JP2018516600A - 高いｐＨを使用してステビオールグリコシドを産生するための発酵方法及びそこから得られる組成物 - Google Patents

Abstract

遺伝子操作酵母を使用して、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭなどのステビオールグリコシドを産生するための方法が開示されている。一部の実施形態では、この方法は、酵母を用いて約５．８以上などの高いｐＨにて発酵させる方法を含む。一部の実施形態では、この方法は、最初に第１のより低いｐＨにて酵母を増殖させ、次により高いｐＨにｐＨを調整することによって行うことができる。

Description

配列表の参照
本出願は、２０１６年５月２７日に作成され、９２ＫＢのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルとして本明細書と同時に提出された、「ＣＡＲ０２１０ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のアミノ酸配列及び／または核酸配列への参照を含む。配列表は、米国特許法施行規則１．５２条（ｅ）（５）に従って、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１５年５月２９日出願の米国仮出願第６２／１６８，３４５号の優先権を主張する。
本発明は、ステビオールグリコシドを産生するための発酵方法、発酵組成物、及び発酵によって産生されるステビオールグリコシド組成物に関する。

スクロース、フルクトース及びグルコースなどの糖は、飲料、食品、医薬品、及び口腔衛生／化粧製品に心地良い食味を提供するために利用される。特に、スクロースは消費者に好まれる食味を付与する。スクロースは優れた甘味特性を提供するが、高カロリーである。消費者の需要を満たすためにノーカロリーまたは低カロリー甘味料が導入されており、食味特性が好ましいこうしたタイプの甘味料に対する需要が存在する。

ステビアは、北西アメリカから南アメリカにかけての亜熱帯及び熱帯地域を原産とするヒマワリ科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）における草及び低木約２４０種に属する。スイートリーフ（ｓｗｅｅｔｌｅａｆ）、スイートリーフ（ｓｗｅｅｔ ｌｅａｆ）、シュガーリーフ（ｓｕｇａｒｌｅａｆ）、または単にステビアとして一般に知られるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ種は、甘味のある葉を利用するために広く栽培されている。ステビアベースの甘味料は、葉から１つ以上の甘味化合物を抽出することによって得ることができる。こうした化合物の多くはステビオールグリコシドであり、これらはジテルペン化合物であるステビオールのグリコシドである。これらのジテルペングリコシドは、甘味が砂糖の約１５０〜４５０倍である。ステビオールグリコシドは、甘味が互いに異なることに加えて、苦み、後味の引きなどのような、食味性質に寄与する感覚的特徴も互いに異なる。Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ａ．Ｄ．，Ｓｔｅｖｉａ：Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｓｔｅｖｉａ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００２）を参照。

ステビオールグリコシドの例は、ＷＯ２０１３／０９６４２０（例えば、図１の一覧を参照）及びＯｈｔａ ｅｔ．ａｌ．の”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｍｏｒｉｔａ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉ．，５７，１９９−２０９（２０１０）（例えば、ｐ．２０４の表４を参照）に記載されている。構造上、ジテルペングリコシドは、単一の塩基、ステビオールによって特徴づけられ、また図２ａ〜２ｋに提示されるように、Ｃ１３位及びＣ１９位における炭水化物残基の存在によって異なる。ＰＣＴ特許公開第ＷＯ／２０１３／０９６４２０号も参照。

通常、ステビアの葉に見いだされる４つの主要なステビオールグリコシドは、乾燥重量に基づきズルコシドＡ（０．３％）、レバウジオシドＣ（０．６〜１．０％）、レバウジオシドＡ（３．８％）及びステビオシド（９．１％）である。ステビア抽出物中で識別される他のグリコシドとしては、レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ステビオールビオシド及びルブソシドのうちの１つ以上が挙げられる。

主要なステビオールグリコシドＲｅｂ Ａは、飲料用途における甘味料として一般に使用されているが、異味の問題を有する。より最近では、より良好な食味特徴を有するいくつかの少数のステビオールグリコシドが注目されている。例えば、レバウジオシドＭは他のステビオールグリコシドよりも甘味強度が高く、強力である（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８：１５２３−１５２６及びＷＯ２０１３／０９６４２０を参照）。レバウジオシドＤは、甘味がスクロースの約２００〜２２０倍であり、官能評価においては、甘味の開始が遅く、非常にすっきりとしており、すなわち全体的にスクロースより甘く、スクロースに比べて甘味の後味の引きが短かった（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３：１５１２６−１５１３６を参照）。

発酵を介したステビオールグリコシド合成が可能な組み換え生物を用意するために、分子的手法が使用されてきた。例えば、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤを産生するため、ステビオールグリコシド合成に関与する酵素をコードする複数の導入遺伝子を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組み換え株が使用されてきた（例えば、ＷＯ２０１４／１２２２２７を参照）。

本発明は、概して、遺伝子操作酵母を使用してステビオールグリコシドを産生する方法、それに加えて発酵組成物、及び１つ以上のステビオールグリコシドを含む発酵産生物に関する。本開示における発酵条件によって、遺伝子操作酵母からのステビオールグリコシドの産生増加を促進することができ、また、レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が高い発酵組成物のような望ましいステビオールグリコシド比率をもたらすこともできる。例えば、本発明の一部の実施形態では、発酵組成物は、１：２０以上のレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率を含むことができる。さらに他の実施形態では、レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率は、１：２０〜１：１の範囲である。他の実施形態では、第２のｐＨにおけるレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が第１のｐＨにて維持された場合に産生されるレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率よりも大きい。

一実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシドを産生するための方法であって、ステビオールグリコシド（複数可）の産生のために発酵中に培地をより高いｐＨ条件に変更することを伴う方法を提供する。

この方法は、第１の培地中で第１のｐＨにて、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を増殖させるステップを含む。「遺伝子操作酵母」とは、細胞に導入され、細胞のゲノムに組み込まれている、またはプラスミドもしくはエピソームなどの染色体外コンストラクト上に存在する、少なくとも１つの外因性ＤＮＡ配列を有する酵母細胞を指す。次に、第１の培地に組成物を添加して、第１のｐＨよりも高い第２のｐＨを有する第２の培地を用意する。遺伝子操作酵母は、第２の培地中で発酵して１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生する。培地に添加する組成物は、窒素含有化合物、例えば水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウムから選択される化合物を含むことができる。培地に添加する組成物は、ｐＨを制御するために使用することができる。また、ｐＨは、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムまたは水酸化カルシウムなどの非窒素含有塩基によって制御することもでき、培地中に酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、尿素、酵母抽出物または他の窒素含有栄養分で窒素を補給することによって制御することもできる。

第２の培地において、ｐＨは約５より高く、約５．５より高く、または約５．８より高く、例えば約５．８〜７．５または５．８〜６．２の範囲に調整することができる。培地に添加する窒素含有化合物は、水酸化アンモニウムなどの塩基とすることができ、第２の、より高いｐＨ条件の形成に使用することができる。代替的に、窒素含有化合物は、より高いｐＨを提供するために非窒素塩基と共に使用することができる。窒素含有化合物、例えば酵母抽出物、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせは、発酵条件中の第２の培地における主な窒素構成成分とすることができる。非窒素塩基としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カルシウムを挙げることができる。

代表的な方法は、（ａ）炭水化物（例えば、グルコース）を有する培地中で、より低いｐＨ、例えば５．８未満にて遺伝子操作酵母を増殖させること、次に（ｂ）培地に、窒素含有化合物、例えば水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせ、及び任意選択により非窒素含有塩基、を含む組成物を、追加の炭水化物、及び任意選択により他の発酵化合物、と共に添加して５．８以上のｐＨを有する培地を用意し、次に遺伝子操作酵母を用いて培地を発酵させてステビオールグリコシド（複数可）を産生すること、を伴う。

別の実施形態では、本発明は、ｐＨシフトを必要とせず、むしろ任意選択的である、ステビオールグリコシドを産生するための方法を提供する。したがって、別の実施形態は、ステビオールグリコシドを産生するための方法であって、窒素源を含む培地中で、遺伝子操作酵母を用いて５．８以上のｐＨの培地にて増殖させ発酵させるステップを含む、方法である。窒素源は、水酸化アンモニウム、尿素、及び硫酸アンモニウム、酵母抽出物から選択され、これらの化合物の１つまたは組み合わせが発酵中における主要窒素源である。発酵中、遺伝子操作酵母は１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生する。例えば、ステビオールグリコシドには、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭまたは、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭが含まれる。一部の実施形態では、レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭのモル比率は１：２０以上である。

別の実施形態では、本発明は、遺伝子操作酵母において、第１の低分子量ステビオールグリコシドの産生を、第２の高分子量ステビオールグリコシドに対して増加させる方法を提供する。この方法は、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を、発酵培地中で５．８以上のｐＨにて発酵させるステップを含み、遺伝子操作酵母は、５．８未満のｐＨにて産生される第１及び第２ステビオールグリコシドの比率よりも大きい比率の第１及び第２のステビオールグリコシドを、５．８以上のｐＨにて産生する。例えば、この方法は、５．８以上のｐＨにて、第１及び第２のステビオールグリコシドの比率を、遺伝子操作酵母をより低いｐＨにて増殖させた場合の比率に対して約１０％以上増加させることができる。

別の実施形態では、本発明は、発酵プロセスによって産生されたステビオールグリコシドを含む組成物も提供する。したがって、別の実施形態では、本発明は、発酵プロセスから得られたレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを含む組成物であって、レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭのモル比が１：２０以上である、組成物を提供する。

代表的なメバロン酸経路を示す図である。

代表的な非メバロン酸経路を示す図である。

ステビオール産生の代表的な経路を示す図である。

ステビオールからステビオールグリコシドを生合成するための代表的な経路を示す図である。

本明細書に記載された本開示における実施形態は、網羅的であることを意図するものではなく、また、以下の発明を実施するための形態に開示されている形態と全く同じものに本発明を限定することを意図するものでもない。むしろ、選ばれかつ記載されている実施形態の目的は、他の当業者が本発明の原理及び実施を容易に認識及び理解できるようにするためのものである。

本開示の発酵方法は、ステビオールグリコシドを産生できる遺伝子操作酵母を使用する。ステビオールグリコシドを産生できる遺伝子操作酵母は、細胞中で１つ以上のステビオールグリコシドの形成を促進する酵素（複数可）をコードする、１つ以上の外因性核酸を含むことができる。例えば、遺伝子操作酵母は、ステビオールグリコシドＲｅｂＭ及びＲｅｂＤを合成するための経路を提供する酵素のセットを有することができる。

本明細書で使用する「ステビオールグリコシド（複数可）」という用語は、ステビオールのグリコシドを指す。代表的なステビオールグリコシドとしては、以下に限定するものではないが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシドが挙げられる。遺伝子操作酵母は、天然に見いだされる（天然に存在する）ステビオールグリコシドと同じステビオールグリコシドを産生することができることに加えて、天然に見いだされないステビオールグリコシドも産生することができる。ステビオールグリコシドは、遺伝子操作酵母において酵素的プロセスによって形成することができる。

構造的には、ステビオールグリコシドは、単一のステビオール塩基である中央の分子部分と、以下に示す原子ナンバリングによるところの、ステビオール塩基のＣ１３及び／またはＣ１９原子に付着したグルコピラノシル残基とを有する。すなわち、グルコピラノシル残基は、以下の式におけるＲ_１基及びＲ_２基に相当する。

下の表Ａは、様々なステビオールグリコシド及び対応するＲ_１基及びＲ_２基を示している。
表Ａ

本開示によれば、ステビオールグリコシドは、典型的な酵母の発酵条件よりも高いｐＨにて遺伝子操作酵母を発酵させることを含むプロセスで産生される。比較のため述べると、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、典型的には４〜５の範囲のｐＨにて発酵させる。

本開示における方法は、１つ以上のステビオールグリコシドへの経路を提供するように遺伝子操作された、様々な酵母宿主細胞を使用することができる。本開示における方法で使用されるこのような細胞は、ステビオールグリコシド合成のための酵素をコードする１つ以上のＤＮＡコンストラクト（複数可）を用いて形質転換することができる。ステビオールグリコシド経路酵素をコードする外因性ＤＮＡコンストラクトのための宿主に使用することができる代表的な酵母としては、以下に限定するものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種を挙げることができる。代表的な種は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。さらに、宿主細胞は、ステビオールグリコシド経路の遺伝子組み換え以外の、発酵中の性能向上をもたらし得る遺伝子組み換えも含むことができる。

「外因性」という用語は、宿主酵母に導入される、核酸などの分子、または酵素活性などの活性を指す。外因性核酸は、周知の手法によって酵母宿主に導入することができ、宿主の染色体材料の外部で維持する（例えば、組み込まれていないベクターで維持する）ことも、組み換えなどによって酵母の染色体に組み込むこともできる。概して、遺伝子操作酵母のゲノムは、１つ以上の組み換え遺伝子の安定的導入によって増強される。外因性核酸は、酵母に対して相同または異種である酵素または酵素の一部をコードすることができる。外因性核酸は、分子的手法により１つ以上の方法で天然に存在しない形態になるように操作された核酸を指す、「組み換え遺伝子またはＤＮＡコンストラクト」の形態をとることができる。

「異種」（例えば、「非ネイティブ」）という用語は、言及された分子または生物とは異なる源からの分子または活性を指す。したがって、言及された生物に対し異種である遺伝子またはタンパク質とは、その生物に見いだされない遺伝子またはタンパク質である。本開示の文脈における「異種グリコシルトランスフェラーゼ」は、宿主生物に固有のものであり得るいかなるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドとも異なる、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。例えば、第１の種に見いだされ、第１の種とは異なる宿主酵母に外因的に導入された特定のグリコシルトランスフェラーゼは、その宿主酵母に対し「異種」である。

遺伝子操作酵母は、ステビオールグリコシド経路酵素をコードする核酸を有する形質転換体の選択に好適な栄養要求マーカーを使用することができる。宿主酵母は、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、及びＴＲＰ１などの、栄養要求性を制御する１つ以上の遺伝子において修飾（欠失など）を含むことができる。１つ以上の外因性遺伝子導入において望ましい遺伝子的背景を有する宿主細胞を使用して、１つ以上の遺伝子コンストラクト（複数可）が細胞に導入されて、ゲノムに組み込まれるか、または安定的に維持され発現が可能になる。遺伝子コンストラクトを宿主細胞に導入する方法としては、形質転換、形質導入、形質移入、同時形質移入、及び電子穿孔が挙げられる。特に、酵母の形質転換は、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などを使用して行うことができる。導入の対象となる遺伝子コンストラクトは、プラスミドの形態で、または宿主の遺伝子への挿入によって、または宿主の遺伝子との相同組み換えによって、染色体に組み込むことができる。遺伝子コンストラクトが導入された形質転換酵母は、選択マーカー（例えば、上述の栄養要求マーカー）によって選択することができる。さらなる確認は、発現タンパク質の活性の測定、または導入された遺伝子（複数可）に関連する生物学的産物（例えば、ステビオールグリコシド）の産生の測定によって、行うことができる。

ステビオール経路遺伝子を含めた外因性核酸配列の形質転換は、当技術分野で周知の方法を使用して確認することができる。このような方法としては、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸分析、または遺伝子産物の発現についてのイムノブロッティング、または導入核酸配列またはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の好適な分析方法が挙げられる。当業者は、外因性核酸が望ましい産物の産生に十分な量で発現されることを理解し、さらに、発現レベルは、当技術分野で周知の方法及び本明細書に開示の方法を使用して、十分な発現を得るように最適化され得ることを理解する。

テルペノイド化合物、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、遺伝子操作酵母中のステビオールグリコシドに対する化学的前駆体として働くことができる。植物、昆虫及び一部の微生物種を含めた一部の生物は、アセチル−ＣｏＡを一連の化学的中間体を経てＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換するメバロン酸（ＭＶＡ）経路を有する。一部の生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）により開始する非メバロン酸経路（メチルＤ−エリトリトール４−リン酸経路、すなわちＭＥＰ経路としても知られる）を通じて、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを産生する。

酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、生来的にメバロン酸経路の遺伝子を発現する。酵素をコードするメバロン酸経路遺伝子としては、以下のものが挙げられる：（ａ１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、（ｂ１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＣ４．１．３．５）；（ｃ１）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）；（ｄ１）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）；（ｅ１）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．４．２）；及び（ｆ１）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３３）。メバロン酸経路の酵素は、以下のようにしてアセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換する：アセチル−ＣｏＡ→アセトアセチル−ＣｏＡ→３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ→メバロン酸→メバロン酸−５−リン酸→メバロン酸−５−ピロリン酸→ＩＰＰ。図１も参照。

一部の実施形態では、遺伝子操作酵母は、アセチル−ＣｏＡからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流動を増加させ、それによってステビオールへの経路で使用するＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰのプールの増加をもたらすための、１つ以上の修飾を含むことができる。この修飾には、例えば、１つ以上のメバロン酸経路酵素（ａ１）〜（ｆ１）の発現または活性を増加させることが含まれ得、これは例えば、発現増加をもたらすプロモーターの制御下で、酵母に対し相同または異種の酵素をコードする核酸を設置するか、核酸の複数のコピーを使用するか、及び／または異種の酵素、変種の酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは天然の酵素に比べて高レベルの酵素活性をもたらす変種かつ異種の酵素を使用することによって、行われる。

代替的に、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路は、ステビオールグリコシド産生に対する前駆体としてＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをもたらすために使用することができる。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、生来的にはＭＥＰ経路の遺伝子を発現しないが、任意選択により、ＭＥＰ経路遺伝子をもたらすように遺伝子操作することができる。理論的には、ＭＥＰ経路は概してエネルギー効率がより高く、それはＭＶＡ経路に比べてＣＯ２としての炭素の損失が少ないためである（ＭＥＰ経路：１ＣＯ２／ＩＰＰ；ＭＶＡ経路：４ＣＯ２／ＩＰＰ；炭素源は糖）。

特に、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路では、化合物のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）から通じる一連の中間体を経て生成され、複数の酵素がこの変換を担当している。Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに至る生合成経路に関与する酵素としては、（ａ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ｉｓｐＣ）−、（ｃ２）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、（ｄ２）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、（ｅ２）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、（ｆ２）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、（ｇ２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）、及び（ｈ２）イソペンテニル−二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が挙げられる（図２を参照）。

発酵によってステビオールグリコシド（複数可）を産生するための本開示の方法は、Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流動を増加させ、それによってステビオールへの経路で使用するＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰのプールの増加をもたらすための１つ以上の遺伝子的修飾を有する、遺伝子操作酵母を使用してもよい。この修飾には、例えば、１つ以上の酵素（ａ２）〜（ｈ２）の発現または活性を増加させることが含まれ得、これは例えば、発現増加をもたらすプロモーターの制御下で、酵母細胞に対し異種の酵素をコードする核酸の設置、核酸の複数のコピーの使用、及び／または異種の酵素、変種の酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは高レベルの酵素活性をもたらす変種かつ異種の酵素の使用によって、行われる。

発酵によってステビオールグリコシド（複数可）を産生するための本開示の方法は、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換する経路も含むことができる遺伝子操作酵母を使用してもよい。例えば一部の態様では、遺伝子操作酵母は、以下の酵素を発現する外因性核酸を含むことができる：（ａ３）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、（ｂ３）コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、（ｃ３）カウレンシンターゼ（ＫＳ）、（ｄ３）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及び（ｅ３）カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）。メバロン酸経路の酵素は、以下のようにしてＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに変換する：ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ→ゲラニルゲラニル二リン酸→コパリル二リン酸→カウレン→カウレン酸→ステビオール。（図３を参照）酵母細胞に対し異種である酵素（ａ３）〜（ｅ３）をコードする外因性核酸は、発現増加をもたらすプロモーターの制御下で、核酸の複数のコピーの使用、及び／または変種の酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含むもの）、もしくは高レベルの酵素活性をもたらす変種かつ異種の酵素の使用によって、配置することができる。

発酵によってステビオールグリコシド（複数可）を産生するための本開示の方法は、ステビオールをステビオールグリコシドに変換する任意の経路を有する遺伝子操作酵母を使用してもよい。２つ以上のステビオールグリコシド経路酵素が遺伝子操作酵母中に存在する場合、この遺伝子操作酵母は種々のステビオールグリコシドを産生できる可能性がある。例えば、この酵母は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１種以上の異なるステビオールグリコシド種を産生できる可能性がある。

ステビオールグリコシド経路は、グリコシル残基の活性化ヌクレオチド糖から受容体分子への移行を媒介する、１つ以上のウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含むことができる。ステビオールグリコシド経路の場合、単糖単位は、ステビオール分子もしくはステビオールグリコシド分子上のヒドロキシル部分もしくはカルボキシル部分に移行するか、またはステビオールの基部に付着したグルコース基上のヒドロキシ基に移行することができる。図４を参照。ＵＧＴは、配列相同性に基づいたファミリー及びサブファミリーに分類されている。Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８−４３４３を参照。モデル植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて、ＵＧＴをコードする１００種を超える遺伝子であって、それぞれが４２アミノ酸共通配列を含有する、遺伝子のスーパーファミリーが同定され、また、いくつかの他の上位植物種においてもＵＧＴをコードする遺伝子が同定された。

代表的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシド基質に少なくとも１つのグルコース単位を添加して目標のステビオールグリコシドをもたらすことが可能な、任意のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼとすることができる。一実施形態では、遺伝子操作酵母は、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）、及びこれらのポリペプチドに対する実質的同一性（例えば、＞８５％、＞７５％、＞６５％、＞５５％、＞４５％及び＞３５％）を有するＵＧＴの群から選択される、１つ以上のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含むことができる。遺伝子操作酵母は、これらのＵＧＴをコードする１つ以上の外因性核酸分子（複数可）を含むことができる。

遺伝子操作酵母は、１つ以上のＵＧＴ及びＵＤＰ−グルコース再利用酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）（複数可）も含むことができる。ルブソシドに少なくとも１つのグルコース単位を添加してステビオシドの形成が可能な代表的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）である。ステビオシドに少なくとも１つのグルコース単位を添加してレバウジオシドＡの形成が可能な代表的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）である。レバウジオシドＡに少なくとも１つのグルコース単位を添加してレバウジオシドＤの形成が可能な代表的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）である。レバウジオシドＤに少なくとも１つのグルコース単位を添加してレバウジオシドＭの形成が可能な代表的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）である。

ステビオールグリコシド産生及びステビオールグリコシド経路酵素のための遺伝子操作微生物について記載されている代表的な刊行物としては、例えば、ＵＳ２０１４／０３５７５８８、ＷＯ２０１４／１９３９３４、ＷＯ２０１４／１９３８８８、及びＷＯ２０１４／１２２２２７が挙げられ、それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、ステビオールグリコシドの産生に有用な遺伝子操作酵母は、以下の酵素を発現する：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５Ｃ２及びＥＵＧＴ１１。ＷＯ２０１４／１２２２２７には、これらの酵素を発現する遺伝子操作酵母株について記載されている。ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ポリペプチド、例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）、及びＥＵＧＴ１１（配列番号１３）をコードする遺伝子とすることができ、こういった遺伝子は、複数の反応が可能なポリペプチドをコードし、例えば、ａ）ステビオールグリコシドにおける１９−ＯグルコースのＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｂ）ステビオールグリコシドにおける１３−ＯグルコースのＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオールグリコシドにおける１９−ＯグルコースのＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｄ）ステビオールグリコシドにおける１３−ＯグルコースのＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｉ）ステビオールまたはステビオールグリコシドにおける１３−ＯＨのグリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｊ）ステビオールまたはステビオールグリコシドのＣ−１９カルボキシルのグリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子である。例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２は反応（ｉ）を行い、ＵＧＴ７４Ｇ１は反応（ｊ）を行い、ＵＧＴ９１Ｄ２は反応（ａ；弱）、（ｂ）を行い、ＵＧＴ７６Ｇ１は反応（ｃ）及び（ｄ）を行い、ＥＵＧＴ１１は反応（ａ）、（ｂ；不十分）を行う。

本開示の態様は、細胞培養の段階を参照しながら説明することができる。例えば、プロセスには、遺伝子操作酵母を培養する１つ以上の「段階（ｓｔａｇｅ）」または「期（ｐｈａｓｅ）」が含まれ得る。例えば、プロセスには、「播種／増殖期」が含まれ得る。本明細書で使用する「播種期」とは、細胞が培地中で増殖して、次の増殖期で使用され細胞数を増加させるための培地構成成分（炭水化物、窒素源、塩、ビタミン、微量金属）に順化する期間を指す。本明細書で使用する「増殖期」とは、細胞が（例えば、指数関数的に）繁殖する期間を指す。播種／増殖期中、遺伝子操作酵母は出芽によって繁殖を開始することができ、これは酵母分割（ｙｅａｓｔ ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と呼ばれる。

播種／増殖期は、遺伝子操作酵母の急速な繁殖によって特徴づけることができる。播種／増殖期は、遺伝子操作酵母の倍加時間の観点から説明することができる。本開示の一部の実施形態では、遺伝子操作酵母の増殖は、より低い（第１の）ｐＨ（例えば、約５．８以下または約５．０以下）にて行うことができ、次に、増殖期の後の方の時点、または次の発酵期の時点にて、ｐＨをより高い（第２の）ｐＨ（例えば、約５．８以上または約６．０以上）に増加させることができる。本開示の別の実施形態では、遺伝子操作酵母の増殖をより高い（第２の）ｐＨにて行うことができ、そのため、増殖期及び発酵期中に、より高いｐＨに調整する必要がない。

増殖期の後、遺伝子操作酵母は「発酵期」に入ることができ、発酵期では増殖の速度が少なくとも低下し、遺伝子操作酵母は活発に炭水化物を取り込み、望ましい産物、例えばステビオールグリコシド（複数可）を産生する。本明細書で使用する「発酵」、「発酵する」、またはこれらの変形形態は、酵母によって基質を変換することによりステビオールグリコシド（複数可）が著しく産生される期を説明するために使用され、発酵は半好気条件、好気条件、または嫌気条件下で発生し得る。半好気条件下では、発酵経路及び呼吸経路の両方が活性となる可能性があり、多少の細胞増殖が発生し得る。半好気条件下では、消費される酸素量が播種／増殖期中よりも少量であり得る。本明細書で使用する「プロセスの終始にわたり（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）」または「終始（ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ）」という表現は、様々な期または処理に関して使用される場合、増殖期から産物の形成までを意味する。

一部の実施様式では、発酵期中の培地のｐＨは、増殖期中または増殖期の開始時に培地のｐＨが増加した場合、より高いｐＨであり得る。他の実施様式では、ｐＨは、発酵期中の所定のポイントにてより高いｐＨに調整され得る。ｐＨが発酵中に増加する場合、発酵期の終わりよりは発酵期の開始付近で増加することが好ましく、発酵期の開始時または開始に非常に近いところで増加することがより好ましい。

一部の実施様式では、増殖期中の培地のｐＨは、発酵期と同じｐＨにて行う。例えば、増殖期はより高い（第２の）ｐＨにて行う。例えば、より高い（第２の）ｐＨは、約５．８以上である。

一部の実施形態では、ステビオールグリコシド（複数可）を産生するための本開示の方法は、遺伝子操作細胞が中に存在する培地を、発酵及びステビオールグリコシド（複数可）の産生のためにより高いｐＨに変更することを伴う。そのため、この方法における一ステップは、第１の培地における遺伝子操作酵母を、第１のより低いｐＨ（例えば、ｐＨ５．８以下またはｐＨ５．０以下）にて増殖させることを伴い、次に、第１のより低いｐＨにおけるある期間後、遺伝子操作酵母を、培地中で第１のｐＨよりも高い第２のｐＨにて発酵させる。遺伝子操作酵母を第２のより高いｐＨ（例えば、ｐＨ５．８以上、またはｐＨ６．０以上）にて発酵させて１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生させる。より高いｐＨ条件により、ステビオールグリコシドの量が増加するだけでなく、産物におけるステビオールグリコシド比率がより望ましくシフトする。

「培地」という用語は、遺伝子操作酵母が維持され得る、増殖し得る、発酵し得る、またはこれらの組み合わせができる液体組成物を指す。「培地」は、「ブロス」または「細胞培養物」とも呼ぶことができ、「開始」または「発酵」などの用語は、培地において発生している培地及び細胞の活性をより具体的に定義するために使用することができる。培地は、培地中に存在する構成成分及びその量に関して定義することができ、構成成分は、例えば以下のものである：炭素源、（ａ）グルコース及びマルトデキストリンなどのデンプン製品のような炭水化物を含む；（ｂ）窒素源、例えば酵母窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、酵母抽出物またはこれらの任意の組み合わせ；（ｃ）塩、例えばリン酸カリウム（リン酸一カリウム、リン酸二カリウム）、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウム；（ｄ）ビタミン、例えばビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、（ミオ）−イノシトール、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、及びクエン酸；（ｅ）微量金属、例えばホウ酸、硫酸銅、塩化コバルト、塩化カルシウム、ヨウ化カリウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム、及び硫酸亜鉛。培地における構成成分は、乾燥重量に基づいて定義することができる。さらに、培地は水ベースの、すなわち「水性」組成物である。また、培地は、そのｐＨ、ならびに培地におけるｐＨ制御に使用される生体適合性の酸、塩基、及び緩衝液に関して定義することもできる。

遺伝子操作酵母の発酵は、デンプン及び／または糖を含有する、塊茎、根、茎、葉及び種子などの任意の植物及び植物の一部から誘導可能な植物材料を有する培地を使用して、行うことができる。デンプン及び／または糖を含有する植物材料は、穀物、例えばオオムギ、コムギ、トウモロコシ、ライムギ、モロコシ、キビ、オオムギ、ジャガイモ、キャッサバ、またはコメ、及びこれらの任意の組み合わせ、から得ることができる。デンプン及び糖を含有する植物材料は、例えば、製粉、モルト処理、または半モルト処理などの方法によって処理することができる。一部の実施形態では、培地（より高いｐＨの場合もより低いｐＨの場合も）は、加工デンプンを含む。例えば、増殖及び／または発酵用の培地は、部分加水分解デンプンを含んでもよい。部分加水分解デンプンには、高分子量のデキストリン及び高分子量のマルトデキストリンが含まれ得る。ステビオールグリコシド産生に有益な望ましい範囲内の量でデンプン及びデンプン分解産物を有する部分加水分解デンプン製品を使用することができる。

任意選択により、遺伝子操作酵母によって利用され得るグルコースなどの単糖の濃度を増加させるために、デンプン材料を含む培地にデンプン分解酵素を添加してもよい。代表的なデンプン分解酵素としては、グリコアミラーゼ及びアミラーゼなどのアミロース分解酵素が挙げられる。

一部の実施様式では、発酵は、ステビオール含有化合物を含む培地中で行うことができる。このような化合物は、遺伝子操作酵母中のグリコシルトランスフェラーゼによって直接使用され得る。例えば、任意選択により、発酵は、ステビオール、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを含有する培地中で行うことができる。この培地を使用して、微生物は、機能的ＥＵＧＴ１１（配列番号１３）、機能的ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１）、機能的ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、及び機能的ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）をコードする遺伝子を含有及び発現することができる。レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、及びレバウジオシドＭなどの化合物を発酵培地から得ることができる。別の選択として、発酵は、ルブソシドを含有する培地で行うことができる。この培地を使用して、微生物は、機能的ＥＵＧＴ１１（配列番号１３）、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号３）、及び機能的ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）をコードする遺伝子を含有及び発現することができる。レバウジオシドＡ、Ｄ、及びＭなどの化合物を発酵後の培地から得ることができる。本明細書で使用する「レバウジオシドＤＭ」、「Ｒｅｂ ＤＭ」、及びこれらの変形形態は、主にレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭである（「ＤＭ」はこのためである）グリコシド、その関連異性体（例えば、天然または合成で）、及び／またはその塩を指す。この用語形式は、グリコシドの任意の他の組み合わせを有するグリコシドに使用することができ、例えば、以下に限定するものではないが、Ｒｅｂ ＤＡ、Ｒｅｂ ＭＡ、Ｒｅｂ ＤＭＡなどのように使用することができる。

場合によっては、経済的利益及び制御を実生産スケールで達成するために、発酵を産業規模の発酵槽中で行う。一実施形態では、発酵を、約１０，０００リットル以上の容量を有する発酵槽中で行う。

「第１の培地」及び「第２の培地」（及び任意選択により、必要な場合は「第３の」、「第４の」、「第５の」など）という用語は、ステビオールグリコシドを産生する方法の態様を説明するために、使用することができる。一実施様式では、より低いｐＨ（例えば、５．８未満または５．０未満）であり遺伝子操作酵母を含有する第１の培地を用意し、ある期間の間、培地中の遺伝子操作酵母を培養する。次に、細胞を含まない液体組成物（例えば、「フィード組成物」）を第１の培地に添加して、同じまたはより高いｐＨを有する第２の培地を用意する。これは、遺伝子操作酵母の発酵に使用することができる。フィード組成物は、連続的プロセスまたはバッチプロセスで第１の培地に添加することができる。好ましい実施様式では、培地における発酵条件をより正確に制御するために、フィード組成物を連続的プロセスで添加する。一部の実施形態では、フィード組成物は、同じ組成の第１の培地に添加されるフィード及び第２の培地に添加されるフィードである。

別の例として、低いｐＨ（例えば、５．８未満または５．０未満）であり遺伝子操作酵母を含む第１の培地は、ある期間の間、培養することができる。次に、第１の培地は、細胞を含まない所定の体積の液体組成物にバッチステップまたはバルクステップで添加して、より高いｐＨ（例えば、５．８以上または６．０以上）を有する第２の培地を作り出すことができる。この第２の培地は、遺伝子操作酵母及びステビオールグリコシドの発酵に使用することができる。様々な方法により、より低いｐＨを有する第１の培地から開始して、より高いｐＨを有する第２の培地を用意できることを理解されたい。そのため、第２の培地の形成は、１つ以上のフィード構成成分のバルク添加または連続的添加を使用した「添加する」、「中に添加する」、または「混合する」プロセスによるものであり得る。フィード構成成分は、液体形態または固体形態をとることができる。場合によっては、第２の培地の形成は、マルチステッププロセスによるものであり得る。他の場合には、第１の培地及び第２の培地の形成は、より高いｐＨの第２の培地を有する。

一部の実施様式では、第１の培地はある容器中に存在し、次に培地のｐＨを調整してより高いｐＨの第２の培地を用意し、同じ容器中で第２の培地を形成する。別の実施様式では、第１の培地を第１の容器で形成し、次に第１の培地を第２の容器に移し、第１の培地を他の構成成分または材料と合わせることによって、より高いｐＨの第２の培地を形成する。

より低いｐＨを有する第１の培地は、炭水化物（複数可）、窒素源（例えば、酵母窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、酵母抽出物、またはこれらの任意の組み合わせ）、塩、ビタミン、及び微量金属を含む液体組成物にシード培養物を添加することによって形成することができる。一部の実施様式では、第１の培地は、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを、培地における唯一の窒素源として含む。遺伝子操作酵母が構成成分を消費するにつれて、第１の培地における構成成分の濃度が経時的に減少し得るという理解によれば、第１の培地における構成成分の「初期」濃度が記載され得る。より高いｐＨ（例えば、５．８以上、または６．０以上）の第２の培地を形成する場合、水酸化アンモニウム、尿素、または硫酸アンモニウムが培地における唯一の窒素源であり得る。

一部の実施様式では、第１の培地、例えば酵母増殖が生じる培地のｐＨは、約６．０未満、約５．９未満、約５．８未満、約５．７未満、約５．６未満、約５．５未満、約５．４未満、約５．３未満、約５．２未満、約５．１未満、約５．０未満、例えば約３．０〜約５．５、約３．５〜約５．３、または約４．０〜約５．０の範囲内とすることができる。第１の培地における代表的なｐＨは、約５．０である。第１の培地における増殖期間中、このｐＨは変動する可能性がある。例えば、酵母細胞の増殖によって、ある期間後に第１の培地の酸性が強くなる可能性がある。任意選択により、第１の培地におけるｐＨは、経時的にｐＨを監視することによって制御することができ、そして必要な場合は、第１の培地における増殖中にｐＨが望ましい範囲内でとどまるように、塩基または緩衝液などを用いてｐＨを調整することによって制御することができる。例えば、第１の培地のｐＨは、ｐＨが約４．８〜約５．２の範囲内で維持されるように、水酸化アンモニウムなどの窒素含有塩基を使用して制御することができる。第１の培地で使用される窒素含有塩基は、第２の培地で使用される窒素含有塩基（例えば、水酸化アンモニウム）と同じであってもよいが、第２の培地で使用される塩基は、より高いｐＨをもたらすためにより高い濃度にするという違いを伴う。

一部の実施様式では、第１の培地のグルコース初期濃度は、約５０ｇ／Ｌ未満、２５ｇ／Ｌ未満、例えば約５ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ〜約３５ｇ／Ｌの範囲内とすることができる。また、第１の培地におけるグルコース濃度は、第２の培地におけるグルコース濃度との相対比較で定義することもできる。

代表的な実施様式では、第１の培地における増殖は、約２５〜３５℃、または２８〜３２℃の範囲内の温度、最も好ましくは約３０℃にて実施される。

また、遺伝子操作酵母の増殖は、通気を伴って、及び攪拌を伴って実施することもできる。

例えば、第１の培地における増殖期中に、通気を実施することができる。通気は、培地に対する溶存酸素移動速度（ｍｇ分^−１リットル^−１を単位とする）の観点から説明することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｌｅｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｂｕｃｈｓ，Ｊ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．Ｊ．３４７８：１−６を参照）。望ましい通気をもたらすために、微細気泡の形成を促進する噴霧手法を実施してもよい。一部の実施様式では、第１の培地における増殖期中に、例えば段階的方式で、攪拌及び通気を増加させる。通気条件は、培地中に溶解する酸素の量、つまり遺伝子操作酵母が利用可能な酸素に影響を及ぼし得る。遺伝子操作酵母による酸素摂取量は、酸素が供給される速度及び培地における酸素の小気泡形成によって制御することができ、これは攪拌及び／または噴霧によって達成することができる。発酵期中に限定的な通気を実施することもできる。

第１の培地における遺伝子操作酵母の増殖は、望ましい期間の間、より高いｐＨの第２の培地に調整する前に行うことができる。一部の実施様式では、第１の培地及び第２の培地がより高いｐＨを有する場合において、第１の培地における遺伝子操作酵母増殖は、望ましい期間の間、第２の培地に調整する前に行うことができる。例えば、第１の培地における増殖は、約２時間以上、または約１０時間以上、例えば約２時間〜約３０時間、または約１０時間〜約２４時間の範囲内の期間の間、行うことができる。第１の培地における時間は、全てまたは一部の増殖の遅滞期及び、全てまたは一部の増殖の対数（指数関数）期を網羅することができる。さらに、より低いｐＨの第１の培地における時間中に、遺伝子操作酵母は所定の増殖速度を有することができる。例えば、第１の培地における遺伝子操作酵母の倍加時間は、約２．３１時間〜約１３．８６時間、または約２．７７時間〜約７．３時間の範囲内とすることができる。代替的に、増殖速度は希釈速度として表現することができ、希釈速度は約０．０５〜０．３１／ｈ、または約０．０９５〜０．２５１／ｈとすることができる。

遺伝子操作酵母の増殖は、望ましい量の生物体量をもたらすために実施することができる。本明細書で使用する「生物体量」とは、遺伝子操作酵母の重量を指し、培地１リットル当たりの乾燥細胞重量をグラムで測定することができる（ＤＣＷ／Ｌ）。一部の実施様式では、遺伝子操作酵母は、約２０ｇ ｄｃｗ／Ｌ以上、約３０ｇ ｄｃｗ／Ｌ以上、例えば約２０ｇ ｄｃｗ／Ｌ〜約１２０ｇ ｄｃｗ／Ｌ、または約４０ｇ ｄｃｗ／Ｌ〜約８０ｇ ｄｃｗ／Ｌの範囲内の生物体量に増殖する。

第２の培地を形成する際に第１の培地に塩基を添加することができ、これによってより低いｐＨからより高いｐＨへの増加がもたらされる。塩基を添加する時期は、遺伝子操作酵母が第１の培地で費やした時間、特定の時点での第１の培地における構成成分の濃度、または特定の時点での遺伝子操作酵母の増殖特性などの見地、またはこれらの見地の組み合わせに基づいて、選択することができる。一部の実施様式では、第１の培地のｐＨは、第１の培地における遺伝子操作酵母の指数関数（増殖）期の少なくとも半ばを過ぎた時期に上昇させる。例えば、第１の培地のｐＨは、遺伝子操作酵母が指数関数期を脱して増殖の速度が低下したときに、約５．８以上、または約６．０以上に上昇させることができる。そのため、ｐＨを上昇させるための塩基添加は、遺伝子操作酵母が増殖速度の低下を伴って発酵期に入る前に実施することができる。そのため、培地のｐＨは、発酵期における遺伝子操作酵母による任意の著しいステビオールグリコシド（複数可）産生の後に上昇させることができる。ただし、高いｐＨの条件は、遺伝子操作酵母によるステビオールグリコシド（複数可）産生をもたらす発酵期間に含めることが好ましい。代替的に、ｐＨを上昇させるための塩基添加は、遺伝子操作酵母が発酵期に入った後に実施することができる。

塩基は、水酸化アンモニウムなどの窒素含有塩基、または発酵培地での使用に好適な非窒素塩基とすることができる。窒素含有塩基及び非窒素含有塩基の混合物を含む組成物も任意選択により使用することができる。第２の培地で使用することができる他の任意選択による窒素含有塩基は、無水アンモニアまたは水酸化アンモニウム／水酸化カリウムのブレンドとすることができる。第２の培地で使用することができる他の任意選択による非窒素含有塩基は、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カルシウムとすることができる。濃縮形態で窒素含有塩基を含む組成物（例えば、約１５％（ｗ／ｖ）まで、またはそれ以上の水酸化アンモニウム）を、ｐＨを変化させるために使用してもよい。

塩基は、第２の培地の形成のために、液体組成物として第１の組成物に添加してもよく、または固体として添加してもよい。塩基は、バルク方法または連続的プロセスで、第１の組成物に添加することができる。一部の実施様式では、望ましい期間にわたって望ましいｐＨを達成するために、塩基を連続的プロセスで添加する。例えば、第１のｐＨから第２のｐＨへの変化は、短い期間（分）、長い時間（時間）、またはその間の任意の時間にわたって行うことができる。例えば、この変化は、約２分〜約４時間、約５分〜約４時間、または約３０分〜約３時間の範囲内の期間の間、発生し得る。代表的な実施様式では、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０の変化は、約３０分〜約１８０分の範囲内の期間において発生し得る。

第２の培地の形成には、第１の培地にフィード培地を提供することも含まれる。一部の実施様式では、第１の培地に塩基を添加してｐＨをより低いｐＨからより高いｐＨに上昇させ、次により高いｐＨの培地にフィード組成物を添加する。別の実施様式では、フィード培地は塩基を含み、かつより高いｐＨを有し、そして第１の培地にフィード培地を添加すると、フィード培地はｐＨを増加させて第２の培地をもたらす。塩基を有するまたは有しないフィード培地は、遺伝子操作酵母が増殖する第１の培地と同じであっても異なってもよい。一部の実施形態では、第１の培地に添加されるフィード培地は、第２の培地に添加されるフィード培地と同じである。

フィード培地は、炭水化物（複数可）、窒素源、例えば酵母抽出物、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ；塩、ビタミン、及び微量金属を含むことができる。フィード培地における構成成分の濃度は、第１の培地における構成成分の濃度よりも高いものとすることができ、そのため、フィード培地を添加すると、フィード培地は、第２の培地において遺伝子操作酵母の発酵に好適な、望ましい量の構成成分をもたらす。代表的な実施形態では、フィード培地におけるまたは発酵中の（例えば、第２の培地）グルコース濃度は、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または０ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌの範囲内に保たれる。代表的な実施形態では、フィード培地における酵母抽出物、窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウムなど窒素源の濃度（総量）は、約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの範囲内に保たれる。代表的な実施形態では、フィード培地における塩の濃度（総量）は、例えば、約０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌの範囲内の硫酸マグネシウム、及び約０ｇ／Ｌ〜約２２ｇ／Ｌの範囲内のリン酸カリウムを含む塩。代表的な実施形態では、フィード培地における微量金属濃度（総量）は、約０ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／Ｌ、または０ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌの範囲内に保たれる。

遺伝子操作酵母が第２の培地中に存在する期間中、例えば発酵の期間中、ｐＨは変動し得る。ただし、ｐＨは、約ｐＨ５．８以上、または約ｐＨ６．０以上、例えば約ｐＨ５．８〜約ｐＨ８．０、ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．５またはそれ以上、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約５．８〜約６．５または約５．８〜約６．２の範囲内で保たれることが好ましい。第２の培地における期間中にｐＨを監視してもよく（例えば、定期的または連続的に）、ｐＨが望ましい範囲外に降下した場合は第２の培地を調整することができる。例えば、ｐＨが５．８未満に下がった場合は、ｐＨを約５．８以上に調整できるように第２の培地に追加の水酸化アンモニウムを添加することができる。代表的な実施形態では、発酵中におよそ０．１７ｋｇ〜約０．２ｋｇの１２％のＮＨ４ＯＨを添加してｐＨを５．０に維持し、発酵中におよそ０．２０ｋｇ〜約０．２４ｋｇの１２％のＮＨ４ＯＨを添加してｐＨを６．０に維持する。典型的な発酵においては、フィード期中におよそ１．１８ｋｇ〜約１．２１ｋｇのフィード培地を添加する。

代表的な実施形態では、フィード培地の流量を制御することによってグルコース濃度を限定的に保った。２期のフィード方式は、１０時間時にて例えばｕ＝０．１２ｌ／ｈの増殖速度で開始する初期の指数関数期を含むことができ、一方第２のフィード（すなわちフィードＩＩ期）は、３３時間で例えば０．１８０ｍｌ／分の一定流量で開始することができる。フィードは、約１２０時間までに約１．９５リットルの最終量を得ることができるまで継続することができる。望ましいステビオールグリコシドを産生するためのフィード速度についての他の方法は、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｅ Ｆｅｅｄｉｎｇ」というタイトルの出願、米国特許出願第６２／１６８，３７２号、「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｅ Ｆｅｅｄｉｎｇ」というタイトルの、本出願と同時に出願された国際ＰＣＴ出願、代理人整理番号Ｎ００２９３ＵＳＰ１（ＣＡＲ０２１２／ＷＯ）に記載されており、各出願はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

遺伝子操作酵母が第２の培地に存在する期間は、望ましい量のステビオールグリコシド産生に十分な程度の時間行われる発酵期間を含むことができる。例えば、より高いｐＨの第２の培地は、遺伝子操作酵母の初期培養から２時間以降、１０時間以降、または２４時間以降の時間にて形成することができ、遺伝子操作酵母の初期培養から１５０時間の時間まで、９６時間まで、または７２時間まで延長することができる。遺伝子操作酵母の発酵及びステビオールグリコシド（複数可）の産生は、第２の培地中に遺伝子操作酵母が滞留する間のあるポイントにて開始することができる。遺伝子操作酵母がより高いｐＨの第２の培地中に存在する間に、ステビオールグリコシドの多く（すなわち、５０％より多く）が遺伝子操作酵母によって産生されることが好ましい。

代表的な実施様式では、第２の培地における発酵及び（任意選択により）増殖は、約２５〜３５℃、または２８〜３２℃の範囲内の温度、最も好ましくは約３０℃にて実施される。また、第２の培地における遺伝子操作酵母の発酵及び（任意選択により）増殖は、通気を伴って、及び攪拌を伴って実施することもできる。

任意選択により、第２の培地におけるｐＨは、経時的にｐＨを監視することによって制御することができ、そして必要な場合は、発酵中にｐＨが望ましい範囲内でとどまるように、塩基または緩衝液などを用いて第２の培地におけるｐＨを調整することによって制御することができる。例えば、第２の培地のｐＨは、水酸化アンモニウムなどの窒素含有塩基を使用して制御することもでき、ｐＨは約５．８以上、例えば約ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．５またはそれ以上、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約５．８〜約６．５または５．８〜約６．２の範囲内に維持される。第２の培地で使用される窒素含有塩基は、第１の培地で使用される窒素含有塩基と同じであってもよい（例えば、水酸化アンモニウム）。

遺伝子操作酵母は、１つ以上のステビオールグリコシド産生に十分な程度の期間の間、第２の培地で維持することができる。例えば、遺伝子操作酵母は、プロセスにおける増殖期及び発酵期を含み得る約１５０時間までの期間の間、第２の培地中に存在することができる。第２の培地における代表的な期間は、約２０時間〜約１５０時間、約３０時間〜約１２０時間、または約４０時間〜約９０時間の範囲内である。第２の培地における期間は、増殖期の大部分及び発酵期の全て、増殖期の一部及び発酵期の全て、発酵期の全て、または発酵期の大部分であり得る。

別の実施形態では、本開示は、遺伝子操作酵母を使用してステビオールグリコシドを産生するための方法であって、増殖期の初めなどの、プロセスの早期ポイントにおいてより高いｐＨ条件が存在する、方法を提供する。例えば、プロセスの増殖期及び発酵期の両方は、ｐＨが約ｐＨ５．８以上、約ｐＨ６．０以上、例えば約ｐＨ５．８〜約ｐＨ８．０、ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．５超、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０、約５．８〜約６．５または約５．８〜約６．２の範囲内である培地において存在し得る。培地は、水酸化アンモニウム、尿素、及び硫酸アンモニウムから選択される窒素源を含むことができる。これらの化合物のうちの１つまたは組み合わせは、プロセスにおける増殖段階及び発酵段階の主要な窒素源とすることができる。

高いｐＨで開始するプロセスでは、遺伝子操作酵母がその期間中に増殖及び発酵しており、ｐＨは変動し得る。ただし、ｐＨは、増殖期間及び発酵期間中、約ｐＨ５．８以上、または約ｐＨ６．０以上、例えば約ｐＨ５．８〜約８．０、ｐＨ５．８〜約７．５以上、または約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．０の範囲内で保たれることが好ましい。これらの期間中にｐＨを監視してもよく（例えば、定期的または連続的に）、ｐＨが望ましい範囲外に降下した場合は培地を調整することができる。例えば、ｐＨが５．８未満または６．０未満に下がった場合は、ｐＨを約５．８以上に調整できるように培地に追加の水酸化アンモニウムを添加することができる。

遺伝子操作酵母が、増殖期の初めまたは早期に、より高いｐＨ培地中に存在する一部の実施様式では、１つ以上のステビオールグリコシドの産生のために十分な期間の間、遺伝子操作酵母を培地中に維持することができる。例えば、遺伝子操作酵母は、約１５０時間、またはさらにそれ以上の期間の間、より高いｐＨの培地中に存在していてもよい。第２の培地における代表的な期間は、約４０時間〜約１５０時間、約５０時間〜約１３０時間、または約６０時間〜約１１０時間の範囲内である。

発酵中、より高いｐＨの培地におけるステビオールグリコシドの産生について監視してもよい。発酵は、ステビオールグリコシドの望ましい総量及びプロファイルが生じたポイントで停止することができる。

「総ステビオールグリコシド」（ＴＳＧ）とは、発酵期間後の培地中に存在する全てのステビオールグリコシドを指し、液体培地中のステビオールグリコシド及び遺伝子操作酵母から得られるステビオールグリコシドの量を含む。ステビオールグリコシドの含有量は、培地中の総ステビオールグリコシド量について、または培地中の１つ以上の、ただし全てではない、ステビオールグリコシドの量について、表現することができる。組成物中のステビオールグリコシドの量は、互いに対して、またはステビオールグリコシドの総量に対して表現することができ、例えばステビオールグリコシドの総量に対する重量百分率、または、重量パーセントまたはモルパーセントとして表される比率もしくは比率の範囲として表現することができる。組成物中の全てのステビオールグリコシド含有量の合計は、通常、乾燥（無水）ベースで行われる。

ステビオールグリコシドの量は、対照試料との相対比較で、例えば、より低いｐＨで発酵させる対照試料との相対比較で表現することもできる。代表的な比較は、約５．０のｐＨにて増殖させ、次に発酵のために５．８〜７．５の範囲内のｐＨに調整される遺伝子操作酵母と、より高いｐＨに調整することなく約５．０のｐＨにて増殖及び発酵させる遺伝子操作酵母との比較である。別の代表的な比較は、５．８〜７．５の範囲内のｐＨにて増殖及び発酵させる遺伝子操作酵母と、約５．０のｐＨにて増殖及び発酵させる遺伝子操作酵母との比較である。

例えば、より高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母、またはより高いｐＨ条件にて増殖及び発酵の両方をさせる遺伝子操作酵母は、より低いｐＨ条件（例えば、ｐＨ５．０）にて増殖させる遺伝子操作酵母株との相対比較で、総ステビオールグリコシド量における約１．２Ｘ以上、約１．３Ｘ以上、約１．４Ｘ以上、約１．５Ｘ以上、約１．６Ｘ以上、約１．７Ｘ以上、約１．８Ｘ以上、約１．９Ｘ以上、または約２．０Ｘ以上の増加を示すことができる。

ある特定のステビオールグリコシド、例えばレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭ、のより高いｐＨ条件での産生も、より低いｐＨ条件にて増殖させる遺伝子操作酵母との相対比較で説明することができる。例えば、より高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母、またはより高いｐＨ条件にて増殖及び発酵の両方をさせる遺伝子操作酵母は、より低いｐＨ条件（例えば、ｐＨ５．０）にて増殖させる遺伝子操作酵母株との相対比較で、レバウジオシドＤ量において約１．４Ｘ以上、約１．５Ｘ以上、約１．６Ｘ以上、約１．７Ｘ以上、約１．８Ｘ以上、約１．９Ｘ以上、約２．０Ｘ以上、約２．１Ｘ以上の増加を示すことができる。発酵培地におけるレバウジオシドＤの代表的な力価は、約１ｇ／Ｌ以上、約１．２５ｇ／Ｌ以上、約１．５ｇ／Ｌ以上、約１．７５ｇ／Ｌ以上、または約２．０ｇ／Ｌ以上である。

別の例として、より高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母、またはより高いｐＨ条件にて増殖及び発酵の両方をさせる遺伝子操作酵母は、より低いｐＨ条件（例えば、ｐＨ５．０）にて増殖させる遺伝子操作酵母株との相対比較で、レバウジオシドＭ量において約１．１Ｘ以上、約１．２Ｘ以上、約１．３Ｘ以上、約１．４Ｘ以上、約１．５Ｘ以上、または約１．６Ｘ以上の増加を示すことができる。

高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母は、産生されるステビオールグリコシドの相対量における変化も示し得る。例えば、低いｐＨでは、遺伝子操作酵母は、ある比率（例えば、Ｘ：Ｙ）での第１及び第２のステビオールグリコシドの産生を示すことができる。より高いｐＨの発酵条件に変更すると、遺伝子操作酵母は、より多くの量の第１及び第２のグリコシドを含めたグリコシドを産生できるようになり得るだけでなく、より低いｐＨでの産生とは異なる比率にて第１及び第２のグリコシドを産生できるようになり得る。一部の実施様式では、第１のステビオールグリコシドは、第２のステビオールグリコシドよりも分子量が低い。例えば、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭに関すれば、より高いｐＨ（例えば、５．８〜７．５の範囲内）での発酵によって、ｒｅｂ Ｄ：ｒｅｂ Ｍの比率を、低いｐＨ（例えば、ｐＨ５．０）にて増殖させるｒｅｂ Ｄ：ｒｅｂ Ｍの比率と比べて増加させることができる。

一部の実施様式では、この方法は、ステップ（ｂ）におけるレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が約１：２０以上、例えば以下のような比率である、発酵組成物を提供する。

約１：２０〜約１：１、約１：５〜約１：１、約１：２〜約１：１、約１：１．７５〜約１：１、または約１：１．５〜約１：１。例えば、より高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母、またはより高いｐＨ条件にて増殖及び発酵の両方をさせる遺伝子操作酵母は、レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率を約１：２０以上として、例えば、約１：２０〜約１：１、約１：１０〜約１：１、約１：７．５〜約１：１、約１：５〜約１：１、約１：３〜約１：１、約１：２〜約１：１、約１：１．７５〜約１：１、または約１：１．５〜約１：１の範囲内として、示すことができる。

例えば、より高いｐＨ条件にて発酵させる遺伝子操作酵母、またはより高いｐＨ条件にて増殖及び発酵の両方をさせる遺伝子操作酵母は、より低いｐＨ条件（例えば、ｐＨ５．８以下、またはｐＨ５．０以下）にて遺伝子操作酵母株を増殖させた時のｒｅｂ Ｄ：ｒｅｂ Ｍの比率との相対比較で、ｒｅｂ Ｄ：ｒｅｂ Ｍの比率にいて約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、または約４０％以上の増加を示すことができる。

より高いｐＨでの発酵期間の後、様々な手法を使用して、培地から１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を含有する組成物を得ることができる。一部の実施形態では、透過剤などの化合物を培地に添加して、細胞から培地へのステビオールグリコシドの移動を強化することができる。

次に、培地を遠心処理または濾過して遺伝子操作酵母を除去することができる。培地は、任意選択により、低分子量の構成成分（グルコース、塩基栄養分、及び塩）を除去するように、例えば膜透析によって処理してもよい。望ましい使用に応じて、１つ以上のステビオールグリコシド化合物（複数可）を含む組成物を使用することができる。

発酵後、遺伝子操作酵母は、任意選択により、ステビオールグリコシドの回収を強化するように熱処理法を使用して処理してもよい。発酵後、ただし任意の熱処理前、培地は、遺伝子操作酵母内にある望ましいステビオールグリコシドの一部と共に、準最適量のステビオールグリコシドを含有し得る。ステビオールグリコシドの回収を増加させるため、一部の実施様式では、組成物（例えば遺伝子操作酵母の発酵を行ったより高いｐＨの培地）を、５０℃〜９５℃、または７０℃〜９５℃の範囲内の温度に、５分〜４８時間の範囲内の期間の間、加熱する。

濃縮もしくは精製された形態でステビオールグリコシド含む組成物、またはある特定のステビオールグリコシドが互いに分離された形態でステビオールグリコシドを含む組成物をもたらすことが望ましい場合、さらなる精製を行うことができる。ステビオールグリコシドにおけるこのような濃縮または精製は、発酵が行われる培地上で行ってもよく、あるいはその際に培地を乾燥させてから精製してもよい。例えば、培地は凍結乾燥を使用して乾燥させて、ステビオールグリコシドを含む乾燥組成物（例えば、粉末またはフレーク）を形成することができ、ステビオールグリコシドは次に処理にかけることができる。

一部の実施様式では、ステビオールグリコシドについて濃縮された乾燥発酵ブロスは、精製の出発材料として使用する。例えば、乾燥発酵ブロスに溶媒または溶媒の組み合わせを添加して、ステビオールグリコシドを含む材料を溶解または懸濁させてもよい。ステビオールグリコシドを溶解させるための代表的な組み合わせは、水及びアルコールの混合物（例えば、５０：５０のエタノール：水）である。溶解または懸濁を容易にするために、乾燥ブロス材料は室温を超える温度、例えば４０℃〜６０℃の範囲内で加熱することができる。乾燥ブロス材料の機械的破壊も、例えば超音波処理によって実施することができる。溶解または懸濁したブロス材料は、ミクロンまたはサブミクロンを使用して濾過し、その後に、例えば分取クロマトグラフィーによって、さらに精製することができる。

ステビオールグリコシド化合物について濃縮された乾燥発酵ブロスは、例えば逆相液体クロマトグラフィーによって、精製にかけることができる。ステビオールグリコシド化合物をカラム中に保持するために好適な樹脂を使用することができ、親水性化合物は、水などの液体によってカラムを経て洗い流され、除去される。カラムからのステビオールグリコシドの溶離は、好適な溶媒または溶媒の組み合わせ、例えばアセトニトリルまたはメタノールによって遂行することができる。

逆相カラムからのステビオールグリコシドの溶離は、様々な目的のうちのいずれか１つに有用であり得る組成物をもたらし得る。例えば、精製されたステビオールグリコシド組成物は、経口摂取または経口使用のための甘味料組成物として使用することができる。この組成物は、組成物中のステビオールグリコシドに関して定義することができる。

ステビオールグリコシドを産生するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８（それぞれの全体が参照によって組み込まれる）に記載されている方法を使用して構築した。親株（株Ａ）を構築するために、以下の配列を使用した：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号６）、切断型Ｚｅａ ｍａｙｓ ＣＤＰＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＫＳポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号８）、組み換えＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＫＯポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号９、配列番号１０）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴＲ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１１、配列番号１２）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１３）、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１４、配列番号１５）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１６、配列番号１７）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号２）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号１）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子（配列番号３）、及びＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ９１Ｄ２変異体（または機能的ホモログ）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ、（配列番号４）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、ステビオールグリコシドを産生した。

ＵＧＴ９１Ｄ２のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ変異体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１からの配列番号５）は、２１１位におけるロイシンからメチオニンへの置換及び、２８６位におけるバリンからアラニンへの置換を含む。（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１の表１２及び実施例１１に記載の、Ｔ１４４Ｓ、Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ、及びＧ３８４Ｃ変異体以外の追加の変異体も使用できると思われる。）アミノ酸修飾Ｌ２１１Ｍ及びＶ２８６Ａを含むＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂをコードするＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化配列（アミノ酸配列は配列番号４；コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号５に示される）。

株Ｂは上述の親株に由来し、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａからのコドン最適化ＣＰＲ１（アミノ酸配列番号１９に対応する配列番号１８）を追加的に含む。

株Ｃは株Ｂに由来し、配列番号２０によるＫＯポリペプチドをコードする遺伝子を追加的に含む。

株Ｄは株Ｃに由来し、配列番号２１によるＫＡＨポリペプチドをコードする遺伝子を追加的に含む。

株Ｅは株Ｃに由来し、配列番号２２によるＣＰＲ４４９７ポリペプチドをコードする遺伝子を追加的に含む。

本開示の典型例をさらに示すために、以下にいくつかの追加の非限定的な実施形態を提供する。
１．ステビオールグリコシドを産生する方法であって、
（ａ）第１の培地中で第１のｐＨにて、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を増殖させることと、
（ｂ）前記第１の培地に組成物を添加して、前記第１のｐＨよりも高い第２のｐＨを有する第２の培地を用意することと、
（ｃ）前記遺伝子操作酵母を発酵させて、前記第２の培地中で前記第２のｐＨにて、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生することと、を含む前記方法。
２．前記第１のｐＨが６．０未満である、実施形態１に記載の方法。
３．前記第１のｐＨが４．０〜５．５の範囲である、実施形態２に記載の方法。
４．前記第２のｐＨが５．０より大きい、実施形態１に記載の方法。
５．前記第２のｐＨが５．５〜８の範囲である、実施形態４に記載の方法。
６．前記第２のｐＨが５．８〜７．５の範囲である、実施形態５に記載の方法。
７．前記組成物が、水酸化アンモニウム、尿素、及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される窒素含有化合物を含む、実施形態１に記載の方法。
８．水酸化アンモニウム、尿素、または硫酸アンモニウムが、前記培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための主要窒素源である、実施形態７に記載の方法。
９．水酸化アンモニウムまたは尿素が、前記第２の培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための前記窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、実施形態８に記載の方法。
１０．ステップ（ｂ）において、前記組成物が非窒素塩基を含む、実施形態１に記載の方法。
１１．前記非窒素塩基が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カルシウムからなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。
１２．水酸化アンモニウム、尿素、または硫酸アンモニウムが、前記第２の培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、実施形態８に記載の方法。
１３．ステップ（ａ）において、前記第１の培地が、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせを含み、ステップ（ｂ）において、前記第２の培地が、前記第１の培地に、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ、及び任意選択により非窒素塩基、を含む組成物を添加することによって達成される、実施形態７に記載の方法。
１４．前記第１の培地が２５ｇ／Ｌ以下の濃度でグルコースを含む、実施形態１に記載の方法。
１５．前記第１の培地が、グルコース、水酸化アンモニウムまたは尿素以外の窒素源、カリウム源、マグネシウム源、微量金属、及びビタミンを含む、実施形態１に記載の方法。
１６．ステップ(ｂ)において、前記第２の培地が４００ｇ／Ｌ〜７５０ｇ／Ｌの範囲の濃度でグルコースを含む、実施形態１に記載の方法。
１７．ステップ（ｂ）において、前記第２の培地が、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属、ビタミン、及び消泡剤を含む、実施形態１に記載の方法。
１８．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母を含む前記第２の培地に対する、追加の発酵材料の連続的添加またはバッチ添加を含む、実施形態１に記載の方法。
１９．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２時間以降に実施される、実施形態１に記載の方法。
２０．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から最長１５０時間までに実施される、実施形態１に記載の方法。
２１．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から１０時間以降または最長９６時間までに実施される、実施形態２０に記載の方法。
２２．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２４時間以降または最長７２時間までに実施される、実施形態２１に記載の方法。
２３．前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）の量は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生する前記１つ以上のステビオールグリコシドの量よりも１０％以上多い、実施形態１に記載の方法。
２４．前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）の量は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生する前記１つ以上のステビオールグリコシドの量よりも２０％以上多い、実施形態２３に記載の方法。
２５．前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、実施形態１に記載の方法。
２６．前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率よりも大きい、実施形態２５に記載の方法。
２７．ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０以上である、実施形態２６に記載の方法。
２８．ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０〜１：１の範囲である、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記遺伝子操作酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３０．前記遺伝子操作酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、実施形態１に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｆ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０リダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１ ｄ２ポリペプチド、及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド。
３２．前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、実施形態１に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド、切断型Ｚｅａ ｍａｙｓ ＣＤＰＳポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＫＳポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＫＯポリペプチド、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴＲ２ポリペプチド、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＵＧＴ１１ポリペプチド、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＣＰＲ８ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、Ｓ．ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ９１Ｄ２変異体または機能的ホモログ、及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド。
３３．前記遺伝子操作酵母を含むシード培地を用意するステップをさらに含み、続いて前記シード培地が、前記培地を前記第１のｐＨにて形成するために使用される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
３４．ステップ（ａ）〜（ｃ）が単一の容器中で実施される、先行実施形態のいずれかに記載の方法。
３５．ステップ（ａ）〜（ｃ）が２つ以上の異なる容器中で実施される、実施形態１から３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．ステビオールグリコシドを産生する方法であって、
１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生する遺伝子操作酵母を、発酵培地中で６．０以上のｐＨにて発酵させるステップを含む、前記方法。
３７．前記発酵培地が、水酸化アンモニウム、尿素、及び硫酸アンモニウムから選択される窒素源を含む、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記ｐＨが６．０〜７．５の範囲である、実施形態３７に記載の方法。
３９．前記ｐＨが６．５〜７．５の範囲である、実施形態３８に記載の方法。
４０．水酸化アンモニウムまたは尿素が、前記培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、実施形態３６に記載の方法。
４１．前記培地が、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属、ビタミン、及び消泡剤を含む、実施形態３６に記載の方法。
４２．前記遺伝子操作酵母を含む前記培地に対する、追加の発酵材料の連続的添加またはバッチ添加をさらに含む、実施形態３６に記載の方法。
４３．最長１５０時間までの期間の間実施される、実施形態３６に記載の方法。
４４．８〜８８時間の範囲の期間の間実施される、実施形態４３に記載の方法。
４５．２２〜４８時間の範囲の期間の間実施される、実施形態４４に記載の方法。
４６．前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、実施形態３６に記載の方法。
４７．前記発酵培地が、２０〜１２０ｇ ｄｃｗ／Ｌの範囲の生物体量を有する、実施形態３３に記載の方法。
４８．遺伝子操作酵母において、第１の低分子量ステビオールグリコシドの産生を、第２の高分子量ステビオールグリコシドに対して増加させる方法であって、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を、発酵培地中で６．０以上のｐＨにて発酵させるステップを含み、前記遺伝子操作酵母がｐＨ６．０以上で産生する前記第１及び第２のステビオールグリコシドは、ｐＨ６．０未満で産生される前記第１及び第２のステビオールグリコシドの比率よりも大きい、前記方法。
４９．６．０以上のｐＨにおける前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率が、６．０未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率の１０％以上である、実施形態４８に記載の方法。
５０．６．０以上のｐＨにおける前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率が、６．０未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率の２５％以上である、実施形態４９に記載の方法。
５１．前記第１のステビオールグリコシドがレバウジオシドＤであり、前記第２のステビオールグリコシドがレバウジオシドＭである、実施形態４８に記載の方法。
５２．前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生するために遺伝子操作酵母を使用する発酵方法に由来する組成物であって、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：２０以上の比率で含む、前記組成物。
５３．レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：５〜１：１の範囲の比率で含む、実施形態５２に記載の組成物。
５４．レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１．７５〜１：１の範囲の比率で含む、実施形態５３に記載の組成物。
５５．レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１．５〜１：１の範囲の比率で含む、実施形態５４に記載の組成物。
５６．発酵培地である、実施形態５２から５５のいずれか１つに記載の組成物。
５７．前記発酵培地が、１ｇ／Ｌ以上、１．２５ｇ／Ｌ以上、１．５ｇ／Ｌ以上、１．７５ｇ／Ｌ以上、または２．０ｇ／Ｌ以上のレバウジオシドＤ濃度を有する、実施形態５６に記載の組成物。

実施例１
主要Ｎ源として尿素または水酸化アンモニウムを用いた、より高いｐＨでの流下発酵におけるＲｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの産生
接種物調製のため、酵母株Ｂ及び株Ｃを、１リットルの振とうフラスコ中の１５０ｍＬのシードフラスコ培地中で、２５０ｒｐｍ及び３０℃にて２０〜２４時間培養した。

発酵のため、７５ｍＬのシード培養物を開始量０．７５リットルの初期発酵培地（表２、３及び４）に移した。２ＬのＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ＢｉｏＦｌｏ３１０発酵槽中で発酵を行った。温度を終始３０℃に維持した。溶解酸素が２０％未満であるように空気流量を維持し、攪拌速度は、発酵中、４００ｒｐｍから９００ｒｐｍに段階的に増加するよう自動制御した。フィード培地の流量を制御することによってグルコース濃度を限定的に保った（表５）。２期のフィード方式は、１０時間時にてｕ＝０．１２ｌ／ｈの増殖速度で開始する初期の指数関数期を伴い、一方第２のフィード期（すなわちフィードＩＩ期）は、３３時間時にて０．１８０ｍｌ／分の一定流量で開始した。フィードは、１２０時間までに１．９５リットルの最終量を得るまで継続した。

株Ｂ処理のあるセットでは、１２％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨを５に制御した。次に、第２のフィード期において、ＮＨ４ＯＨを用いて、ｐＨを５に制御するか、またはｐＨ６もしくはｐＨ７まで増やした。消泡剤の添加は、１０ｗｔ％の消泡剤溶液（Ｉｖａｎｈｏｅ１１６３Ｂ）と共に発泡制御プローブを利用することによって制御した。表６の結果を参照。

１２％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨ５でのｐＨ制御を行った株Ｃの結果を表７に示す。

株Ｂ処理の別のセットでは、発酵を、１）１２％のＮＨ４ＯＨを用いてｐＨ５．０に、２）６．２ＮのＫＯＨのみを用いて（ｐＨは７まで変動）培地中に存在する尿素と共に、制御した。結果を表８に示す。

培地は、Ｖｅｒｄｕｙｎ ｅｔ ａｌ（Ｖｅｒｄｕｙｎ Ｃ，Ｐｏｓｔｍａ Ｅ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ ＷＡ，Ｖａｎ Ｄｉｊｋｅｎ ＪＰ．Ｙｅａｓｔ．１９９２ Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）を表２〜５に記載のように改変したものに基づいた。尿素処理については、初期発酵培地において硫酸アンモニウムを１５ｇ／Ｌに増加させ、発酵フィード培地において尿素を３９ｇ／Ｌに添加した。ＫＯＨは、尿素処理におけるｐＨ制御用の塩基として、ＮＨ_４ＯＨの代わりに使用した。

グルコースにおけるＲｅｄ ＤＭ収率を、利用された総グルコースに基づいて算出した。生物体量におけるＲｅｂ ＤＭの収率は、細胞乾燥重量に基づいた。Ｒｅｂ ＤＭの産生力は、Ｒｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの濃度の合計を、最終発酵時間（フィード培地が空になった時間として決定された）で割って算出した。細胞乾燥重量の生物体量決定は、当技術分野で一般的な濾過／オーブン法（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／ｏｖｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）に基づいた。ステビオールグリコシドの定量化は、以下に記載する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって行い、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘから購入した真正の標準物質を使用して得られる較正曲線と比較することができる。

１００μＬの発酵培地をピペットで２ｍＬの微量遠心機チューブに移した。９００μＬの６１％メタノール（抽出溶媒）を２ｍＬの微量遠心機チューブに添加し、試料回転機に設置することにより１０分間攪拌してステビオールグリコシドを抽出した。次に、試料を微量遠心機中で１０Ｋ ｒｐｍにて３分間遠心処理し、分析のため、清澄化した上清をピペットでオートサンプラーのバイアルに移した。

グリコシド分離のためのＵＨＰＬＣ法

ステビオールグリコシドの分離は、２つの直列のＡｇｉｌｅｎｔ ＳＢ−Ｃ１８ ＲＲＨＤカラム（２．１ｍｍｘ１５０ｍｍ、１．８ｕｍ）及びプレカラムフィルターとして取り付けられたＯｐｔｉｍｉｚｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのステムフィルターアセンブリーを使用して行った。使用した移動相は、チャネルＡ：水中０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びチャネルＢのアセトニトリルであった。流量は０．３８ｍＬ／分、カラム温度は６５℃であり、検出を２１０ｎｍの紫外線吸収にて実施した。グラジエント溶離プロファイルを以下に示す。

Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｉｎｃ ｌｏｔ１００８−００５のＲｅｂ Ａ（純度９８．８５％）を５５％のＭｅＯＨにおいて以下の濃度で較正を実施した：０．３５、０．１７５、０．０７、０．０３５、０．０１４、０．００７ｍｇ／ｍＬ。全てのグリコシドをＲｅｂ Ａ曲線に基づいて定量化する。Ｒｅｂ Ｄ、Ｒｅｂ Ｍ、及びＲｅｂ ＢのＲｅｂ Ａに対する実験的補正係数を決定し、一方で他の全ての分析物を分子量に基づいて補正する。典型的な発酵ブロスの例を添付する。

表６ａ及び６ｂでは、グルコースにおけるＲｅｂ ＤＭ収率％＝Ｒｅｂ ＤＭ（ｇ／Ｌ）／消費されたグルコース（ｇ／Ｌ）＊１００である。生物体量におけるＲｅｂ ＤＭ収率％＝Ｒｅｂ ＤＭ（ｇ／Ｌ）／産生された生物体量（ｇ細胞乾燥重量（ＣＤＷまたはＤＣＷ）／Ｌ）＊１００である。Ｒｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの力価は元々ｇ／Ｌで測定された。対照との比較は、処理の値÷対照の値＊１００％である。例えば、処理のＲｅｂ Ｄ（ｇ／Ｌ）÷対照のＲｅｂ Ｄ＊１００％は、対照の％に等しい。

より高いｐＨでの遺伝子操作酵母の発酵により、力価、産生速度及び収率の増加、ならびにステビオールグリコシドＲｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの比速度の増加がもたらされた。また、より高いｐＨでの発酵により、ステビオールグリコシドのＲｅｂ Ｄ：Ｒｅｂ Ｍの比率の増加ももたらされた。Ｒｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの力価の増加は、より高いｐＨ条件における複数の株で観察された。

実施例２
より高いｐＨでの流下発酵におけるＲｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍの産生
２Ｌ（仕込量）の発酵槽において好気的に流下発酵を行った。同じ培地中で増殖させたシード培地を使用して、５００ｍＬの初期ミネラル培地（表９）を接種して、０．２の初期ＯＤに到達させた。４相の指数関数的フィードプロファイル及び表２に記載のフィード培地を使用して、培養物をバッチモードで１８時間運転し、次に流下発酵モードで約１１０時間運転した。グルコースを炭素源及びエネルギー源として利用し、完全な呼吸代謝を可能にする（エタノール形成を最小限に抑える）ため、流量を制御することによってグルコースの濃度を限定的に保った。全体のプロセス中、空気流を約１ｖｖｍに保ち、最初の４２時間は攪拌を８００ｒｐｍに設定し、次に残りのプロセスについては増加させ１２００ｒｐｍにて維持した。発酵の終始にわたり、温度を３０℃に制御した。

デフォルトの発酵セットアップでは、最初の４２時間は８％のＮＨ４ＯＨを使用してｐＨをｐＨ５．０にて制御し、次に残りのプロセスについては１６％のＮＨ４ＯＨに切り替える。

ある処理のセットでは、最初の４２時間は８％のＮＨ４ＯＨを使用して、初めは発酵をｐＨ５．０にて制御し、次に、１６％のＮＨ４ＯＨを使用して５時間の時間間隔でｐＨ６．０に増やして（１時間当たり０．２ｐＨ単位の増加）プロセスの最後まで至る。表１３に示す結果を参照。第２の処理のセットでは、最初の４２時間はＮＨ４ＯＨを使用し、それ以降は１６％のＮＨ４ＯＨを使用して、プロセスの終始にわたり発酵のｐＨをｐＨ６．０にて制御する。表１４に示す結果を参照。

上述の条件のセット全てにおいて、７００ｍＬのフィード培地を用いた。

実施例１に記載のようにＲｅｂ Ｄ及びＲｅｂ Ｍのレベルを調べるため、培養物試料全体を（細胞除去なしで）取り出し、等体積のＤＭＳＯ中で煮沸した。

ｐＨ５．０（対照）ｖｓ．高いｐＨの酵母株Ｅを使用して実施した発酵についての結果概要を表１３に示す。全ブロス試料において測定された全てのステビオールグリコシドについて、正規化された結果を提示する。

ｐＨ５．０（対照）ｖｓ．高いｐＨで酵母株Ｄを使用して実施した発酵についての結果概要を表１４に示す。全ブロス試料において測定された全てのステビオールグリコシドの正規化された結果を、下の表に提示する。

この実施例では、全ケースにおいて、全ての発酵経過時間が同等であり、供給された基質（グルコース）の量も同じであった。そのため、ｐＨ６．０での発酵プロセスの操作を、バッチ期の開始から行う場合及び最初の４２時間の後に増加を実施する場合の両方において、追加の株によるＲｅｂ Ｄ及びＭの力価の増加、グルコースにおける収率の増加、及び産生速度の増加がもたらされたことになる。

Claims (68)

1. ステビオールグリコシドを産生する方法であって、
   １つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生する遺伝子操作酵母を用いて５．８以上のｐＨにて発酵培地を発酵させることを含み、前記１つ以上のステビオールグリコシドが、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭまたはＤ：Ｍ比率が１：２０以上であるレバウジオシドＤＭを含む、前記方法。
2. 前記ｐＨが５．８〜８の範囲である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｐＨが６．０〜７．５の範囲である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ｐＨが６．５〜７．５の範囲である、請求項２に記載の方法。
5. 前記ｐＨが５．８〜６．５の範囲である、請求項２に記載の方法。
6. 前記ｐＨが５．８〜６．２の範囲である、請求項２に記載の方法。
7. 前記発酵培地が、水酸化アンモニウム、酵母抽出物、尿素、及び硫酸アンモニウムから選択される窒素源を含む、請求項１に記載の方法。
8. 水酸化アンモニウムまたは尿素が、前記培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、請求項７に記載の方法。
9. 前記培地が、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属、ビタミン、及び消泡剤を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記遺伝子操作酵母を含む前記培地に対する、追加の発酵材料の連続的添加またはバッチ添加をさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 最長１５０時間までの期間の間実施される、請求項１に記載の方法。
12. ８〜８８時間の範囲の期間の間実施される、請求項１１に記載の方法。
13. ２２〜４８時間の範囲の期間の間実施される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記発酵培地が、２０〜１２０ｇ ｄｃｗ／Ｌの範囲の生物体量を有する、請求項１に記載の方法。
15. 前記遺伝子操作酵母の産生する１つ以上のグリコシド（複数可）が、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が第１のｐＨにて維持された場合に産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドの量よりも１０％以上多い、請求項１に記載の方法。
16. 前記遺伝子操作酵母が産生する、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）が、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生される前記１つ以上のステビオールグリコシドの量よりも２０％以上多い、請求項１５に記載の方法。
17. 前記遺伝子操作酵母がｐＨ５．８以上で産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が第１のｐＨにて維持された場合に産生されるレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率よりも大きいを、請求項１に記載の方法。
18. 前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０〜１：１の範囲である、請求項１に記載の方法。
19. 前記遺伝子操作酵母を、第１の培地中で第１のｐＨにて増殖させることをさらに含み、前記第１のｐＨが前記発酵培地の前記ｐＨと同じである、請求項１に記載の方法。
20. ステビオールグリコシドを産生する方法であって、
    （ａ）第１の培地中で第１のｐＨにて、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生可能な遺伝子操作酵母を増殖させることと、
    （ｂ）前記第１の培地に組成物を添加して、前記第１のｐＨよりも高い第２のｐＨを有する第２の培地を用意することと、
    （ｃ）前記遺伝子操作酵母を用いて第２の培地を発酵させて、前記第２の培地中で前記第２のｐＨにて、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生することと、を含む前記方法。
21. 前記第１のｐＨが５．８未満である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第１のｐＨが４．０〜５．５の範囲である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第２のｐＨが５．０より大きい、請求項２１に記載の方法。
24. 前記第２のｐＨが５．８〜８の範囲である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記第２のｐＨが５．８〜７．５の範囲である、請求項２１に記載の方法。
26. 前記ｐＨが６．５〜７．５の範囲である、請求項２１に記載の方法。
27. 前記ｐＨが５．８〜６．５の範囲である、請求項２１に記載の方法。
28. 前記ｐＨが５．８〜６．２の範囲である、請求項２１に記載の方法。
29. 前記組成物が、前記第２のｐＨを調整するための塩基を含む、請求項２０に記載の方法。
30. 前記塩基が、水酸化アンモニウム、酵母抽出物、尿素、及び硫酸アンモニウムからなる群から選択される窒素含有化合物を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 水酸化アンモニウム、酵母抽出物、尿素、または硫酸アンモニウムが、前記培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための主要窒素源である、請求項２０に記載の方法。
32. 水酸化アンモニウムまたは尿素が、前記第２の培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、請求項３１に記載の方法。
33. ステップ（ｂ）において、前記組成物が非窒素塩基を含む、請求項２０に記載の方法。
34. 前記非窒素塩基が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及び水酸化カルシウムからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
35. 水酸化アンモニウム、尿素、または硫酸アンモニウムが、前記第２の培地における前記遺伝子操作酵母の発酵のための前記窒素源の９０％（ｗｔ）以上、または９５％（ｗｔ）以上である、請求項２９に記載の方法。
36. ステップ（ａ）において、前記第１の培地が、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせを含み、ステップ（ｂ）において、前記第２のｐＨが、前記第１の培地に、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ、及び任意選択により非窒素塩基、を含む前記組成物を添加することによって達成される、請求項２０に記載の方法。
37. 前記第１の培地が２５ｇ／Ｌ以下の濃度でグルコースを含む、請求項２０に記載の方法。
38. 前記第１の培地が、グルコース、水酸化アンモニウムまたは尿素以外の窒素源、カリウム源、マグネシウム源、微量金属、及びビタミンを含む、請求項２０に記載の方法。
39. 前記第２の培地が４００ｇ／Ｌ〜７５０ｇ／Ｌの範囲の濃度でグルコースを含む、請求項２０に記載の方法。
40. ステップ（ｂ）において、前記第２の培地が、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属、ビタミン、及び消泡剤を含む、請求項２０に記載の方法。
41. ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母を含む前記第２の培地に対する、追加の発酵材料の連続的添加またはバッチ添加を含む、請求項２０に記載の方法。
42. ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２時間以降に実施される、請求項２０に記載の方法。
43. ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から最長１５０時間までに実施される、請求項２０に記載の方法。
44. ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から１０時間以降または最長９６時間までに実施される、請求項４２に記載の方法。
45. ステップ（ｂ）が、前記遺伝子操作酵母の初期培養から２４時間以降または最長７２時間までに実施される、請求項４２に記載の方法。
46. 前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生する、前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）の量よりも１０％以上多い、を、請求項２０に記載の方法。
47. 前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨで維持された場合に産生する前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）の量よりも２０％以上多い、請求項４５に記載の方法。
48. 前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）が、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭ及びレバウジオシドＤの両方を含む、請求項２０に記載の方法。
49. 前記遺伝子操作酵母がステップ（ｂ）において前記第２のｐＨにて産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率は、発酵の終始にわたり遺伝子操作酵母が前記第１のｐＨにて維持された場合に産生するレバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率よりも大きい、請求項４７に記載の方法。
50. ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０以上である、請求項４７に記載の方法。
51. ステップ（ｂ）における前記レバウジオシドＤ：レバウジオシドＭの比率が１：２０〜１：１の範囲である、請求項４９に記載の方法。
52. 前記遺伝子操作酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来である、請求項１から５０のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記遺伝子操作酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項５１に記載の方法。
54. 前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、請求項１から５３のいずれか１項に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド、ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０リダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１−Ｄ２ポリペプチド、及びＥＵＧＴ１１ポリペプチド
55. 前記遺伝子操作酵母が、前記酵母に対して異種である以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードする１つ以上の外因性核酸（複数可）を発現する、請求項１から５４のいずれか１項に記載の方法：ＧＧＰＰＳポリペプチド（配列番号６）、切断型Ｚｅａ ｍａｙｓ ＣＤＰＳポリペプチド（配列番号７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＫＳポリペプチド（配列番号８）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＫＯポリペプチド（配列番号９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＡＴＲ２ポリペプチド（配列番号１１）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＥＵＧＴ １１ポリペプチド（配列番号１３）、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチド（配列番号１４）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＣＰＲ８ポリペプチド（配列番号１６）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２）ポリペプチド、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド（配列番号１）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（配列番号３）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号４）、変異体または機能的ホモログ、及びＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂポリペプチド（配列番号５）。
56. 前記遺伝子操作酵母を含むシード培地を用意するステップをさらに含み、続いて前記シード培地が、前記第１のｐＨの前記第１培地を形成するために使用される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
57. ステップ（ａ）〜（ｃ）が単一の容器中で実施される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
58. ステップ（ａ）〜（ｃ）が２つ以上の異なる容器中で実施される、請求項２０から５６のいずれか１項に記載の方法。
59. 遺伝子操作酵母において、第１の低分子量ステビオールグリコシドの産生を、第２の高分子量ステビオールグリコシドに対して増加させる方法であって、１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生できる遺伝子操作酵母を、発酵培地中で５．８以上のｐＨにて発酵させるステップを含み、前記遺伝子操作酵母が、５．８未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２ステビオールグリコシドの比率よりも大きい比率の前記第１及び第２のステビオールグリコシドを５．８以上のｐＨにて産生する、前記方法。
60. ５．８以上のｐＨにおける前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率が、５．８未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率の１０％以上である、請求項５８に記載の方法。
61. ５．８以上のｐＨにおける前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率が、５．８未満のｐＨにて産生される前記第１及び第２のステビオールグリコシドの前記比率の２５％以上である、請求項５９に記載の方法。
62. 前記第１のステビオールグリコシドがレバウジオシドＤであり、前記第２のステビオールグリコシドがレバウジオシドＭである、請求項５８に記載の方法。
63. 前記１つ以上のステビオールグリコシド（複数可）を産生するために遺伝子操作酵母を使用する発酵方法に由来する組成物であって、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：２０以上の比率で含む、前記組成物。
64. レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項６２に記載の組成物。
65. レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１．７５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項６３に記載の組成物。
66. レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭをそれぞれ１：１．５〜１：１の範囲の比率で含む、請求項６４に記載の組成物。
67. 発酵培地である、請求項５８から６５のいずれか１項に記載の組成物。
68. 前記発酵培地が、１ｇ／Ｌ以上、１．２５ｇ／Ｌ以上、１．５ｇ／Ｌ以上、１．７５ｇ／Ｌ以上、または２．０ｇ／Ｌ以上のレバウジオシドＤ濃度を有する、請求項６６に記載の組成物。

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