описанными в литературе, Os_UGT_91C1 (то есть EUGT11, описанным в материалах патентной заявки WO 2013/022989 А2) и Sl_UGT_101249881 (то есть UGTSL2 в WO2014 / 193888 А1), которые также преобразуют RebA в REBD. В Таблице 5 приведено медианное соотношение [микромоль Reb (D + М) / микромоль (А + D + М)]; RebA, RebD и RebM измеряли in vivo, как описано выше. Это соотношение является мерой эффективности преобразования RebA в RebD. Сумма uM [Reb (А + D + М)] измеряет общее количество RebA, которое когда-либо производилось в клетке. Сумма uM [Reb (D + М)] измеряет общее количество RebD, которое когда-либо производилоь в клетке. На ФИГ. 5a-i показаны хроматограммы RebE, RebA, RebD, RebM и RebM2 для всех генов UGT на ФИГ. 3 и в Таблице 2. RebM2 является изомером RebM с единственной неправильной глюкозной связью. RebM2 имеет Glcβ (1-2) [Glcβ (1-6)] Glcβ1-в позиции углерода 19 (СООН) вместо желаемого Glcβ (1-2) [Glcβ (1-3)] Glcβ1- для RebM.
[0229] Используя методы ЯМР, описанные в Примере 7, образец продукта, полученный из штамма, содержащего UGT40087, сравнивали со стандартным RebM с помощью 1D и 2D ЯМР спектроскопии. Наложение 1D и 2D ЯМР спектров, зарегистрированных в метаноле и пиридине, подтвердило, что оба соединения идентичны. Детальная интерпретация данных 2D ЯМР и сравнение с данными, опубликованными в литературе, подтвердили, что оба образца представляли собой RebM.
[0230] В сосуде для ферментации объемом 0,5 или 2,0 литра UGT40087, экспрессированный на фоне разных штаммов, продуцировал RebA, RebD и RebM в соотношении примерно RebA : RebD : RebM примерно 1:7:50.
Пример 9: Специфичность ферментов в Таблице 5, которые преобразуют RebA в RebD.
[0231] Ферменты, перечисленные в таблице 5, способны катализировать преобразование RebA в RebD путем добавления глюкозного сахара в позиции С-2'19-О-глюкозы RebA посредством образования бета-1,2-гликозидной связи. В некоторых вариантах осуществления для биотехнологического производства RebM в гетерологичном хозяине желательно продуцировать RebM (1) с высокой чистотой и (2) без получения каких-либо «неприродных» стевиоловых гликозидов. Любой коммерческий продукт, вероятно, потребует чрезвычайно высокой чистоты, чтобы обеспечить наилучший профиль вкуса и соответствовать множеству человеческих пищевых стандартов. Присутствие стевиоловых гликозидов, отличных от RebM, вероятно, увеличит стоимость последующей обработки для получения высокочистого RebM. Если имеются значительные количества не-RebM стевиоловых гликозидов, это может потенциально поставить под угрозу конечную чистоту продукта RebM. В определенных вариантах осуществления может быть выгодным, чтобы гетерологичные ферменты не продуцировали никаких «неприродных» стевиоловых гликозидов. «Неприродный» стевиоловый гликозид определяется здесь как любой стевиоловый гликозид, который, как известно, не встречается в природе в растении Stevia rebaudiana.
[0232] По причинам, описанным выше, все ферменты, перечисленные в Таблице 5, исследовали на предмет их профиля примесей, чтобы определить, производили ли они какие-либо неожиданные или неприродные стевиоловые гликозиды, которые не показаны на РИС 2В. Дополнительно анализировали хроматографические следы для более длительного времени удерживания для всех ферментов, перечисленных в Таблице 2. Из всех ферментов с эффективностью преобразования выше 50% единственными ферментами, которые не давали неожиданных продуктов, были UGT40087 и Os_UGT_91C1 (EUGT11). Как и ожидалось, UGT91D_like3 не давал неожиданных пиков на хроматограмме.
[0233] Среди ферментов с эффективностью преобразования выше 50% хроматографические следы этих ферментов продуцировали один или несколько неожиданных пиков, которые связаны с не встречающимся в природе гликозидом. Например, хроматографический след Ob_UGT91B1_like дает неожиданный пик (стевиол + 2 глюкоза) между пиком RebA и пиком RebB при времени удерживания около 6,61 минуты. Интенсивность неожиданного пика Ob_UGT91B1_like была как минимум в 31 раз выше, чем у пика RebA. См. ФИГ. 9в. Неожиданный пик (стевиол + 2 глюкоза) отсутствует в хроматографическом следе от родительского контрольного штамма (с UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1 и UGT91D_like3) или от штамма, содержащего UGT40087. См. ФИГ. 9б и 9в. В другом примере хроматографический след Hv_UGT_V1 дает неожиданный пик (стевиол + 2 глюкоза) между пиком RebA и пиком RebB при времени удерживания около 6,61 минуты. Интенсивность неожиданного пика Hv_UGT_V1 была на 0,6 раза ниже, чем у пика RebA. В другом примере хроматографический след Sl_UGT_101249881 дает неожиданный пик (стевиол + 2 глюкоза) между пиком RebA и пиком RebB при времени удерживания около 6,67 минут. Интенсивность неожиданного пика Sl_UGT_101249881 была примерно в 1,11 раза выше, чем у пика RebA. В другом примере хроматографический след Sr.UGT_g252778 дает неожиданный пик (стевиол + 2 глюкоза) между пиком RebA и пиком RebB при времени удерживания около 6,67 минут. Интенсивность неожиданного пика Sr.UGT_g252778 была примерно на 0,96 раза ниже, чем у пика RebA. Некоторые из этих ферментов также дают дополнительные неожиданные пики. Хроматографические следы для Hv_UGT_V1, Sl_UGT_101249881 и Sr.UGT_g252778 опущены.
[0234] Эти результаты показывают, что по сравнению с двумя ферментами UGT40087 и Os_UGT_91C1 (EUGT11) другие три фермента с более чем 50%-ной эффективностью преобразования А в D (т.е. Hv_UGTV1, SI_UGT_101249881 и Sr.UGT_g252778) могут катализировать дополнительные реакции, потенциально продуцирующие стевиоловые гликозиды, которые обычно не образуются на пути к RebM на растении Stevia Rebaudiana.
Пример 10. Активность фермента UGT40087 специфична для позиции С-2'стевиоловых гликозидов 19-О-глюкозы.
[0235] UGT40087 катализирует реакцию добавления второго сахарного фрагмента к позиции С-2'19-О-глюкозы либо стевиозида, либо RebA. Как показано на ФИГ. 5а и 5i, родительский контрольный штамм без UGT40087 (как описано в Примере 2) способен вырабатывать RebA, но не выявляет определяемых количеств RebE, RebD или RebM. Добавление UGT40087 в родительскую клетку теперь приводит к обнаруживаемому количеству RebE, что указывает на то, что UGT40087 катализирует добавление второго фрагмента глюкозы к позиции С-2'19-О-глюкозы в связи бета-1,2 стевиозид, для получения RebE. Кроме того, два новых пика для RebD и RebM появляются на хроматограмме для штамма, содержащего UGT40087, в то время как пик для RebA значительно снижается по сравнению с родительским штаммом без UGT40087. Следовательно, UGT40087 способен катализировать добавление второй глюкозной группы к позиции С-2'19-О-глюкозы в бета-1,2-связи ребаудиозида А с ребаудиозидом D. Присутствие UGT76G1 в штамме затем катализирует окончательное добавление глюкозы для преобразования RebD в RebM.
[0236] Чтобы проверить способность добавлять сахар в позиции С-2'13-О-глюкозы в бета-1,2-связи стевиолмонозида или рубусозида, изготовили базовый штамм, который несет высокий поток только к рубусозиду. Базовый штамм рубузозида генетически идентичен базовому штамму RebA, описанному в Примере 2, за исключением того, что базовый штамм рубусозида не содержит фермент UGT91D_like3. Как показано в Таблице 7, штамм на основе рубусозида, который имеет UGT74G1, UGT85C2 и UGT76G1, способен производить только 19-гликозид, стевиолмонозид и рубусозид. Добавление UGT40087 к этому штамму не меняет этот профиль. Если UGT40087 был способен добавлять сахар в позиции С-2' 13-О-глюкозы в бета-1,2-связи стевиолмонозида или рубусозида, то должны быть обнаруживаемые количества либо стивиолбиозида, либо стивиозида, либо обоих. Стевиолбиозид, стевиозид, а также RebA видны, когда штамм трансформируется UGT91D_like3, который способен добавлять сахар в позиции С-2'13-О-глюкозы в бета-1,2-связи как стевиолмонозида, так и рубусозида.
[0237] EUGT 11 (Os_UGT_91C1) ранее был охарактеризован другими исследователями для катализирования добавления второго сахарного фрагмента в позиции С-2' либо гликозида 19-О-стевиола, либо гликозида 13-О-стевиола. См. ФИГ. 5 патентной заявки WO 2013/022989. Как отмечено выше, UGT40087, по-видимому, не катализирует добавление сахара в позиции С-2' 13-О-глюкозы в бета-1,2-связи стевиолмонозида или рубусозида на определяемом уровне. Эти результаты показывают, что UGT40087 является UDP-гликозилтрансферазой, которая функционально различима и дает другие результаты по сравнению с EUGT11.
Пример 11. Проектирование UGT-химер путем замены N-концевых доменов.
[0238] Растительные UDP-гликозилтрансферазы (UGT) имеют высоко консервативные белковые структуры, даже если они имеют относительно низкую гомологию аминокислотной последовательности. Эти UGT, которые принимают так называемую структурную складку GT-B, состоят из двух доменов, грубо разрушающихся в средней точке их первичных аминокислотных последовательностей. N-концевой домен представляет собой акцепторный домен сахара, который в основном определяет субстратную специфичность. Как и ожидалось, этот домен является более вариабельным доменом с точки зрения его аминокислотной последовательности, отражая разнообразные субстраты, которые могут быть гликозилированы UGT. Более консервативным С-концевым доменом является донорный домен сахара, с которым связана UDP-глюкоза. Два домена обычно связаны гибким линкером, создавая идеальную область для расщепления белка для схем замены доменов (ФИГ. 6). Учитывая природу высоко консервативной доменной структуры UGT, домены из любых двух UGT могут быть рекомбинированы для изменения специфичности субстрата или усиления желаемой функции, такой как каталитическая активность. В этом примере мы исследовали роль N-концевого домена UGT40087 в придании субстратной специфичности, то есть активности преобразования RebA в RebD путем конструирования нескольких химер UGT путем замены домена.
[0239] Общий подход, который можно было бы использовать для разработки эксперимента по перестановке доменов, включает следующие этапы: 1) выбор пар перестановки кандидатов, 2) выбор сайта перестановки доменов для создания химеры между парой UGT (с возможностью мутировать С-концевой домен для улучшения взаимодействия с целевым субстратом и N-концевым доменом), и 3) создание, развитие и тестирование химерных белков на предмет требуемой активности. Этот подход был использован в этом примере для замены домена, как описано ниже.
[0240] В качестве родителей для конструирования химер выбрали четыре UGT: UGT40087 (SEQ ID №11), UGT Si91Dlike (SEQ ID №12), OS_UGT_91C1 (SEQ ID №8) и 91Dlike3 (SEQ ID №7), N-концевой домен UGT40087 использовался для замены N-концевых доменов Si91Dlike, OS_UGT_91C1 и 91Dlike3, создавая три химеры с общей идентичностью последовательностей 97%, 79% и 71% относительно UGT40087 соответственно.
[0241] SWISS-MODEL использовали для генерации структурных моделей для всех четырех UGT. Точные положения аминокислот («сайты обмена») выбрали на основе структурных выравниваний и выравниваний последовательностей. Чтобы минимизировать возмущение трехмерного сворачивания химерных белков, гибкий участок, расположенный между N- и С-концевыми доменами, которые составляют две отдельные половины фермента (ФИГ. 6), использовали для обмена местами. Gly215 и Leu216 (номера аминокислот относятся к UGT40087) в этом регионе высоко консервативны во всех UGT, включая четыре UGT в этом Примере. Следовательно, два домена разделили между этими двумя остатками для замены домена (ФИГ. 6).
[0242] Чтобы проверить эффекты перестановок доменов, эксперименты проводили на штаммах дрожжей, которые являются генетически идентичными, за тем исключением, что штаммы дрожжей включают разные UGT. Эти штаммы дрожжей, однако, генетически отличаются от тех, которые используются при скрининге разнообразия UGT, описанном в Примере 4. Общие методы, описанные в Примерах 4-7, использовали для трансформации штаммов, культивирования и анализа. Коэффициенты преобразования RebA в RebD для различных схем обмена доменами показаны в Таблице 8 ниже.
[0243] UGT40087 разделяет 90%, 54% и 36% общей идентичности последовательностей с Si91Dlike, Os_UGT_91C1 и 91Dlike3 соответственно. За исключением 91Dlike3, который имеет приблизительно 40% идентичных последовательностей в N- и С-концевых последовательностях в отношении UGT40087, химеры N-концевого домена UGT40087 и С-концевые домены Si91Dlike и Os_UGT_91C1 активны в преобразовании RebA в RebD (Таблица 8). Несмотря на то, что Si91Dlike не имеет обнаруживаемой активности, замена его N-концевого домена доменом UGT40087 перенесоа всю активность UGT40087, что указывает на то, что N-концевой домен UGT40087 важен для преобразования RebA в RebD.
[0244] Выравнивания четырех родительских UGT также выявляют шесть N-концевых аминокислотных остатков (V11, I12, Р55, Е90, S203, Е223 и V413 в UGT40087; ФИГ. 8 - выравнивание последовательности), которые являются общими для двух активных ферментов (UGT40087 и Os_UGT_91C1) для преобразования RebA в RebD, но отличаются от таковых в двух неактивных ферментах (Si91Dlike и 91Dlike3).
Пример 12. Разработка вариантов UGT путем замены N-концевых петель
[0245] Сравнение смоделированных структур UGT40087 и Os_UGT_91C1 выявило четыре петли, которые обладают значительными конформационными различиями в N-концевом акцепторном домене сахара. Расположение петель показано на ФИГ. 6. Чтобы идентифицировать петли, которые могут способствовать превосходной активности UGT40087 по преобразованию RebA в RebD, каждую из этих петель поменяли местами в двух белках для генерации в общей сложности 12 вариантов UGT. Разработали две версии loop_3 и loop_4 для учета двух возможных длин петли. Подробные проекты приведены в Таблицах 9 и 10.
[0246] В таблице 9 аминокислотная последовательность с идентификационным номером последовательности между двумя аминокислотными остатками с индексами представляет собой область петли, замененную с Os_UGT_91C на основание UGT40087. Два аминокислотных остатка с индексами, смежными с областью замененной петли из Os_UGT_91C, и номера индексов соответствуют аминокислотным остаткам и аминокислотной позиции UGT40087, соответственно, до включения области измененной петли. В новых химерных UGT, перечисленных в Таблице 9, область перестановочной петли из Os_UGT_91C заменила соответствующую область петли основания UGT40087.
[0247] Отмечено, что аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 27, область с измененной петлей, интегрированной в UGT40087_loop1, является модифицированной версией первоначальной петли 1 Os_UGT_91C1. Более конкретно, 12-й аминокислотный остаток в последовательности SEQ ID NO: 27 представляет собой пролин (вместо аргинина, который присутствует в соответствующей позиции в исходной петле 1 Os_UGT_91C, имеющей SEQ ID NO: 8). Таким образом, в UGT40087_loop1 имеется одна аминокислотная замена, пролин в положении 51, по сравнению с исходной последовательностью UGT40087, имеющей SEQ ID NO: 11. Положение замещенного пролина в положении 51 в UGT40087_loop1 показано жирным шрифтом в Таблице 9.
[0248] В Таблице 10 аминокислотная последовательность с идентификационным номером последовательности между двумя аминокислотными остатками с индексами представляет собой область петли, замененную UGT40087 на основание Os_UGT_91C1. Два аминокислотных остатка с индексами, смежными с областью подкачки петли из UGT40087, и номера индексов соответствуют аминокислотным остаткам и аминокислотным положениям Os_UGT_91C1, соответственно, до включения области подкачки петли. В новых химерных UGT, перечисленных в таблице 10, область перестановочной петли из UGT40087 заменила соответствующую область петли в базе OSUGT91C1.
[0249] Отмечается, что аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 28, области с замененной петлей, интегрированной в Os_UGT_91C1_loop1, представляет собой модифицированную версию оригинальной петли 1 UGT40087. Более конкретно, 12-й аминокислотный остаток в последовательности SEQ ID NO: 28 представляет собой аргинин (вместо пролина, который присутствует в соответствующем положении в исходной петле 1 UGT40087, имеющей SEQ ID NO: 11). Таким образом, в Os_UGT_91C1_loop1 имеется одна аминокислотная замена, аргинин в положении 58, по сравнению с исходной последовательностью Os_UGT_91C1, имеющей SEQ ID NO: 8. Положение замещенного аргинина в положении 58 в Os_UGT_91C1_loop1 выделено жирным шрифтом в Таблице 10.
[0250] Вариантные белки синтезировали с помощью Twist Bioscience с последовательностью в 60 п.н., гомологичной промотору GAL1, и дрожжевым терминатором, фланкирующим последовательности F-CphI в посадочной площадке, описанной в Примере 4. Каждый синтезированный вариант UGT тестировали индивидуально как отдельную хромосомную копию на предмет активности в преобразовании RebA в RebD на том же фоне штаммов, что и в Примере 11 для экспериментов по замене химер доменом UGT. Для создания штаммов ДНК-доноры химеры UGT и плазмиду, содержащую эндонуклеазу F-CphI, трансформировали в клетки-хозяева дрожжей. Правильные интеграции проверяли верены с помощью ПЦР колоний с использованием обратного праймера, внутреннего по отношению к конкретным генам UGT, и универсального прямого праймера в конце локуса интеграции. Подтвержденные штаммы тестировали на преобразование RebA в RebD, как описано выше.
[0251] С UGT40087 в качестве родителя все варианты с циклической заменой были активны при преобразовании RebA в RebD, за исключением UGT40087_loop4_2 (Таблица 11). Loop4_2 - это длинная последовательность, которая расположена близко к интерфейсу домена N- и С-конца, и ее замена может создать существенное возмущение для общей структуры варианта. Среди всех активных вариантов идентичность N-концевой последовательности к UGT40087 варьируется от 84% (Loop4_1) до 99% (Loop1).
[0252] С Os_UGT_91C1 в качестве родителя, большинство вариантов с циклической заменой также показали активность в преобразовании RebA в RebD (таблица 12). Опять же, обмен Loop4_2 отменил действие, поддерживая гипотезу о том, что его замена может повлиять на структурную целостность варианта. Примечательно, что включение Loop4_1 привело к увеличению коэффициента преобразования RebA в RebD (с 88% до 97%), что указывает на то, что Loop4_1 ответственен за обеспечение превосходной активности UGT40087. Кроме того, результаты экспериментов по замене петель с обоими белками в качестве родителей также показали, что эти области петель важны для придания различий в активности и субстратной специфичности UGT, обладающих активностью RebA к RebD, и дополнительную замену вариантов петли гомолога или мутагенеза этих областей петли можно использовать для генерации улучшенных вариантов UGT для преобразования RebA в RebD.
[0253] Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в этом описании, включены сюда посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки. Хотя вышеизложенное изобретение было описано в некоторых деталях в целях иллюстрации и примера для ясности понимания, специалистам в данной области техники будет легко понять в свете идей этого изобретения, что некоторые изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения.
Claims (92)
1. Генетически модифицированная клетка-хозяин для производства одного или более стевиоловых гликозидов, содержащая гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую UDP-гликозилтрансферазу, содержащую аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 не менее 80%.
2. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 1, которая способна преобразовывать ребаудиозид A (RebA) в ребаудиозид D (RebD) с эффективностью, превышающей 90%, 95%, 96% или 97%.
3. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 1, в которой UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
4. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой UDP-гликозилтрансфераза способна к бета 1,2-гликозилированию С2' позиции 19-O глюкозы стевиолового гликозида.
5. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 13, по меньшей мере, 80%.
6. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой UDP-гликозилтрансфераза кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность SEQ ID NO: 13.
7. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза представляет собой полипептид, имеющий функциональный домен с идентичностью последовательности функционального домена SEQ ID. NO: 1 или SEQ ID NO: 11 не менее 80%.
8. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 5, в которой функциональный домен представляет собой акцепторный домен сахара.
9. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 6, где акцепторный домен сахара расположен на N-конце UDP-гликозилтрансферазы.
10. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит акцепторный домен сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
11. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит акцепторный домен сахара, где аминокислотная последовательность акцепторного домена сахара имеет идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 по меньшей мере 84%.
12. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 11, где UDP-гликозилтрансфераза содержит:
(a) аминокислотную последовательность loop1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, последовательность SEQ ID NO: 28 или вариантную аминокислотную последовательность loop1, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loopl в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(b) аминокислотную последовательность 1оор2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантную аминокислотную последовательность 1оор2, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop2 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(c) аминокислотную последовательность loop3_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантную аминокислотную последовательность loop3_1, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_1 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(d) аминокислотную последовательность loop3_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантную аминокислотную последовательность loop3_2 в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению loop3_2 в SEQ ID NO: I или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(e) аминокислотную последовательность 1оор4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 или вариантную аминокислотную последовательность 1оор4_1, в позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует местоположению 1оор4_1 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно;
(f) аминокислотную последовательность 1оор4_2 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 в позиции, которая соответствует местоположению 1оор4_2 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно; или
(g) любую комбинацию от (а) до (f).
13. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 11, в которой любая из вариантной аминокислотной последовательности loop1, вариантной аминокислотной последовательности 1оор2, вариантной аминокислотной последовательности loop3_1, вариантной аминокислотной последовательности loop 3_2 и вариантной аминокислотной последовательности 1оор4_1 получена из соответствующих им позиций петли другой UDP-гликозилтрансферазы, отличной от SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, где другая UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 не менее 80%.
14. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 13, где другая UDP-гликозилтрансфераза способна к бета-1,2-гликозилированию С'2 позиции 19-O-глюкозы стевиолового гликозида.
15. Генетически модифицированная клетка-хозяин по п. 13, в которой другой UDP-гликозилтрансферазой является Os_UGT_91C1.
16. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит:
(а) акцепторный домен сахара другой UDP-гликозилтрансферазы, содержащей аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности не менее 80% по отношению к последовательности акцепторного домена сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11; и
(b) аминокислотную последовательность 1оор4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 в местоположении другой UDP-гликозилтрансферазы, которое соответствует расположению 1оор4_1 в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, соответственно.
17. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой UDP-гликозилтрансфераза содержит последовательность SEQ ID NO: 22 в качестве акцепторного домена сахара.
18. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, по меньшей мере, 80%, и имеет аминокислотную последовательность 1оор4_1 последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 в позиции, которая соответствует местоположению 1оор4_1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11 соответственно.
19. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит последовательность SEQ ID NO: 25.
20. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит один или несколько из следующих аминокислотных остатков:
(a) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 11 в SEQ ID NO: 11;
(b) изолейцин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 12 в SEQ ID NO: 11;
(c) пролин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 55 в SEQ ID NO: 11;
(d) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 90 в SEQ ID NO: 11;
(e) серин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 203 в SEQ ID NO: 11;
(f) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 223 в SEQ ID NO: 11; или
(g) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 413 в SEQ ID NO: 11,
где позиции аминокислот UDP-гликозилтрансферазы, которые соответствуют позициям аминокислот SEQ ID NO: 11, определяются выравниванием последовательности.
21. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит аминокислотную последовательность, имеющую SEQ ID NO: 24.
22. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где UDP-гликозилтрансфераза содержит донорный домен сахара, где донорный домен сахара содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью домена донора сахара SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11, по меньшей мере, 80%.
23. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где донорный домен сахара расположен на С-конце UDP-гликозилтрансферазы.
24. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, способная продуцировать RebD.
25. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, способная продуцировать ребаудиозид М (RebM).
26. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, которая способна продуцировать в RebM и RebM2 в соотношении не менее 10:1, 100:1 или 1000:1.
27. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин продуцирует необнаружимый уровень RebM2.
28. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин способна преобразовывать стевиозид в ребаудиозид Е (RebE).
29. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути для получения стевиола.
30. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути для получения стевиолового гликозида.
31. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути для получения RebA.
32. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути для получения RebM.
33. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где генетически модифицированная клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути для получения RebE.
34. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают геранилгеранил-дифосфат синтазу.
35. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают копалил-дифосфат-синтазу.
36. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают энт-кауренсинтазу.
37. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути содержат кауреноксидазу.
38. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают гидроксилазу кауреновой кислоты.
39. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают цитохром Р450-редуктазу.
40. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают уридин-5'-дифосфогликозилтрансферазу.
41. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой один или несколько ферментов пути включают UGT74G1, UGT76G1, UGT85C2 и UGT91D.
42. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают геранилгеранил-дифосфатсинтазу, копалил-дифосфат-синтазу, энт-каурен-синтазу, кауреноксидазу, гидроксилазу кауреновой кислоты, цитохром Р450 редуктазу, UGT74G1, UGT76G1, UGT85C2 и UGT91D.
43. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где один или несколько ферментов пути включают бифункциональную копалил-дифосфат-синтазу и кауренсинтазу.
44. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где одна или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути, находятся под контролем одного регулятора транскрипции.
45. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где одна или несколько гетерологичных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ферментов пути, находятся под контролем множества гетерологичных регуляторов транскрипции.
46. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, в которой клетка выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки, грибковой клетки, клетки водорослей, клетки насекомого и клетки растения.
47. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где клетка представляет собой дрожжевую клетку.
48. Генетически модифицированная клетка-хозяин по любому из предшествующих пунктов, где дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae.
49. Способ производства RebD, включающий:
(a) культивирование популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebD; и
(b) извлечение указанного соединения RebD из среды.
50. Способ производства RebM, включающий:
(a) культивирование популяции генетически модифицированных клеток-хозяев по любому из предшествующих пунктов в среде с источником углерода в условиях, подходящих для получения RebM; и
(b) извлечение указанного соединения RebM из среды.
51. Способ производства RebD, включающий:
(a) контактирование RebA с глюкозой и UDP-гликозилтрансферазой по любому из предшествующих пунктов, способных преобразовывать RebA в RebD, в условиях, подходящих для образования RebD; и
(b) извлечение указанного соединения RebD из среды.
52. Способ производства RebM, включающий:
(а) контактирование в условиях, подходящих для образования RebM, субстрата с глюкозой или UDP-сахаром, и
(i) UDP-гликозилтрансферазой по любому из предшествующих пунктов, способной преобразовывать RebA в RebD; и
(ii) UDP-гликозилтрансферазой, способной преобразовывать RebD в RebM.
53. Способ получения RebM, включающий:
(a) преобразование RebA в RebD с использованием любой из UDP-гликозилтрансферазы по любому из предшествующих пунктов, способной преобразовывать RebA в RebD; и
(b) преобразование RebD в RebM с использованием UDP-гликозилтрансферазы, способной преобразовывать RebD в RebM.
54. Не встречающаяся в природе UDP-гликозилтрансфераза, имеющая по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 11.
55. He встречающаяся в природе UDP-гликозилтрансфераза по п. 54, где UDP-гликозилтрансфераза содержит один или несколько следующих аминокислотных остатков;
(a) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 11 SEQ ID NO: 11;
(b) изолейцин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 12 SEQ ID NO: 11;
(c) пролин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 55 SEQ ID NO: 11;
(d) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 90 SEQ ID NO: 11;
(e) серин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 203 SEQ ID NO: 11;
(f) глутаминовая кислота в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, которая соответствует аминокислотной позиции 223 SEQ ID NO: 11; или
(g) валин в аминокислотной позиции UDP-гликозилтрансферазы, который соответствует аминокислотной позиции 413 SEQ ID NO: 11,
где положения аминокислот UDP-гликозилтрансферазы, которые соответствуют положениям аминокислот SEQ ID NO: 11, определяются выравниванием последовательности.
56. Не встречающаяся в природе нуклеиновая кислота, кодирующая не встречающуюся в природе UDP-гликозилтрансферазу по п. 54.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662374408P | 2016-08-12 | 2016-08-12 | |
US62/374,408 | 2016-08-12 | ||
PCT/US2017/046637 WO2018031955A2 (en) | 2016-08-12 | 2017-08-11 | Udp-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019104496A RU2019104496A (ru) | 2020-09-14 |
RU2019104496A3 RU2019104496A3 (ru) | 2021-04-09 |
RU2777901C2 true RU2777901C2 (ru) | 2022-08-11 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013022989A3 (en) * | 2011-08-08 | 2013-07-04 | Evolva Sa | Recombinant production of steviol glycosides |
US20160021918A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-28 | Cargill, Incorporated | Stevia plants with an increased rebaudioside d content |
RU2575042C2 (ru) * | 2011-09-06 | 2016-02-10 | Пепсико, Инк. | Подсластители на основе ребаудиозида d и пищевые продукты, подслащенные ребаудиозидом d |
WO2016023844A1 (en) * | 2014-08-11 | 2016-02-18 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
WO2016073740A1 (en) * | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Manus Biosynthesis, Inc. | Microbial production of steviol glycosides |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013022989A3 (en) * | 2011-08-08 | 2013-07-04 | Evolva Sa | Recombinant production of steviol glycosides |
RU2575042C2 (ru) * | 2011-09-06 | 2016-02-10 | Пепсико, Инк. | Подсластители на основе ребаудиозида d и пищевые продукты, подслащенные ребаудиозидом d |
US20160021918A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-01-28 | Cargill, Incorporated | Stevia plants with an increased rebaudioside d content |
WO2016023844A1 (en) * | 2014-08-11 | 2016-02-18 | Evolva Sa | Production of steviol glycosides in recombinant hosts |
WO2016073740A1 (en) * | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Manus Biosynthesis, Inc. | Microbial production of steviol glycosides |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11866738B2 (en) | UDP-dependent glycosyltransferase for high efficiency production of rebaudiosides | |
JP7487099B2 (ja) | レバウジオシドの高効率生成のためのエンドウ(pisum sativum)カウレンオキシダーゼ | |
US20210371892A1 (en) | Stevia rebaudiana kaurenoic acid hydroxylase variants for high efficiency production of rebaudiosides | |
RU2777901C2 (ru) | Udp-зависимая гликозилтрансфераза для высокоэффективного продуцирования ребаудиозидов | |
RU2795855C2 (ru) | Аbc-транспортеры для высокоэффективного производства ребаудиозидов | |
RU2795550C2 (ru) | Применение кауреноксидазы pisum sativum для высокоэффективного производства ребаудиозидов | |
US20220106619A1 (en) | Abc transporters for the high efficiency production of rebaudiosides | |
US20220282228A1 (en) | Kaurenoic acid 13-hydroxylase (kah) variants and uses thereof |