CN117015611A

CN117015611A - 木糖基化甜菊醇糖苷和用于生产的酶促方法

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Publication number: CN117015611A
Application number: CN202280022642.4A
Authority: CN
Inventors: E·艾文斯; D·S·加斯帕德; P·基里亚库; 艾琳·凯思琳·马拉斯科; 郑国华
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2021-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2023-11-07
Also published as: CL2023002544A1; JP2024508795A; EP4301866A1; MX2023010079A; US20240182941A1; CA3209929A1; WO2022187819A9; BR112023017663A2; WO2022187819A1

Abstract

本发明公开了用于生产木糖基化甜菊醇糖苷的方法和组合物，这些木糖基化甜菊醇糖苷包括连接到甜菊醇碱的19位碳的木糖残基或包括木糖残基的低聚糖部分。具有UDP‑木糖:19‑甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶(诸如SEQ ID NO:1或其同系物或变体中的一者)使用具有与连接到该甜菊醇碱的该第19位碳的葡萄糖残基的甜菊醇糖苷受体来形成该木糖基化甜菊醇糖苷。还描述了具有增加的活性的糖基转移酶变体。

Description

木糖基化甜菊醇糖苷和用于生产的酶促方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月1日提交的美国临时专利申请号63/155,229的权益，该美国临时专利申请全文以引用方式并入本文。

对通过EFS-Web提交的序列表的参考

名称为“PT_923_WO_ST25.txt”的序列表的ASCII文本文件(大小为43.7kb)的内容在2022年3月1日创建并且通过EFS-Web与本申请一起电子提交，其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及木糖基化甜菊醇糖苷和用于其生产的酶促方法。

背景技术

糖(诸如蔗糖、果糖和葡萄糖)被用于为饮料、食品、药物和口腔卫生/化妆产品提供令人愉快的味道。特别地，蔗糖赋予消费者喜欢的味道。尽管蔗糖提供优异的甜味特征，但它也有热量。已经引入无热量或较低热量的甜味剂以满足消费者需求，并且期望这些类型的甜味剂具有有利的味道特征。

甜叶菊是向日葵家族(菊科(Asteraceae))中约240种草本植物和灌木的属，原产于从西北美洲到南美的亚热带和热带地区。物种甜叶菊(Stevia rebaudiana)通常称为甜叶、甜的叶子、糖叶或简单地甜叶菊，因其甜的叶子而广泛种植。基于甜叶菊的甜味剂可通过从叶子中提取一种或多种甜味化合物而获得。这些化合物中的许多化合物是甜菊醇糖苷，其是甜菊醇(一种二萜化合物)的糖苷。这些二萜糖苷是糖的甜味的约150倍至450倍。

甜菊醇糖苷的示例描述于WO 2013/096420(参见例如，图1中的列表)；和Ohta等人，(2010)“Characterization of Novel Steviol Glycosides from Leaves of Steviarebaudiana Morita,”J.Appl.Glycosi.,57:199-209(参见例如，第204页的表4)中。在结构上，如图2a至图2k所示，二萜糖苷的特征在于单一碱甜菊醇，并且不同之处在于在C13和C19位处存在碳水化合物残基。还可参见PCT专利公开WO 20013/096420。

在甜叶菊(S.rebaudiana)中最丰富的甜菊醇糖苷是1,2-甜菊苷、莱苞迪苷A(RebA)和莱苞迪苷C(Reb C)，它们分别占叶子干重的5％-10％、2％-4％和1％-2％(Chatsudthipong,V.和Muanprasat,C.(2009)Stevioside and related compounds:therapeutic benefits beyond sweetness.Pharmacol Ther.；121:41–54)。Reb A是蔗糖的甜味的250倍至300倍，但具有苦的持久余味(Prakash,I.等人(2014)Development ofnext generation stevia sweetener:rebaudioside M.Foods 3:162–75)。Reb C是葡萄糖的甜味的仅30倍，区别在于在C13位处连接到葡萄糖部分的鼠李糖部分(DuBois,G.E.和Stephenson,R.A.(1985)Diterpenoid sweeteners.Synthesis and sensory evaluationof stevioside analogues with improved organoleptic properties.J.Med.Chem.28:93–8.)。莱苞迪苷D(Reb D)和莱苞迪苷M(Reb M)具有高达蔗糖的350倍的甜味效力，苦味较少(Prakash)。与Reb A和其他甜菊醇糖苷相比(Prakash)，Reb M的特征在于高甜味强度、快速甜味开始、纯正味道以及大大降低的甘草味、苦味、酸味和涩味余味。Reb D和Reb M仅以微量存在于甜叶菊的叶子中(在中国传统植物中，占总干重的约0.4％w/w至1.5％w/w)。

发明内容

本公开提供了用于生产木糖基化甜菊醇糖苷的酶促方法。在各方面，木糖基化可在反应组合物中进行，或者可在工程化细胞中进行。本公开还提供了能够产生木糖基化甜菊醇糖苷的工程化细胞，以及包含木糖基化甜菊醇糖苷的组合物。本公开的方面基于与具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽(包括SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的那些)的鉴定相关的实验发现，这些糖基转移酶多肽可以利用活化的木糖来提供具有连接到甜菊醇碱的19C位的木糖残基或包含木糖残基的低聚糖部分的甜菊醇糖苷。

在一些方面，本公开提供了用于形成木糖基化甜菊醇糖苷的方法。该方法包括使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶在体外或在工程化细胞中由式I的化合物形成式II的化合物。式I是：

其中R¹包含葡萄糖残基，并且R²包含一个或多个糖残基或为氢。该糖基转移酶将木糖从活化的木糖转移至该式I的化合物以形成式II的化合物：

其中R³包含由该糖基转移酶添加的一个或多个木糖残基，并且R⁴与R²相同或包含一个或多个额外的糖残基。

具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的那些、它们的变体以及它们的同系物。

在式II木糖基化产物中，R³包括木糖残基，并且R⁴可具有与式I的化合物中的R²相同的化学性质，或者R⁴与R²相比可包括一个或多个额外的糖残基。在各方面，R⁴是包含木糖残基的低聚糖部分，诸如β-Glc-β-Xyl，其可具有Glc2C→Xyl1C糖苷键。在各方面，R⁴可包括一个或多个其他糖残基，诸如葡萄糖或鼠李糖。在其他方面，在19位变成木糖基化的式I的化合物选自甜菊苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G和杜尔可苷A，其中甜菊苷、RebA和RebC是优选的底物。

在一些方法中，本文公开的方法提供了式II的化合物：

化学注释的SG-[13-β-Glc[(3→1)β-Glc](2→1)β-Glc(1-2)]-[19-β-Glc(2→1)β-Xyl，命名为莱苞迪苷DG(RebDG)。

在一些方面，本公开提供了形成木糖基化甜菊醇糖苷的方法，其中该方法使用反应组合物。反应组合物包含(i)式I的甜菊醇糖苷化合物，(ii)活化的木糖；和(iii)具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶。由反应组合物形成产物组合物，其中通过糖基转移酶将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物而形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物，诸如RebDG。

在各方面，在反应组合物中，式I的化合物可以超过50％(mol)且至多100％(mol)的甜菊醇糖苷受体的量存在于其中。反应组合物可包括组分诸如非活化的糖和盐、期望范围内的pH、活化的木糖、甜菊醇糖苷受体和相对于活化的木糖至甜菊醇糖苷受体的期望量的多肽，以提供用于将木糖转移至甜菊醇糖苷受体的优化反应条件。在一些方面，使用相对于甜菊醇糖苷受体摩尔过量的活化的木糖。在该方法中，超过2％、5％、7％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、75％或超过80％的式I的甜菊醇糖苷化合物可被转化为式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物，诸如RebDG。

在其他方面，本公开提供了用于使用工程化细胞形成木糖基化甜菊醇糖苷的方法，其中工程化细胞能够制备式I的甜菊醇糖苷化合物，并且其中该细胞表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶，诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中的一者，或与SEQ ID NO:1-3中的任一者的糖基转移酶多肽具有至少50％的同一性的多肽。

在工程化细胞中提供活化的木糖，诸如通过将活化的木糖从外部来源供给至细胞，或者工程化细胞能够产生活化的木糖。多肽将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物以形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。在一些方面，可向细胞供给甜菊醇糖苷(前体)化合物，该甜菊醇糖苷化合物用于制备用作受体分子的式I的甜菊醇糖苷化合物。在一些方面，向细胞供给式I的甜菊醇糖苷化合物，诸如RebA，该甜菊醇糖苷化合物然后可直接用作木糖基化的受体以形成式II的化合物，诸如RebDG。

在其他方面，本公开提供了具有用于形成式I的甜菊醇糖苷化合物的途径的工程化细胞。该细胞被工程化以提供式I的甜菊醇糖苷化合物，诸如甜菊苷、RebA或RebC，其量大于细胞中可能形成的非式I的甜菊醇糖苷的量。该细胞还表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶，其中该多肽能够将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物以形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

在其他方面，本公开提供了包含甜菊醇糖苷混合物的可摄取或含水组合物，该甜菊醇糖苷混合物包含式II的化合物，其中式II的化合物(诸如RebDG)以大于组合物中任何其他单一甜菊醇糖苷的量存在。在另一个方面，在这样的可摄取或含水组合物中存在2种或更多种式II的化合物，并且式II的化合物以大于组合物中其他甜菊醇糖苷的总量的总量存在。在另一个方面，可摄取或含水组合物包含任选地包含莱苞迪苷M的甜菊醇糖苷混合物，该甜菊醇糖苷混合物包含以大于莱苞迪苷M的量存在的式II的化合物(如果存在任何莱苞迪苷M的话)，并且式II的化合物任选地占可摄取或含水组合物中所有甜菊醇糖苷的1％(mol)或更多，例如，2％、3％或5％(mol)或更多。

包含甜菊醇糖苷混合物的组合物可从包含具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶的反应组合物或工程化细胞获得。

在又一个方面，本公开提供了具有令人惊讶的高水平的UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的工程化糖基转移酶变体。糖基转移酶变体包括相对于SEQ ID NO:1在152位处将丝氨酸(野生型)改变为异亮氨酸(变体)残基的变体氨基酸。在存在活化的木糖的情况下，氨基酸改变导致甜菊醇糖苷在19位处的木糖基化显著增加。

因此，在另一个方面，本公开提供了具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶变体，该糖基转移酶变体包含与SEQ ID NO:1具有50％或更多、90％或更多、95％或更多、或98％或更多的同一性的多肽以及以下氨基酸：I152。在一些方面，糖基转移酶变体是SEQ ID NO:2，其具有相对于SEQ ID NO:1在152位处具有单个丝氨酸至异亮氨酸改变的序列。

附图说明

图1示出了甜菊醇碱的化学结构和具有R¹和R²基团的化学定义的各种甜菊醇糖苷的表格。

图2示出了使用真核生物和/或古细菌酶将乙酰-CoA转化为异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的甲羟戊酸(MVA)途径。

图3示出了将甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)酶促转化为IPP和DMAPP的非甲羟戊酸(MEP)途径。

图4示出了将IPP和焦磷酸法尼酯(FPP)转化为甜菊醇的酶途径。

图5是示出使用SEQ ID NO:1的酶和UGT76G1酶的UDP-木糖的平均SG受体转化％的图。

图6是SEQ ID NO:1(AC133334)的氨基酸序列。

图7是SEQ ID NO:1与其他糖基转移酶或其变体的氨基酸序列比对。

图8A是示出在存在SEQ ID NO:1的多肽和1mM活化的糖的情况下，葡萄糖和木糖随时间从UDP-葡萄糖和UDP-木糖转移至RebA的图。

图8B是示出在存在SEQ ID NO:1的多肽和2mM活化的糖的情况下，葡萄糖、木糖和鼠李糖随时间从UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-鼠李糖转移至RebA的图。

图9A至图9C是示出在存在SEQ ID NO:1的多肽的情况下，葡萄糖、木糖和鼠李糖随时间从UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-鼠李糖转移至Reb F、Reb G和杜尔可苷A的-19C(O)-β-Glc残基的图。

图10是SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2-4的氨基酸序列比对。

具体实施方式

本文所述的公开内容的各方面并非旨在为穷举性的或将权利要求限制为下文详细描述中所公开的确切形式。相反，所选择和所描述的各方面的目的在于可以有利于本领域其他技术人员对本公开的原理和实践的了解和理解。

本公开的方法提供了使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶和活化的木糖分子从甜菊醇糖苷受体分子形成木糖基化甜菊醇糖苷的方式，该糖基转移酶在一些方面是与SEQ ID NO:1-3中的任一者具有至少50％的同一性的多肽。已经发现，在存在SEQ ID NO:1的糖基转移酶多肽和活化的木糖的情况下，甜菊醇糖苷受体分子优先在第19碳位上木糖基化以形成木糖基化甜菊醇糖苷，这些木糖基化甜菊醇糖苷具有连接到第19位碳的木糖残基，或具有连接到第19位碳的低聚糖中存在的一个或多个木糖残基。

本公开的方法可使用反应组合物进行(例如，不需要工程化细胞的体外方法)，该反应组合物包含甜菊醇糖苷受体、具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶(诸如与SEQ ID NO:1-3中的任一者具有至少50％的同一性的糖基转移酶多肽)和活化的木糖(诸如UDP-木糖)。

本公开的方法还可使用表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶(诸如与SEQ ID NO:1-3中的任一者具有至少50％的同一性的糖基转移酶多肽)和活化的木糖(诸如UDP-木糖)的工程化细胞来进行。工程化细胞还可具有制备甜菊醇糖苷化合物的途径，该甜菊醇糖苷化合物是用于在第19碳位处木糖基化的受体分子。在一些方面，工程化细胞还可具有制备活化的木糖的途径，该活化的木糖可被多肽用于使甜菊醇糖苷化合物木糖基化。例如，工程化细胞还可包括用于生产UDP-木糖的UDP-葡萄糖脱氢酶和/或UDP-葡糖醛酸脱羧酶中的一者或多者。另选地，可向工程化细胞供给活化的木糖，该活化的木糖可被细胞摄取并被糖基转移酶多肽使用。另选地，可向工程化细胞供给将能够作为用于在19C位上木糖基化的受体分子或作为形成甜菊醇糖苷受体分子的前体的甜菊醇糖苷分子。

如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，即，连接至甜菊醇碱的一个或多个糖残基。在结构上，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(其是单一的甜菊醇碱)和连接到甜菊醇碱的C13和/或C19原子上的糖(吡喃葡糖基)残基，根据下面所示碱上的原子编号。即，一个或多个吡喃葡糖基残基可存在于式I中的基团R¹和/或R²中：

可存在于甜菊醇糖苷中的吡喃葡糖基残基包括基于葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖的那些。其他糖残基诸如果糖和脱氧葡萄糖可存在于甜菊醇糖苷中。如果R¹和/或R²中的一者或两者具有单个吡喃葡糖基残基，则其可被称为甜菊醇糖苷的单糖部分或单糖残基。如果R¹和/或R²中的一者或两者具有两个或更多个吡喃葡糖基残基，则其可被称为甜菊醇糖苷的低聚糖部分/残基。低聚糖部分可由该部分内相同类型的吡喃葡糖基残基组成(同低聚糖部分)，或可由该部分内不同类型的吡喃葡糖基残基组成(异低聚糖部分)。

低聚糖部分还可根据低聚糖中吡喃葡糖基残基之间的化学键来描述。例如，在低聚糖部分中，键可以是1→2、1→3、1→4或1→6、α或β糖苷键，基于吡喃葡糖基环上的编号和糖苷键的立体化学。在α糖苷键中，从异头碳到糖苷键的氧的键从吡喃葡糖基环向下取向，而在β糖苷键中，键从吡喃葡糖基环向上取向。甜菊醇糖苷的低聚糖部分可具有直链或支链构型，其中支链构型具有至少一个与低聚糖部分中的两个或更多个其他糖残基键合的糖残基。吡喃葡糖基残基可任选地根据它们与甜菊醇碱的19C和13C原子的有序连接来描述，诸如伯、仲、叔残基，其中伯吡喃葡糖基残基直接与19C和/或13C原子键合，仲吡喃葡糖基残基直接与伯吡喃葡糖基残基键合，叔吡喃葡糖基残基直接与仲吡喃葡糖基残基键合等。各种已知的甜菊醇糖苷示于图1中，参照式I甜菊醇碱结构，以及分别与甜菊醇碱的19C和13C位连接的R¹和R²基团。参见例如Compendium of Food Additive Specifications(食品添加剂联合FAO/WHO专家委员会；2017年第84届会议，FAO JECFA专著)。

本公开的方法使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶。“糖基转移酶”一般是指能够将糖部分转移至受体分子的酶，以及能够将糖部分分别转移至甜菊醇碱受体或甜菊醇糖苷受体的“甜菊醇糖基转移酶”或“甜菊醇糖苷糖基转移酶”。糖基转移酶还可根据其在甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的一个或多个特定位置处添加一个或多个特定糖部分的活性来描述。根据本公开的方法、组合物和工程化，使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶，诸如SEQ ID NO:1的多肽。UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性是指将木糖部分从UDP-木糖转移至19C原子或将直接或间接连接到19C原子(并从19C原子延伸)的糖残基转移至甜菊醇受体分子的酶活性。糖基转移酶可不排他地具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性，并且可(或可不)具有另外的且不同的糖基转移酶活性，诸如UDP-木糖:13-甜菊醇木糖基转移酶活性，和/或UDP-葡萄糖:19-甜菊醇葡糖基转移酶活性，和/或UDP-葡萄糖:19-甜菊醇葡糖基转移酶活性，和/或UDP-鼠李糖:19-甜菊醇鼠李糖基转移酶活性，和/或UDP-鼠李糖:19-甜菊醇鼠李糖基转移酶活性。本公开的糖基转移酶可优先将木糖添加至–甜菊醇/甜菊醇糖苷的19位(超过13位)。糖基转移酶在19位处优先添加木糖的能力可通过使用包括糖基转移酶和UDP-木糖的组合物进行测定以及分析反应产物来确定，其中大于50％mol(或>60％、>70％、>80％、>90％、>95％、>97％、>98％或>99％)的产物是在19(c)位上木糖基化的甜菊醇糖苷。

在各方面，与SEQ ID NO:1-3中的任一者具有至少50％的同一性的糖基转移酶多肽用于将一个或多个木糖残基转移至甜菊醇糖苷受体分子的第19碳位。在该方法中，甜菊醇糖苷受体分子具有单个吡喃葡萄糖部分或低聚糖部分，该低聚糖部分包括连接到甜菊醇糖苷的第19位碳的一个或多个吡喃葡萄糖残基。甜菊醇糖苷受体可以是式I的化合物：

其中R¹包含葡萄糖残基，并且R²包含一个或多个糖残基或为氢。用于木糖基化的示例性甜菊醇糖苷受体是甜菊苷、莱苞迪苷A(RebA)、莱苞迪苷C(RebC)、莱苞迪苷D(RebD)、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G和杜尔可苷A，其中甜菊苷、RebA和RebC是优选的底物。

在一些情况下，SEQ ID NO:1、2或3的糖基转移酶多肽利用活化的木糖在第19碳位处将木糖连接到吡喃葡萄糖残基，产生包括糖苷连接至木糖残基的吡喃葡萄糖残基的低聚糖。酶促反应可产生式II的化合物：

其中R³包括木糖残基，并且其中R⁴具有与式I的化合物中的R²相同的化学性质，或者R⁴与R²相比包括一个或多个额外的糖残基。在一些情况下，糖基转移酶将一个或多个木糖、葡萄糖或鼠李糖部分添加至13碳位(例如，添加至连接到13碳位的糖残基)。在多个方面中，R³是包含木糖残基的低聚糖部分，诸如β-Glc-β-Xyl，其可具有Glc2C→Xyl1C糖苷键。例如，木糖基化甜菊醇糖苷可包括连接到甜菊醇碱的第19位碳的低聚糖部分(R³)，包括β-Glc-β-Xyl，其中β-Glc-β-Xyl可具有Glc2C→Xyl1C糖苷键。式II的示例性产物是SG-[13-β-Glc[(3→1)β-Glc](2→1)β-Glc(1-2)]-[19-β-Glc(2→1)β-Xyl，其被称为莱苞迪苷DG(RebDG)。

糖基转移酶构成催化糖(糖基)部分转移至受体分子上的酶家族。常见受体分子包括糖类和非糖类，包括多糖、糖蛋白、糖脂和萜烯。活化的单糖(通常为核苷二磷酸糖的形式)用作将糖部分转移至受体分子的底物。单糖单元可转移至甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或转移至与甜菊醇碱连接的葡萄糖基团上的羟基基团。糖基转移酶可反转糖的端基异构构型，诸如从UDP-葡萄糖形成β-葡糖苷，或者保留端基异构构型，诸如从UDP-葡萄糖形成α-葡糖苷。

尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)是家族1糖基转移酶(GT)的成员，其进行天然产物的糖基化，特别是各种糖向植物天然产物的转移。还有许多UGT基因亚家族参与不同类型的植物产物的糖基化。例如，参见Wang,X.(2009)FEBS Letters 583:3303–3309。基于序列同源性将GT分类为家族和亚家族。参见Li等人，2001,J.Biol.Chem.276:4338-4343。已经在模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定了编码UGT的超过100个基因的超家族，每个基因含有42个氨基酸共有序列，并且也已经在若干其他高等植物物种中鉴定了编码UGT的基因。每个GT家族由序列相关的蛋白质组成，因此也由蛋白质折叠的类型相关的蛋白质组成。因此，基于催化机制的保守性，在该家族内存在可预测性。还通过氨基酸序列相似性将GT多肽分类为家族(例如，参见Coutinho等人，2003)。GT家族和成员的列表可在碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate Active enZyme database)(afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY)中找到，该列表正在积极编辑中。

一些植物UGT的晶体结构揭示了GT-B折叠的存在，GT-B折叠是酶的GT超家族的两个一般折叠之一，并且这些UGT还具有带有类似罗斯曼样折叠的两个N和C末端结构域。一些UGT晶体结构包括下式的那些M.truncatula UGT71G1、UGT85H2、UGT78G1、葡萄(Vitisvinifera)VvGT126和拟南芥(A.thaliana)UGT72B1。参见例如，Shao,H.等人(2005)PlantCell,17:3141-3154；Modolo,L.V.等人(2009),pp.J.Mol.Biol.,392:1292-1302；L.Li,L.等人(2007)J.Mol.Biol.,370:951-963；Offen,W.等人(2006)EMBO J.,25:1396-1405；Brazier,M.等人(2007),Proc.Natl.Acad.Sci.104:20238-20243；以及Bourne,Y.和Henrissat,B.(2001)Curr.Opin.Struct.Biol.,11:593-600。还可参见Lin,M.等人(Biochemical Engineering Journal,59,2020)，其使用计算策略描述了SEQ ID NO:1的模型化结构，所述计算策略将蛋白结构预测、序列优化和分子动力学模拟合并以改善UDP-依赖性糖基转移酶SEQ ID NO:1用于从莱苞迪苷A合成莱苞迪苷D的催化效力。

SEQ ID NO:1的酶属于GT-B折叠亚家族UGT。SEQ ID NO:1对应于来自水稻(Oryzasativa)日本组的462个氨基酸的尿苷5'-二磷酸(UDP)糖基转移酶(参见例如，美国专利号9,631,215(#152)和检索号AC133334。基于与其他EUGT的比对，可在SEQ ID NO:1中鉴定保守结构域的氨基酸残基，包括活性位点、底物结合凹坑和TDP结合位点。

本公开的方法使用与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的多肽。优选地，糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性。在一些方面，糖基转移酶与SEQID NO:1具有100％的同一性。

使用计算机建模系统来预测SEQ ID NO:1的多肽和配体的相互作用，这又基于SEQID NO:1的同系物的解析结构。通过该计算机建模，对于SEQ ID NO:1-RebA-UDP-木糖和SEQID NO:1-RebA-UDP-葡萄糖获得揭示具有SEQ ID NO:1的与底物接触的氨基酸残基的数据。数据揭示了参与RebA-UDP-木糖(配体)相互作用的以下氨基酸：W22、L23、A24、F25、G26、H27、L28、L29、P30、L57、P59、D90、V91、P92、H93、D94、R95、P96、D97、M98、V99、D128、F130、L150、G151、S152、M155、R190、M191、K192、R195、T196、K197、S199、S200、G201、M202、S203、L204、A205、R221、P249、P250、L251、Y277、A279、L280、G281、S282、E283、V284、P285、A308、L309、R310、R338、W339、V340、P341、Q342、M343、L346、F354、H357、C358、G359、W360、N361、S362、T363、E365、I378、F379、G380、D381、Q382和N385(氨基酸列表“A”)；。数据显示相同的氨基酸参与RebA-UDP-葡萄糖(配体)相互作用，除以下例外：P59和D128参与UDP-木糖(配体)相互作用但不参与UDP-葡萄糖相互作用，并且L149、S203、R310和I378参与UDP-葡萄糖(配体)相互作用但不参与UDP-木糖(配体)相互作用，尽管S203、R310和I378仍参与RebA相互作用。

比较序列分析揭示了在SEQ ID NO:1和其他UGT之间高度保守的以下氨基酸：M1、H16、V18、P21、W22、L23、A24、F25、G26、H27、P30、L34、L38、A39、G42、H43、S46、S49、T50、P51、N53、R56、L57、P58、V71、P76、L81、P82、A85、E86、T88、D90、A105、D107、L109、L117、D123、D128、W133、A138、A153、P180、E187、S200、R207、R221、S222、E225、E227、P241、G246、P249、W266、L267、Q270、S274、V275、Y277、V278、A279、G281、S282、E283、E293、L294、A295、G297、L298、E299、F305、W307、R310、L321、P322、G324、F325、R328、G333、V335、W339、P341、Q342、I345、L346、H348、V351、G352、F354、L355、T356、H357、G359、S362、E365、L373、L376、P377、D381、Q382、G383、N385、A386、R387、G395、V398、R400、D404、G405、F407、V412、A413、V419和A433(氨基酸列表“B”)。

比较分析还揭示了在UGT中高度保守但在SEQ ID NO:1中不高度保守的以下氨基酸：M15、A35、Q36、S87、H102、R103、V143、F244、M248、A301、R304、A350、A415、S425和Q430(氨基酸列表“C”)。

在一些方面中，糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有小于99.8％的同一性但大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性，并且其中糖基转移酶具有不在氨基酸列表“A”中的位置、不在氨基酸列表“B”中的位置或不在“A”和“B”两者中的位置的一个或多个变体氨基酸。在一些方面中，基于SEQ ID NO:1的糖基转移酶具有不在氨基酸列表“C”中的位置的一个或多个变体氨基酸。

在一些方面，具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶包括以下氨基酸基序中的一个或多个氨基酸基序：SEQ ID NO:1：WLAFGHLLP(SEQ ID NO:5)；LPP；NDVPHDRPDMV(SEQ ID NO:6)；DVF,LLGSAHM(SEQ ID NO:7)；RMKLIRTKGSSGMSLA(SEQ ID NO:8)；PPL；YVALGSEVP(SEQ ID NO:9)；ALR；RWVPQMSIL(SEQ ID NO:10)；FLTHCGWNSTIE(SEQ IDNO:11)；IFGDQGPN(SEQ ID NO:12)。这些基序对应于SEQ ID NO:1中的以下氨基酸位置：22-30、57-59、90-99、128-130、149-155、190-205、249-251、277-285、308-310、338-346、354-365和378-385。

Hughes和Hughes(DNA Sequence,5:41-49,1994)表明所有糖基转移酶的共有基序可被精制并向蛋白质的N-末端延伸成次级代谢植物UGT典型的44-氨基酸共有序列。该植物次级产物糖基转移酶(PSPG)基序后来在来自其他植物物种的所有克隆的次级代谢UGT中发现。

在一些方面，具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶的糖基转移酶在参与RebA-UDP-葡萄糖(配体)相互作用但不参与RebA-UDP-木糖(配体)相互作用的位置处具有一个或多个变体氨基酸。如本文所述，数据显示相同的氨基酸参与RebA-UDP-葡萄糖(配体)相互作用，除以下例外：P59和D128参与UDP-木糖(配体)相互作用但不参与UDP-葡萄糖相互作用，并且L149、S203、R310和I378参与UDP-葡萄糖(配体)相互作用但不参与UDP-木糖(配体)相互作用，尽管S203、R310和I378仍参与RebA相互作用。因此，相对于SEQ ID NO:1或2，糖基转移酶可在以下位置中的一者或多者处具有变体氨基酸：L149、S203、R310和I378W339。

一个或多个氨基酸变体可以是非保守取代(更优选)或保守取代(次优选)。这种变型可导致糖基转移酶与UDP-葡萄糖相互作用的相互作用降低，继而有利于与UDP-木糖相互作用并驱动甜菊醇糖苷受体分子更大的木糖基化。在其他方面，相对于SEQ ID NO:1或2，糖基转移酶可在以下位置中的一者或多者处具有变体氨基酸：M15、A35、Q36、S87、H102、R103、V143、F244、M248、A301、R304、A350、A415、S425和Q430(氨基酸列表“C”)。

在一些方面，具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶包括相对于SEQ ID NO:1的以下氨基酸变型：I152。对于使用与SEQ IDNO:1-3中的任一者具有小于100％的同一性的多肽的方面，同一性的差异可能是由于多肽的一个或多个区域中的一个或多个氨基酸取代，例如，在被理解为对于活性位点、底物结合袋和TDP结合位点重要的那些区域之外的区域中和/或在基于与SEQ ID NO:1相同的家族的一个或多个其他UGT的比对的保守区域之外的区域中。另选地，如果对SEQ ID NO:1-3中的任一者进行一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，则它们优选地在SEQ ID NO:1-3中的任一者与相同家族的其他UGT之间具有较低程度的同一性的位置处进行。在一些方面，糖基转移酶具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，这导致序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3序列的序列不同，同时保留某些序列特征。即，如果SEQ ID NO:1被修饰，则其在对于蛋白质的酶促功能而言保守和/或重要的区域之外的一个或多个氨基酸位置处被修饰。

图7示出了SEQ ID NO:1与变体或与SEQ ID NO:1具有同源性的其他糖基转移酶的比对。如比对中所示，特定位置处的阴影氨基酸列代表与SEQ ID NO:1模板中的相应氨基酸具有同一性或相似性的SEQ ID NO:1同源物中的氨基酸。同样，图10示出了SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2-4的比对，阴影代表不同组的氨基酸的性质。

在优选的方面，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的任何变体在该位置处不具有变体氨基酸，或者如果存在变体，则它是保守氨基酸取代。例如，使用两个或更多个糖基转移酶序列(它们中的一者是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)的任何比对，变体糖基转移酶可通过在糖基转移酶模板(诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)中在与相对于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的位置3-15、18-20等进行比对的任何氨基酸位置处进行的一个或多个氨基酸取代来产生(如由非阴影氨基酸所反映的)。这种取代可优选地是保守取代，但是如果功能性不受影响，则可使用非保守取代。如果使用或制备变体，或者如果使用至多保守氨基酸取代，则模板中的阴影氨基酸(诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3，诸如1、2、16、17、21-24等)优选不进行任何取代。

特定序列的“保守氨基酸取代”或“保守变型”是指用功能上相同的氨基酸替换一个氨基酸或一系列氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的，并且包括用具有相同类型的官能团或侧链极性、大小、形状或电荷(例如，脂族、芳族、带正电、带负电、极性、非极性、正极性、负极性、不带电的极性、非极性疏水性、可离子化酸性、可离子化碱性或含硫残基)的另一种氨基酸替换一种氨基酸。以下六组各自含有可彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

可使用本文所述的序列比对工具来理解SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3与同源多肽之间的多肽序列同一性区域。

本公开的糖基转移酶多肽还可具有对天然糖基转移酶多肽的一个或多个区域的缺失，其中这些缺失不影响多肽的糖基转移酶活性。缺失可基于关于天然糖基转移酶的结构和功能的已知信息，包括关于对于蛋白质的酶促功能而言保守和/或重要的区域的信息，例如如本文所述的序列(a)至(i)。

来自两种或更多种糖基转移酶的“对应”氨基酸的确定可以通过其全部或部分氨基酸序列的比对来理解。序列比对和序列同一性的生成包括通常使用计算方法的全局比对和局部比对。为了提供全局比对，使用跨所有查询序列整个长度强制序列比对的全局优化。通过比较，在局部比对中，鉴定出长序列内较短的相似区域。

如本文所用，“等效位置”是指两个序列(例如，SEQ ID NO:1和具有所需取代基的不同UGT序列)所共有的位置，所述位置基于一种糖基转移酶的氨基酸序列的最佳比对或三维结构的比对。因此，可使用序列比对或结构比对或两者来确定等效性。

尽管本文所述的氨基酸位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但用于本公开方法的其他糖基转移酶中的相应位置不具有相同的序列长度，但仍可使用MUSCLE算法进行比对，其中开口间隙为10个位置，扩展间隙为0.2，如薛定谔平台V 2020-4中所实现的。如图10所示，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3和4具有良好的比对，因此可以容易地理解SEQ ID NO:3和4中的任一者相对于SEQ ID NO:1和3的相应位置的鉴定。例如，在SEQ ID NO:3中，对于前44个氨基酸，氨基酸位置从SEQ ID NO:1和2偏移-10(即，SEQ ID NO:1中的位置11是SEQ ID NO:3中的位置1)，然后对于SEQ ID NO:3中的后49个氨基酸，氨基酸位置偏移-9。

在一些实践模式中，使用BLAST算法来比较和确定序列相似性或同一性。另外，可以确定序列中可以分配权重或得分的缺口的存在或重要性。也可以使用这些算法来确定核苷酸序列相似性或同一性。基于用于计算统计相似性以及所确定的匹配的重要性的本领域已知方法来计算用于确定相关性的参数。预期相关的基因产物具有高度相似性，诸如大于50％的序列同一性。使用BLAST算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数可以如下。

在一些实施方式中，使用具有默认参数的BLAST(国家生物信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具)版本2.2.29软件进行比对。使用具有默认参数的BLAST版本2.2.29算法相对于参考序列具有XX％(例如，80％)的同一性得分的序列被视为至少XX％相同，或者等效地与参考序列具有XX％的序列同一性。

全局比对可用于将具有显著同一性的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3进行比对，以确定如果使用糖基转移酶变体，则靶序列(例如，糖基转移酶直系同源物)中的哪个(哪些)对应氨基酸位置可以被一个或多个氨基酸取代。

在本公开的方面中，形成木糖基化甜菊醇糖苷的方法在反应组合物中进行。反应组合物可制备成包括所需类型和量的以下试剂：(i)式I的甜菊醇糖苷化合物(甜菊醇糖苷受体)；(ii)活化的木糖；和(iii)具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶，诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的糖基转移酶。反应组合物可包括组分(i)、(ii)和(iii)，这意味着可任选地在反应组合物中包括不同于(i)、(ii)和(iii)的其他组分。反应组合物可包括其他组分，诸如非活化的糖、辅因子和在其中进行反应的液体或液体混合物。

反应组合物包含式I甜菊醇糖苷受体：

其中R¹包括葡萄糖残基，并且R²包括一个或多个糖残基或为氢。在一些情况下，R¹为单个葡萄糖残基，诸如β-Glc。在R¹处具有单个葡萄糖残基的甜菊醇糖苷受体的示例包括甜菊醇单葡糖基酯(R¹＝β-Glu，R²＝-H)、甜茶苷(R¹＝β-Glc，R²＝β-Glc)、甜菊苷(R¹＝β-Glc，R²＝-β-Glc(1-2)β-Glc)、莱苞迪苷A(RebA；R¹＝β-Glc，R²＝-β-Glc[β-Glc(1-3)]β-Glc(1-2)])、莱苞迪苷C(RebC；R¹＝β-Glc，R²＝-α-Rha(1-2)[β-Glc(1-3)]β-Glc)、莱苞迪苷F(RebF；R¹＝β-Glc，R²＝β-Glc(1-2)[β-Xyl(1-3)]β-Glc)、莱苞迪苷G(RebG；R¹＝β-Glu，R²＝-β-Glu(1-3)β-Glu)和杜尔可苷A(R¹＝β-Glu，R²＝α-Rha(1-2)β-Glu-)。在一些方面，式I甜菊醇糖苷受体以纯的(例如，大于总甜菊醇糖苷的99.9％(重量))或基本上纯的形式(例如，大于总甜菊醇糖苷的99％(重量))提供给反应组合物。

在一些方面，式I甜菊醇糖苷受体可以与一种或多种其他甜菊醇糖苷的混合物形式提供给反应组合物。例如，甜菊醇糖苷的混合物可通过从植物或植物细胞中提取甜菊醇糖苷的方法获得。另选地，甜菊醇的混合物可从能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化生物获得。例如，细胞培养物或发酵培养基可用于获得甜菊醇糖苷的混合物(参见，例如，美国专利号9,631,215、WO2016/196321(CAR0210/WO)、WO2016/196345(CAR0211/WO)、WO2016/196368(CAR0212/WO)。

在各方面，在反应组合物中，甜菊醇糖苷受体(式I的化合物)例如可以是甜菊醇单葡糖基酯、甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G和杜尔可苷A中的任一者或它们的混合物。除了式I甜菊醇糖苷受体之外，反应组合物可包括一种或多种不同于式I的那些并且不是木糖基化的受体分子的其他甜菊醇糖苷。包括受体和非受体甜菊醇糖苷的混合物的反应组合物可从叶(例如，甜菊醇叶)提取物获得。

在其他方面，反应组合物可富集一种或多种式I甜菊醇糖苷受体。例如，在反应组合物中，式I甜菊醇糖苷受体构成其中超过50％(mol)、75％(mol)或更多、85％(mol)或更多、90％(mol)或更多、92.5％(mol)或更多、95％(mol)或更多、97％(mol)或更多、98％(mol)或更多、99％(mol)或更多、99.5％(mol)或更多、或99.9％(mol)或更多、或基本上全部的甜菊醇糖苷。在一些方面，反应混合物的甜菊醇糖苷组分基本上由一种或多种式I的化合物组成，这意味着非式I的其他甜菊醇糖苷可以非常小的量(小于总甜菊醇糖苷的1％(重量))存在于反应混合物的甜菊醇糖苷组分中。在其他方面，反应混合物的甜菊醇糖苷组分由一种或多种式I的化合物组成，这意味着非式I的其他甜菊醇糖苷在反应混合物的甜菊醇糖苷组分中不以任何可检测量存在。

在一些方面中，反应组合物包含莱苞迪苷A，莱苞迪苷A构成其中超过50％(mol)、75％(mol)或更多、85％(mol)或更多、90％(mol)或更多、92.5％(mol)或更多、95％(mol)或更多、97％(mol)或更多、98％(mol)或更多、99％(mol)或更多、99.5％(mol)或更多、或99.9％(mol)或更多、或基本上全部的甜菊醇糖苷。在其他方面，反应组合物的甜菊醇糖苷组分由莱苞迪苷A组成。

在各方面，甜菊醇糖苷(SG)受体(其可以是甜菊醇糖苷受体中的任一者或混合物)以其中SG受体可溶于反应混合物中的量存在于反应组合物中。例如，(SG)受体可以约0.01摩尔至约1.0摩尔(例如，约0.01μmol至约1μmol SG受体/100μL反应体积)、约0.025摩尔至约0.5摩尔或约0.05摩尔至约0.2摩尔的范围存在。

组合物还包括具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽。在一些方面，糖基转移酶包含相对于SEQ ID NO:1或2的氨基酸列表“A”和/或氨基酸列表“B”的以下氨基酸。本公开的糖基转移酶可以是与SEQ ID NO:1或2具有至少50％的同一性并且优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少60％、75％、85％、90％、95％、98％或99％或更高的同一性的多肽。美国专利号9,631,215描述了从表达该融合蛋白的重组大肠杆菌(E.coli)菌株纯化6HIS或GST标记的SEQ ID NO:1。

在各方面，糖基转移酶多肽以约0.25％(重量)至约10％(重量)(例如，约0.25μg至约10μg蛋白/100μL反应体积)、约0.5％(重量)至约5％(重量)或约1％(重量)至约3％(重量)范围内的量存在于反应组合物中。

任选地，反应组合物中存在的甜菊醇糖苷(SG)受体和糖基转移酶多肽的量可参照彼此来描述。例如，反应组合物可具有25μg:1μmol至5μg:1μmol范围内、15μg:1μmol至7.5μg:1μmol或约10μg:1μmol范围内的糖基转移酶多肽(重量)与甜菊醇糖苷(SG)受体(mol)的比率。

反应组合物还包括活化的木糖，其优选为UDP-木糖(尿苷[5']二磷酸-α-D-吡喃木糖苷)的形式，其可商购获得(例如，Biosynth Carbosynth，英国；Sigma-Aldrich)。在各方面，UDP-木糖以约0.02摩尔至约2.0摩尔(例如，约0.02μmol至约2μmol UDP-木糖/100μL反应体积)、约0.05摩尔至约1.0摩尔或约0.1摩尔至约0.4摩尔范围内的量存在于反应组合物中。UDP-木糖具有以下化学结构：

任选地，UDP-木糖和甜菊醇糖苷(SG)受体的量、或UDP-木糖和糖基转移酶多肽的量、或存在于反应组合物中的量可参照彼此来描述。例如，在一些方面，反应组合物包含相对于式I的甜菊醇糖苷化合物(SGI)摩尔过量的UDP-木糖(UDP-X)，或在1.1:1至100:1、1.1:1至10:1、1.2:1至5:1或1.5:1至3:1范围内的UDP-X:SGI摩尔比。在一些方面，反应组合物包含50μg:1μmol至10μg:1μmol范围内、25μg:1μmol至15μg:1μmol或约20μg:1μmol范围内的糖基转移酶多肽(重量)与UDP-X(mol)的比率；

反应组合物还可包括一种或多种非活化的糖组分以促进反应。例如，组合物可包括非活化的糖，诸如蔗糖，以促进酶促反应的稳定。其他非活化的糖包括麦芽糖、海藻糖、葡萄糖和淀粉水解产物诸如葡萄糖浆和麦芽糖糊精。非活化的糖的用量范围可以是约10mM至约0.5M或约50mM至约0.2M。任选地，非活化的糖和甜菊醇糖苷(SG)受体的量可参照彼此来描述。例如，在一些方面，反应组合物包含相对于式I的甜菊醇糖苷化合物(SGI)摩尔过量的非活化的糖，其范围为0.1:1至1:1、1:1至5:1、2:1至5:1、5:1至10:1或10:1至20:1。

组合物还可包括提供二价阳离子的盐，该二价阳离子可用作糖基转移酶多肽的辅因子。示例性二价金属盐包括镁盐和/或锰盐，其可以在反应混合物中以约0.5mM至约5mM或约1mM至约4mM范围内的量使用。

反应可在中性或弱碱性pH(诸如在4.0-8.0、6.8-7.8或7.1-7.5的范围内的pH)下使用缓冲液诸如包括柠檬酸盐、磷酸盐或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液进行。

在一些方面，反应组合物基本上由以下组成：(i)式I的甜菊醇糖苷化合物(甜菊醇糖苷受体)，(ii)活化的木糖，(iii)与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的多肽，(iv)非活化的糖，(v)二价阳离子的盐，和(vii)缓冲液。

反应可在期望的温度和时间下进行以促进甜菊醇糖苷受体的木糖基化。例如，反应进行至少1小时且至多约10天，诸如1小时至24小时范围内、1小时至12小时范围内、约12小时至约7天范围内或约1天至约5天的时间量。反应可在约以下范围内的温度下进行：5℃-95℃、25℃-80℃、25℃-40℃、30℃-40℃、40℃-50℃、50℃-60℃、60℃-70℃、70℃-80℃或25℃-35℃或28℃-32℃。

作为反应的结果，形成了一种“产物组合物”，其包括一种或多种木糖基化甜菊醇糖苷剩余反应组分，包括多肽以及任何一种或多种赋形剂组分或由该反应产生的一种或多种组分。在一些情况下，产物组合物可包括一定量的未反应的甜菊醇糖苷受体反应物。

反应后，可对产物组合物进行精制以分离反应混合物的组分。木糖基化甜菊醇糖苷产物可通过诸如本文所述的结晶的方法或通过使用反相色谱柱来纯化。反应混合物的亲水性组分可用水去除，并且木糖基化甜菊醇糖苷化合物可通过用溶剂如甲醇洗脱而去除。此外，木糖基化甜菊醇糖苷化合物可使用制备型HPLC进一步拆分(例如，参见WO 2009/140394)。

反应组合物可提供式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物：

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其中R³包括木糖残基，并且其中R⁴包括一个或多个糖残基或为氢。示例性化合物包括其中R³为包含木糖残基(诸如β-Glc-β-Xyl)并且具有Glc2C→Xyl1C糖苷键的低聚糖部分的那些。在各方面，木糖基化甜菊醇糖苷选自以下化合物中的一者或多者：

/>

化合物E(RebDG)的化学结构如下所示：

反应还可提供高产率的木糖基化甜菊醇糖苷。特别地，在反应组合物中，超过50％、超过60％、超过65％、超过75％或超过80％的式I的甜菊醇糖苷化合物被转化为式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

反应还可提供包含一种或多种如本文所述的式II的化合物的产物组合物。木糖基化甜菊醇糖苷产物的类型和相对量可取决于在反应组合物中使用的甜菊醇糖苷受体的类型和相对量。

在一些方面，产品组合物包含甜菊醇糖苷组分的混合物，其包括化合物A至F的一种、两种或三种或更多种木糖基化甜菊醇糖苷。在一些方面，产品组合物包含甜菊醇糖苷组分的混合物，其至少包括化合物E和/或F的木糖基化甜菊醇糖苷。在一些方面，化合物E和/或F是产品组合物中主要的甜菊醇糖苷组分，这意味着化合物以大于产品组合物中任何其他甜菊醇糖苷的量存在。在其他方面，两种或更多种化合物E和F存在于产品组合物中的主要甜菊醇糖苷组分中，这意味着化合物以大于产品组合物中任何其他甜菊醇糖苷的量存在。在一些方面，化合物E和/或F在产品组合物中以大于组合物中甜菊醇糖苷的总量的50％、大于60％、大于65％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的量存在。

反应后，可对产物组合物进行精制以分离反应混合物的组分。糖基化甜菊醇糖苷产物可使用诸如结晶的方法或通过使用反相色谱柱来纯化。反应混合物的亲水性组分可用水去除，并且糖基化甜菊醇糖苷化合物可通过用溶剂如甲醇洗脱而去除。此外，糖基化甜菊醇糖苷化合物可使用制备型HPLC进一步拆分(例如，参见WO 2009/140394)。

在一些方面，工程化细胞用于制备式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。工程化细胞可具有能够制备式I甜菊醇糖苷受体化合物的途径，并且可表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽，诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的多肽。细胞还可表达用于形成活化的木糖(诸如UDP-木糖)的途径。

在各方面，工程化细胞包含生成甜菊醇的途径，甜菊醇是式I的化合物的前体，其继而可用作底物以使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽(诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的多肽)和活化的木糖形成式II的化合物。细胞可被工程化以提供式I的甜菊醇糖苷化合物，其量大于细胞中可能形成的非式I的甜菊醇糖苷的量。细胞还表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽，诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的多肽，其中该多肽能够将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物以形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。示例性工程化细胞包括工程化的酵母、细菌和真菌。

萜类化合物异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)可用作工程化细胞内甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有甲羟戊酸(MVA)途径，该途径通过一系列化学中间体将乙酰-CoA转化为IPP和DMAPP。一些生物通过从甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)开始的非甲羟戊酸途径(也称为甲基D-赤藓糖醇4-磷酸或MEP途径)产生IPP和DMAPP。

图2示出了代表性的甲羟戊酸途径。在该途径中，甲羟戊酸途径基因包括：(a1)乙酰乙酰CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)、(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合酶(EC4.1.3.5)；(c1)HMG-CoA还原酶(EC 1.1.1.34)；(d1)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)；和(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)。甲羟戊酸途径的酶如下将乙酰-CoA转化为IPP：乙酰-CoA→乙酰乙酰-CoA→3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→IPP。另选地，该途径可包括来自古细菌的酶，使用甲羟戊酸-3-激酶，其将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-3-磷酸，然后甲羟戊酸-3-磷酸-5-激酶将甲羟戊酸-3-磷酸转化为甲羟戊酸-3,5-二磷酸，并且甲羟戊酸-5-磷酸脱羧酶将甲羟戊酸-3,5-二磷酸转化为磷酸异戊酯，然后磷酸异戊酯激酶将磷酸异戊酯转化为IPP。

一些宿主细胞可能不包括任何甲羟戊酸途径所必需的酶，而一些细胞可能包括一些但不是全部的甲羟戊酸途径基因，而一些宿主细胞可能天然地包括全部甲羟戊酸途径基因。在一些情况下，不包括任何或包括一些的宿主细胞可被工程化为包括那些缺失的甲羟戊酸途径基因。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)天然地表达甲羟戊酸途径的基因，但是可被工程化以增加那些途径基因的表达。

在一些方面，用甲羟戊酸途径将原核细胞工程化。Martin,V.J.等人描述了在大肠杆菌(Escherichia coli)中将甲羟戊酸途径工程化以生产萜类化合物(NatureBiotechnology 21:796–802,2003)。Wang,J.等人描述了通过染色体整合将用于甲羟戊酸发酵的高效大肠杆菌菌株工程化(Appl.Environ.Microbiol.82:7176–7184,2016)。

在一些方面，用甲羟戊酸途径将真核细胞工程化，或通过甲羟戊酸途径基因的修饰将真核细胞工程化以提供更大量的IPP。例如，Gold,N.D.等人描述了研究用于在面包酵母中从头生产甜菊醇糖苷的细胞色素P450酶的组合方法。ACS Synth.Biol.7:2918–2929(2018)。

另选地，非甲羟戊酸(MEP)途径可用于提供IPP和DMAPP作为甜菊醇生产的前体。理论上，MEP途径一般更能量有效，因为与MVA途径相比，其以CO₂形式损失更少的碳(MEP途径：1CO₂/IPP；MVA途径：4CO₂/IPP；糖作为碳源)。

特别地，在非甲羟戊酸(MEP)途径中，化合物异戊烯基二磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)是通过一系列由甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)产生的中间体产生的，并且许多酶负责这种转化。图3示出了代表性的非甲羟戊酸途径。参与从G3P和PYR到IPP和DMAPP的生物合成途径的酶包括(a2)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b2)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(ispC)、(c2)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(IspD)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、(e2)2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、(f2)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)和(h2)异戊烯基-二磷酸异构酶(IDI)。

US 9,284,570描述了用于在大肠杆菌中生产甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法，其使用产生异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的上游甲基赤藓糖醇途径(MEP)。

酿酒酵母不天然地表达MEP途径的基因，但可任选地被工程化以提供MEP途径基因。

在一些方面，工程化细胞可包括一种或多种修饰以增加从乙酰基-CoA到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供增加的IPP和/或DMAPP库以用于生成甜菊醇的途径。修饰可包括例如增加一种或多种甲羟戊酸途径(a1)至(f1)的表达或活性，诸如通过将编码同源或异源酶的核苷酸置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用核酸的多个拷贝，和/或使用异源酶、变体酶(例如，包括一个或多个氨基酸取代的变体酶)或与天然酶相比提供更高水平的酶活性的变体异源酶。

使用工程化细胞生产木糖基化甜菊醇糖苷的本公开的方法可包括具有一个或多个遗传修饰的细胞，所述遗传修饰增加从G3P和PYR到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供增加的IPP和/或DMAPP库以用于生成甜菊醇的途径。修饰可包括例如增加一种或多种酶(a2)至(h2)的表达或活性，诸如通过将编码与宿主细胞异源的酶的核酸置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用核酸的多个拷贝，和/或使用异源酶、变体酶(例如，包括一个或多个氨基酸取代的变体酶)或提供高水平的酶活性的变体异源酶。

本公开的用于生产木糖基化甜菊醇糖苷的方法可使用工程化细胞，还可包括将IPP和/或DMAPP和焦磷酸法尼酯(FPP)转化为甜菊醇的途径。例如，参照图4，在一些方面，工程化细胞可包括表达以下酶的外源核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、(b3)柯巴基二磷酸合酶(CPS)、(c3)贝壳杉烯合酶(KS)、(d3)贝壳杉烯氧化酶(KO)、(e3)贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)。甲羟戊酸途径的酶如下将IPP和/或DMAPP转化为甜菊醇：IPP/DMAPP→香叶基香叶基二磷酸合酶→柯巴基二磷酸→贝壳杉烯→贝壳杉烯酸→甜菊醇。编码与酵母细胞异源的酶(a3)至(e3)的外源核酸可置于提供增加的表达的启动子的控制下，使用核酸的多个拷贝，和/或使用变体酶(例如，包括一个或多个氨基酸取代的变体酶)或提供高水平的酶活性的变体异源酶。

US 9,284,570描述了用于在大肠杆菌中生产甜菊醇或甜菊醇糖苷的方法，其使用产生异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的上游甲基赤藓糖醇途径(MEP)，以及从所述IPP和DMAPP生产甜菊醇或甜菊醇糖苷的下游途径，所述下游途径表达柯巴基二磷酸合酶(CPS)、贝壳杉烯合酶(KS)、香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)和贝壳杉烯氧化酶(KO)，以及任选的一种或多种甜叶菊UDP糖基转移酶。

工程化细胞还表达具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶多肽，诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性并且优选与SEQ ID NO:1具有至少60％、75％、85％、90％、95％、98％或99％或更高的同一性的多肽。

对异源基因表达的调节可使用期望的启动子、终止子和基因拷贝数来控制。

在一些方面，工程化细胞被工程化以制备比其他甜菊醇糖苷更多的Reb A、Reb C或甜菊苷。

工程化细胞可包括一种或多种尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)，其不同于SEQID NO:1或SEQ ID NO:1的同系物或变体，并且介导糖基残基从活化的核苷酸糖向甜菊醇受体分子的转移。

除了具有SEQ ID NO:1的UDP-葡糖基转移酶之外的示例性UDP-葡糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单元添加至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物以提供目标甜菊醇糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个方面，工程化细胞可包括一种或多种选自下组的UDP-葡糖基转移酶：UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、UGT91d2以及还有与这些多肽具有实质性(>85％)同一性的UGT。工程化细胞可包括编码这些UGT的一种或多种外源核酸分子。

工程化细胞还可包括在异源基因控制下的一种或多种UDP-葡萄糖再循环酶、和/或一种或多种UGT。能够将至少一个葡萄糖单元添加至甜茶苷以形成甜菊苷的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91d2。能够将至少一个葡萄糖单元添加至甜菊苷以形成莱苞迪苷A的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1。能够将至少一个葡萄糖单元添加至莱苞迪苷A以形成莱苞迪苷D的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91d2。能够将至少一个葡萄糖单元添加至莱苞迪苷D以形成莱苞迪苷M的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1。

描述用于甜菊醇糖苷生产和甜菊醇糖苷途径酶的工程化微生物的示例性出版物包括例如US2014/0357588、WO2014/193934、WO2014/193888和WO2014/222227。

在一个方面，用于生产甜菊醇糖苷的工程化细胞表达以下酶中的一些或全部：香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯合酶(KS)；甜菊醇合酶(KAH)、细胞色素P450还原酶(CPR)、UGT74G1、UGT76G1、UGT91d2和SEQ ID NO:1的多肽。WO 2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。UGT74G1酶用作尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷19-COOH转移酶。UGT76G1酶是甜叶菊尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶，其催化甜菊醇主链上的几个糖基化反应。UGT76G1酶可催化甜菊醇和甜菊醇糖苷在19-0位或13-0位的糖基化。

UGT91d2酶可用作尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶(也称为甜菊醇-13-单葡萄糖苷1,2-转葡萄糖基酶)，将葡萄糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'上，或者用作尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜茶苷转移酶，将葡萄糖部分转移至受体分子甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-2'上，以产生甜菊苷。SEQ ID NO:1的酶还可将葡萄糖部分转移至受体分子甜茶苷的19-O-葡萄糖的C-2'上，以产生19-O-1,2-二糖基化甜茶苷。

在工程化细胞中提供活化的木糖，诸如通过将活化的木糖从外部来源供给至细胞，或者工程化细胞能够产生活化的木糖。多肽将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物以形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

“工程化细胞”是指具有至少一个外源DNA序列的宿主细胞，所述外源DNA序列被引入细胞中，整合到细胞的基因组中或存在于染色体外构建体(诸如质粒或游离基因)上。术语“外源”是指引入宿主细胞的分子(诸如核酸)或活性(诸如酶活性)。可通过众所周知的技术将外源核酸引入宿主细胞中，并且可将其保持在宿主染色体材料的外部(例如，保持在非整合载体上)，或者可以将其整合到细胞的染色体中，诸如通过重组事件。一般地，通过稳定引入一种或多种重组基因来扩增工程化细胞的基因组。外源核酸可编码与细胞同源或异源的酶或其部分。外源核酸可以是“重组基因或DNA构建体”的形式，是指通过分子技术以一种或多种方式操作而成为非天然存在形式的核酸。

术语“异源”(例如，“非天然”)是指来自与所提及的分子或生物不同的来源的分子或活性。因此，与所提及的生物异源的基因或蛋白质是在该生物中未发现的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源糖基转移酶”是指与宿主生物可能天然的任何糖基转移酶多肽不同的糖基转移酶多肽。例如，在第一物种中发现并外源引入与第一物种不同的宿主细胞生物中的特异性糖基转移酶基因对宿主细胞是“异源的”。

在一些方面，产生木糖基化甜菊醇糖苷的工程化细胞是原核细胞。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源DNA构建体的宿主的示例性细菌包括但不限于以下物种：埃希氏菌属、链球菌属、乳杆菌属、假单胞菌属、乳球菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属、青枯菌属、分枝杆菌属、土壤杆菌属、地杆菌属、发酵单胞菌属、醋杆菌属、柠檬酸杆菌属、集胞藻属、根瘤菌属、棒状杆菌属、黄单胞菌属、产碱菌属、嗜水气单胞菌属、固氮菌属、丛毛单胞菌属、红球菌属、葡糖酸杆菌属、嗜酸硫杆菌属、小月菌属、土芽孢杆菌属、节杆菌属、黄杆菌属、沙雷氏菌属、糖多孢菌属、栖热菌属、寡养单胞菌属、色杆菌属、中华根瘤菌属、糖多孢菌属和泛菌属。示例性细菌物种是大肠杆菌。

在一些方面，产生木糖基化甜菊醇糖苷的工程化细胞是真核细胞。

例如，各种酵母宿主细胞被工程化以提供生成一种或多种木糖基化甜菊醇糖苷的途径。此类细胞可用编码用于木糖基化甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种DNA构建体转化。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源DNA构建体的宿主的示例性酵母包括但不限于以下物种：伞菌属、曲霉属、酒香酵母属、假丝酵母属、镰孢菌属、赤霉菌属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、腐质霉属、伊萨酵母属、克勒克酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、硫磺菌属、香菇属、油脂酵母属、管囊酵母属、法夫酵母属、原毛平革菌属、小立碗藓属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌属(Saccharomycete)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属、痂圆菌属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、丝孢酵母属、法夫酵母属、山田氏酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。示例性物种是食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、棉阿舒囊霉、白假丝酵母、博伊丁假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、杰丁塞伯林德纳氏酵母、乳酸克鲁维酵母属、多形汉逊酵母、东方伊萨酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、红法夫酵母和解脂耶氏酵母。此外，宿主细胞还可包括与甜菊醇糖苷途径的遗传修饰不同的遗传修饰，其可在发酵期间提供改善的性能。

工程化酵母可使用适于选择具有编码甜菊醇糖苷途径酶的核酸的转化体的营养缺陷型标记。宿主酵母可在控制营养缺陷型的一个或多个基因中(诸如LYS2、LEU2、HIS3、URA3、URA5和TRP1)包括修饰(缺失等)。使用具有用于引入一种或多种外源基因的所需遗传背景的宿主细胞，将一种或多种基因构建体引入细胞以整合到基因组中，或稳定地维持并允许表达。将基因构建体引入宿主细胞中的方法包括转化、转导、转染、共转染和电穿孔。具体地，可以使用乙酸锂方法、原生质体方法等来进行酵母转化。可将待引入的基因构建体以质粒的形式或通过插入宿主基因中或通过与宿主基因的同源重组结合到染色体中。可以用选择标记(例如，如上所述的营养缺陷型标记)选择已经引入基因构建体的转化酵母。可通过测量表达的蛋白质的活性或生物产物诸如甜菊醇糖苷的生产来进行进一步的确认。

可使用本领域众所周知的方法来确认包括甜菊醇途径基因的外源核酸序列的转化。此类方法包括例如核酸分析(诸如mRNA的Northern印迹法或聚合酶链反应(PCR)扩增)，或者用于基因产物表达的免疫印迹法，或者用于测试引入的核酸序列或其对应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应当理解，外源核酸以足以产生所需产物的量表达，并且还应当理解，可以使用本领域众所周知以及如本文公开的方法来优化表达水平以获得足够的表达。

用于通过细胞培养生产甜菊醇糖苷的本公开的方法可使用具有将甜菊醇转化为式II木糖基化甜菊醇糖苷的途径的工程化细胞。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则酵母可能能够产生不同的甜菊醇糖苷，其中至少一种甜菊醇糖苷是式II甜菊醇木糖基化甜菊醇糖苷。例如，酵母可能能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的甜菊醇糖苷种类，其中一种或多种甜菊醇糖苷是木糖基化甜菊醇糖苷。

术语“培养基”是指工程化细胞在其中可维持、可生长、可发酵的液体组合物或它们的组合。“培养基”也可称为“肉汤”或“细胞培养物”，并且诸如“生长”、“分裂”、“呼吸”和“发酵”的术语可用于更具体地定义在培养基中发生的细胞活性的类型。“细胞培养”是指在受控条件下生长细胞的过程，包括原核和真核细胞在确定的培养基、确定的时间段和确定的温度中的一者或多者中的生长。细胞培养包括

培养基可根据存在于培养基中的组分及其量来定义，诸如碳源，包括(a)碳水化合物(诸如葡萄糖)和淀粉产物(诸如麦芽糖糊精)；(b)氮源，诸如酵母氮碱、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或它们的任意组合；(c)盐，诸如磷酸钾(一价、二价)、硫酸镁、氯化钠和氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟碱酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素和枸橼酸；(e)痕量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、氯化铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠和硫酸锌。培养基中的组分可基于干重来定义。此外，培养基是水基或“水性”组合物。培养基还可根据其pH以及用于控制培养基中pH的生物相容性酸、碱和缓冲液来定义。

可将组合物(“进料组合物”)添加到包含工程化细胞的培养基中以增加培养基的体积，并且随着工程化细胞在培养基中生长，增加生物质的量。

在一些实施方式中，细胞培养可在包括含甜菊醇的化合物的培养基中进行。特别地，培养基可包括一种或多种式I的甜菊醇糖苷化合物。此类化合物可直接用于葡糖基转移酶多肽，诸如与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性的葡糖基转移酶多肽，其中多肽能够将木糖从活化的木糖转移至式I的化合物以形成式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。其他糖(诸如鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和/或葡萄糖)也可转移至式I的化合物中。在这些方面，工程化细胞不需要具有生成甜菊醇糖苷前体的途径(例如，MVA、MEP或SG途径，如本文所述)。

示例性工程化细胞包括工程化的酵母、细菌和真菌。

“总甜菊醇糖苷”是指在细胞培养一段时间后存在于培养基中的全部甜菊醇糖苷，其包括液体培养基中可从工程化酵母获得的甜菊醇糖苷(包括本公开的木糖基化甜菊醇糖苷)的量。甜菊醇糖苷含量可相对于培养基中的总甜菊醇糖苷量、或培养基中一种或多种但不是全部甜菊醇糖苷的量来表示。组合物(包括木糖基化甜菊醇糖苷)中甜菊醇糖苷的量可相对于彼此或相对于甜菊醇糖苷的总量来表达，诸如通过甜菊醇糖苷的总量的重量百分比，或以重量百分比或摩尔百分比表达的比率、或比率范围来表达。

为了回收木糖基化甜菊醇糖苷，然后可将培养基离心或过滤以去除工程化细胞。可任选地处理培养基以去除低分子量组分(葡萄糖、碱性营养物和盐)，诸如通过膜透析。根据期望的用途，可使用包含一种或多种甜菊醇糖苷化合物的组合物。

如果需要提供具有以下组分的组合物：富集或纯化形式的木糖基化甜菊醇糖苷，或其中将甜菊醇糖苷彼此分离，可进行进一步纯化。甜菊醇糖苷组分的这种富集或纯化可在其中发生发酵的培养基上进行，或者该培养基然后可在纯化之前干燥。例如，可使用冻干法将培养基干燥以形成包含甜菊醇糖苷的干燥组合物(例如，粉末或薄片)，其可随后加工。

如本文所用，术语“总甜菊醇糖苷”(TSG)计算为基于干(无水)的组合物中全部甜菊醇糖苷的含量的总和。

在一些实施方式中，将富含甜菊醇糖苷的干燥发酵肉汤用作纯化的起始材料。例如，可将溶剂或溶剂组合添加到干燥的发酵液中以溶解或悬浮包括甜菊醇糖苷的物质。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水和醇的混合物(例如，50:50的乙醇:水)。为了促进溶解或悬浮，干燥的肉汤材料可在高于室温的温度下加热，诸如在40℃-60℃的范围内。还可进行干燥的肉汤材料的机械破碎，诸如通过超声处理。在进一步纯化(诸如通过制备型色谱法)之前，可使用微米级或亚微米级过滤溶解或悬浮的肉汤材料。

富含甜菊醇糖苷化合物的干燥的发酵肉汤可使用诸如结晶的方法或通过使用反相液相色谱法进行纯化或精制。本领域已知的用于富集和纯化甜菊醇糖苷化合物的技术包括使用不同溶剂的提取、吸附和离子交换色谱法、超临界流体提取、结晶以及超滤膜和纳米膜过滤(例如，参见Kumari,N.等人(2017)Indian J Pharm Sci；79:617-624；Zhang,S.Q.等人(2000)Food Res Int；33:617-20；Pol,J.等人(2007)Anal Bioanal Chem；388:1847-57；Puri,M.等人(2012)Food Chem；132:1113-20；Teo,C.C.等人，Tan,S.N.等人(2010)JChromatogr A；121:2484-91)。美国专利号5,962,678公开了使用无水甲醇溶液重结晶莱苞迪苷A以获得80％纯度的莱苞迪苷A。美国专利公开号2006/0083838公开了通过用包含乙醇和4％-15％水的溶剂重结晶来纯化莱苞迪苷A。日本专利申请号55-23756公开了用于通过从含水乙醇(>70％)中结晶来纯化莱苞迪苷A和甜菊苷以获得80％纯度的莱苞迪苷A的方法。美国专利公开号2007/0082103公开了用于通过从含水乙醇中重结晶来纯化莱苞迪苷A的方法，声称从粗莱苞迪苷(60％)的两步重结晶导致形成>98％纯莱苞迪苷，产率为97％。WO2007/149672和WO2011/082288公开了使用有机溶剂的单步骤结晶方法。

如果使用色谱法，则可使用合适的树脂以将甜菊醇糖苷化合物保留在柱中，同时去除用液体诸如水洗涤通过柱的亲水性化合物。从柱中洗脱甜菊醇糖苷可通过合适的溶剂或溶剂组合(诸如乙腈或甲醇)来完成。

例如，甜菊醇糖苷化合物可使用制备型液相色谱法纯化，诸如高压液相色谱法(HPLC)或超高压液相色谱法(UHPLC)。可将具有木糖基化甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷组合物溶解在流动相中，诸如以期望的比率(例如，60％水、40％甲醇，v/v)的水和醇(诸如甲醇)的混合物。还可加热组合物以增强甜菊醇糖苷材料的溶解，诸如在约50℃下加热。也可在注入柱之前过滤溶液，诸如使用0.2μm过滤器。Phenomenex Kinetex XB-C185μm，核-壳二氧化硅固体载体，和具有异丁基侧链和TMS封端的C18固定相。通过柱的流速可基于柱性质(诸如约20mL/min)，最大压力为400巴。各种木糖基化甜菊醇糖苷可通过它们从柱上的洗脱时间来鉴定。本领域技术人员将理解，木糖基化甜菊醇糖苷的洗脱时间可随着溶液和/或设备的变化而变化。

从反相柱洗脱木糖基化甜菊醇糖苷可产生可用于多种目的中的任一种目的的组合物。例如，纯化的木糖基化甜菊醇糖苷组合物可用作用于口服摄取或口服使用的甜味剂组合物。组合物可根据组合物中的甜菊醇糖苷来定义。

如本文所用，甜味剂组合物(也称为增甜组合物)是指包括一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷的组合物。在一个优选的方面，甜味剂组合物包含化合物E(SG-[13-β-Glu[(3→1)β-Glu](2→1)β-Glu(1-2)]-[19-β-Glu(2→1)β-Xyl])。例如，甜味剂组合物可包括一种或多种式II甜菊醇糖苷(式II SG)以及除式II之外的另一种甜菊醇糖苷(非式II SG)。如果多种甜菊醇糖苷存在于甜味剂组合物中，则在一些方面，非式II SV可以少量存在于组合物中(例如，小于组合物中甜菊醇糖苷的总量的约25％、小于约20％、小于约15％或小于约10％)。一种或多种式II SG可以大量存在于组合物中，诸如大于组合物中甜菊醇糖苷的总量的约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，化合物E(RebDG；SG-[13-β-Glu[(3→1)β-Glu](2→1)β-Glu(1-2)]-[19-β-Glu(2→1)β-Xyl])是甜味剂组合物中SG的主要SG，这意味着它以大于组合物中任何其他SG的量存在。在一些方面，化合物E以大于组合物中全部其他SG的组合量的量存在，即，化合物E以大于甜味剂组合物中总SG的50％(重量)的量存在，并且在一些方面，大于组合物中甜菊醇糖苷的总量的60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％(重量)。

甜味剂组合物可任选地包括另一种甜味剂、添加剂、液体载体或它们的组合。甜味剂组合物用于增甜其他组合物(可增甜组合物)，诸如食物、饮料、药物、口腔卫生组合物、营养品等。

如本文所用，可增甜组合物是指与人或动物的口腔接触的物质，包括被摄入但随后从口腔排出的物质(诸如漱口液)和饮用、食用、吞咽或以其他方式摄取的物质，并且当以一般可接受的范围使用时适合于人或动物食用。可增甜组合物是增甜组合物的前体组合物，并且通过将增甜组合物与至少一种包括一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷的增甜组合物混合而转化为可增甜组合物。例如，不含甜味剂组分的饮料是一种可增甜组合物。可将包含一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷的甜味剂组合物添加至未增甜的饮料中，从而提供增甜的饮料。增甜的饮料是一种增甜的组合物。

在一些制剂中，一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷提供增甜组合物中的唯一甜味剂组分。

在一些方面，增甜组合物包含一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷，其量有效提供相当于指定量的蔗糖的甜味强度。参比溶液中蔗糖的量可用白利糖度(°Bx)描述。1度白利糖度为100克溶液中1克蔗糖，并以重量百分比(％w/w)表示溶液的强度。例如，甜味剂组合物含有一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷，其量当存在于增甜的组合物中时有效提供相当于约0.50白利糖度至14白利糖度的糖的甜味，诸如约5白利糖度至约11白利糖度、约4白利糖度至约7白利糖度或约5白利糖度。

甜味剂组合物中式II木糖基化甜菊醇糖苷的量可变化。一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷可以任何量存在于甜味剂组合物中，以在将甜味剂组合物掺入增甜的组合物中时赋予期望的甜味。例如，一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷以当存在于增甜的组合物中时有效提供约1ppm至约10,000ppm的总甜菊醇糖苷浓度的量存在于甜味剂组合物中。在另一个方面，一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷以有效提供以下范围内的甜菊醇糖苷浓度的量存在于甜味剂组合物中：10ppm至约2,500ppm，更具体地，约10ppm至约2000ppm、约10ppm至约1500ppm、约10ppm至约1250ppm、约10ppm至约1000ppm、约10ppm至约800ppm、约50ppm至约800ppm、约50ppm至约600ppm或约200ppm至约500ppm。除非另有明确说明，否则ppm基于重量。

任选地，甜味剂组合物还可含有一种或多种另外的非甜菊醇糖苷甜味剂化合物，诸如天然甜味剂(诸如蔗糖、果糖、葡萄糖、赤藓糖醇等)，或一种或多种合成甜味剂(诸如三氯蔗糖、丁磺氨钾、丁磺氨酸及其盐、阿斯巴甜、糖精及其盐等)。

除了一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷之外，甜味剂组合物可任选地包括液体载体、粘合剂基质、另外的添加剂等。在一些方面，甜味剂组合物含有添加剂，这些添加剂包括但不限于碳水化合物、多元醇、氨基酸及其对应的盐、聚氨基酸及其对应的盐、糖酸及其对应的盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐(包括有机酸盐和有机碱盐)、无机盐、苦味化合物、风味剂和风味成分、涩味化合物、蛋白质或蛋白质水解产物、表面活性剂、乳化剂、加重剂、树胶、抗氧化剂、着色剂、类黄酮、醇、聚合物以及它们的组合。在一些方面，添加剂用于改善甜味剂的时间和风味特征，以向甜味剂组合物提供有利的味道，诸如类似于蔗糖的味道。

甜味剂组合物还可含有一种或多种功能性成分，这些功能性成分为组合物提供真正或感知到的健康有益效果。功能性成分包括但不限于皂草苷、抗氧化剂、膳食纤维源、脂肪酸、维生素、葡糖胺、矿物质、防腐剂、水合剂、益生菌、益生元、体重控制剂、骨质疏松控制剂、植物雌激素、长链脂族饱和伯醇、植物甾醇以及它们的组合。

通常，甜味剂组合物或增甜的组合物中功能性成分的量根据特定的甜味剂组合物或增甜的组合物和期望的功能性成分而广泛地变化。本领域普通技术人员将容易地确定每种甜味剂组合物或增甜的组合物的功能性成分的适当的量。

可将一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷或包含这些甜菊醇糖苷的甜味剂组合物掺入任何已知的可食用材料(本文中称为“可增甜组合物”)或旨在用人或动物的嘴部摄入和/与人或动物的嘴部接触的其他组合物中，诸如例如药物组合物、可食用凝胶混合物和组合物、牙齿和口腔卫生组合物、食料(糖果、调味品、口香糖、谷物组合物、焙烤食品、烘培食品、烹饪助剂、乳制品和餐桌用甜味剂组合物)、饮料和其他饮料产品(例如，饮料混合物、饮料浓缩物等)。

在一个方面，增甜的组合物是包含一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷的饮料产品。如本文所用，“饮料产品”是即饮型饮料、饮料浓缩物、饮料糖浆、冷冻饮料或粉状饮料。合适的即饮型饮料包括碳酸饮料和非碳酸饮料。碳酸饮料包括但不限于增能汽水、可乐、柠檬酸橙味汽水、橙味汽水、葡萄味汽水、草莓味汽水、菠萝味汽水、姜汁饮料、软饮料和麦根沙士。非碳酸饮料包括但不限于果汁、水果风味汁、果汁饮品、花蜜、蔬菜汁、蔬菜风味汁、运动饮品、能量饮品、增能水饮品、维生素增能水、近水饮品(例如，具有天然或合成风味剂的水)、椰子水、茶类饮料(例如，红茶、绿茶、博士茶、乌龙茶)、咖啡、可可饮品、含有乳成分的饮料(例如，乳饮料、含有乳成分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果乳饮料)、含有谷物提取物的饮料、思慕雪以及它们的组合。

冷冻饮料的示例包括但不限于刨冰、冷冻鸡尾酒、代基里酒、冰镇果汁朗姆酒、玛格丽塔酒、奶昔、冷冻咖啡、冷冻柠檬水、格兰尼它冰糕和冰沙。

饮料浓缩物和饮料糖浆可用初始体积的液体基质(例如，水)和期望的饮料成分制备。然后通过添加另外体积的水来制备全浓度饮料。粉状饮料是通过在不存在液体基质的情况下干混所有饮料成分来制备的。然后通过添加全部体积的水来制备全浓度饮料。

在一个方面中，饮料含有包含甜菊醇糖苷(包括一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷)的甜味剂组合物。任何包含甜菊醇糖苷(包括一种或多种本文详述的式II木糖基化甜菊醇糖苷)的甜味剂组合物均可用于饮料中。在另一个方面，制备饮料的方法包括将液体基质和甜菊醇糖苷(包括一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷)混合。该方法还可包括添加一种或多种甜味剂、添加剂和/功能性成分。在另一个方面，制备饮料的方法包括将液体基质和包含甜菊醇糖苷(包括一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷)的甜味剂组合物混合。

在另一个方面，饮料含有甜味剂组合物，该甜味剂组合物含有一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷，其中甜菊醇糖苷以约1ppm至约10,000ppm(诸如例如约25ppm至约800ppm)范围内的量存在于饮料中。在另一个方面，甜菊醇糖苷以约100ppm至约600ppm范围内的量存在于饮料中。在其他方面，甜菊醇糖苷以约100ppm至约200ppm、约100ppm至约300ppm、约100ppm至约400ppm或约100ppm至约500ppm范围内的量存在于饮料中。在又一个方面，甜菊醇糖苷以约300ppm至约700ppm(诸如例如约400ppm至约600ppm)范围内的量存在于饮料中。在一个具体方面，甜菊醇糖苷以约500ppm的量存在于饮料中。

在另一个方面，提供了一种或多种式II木糖基化甜菊醇糖苷的颗粒形式。如本文所用，术语“颗粒”、“颗粒形式”和“颗粒状形式”是同义的，并且是指甜菊醇糖苷甜味剂组合物的自由流动的、基本上无粉尘的、机械性强的团聚体。制粒方法是本领域普通技术人员已知的，并且更详细地描述于PCT公开WO 01/60842中。

UGT酶的制备

将SEQ ID NO:1的氨基酸序列与GST蛋白的C末端融合，并对该序列进行密码子优化以用于大肠杆菌表达。(DNA2.0，Menlo Park，CA)。将所得序列克隆到专有的表达载体(DNA2.0)中，该载体含有IPTG诱导型T5启动子和强RBS。将质粒转化到大肠杆菌中。使用标准方法将来自表1的适当质粒转化到BL21细胞中。在30℃和250RPM下，将过夜培养物在具有50mL LB+50mg/mL卡那霉素的250mL烧瓶中生长。第二天早晨，种子培养物的OD600＝2.4+/-0.5。第二天早晨，将含有LB或Terrific Broth+50mg/ml卡那霉素的3升Fernbach烧瓶用16ml过夜培养物接种，靶向初始OD600＝0.04。培养物在表1所示的温度下以250RPM生长5小时至7小时，然后用0.8mM IPTG诱导。诱导后，将培养物在表1所示的温度下以250RPM孵育过夜。将生物质在1升离心瓶中在4℃下以8000RPM沉淀15分钟。将细胞重悬于裂解缓冲液中并通过超声裂解。将细胞悬浮液用20秒脉冲超声处理2分钟，随后在冰上静置20秒。将细胞转移至30mL Oakridge管中并以15,000RPM离心15分钟。将上清液倒入新的锥形管中。

实施例1：使用SEQ ID NO:1的酶和UDP-木糖的甜菊苷、RebA、Reb C和Reb D的19C 木糖基化

使用已知在甜叶菊叶和活化的木糖(UDP-木糖)中的SG生物合成中起关键作用的2种葡糖基转移酶(SEQ ID NO:1和UGT76G1)测试六种甜菊醇糖苷(SG)“受体”Reb A、B、C、D、M和甜菊苷。

UDP-木糖(98.9％纯度)和UDP-鼠李糖二钠盐(95％纯度)购自BOC Sciences。使用0.05M tris缓冲液将活化的糖供体制备成10mM浓度，并且在使用前根据制造商的推荐进行储存。

在大肠杆菌宿主细胞中制备SEQ ID NO:1的酶和UGT76G1酶作为标记蛋白，其表达由化学诱导物诱导。诱导后，将细胞孵育过夜并收获。然后将细胞裂解(通过超声处理、机械破碎或化学裂解)，将蛋白质通过色谱法纯化并在-20℃冷冻储存直至使用。在初步测试中使用UDP-葡萄糖确认酶活性。冷冻的酶溶液在使用前立即解冻并在使用后返回冷冻储存。先前的工作表明重复冷冻-解冻对酶活性影响非常小。

从各种来源获得具有90％+纯度的SG材料。所有SG材料均用90％DMSO以20mM制备，并在环境温度下储存。反应混合物中的最终DMSO浓度为4.5％。先前的工作证明该水平的DMSO对生物转化没有任何影响。

先前显示对生物转化反应具有稳定作用的蔗糖用0.05M tris缓冲液以0.1M制备。

Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲液以0.05M、pH 7.3制备，并含有各自3mM的MgCl₂和MnCl₂作为辅因子。

生物转化反应在含有Tris缓冲液、0.1μmol SG受体、0.2μmol活化的糖供体、1μmol蔗糖和2μg酶蛋白的总共100μL密封小瓶中进行。向每个小瓶中依次添加缓冲液、蔗糖、UDP-糖供体和SG受体，最后添加酶。对于每个SG供体，包括含有相同量的蔗糖和酶而不含UDP-糖供体的对照。手动混合后，将小瓶置于设定为30℃和100rpm的温度受控的振荡器中旋转运动96小时(4天)。

反应4天后，向每个小瓶中添加0.9mL 80％乙腈并将所得样品在LC/MS中分析。确认-19C(O)-β-Glc残基的木糖修饰。

如表1和图5所示，SEQ ID NO:1的多肽在将木糖转移至SG受体方面比UGT76G1更有效。该结果是相当出乎意料的，因为其他人推测UGT76G1对受体和供体具有比SEQ ID NO:1更广泛的活性。当使用SEQ ID NO:1的多肽时，甜菊苷、Reb A和Reb C均显示非常高的转化率，并且RebD复制品之一显示约10％的转化。当使用UGT76G1时，甜菊苷显示出比Reb A和Reb C更高的转化。

表1.

实施例2：使用SEQ ID NO:1和活化的糖对Reb A的糖基化的过程分析

检测SEQ ID NO:1用以不同浓度使用的不同活化的糖使Reb A糖基化的能力，在反应过程中测量所形成的反应产物。

SEQ ID NO:1的纯化蛋白与UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-鼠李糖二钠盐一起使用，试剂和反应条件如实施例1中所述。

表2.

表3.

SEQ ID NO:1的多肽能够有效地将葡萄糖和木糖分别从UDP-葡萄糖和USP-木糖转移至RebA。在存在SEQ ID NO:1的纯化蛋白和1mM活化的糖的情况下，RebA的糖基化和木糖基化在20分钟后达到稳定，RebA具有比木糖基化略高水平的糖基化(参见表2和图8A)。在存在SEQ ID NO:1的纯化蛋白和2mM活化的糖的情况下，RebA的糖基化和木糖基化在20分钟后达到稳定并处于相似水平，而使用UDP-鼠李糖的鼠李糖基化显著更低(参见表3和图8B)。

实施例3：使用SEQ ID NO:1和活化的糖的Reb F、Reb G和杜尔可苷A的糖基化

检测SEQ ID NO:1用以不同浓度使用的不同活化的糖使RebF、RebG和杜尔可苷A的-19C(O)-β-Glc残基糖基化的能力，在反应过程中测量所形成的反应产物。

使用UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-鼠李糖二钠盐，试剂和反应条件如实施例1中所述。

表4.(Reb F的糖基化)

表5.(Reb G的糖基化)

表6.(杜尔可苷A的糖基化)

SEQ ID NO:1能够有效地将葡萄糖和木糖分别从UDP-葡萄糖和UDP-木糖转移至Reb F、Reb G和杜尔可苷A的-19C(O)-β-Glc残基，糖基化和木糖基化在20分钟后达到稳定。使用UDP-鼠李糖的鼠李糖基化显著较低(参见表4至表6和图9A至图9C)。

实施例4：使用SEQ ID NO:1同系物和变体的Reb A的糖基化

体外酶生产

使用来自New England Biolabs的PURExpress体外蛋白合成试剂盒(NEB#E6800)根据制造商的说明书体外生产候选木糖基转移酶，包括250ng质粒DNA和添加20单位鼠源RNA酶抑制剂(NEB#M0314)。

通过体外蛋白质合成产生的酶的糖基转移酶测定

甜菊醇糖苷(SG)“受体”Reb A在甜叶菊叶中的SG生物合成中使用与葡糖基转移酶同源的4种葡糖基转移酶(SEQ ID NO:1-4)进行测试。SEQ ID NO:2-4与SEQ ID NO:1的同一性列于表7中。

表7.

	与SEQ ID NO:1的同一性
		SEQ ID NO:1	100％
SEQ ID NO:2	99％
		SEQ ID NO:3	27％
SEQ ID NO:4	25％

UDP-木糖(98.9％纯度)购自BOC Sciences。使用0.05M tris缓冲液将活化的糖供体制备成10mM浓度，并且在使用前根据制造商的推荐进行储存。从各种来源获得具有90％+纯度的SG材料。所有SG材料均用90％DMSO以20mM制备，并在环境温度下储存。反应混合物中的最终DMSO浓度为4.5％。先前的工作证明该水平的DMSO对生物转化没有任何影响。

通过体外转录-翻译(IVTT)产生酶，并在初步测试中使用UDP-葡萄糖确认活性。生物转化反应在含有Tris缓冲液、0.1μmol SG受体、0.2μmol活化的糖供体、1μmol蔗糖和2μg酶蛋白的总共100μL密封小瓶中进行。向每个小瓶中依次添加缓冲液、UDP-糖供体、SG受体，最后添加酶。对于每个SG供体，包括含有相同量的酶而不含UDP-糖供体的对照。手动混合后，将小瓶置于设定为30℃和100rpm的温度受控的振荡器中旋转运动96小时(4天)。

SEQ ID NO:2-4的活性相对于SEQ ID NO:1的活性表示。如表8所示，SEQ ID NO:1在将木糖转移至SG受体方面比SEQ ID NO:3或4更有效。SEQ ID NO:2相对于SEQ ID NO:1的基本上整体增加的活性是相当出乎意料的。在存在SEQ ID NO:1和2的情况下，在存在UDP-葡萄糖和UDP-木糖时发生Reb A向木糖基化产物的非常高的转化。[SEQ ID NO:3在该实验中运行一次以上]

表8.

	SEQ ID1	SEQ ID2	SEQ ID3	SEQ ID3	SEQ ID4
							葡萄糖	葡萄糖	葡萄糖	葡萄糖	葡萄糖
18小时	100％	825	81.5	148	174
						48小时	100％	578	87.1	132	151
96小时	100％	504	99.1	148	170
							木糖	木糖	木糖	木糖	木糖
18小时	100％	459	47.1	78.1	11.5
						48小时	100％	392	51.0	78.6	9.68
96小时	100％	312	38.9	62.1	10.9

序列表

<110> 嘉吉公司

<120> 木糖基化甜菊醇糖苷和用于生产的酶促方法

<130> CSST-PT-923-WO-PCT

<150> 63/155,229

<151> 2021-03-01

<160> 19

<170> PatentIn 3.5版本

<210> 1

<211> 462

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

290 295 300

Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

325 330 335

Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

385 390 395 400

Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

420 425 430

Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

435 440 445

Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ile Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

290 295 300

Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

325 330 335

Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

385 390 395 400

Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

420 425 430

Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

435 440 445

Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

<210> 3

<211> 442

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly

1 5 10 15

His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly

20 25 30

Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile

35 40 45

Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu

50 55 60

Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met

85 90 95

Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu

115 120 125

Gln Asn Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Thr Ser Cys Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe

145 150 155 160

Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile

165 170 175

Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys

180 185 190

Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile

195 200 205

Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Cys Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro

210 215 220

Pro Phe Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Trp Leu Gly Thr Lys His Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe

245 250 255

Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe

260 265 270

Ala Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro

275 280 285

Lys Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu

290 295 300

Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln

305 310 315 320

Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile

340 345 350

Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val

355 360 365

Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile

370 375 380

His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Ser Val Val Thr Gly Glu

385 390 395 400

Thr Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg Glu Ile Ser Lys Asn Leu

405 410 415

Lys Ser Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile

420 425 430

Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys

435 440

<210> 4

<211> 454

<212> PRT

<213> 枸杞(Lycium barbarum)

<400> 4

Met Gly Thr Glu Val Thr Val His Lys Asn Thr Leu Arg Val Leu Met

1 5 10 15

Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Val Ala

20 25 30

Lys Lys Leu Val Asp Arg Gly Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Ala

35 40 45

Ile Asn Leu Lys Ser Thr Ile Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ser Asp

50 55 60

Ser Ile Gln Leu Ile Glu Leu His Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro

65 70 75 80

Pro His Tyr His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro His Leu Asn His Thr

85 90 95

Leu Gln Lys Ala Leu Lys Met Ser Lys Pro Asn Phe Ser Lys Ile Leu

100 105 110

Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu Val Ile Tyr Asp Leu Leu Gln Gln Trp

115 120 125

Ala Glu Gly Val Ala Asn Glu Gln Asn Ile Pro Ala Val Lys Leu Leu

130 135 140

Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Val Lys Lys

145 150 155 160

Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe Pro Ala Ile Tyr Leu Arg Lys Asn Glu

165 170 175

Leu Glu Lys Met Ser Glu Leu Leu Ala Gln Ser Ala Lys Asp Lys Glu

180 185 190

Pro Asp Gly Val Asp Pro Phe Ala Asp Gly Asn Met Gln Val Met Leu

195 200 205

Met Ser Thr Ser Arg Ile Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp Tyr Phe Ser

210 215 220

Gly Leu Ser Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro Val Gln Asp

225 230 235 240

Pro Ile Ala Asp Asp Ala Asp Glu Met Glu Leu Ile Asp Trp Leu Gly

245 250 255

Lys Lys Asp Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr

260 265 270

Phe Leu Ser Lys Glu Asp Arg Glu Glu Ile Ala Phe Gly Leu Glu Leu

275 280 285

Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys Gly Glu Glu

290 295 300

Gln Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu Arg Ile Gly

305 310 315 320

Asp Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln Pro Arg Ile Leu

325 330 335

Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp Asn Ser

340 345 350

Val Met Glu Ser Val Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala Met Pro Ile

355 360 365

His Leu Asp Gln Pro Met Asn Ala Arg Leu Ile Val Glu Leu Gly Val

370 375 380

Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Tyr Gly Lys Ile His Arg Glu Glu

385 390 395 400

Ile Ala Glu Ile Leu Lys Asp Val Ile Ala Gly Lys Ser Gly Glu Asn

405 410 415

Leu Lys Ala Lys Met Arg Asp Ile Ser Lys Asn Leu Lys Ser Ile Arg

420 425 430

Asp Glu Glu Met Asp Thr Ala Ala Glu Glu Leu Ile Gln Leu Cys Lys

435 440 445

Asn Ser Pro Lys Leu Lys

450

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 5

Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 6

Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro Asp Met Val

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 7

Leu Leu Gly Ser Ala His Met

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 8

Arg Met Lys Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 10

Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu

1 5

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 11

Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 12

Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn

1 5

<210> 13

<211> 463

<212> PRT

<213> 大麦(Hordeum vulgare)

<400> 13

Met Asp Gly Asp Gly Asn Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Leu His Val

1 5 10 15

Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Leu Gly His Leu Leu Pro Cys Leu Asp

20 25 30

Ile Ala Glu Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser

35 40 45

Thr Pro Arg Asn Ile Ala Arg Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ala Val Ala

50 55 60

Pro Leu Val Glu Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro His Val Asp Gly Leu

65 70 75 80

Pro Glu Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro Tyr Asp Lys Phe Glu

85 90 95

Leu His Arg Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ser Glu Phe

100 105 110

Leu Arg Ala Ala Cys Ala Glu Gly Ala Gly Ser Arg Pro Asp Trp Leu

115 120 125

Ile Val Asp Thr Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Asn

130 135 140

Lys Val Pro Cys Val Met Leu Leu Leu Gly Ala Ala Thr Val Ile Ala

145 150 155 160

Gly Phe Ala Arg Gly Val Ser Glu His Ala Ala Ala Ala Val Gly Lys

165 170 175

Glu Arg Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ser Phe Glu Thr Glu Arg Arg Lys

180 185 190

Leu Met Thr Thr Gln Asn Ala Ser Gly Met Thr Val Ala Glu Arg Tyr

195 200 205

Phe Leu Thr Leu Met Arg Ser Asp Leu Val Ala Ile Arg Ser Cys Ala

210 215 220

Glu Trp Glu Pro Glu Ser Val Ala Ala Leu Thr Thr Leu Ala Gly Lys

225 230 235 240

Pro Val Val Pro Leu Gly Leu Leu Pro Pro Ser Pro Glu Gly Gly Arg

245 250 255

Gly Val Ser Lys Glu Asp Ala Ala Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro

260 265 270

Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Arg

275 280 285

Ala Glu Gln Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly Ala

290 295 300

Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Asp Ala Pro Asp Ala Ala

305 310 315 320

Val Leu Pro Pro Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Leu Val

325 330 335

Val Thr Gly Trp Val Pro Gln Ile Gly Val Leu Ala His Gly Ala Val

340 345 350

Ala Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu

355 360 365

Leu Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Ser Ser Asp Gln Gly

370 375 380

Pro Asn Ala Arg Leu Met Glu Gly Arg Lys Val Gly Met Gln Val Pro

385 390 395 400

Arg Asp Glu Ser Asp Gly Ser Phe Arg Arg Glu Asp Val Ala Ala Thr

405 410 415

Val Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Asp Gly Arg Arg Val Phe Thr Ala

420 425 430

Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Val Ala Asp Gly Ala Cys His Glu

435 440 445

Arg Cys Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Ala

450 455 460

<210> 14

<211> 436

<212> PRT

<213> 小米(Setaria italica)

<400> 14

Met Asp Ala Ser Asp Ser Ser Pro Leu His Ile Val Ile Phe Pro Trp

1 5 10 15

Leu Ala Phe Gly His Met Leu Ala Ser Leu Glu Leu Ala Glu Arg Leu

20 25 30

Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile

35 40 45

Ser Arg Leu Arg Pro Val Pro Pro Ala Leu Ala Pro Leu Ile Asp Phe

50 55 60

Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu

65 70 75 80

Ala Thr Ser Asp Ile Pro Pro Gly Lys Thr Glu Leu His Leu Lys Ala

85 90 95

Leu Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ala Ala Phe Leu Asp Ala Ala Cys

100 105 110

Ala Asp Gly Ser Thr Asn Lys Val Asp Trp Leu Phe Leu Asp Asn Phe

115 120 125

Gln Tyr Trp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp His Lys Ile Pro Cys Ala

130 135 140

Leu Asn Leu Thr Phe Ala Ala Ser Thr Ser Ala Glu Tyr Gly Val Pro

145 150 155 160

Arg Val Glu Pro Pro Val Asp Gly Ser Thr Ala Ser Ile Leu Gln Arg

165 170 175

Phe Val Leu Thr Leu Glu Lys Cys Gln Phe Val Ile Gln Arg Ala Cys

180 185 190

Phe Glu Leu Glu Pro Glu Pro Leu Pro Leu Leu Ser Asp Ile Phe Gly

195 200 205

Lys Pro Val Ile Pro Tyr Gly Leu Val Pro Pro Cys Pro Pro Ala Glu

210 215 220

Gly His Lys Arg Glu His Gly Asn Ala Ala Leu Ser Trp Leu Asp Lys

225 230 235 240

Gln Gln Pro Glu Ser Val Leu Phe Ile Ala Leu Gly Ser Glu Pro Pro

245 250 255

Val Thr Val Glu Gln Leu His Glu Ile Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala

260 265 270

Gly Thr Thr Phe Leu Trp Ala Leu Lys Lys Pro Asn Gly Leu Leu Leu

275 280 285

Glu Ala Asp Gly Asp Ile Leu Pro Pro Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg

290 295 300

Asp Arg Gly Leu Val Ala Met Gly Trp Val Pro Gln Pro Ile Ile Leu

305 310 315 320

Ala His Ser Ser Val Gly Ala Phe Leu Thr His Gly Gly Trp Ala Ser

325 330 335

Thr Ile Glu Gly Val Met Ser Gly His Pro Met Leu Phe Leu Thr Phe

340 345 350

Leu Asp Glu Gln Arg Ile Asn Ala Gln Leu Ile Glu Arg Lys Lys Ala

355 360 365

Gly Leu Arg Val Pro Arg Arg Glu Lys Asp Gly Ser Tyr Asp Arg Gln

370 375 380

Gly Ile Ala Gly Ala Ile Arg Ala Val Met Cys Glu Glu Glu Ser Lys

385 390 395 400

Ser Val Phe Ala Ala Asn Ala Lys Lys Met Gln Glu Ile Val Ser Asp

405 410 415

Arg Asn Cys Gln Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Leu Ile Gln Arg Leu Gly

420 425 430

Ser Phe Glu Lys

435

<210> 15

<211> 473

<212> PRT

<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)

<400> 15

Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val

1 5 10 15

Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln

20 25 30

Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser

35 40 45

Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile

50 55 60

Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp

65 70 75 80

Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys

85 90 95

Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln

100 105 110

His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro

115 120 125

Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr

130 135 140

Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile

145 150 155 160

Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu

180 185 190

Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg

195 200 205

Met Gly Met Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr

210 215 220

His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln

225 230 235 240

Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys

260 265 270

Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Leu Val

275 280 285

Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly

290 295 300

Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg

325 330 335

Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His

340 345 350

Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val

355 360 365

Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly

370 375 380

Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile

385 390 395 400

Glu Ile Pro Arg Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val

405 410 415

Ala Arg Ser Leu Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr

420 425 430

Lys Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val

435 440 445

Glu Lys Glu Tyr Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala

450 455 460

Arg Ala Val Ala Ile Asp His Glu Ser

465 470

<210> 16

<211> 442

<212> PRT

<213> 人参(Panax ginseng)

<400> 16

Met Asp Asn Gln Asn Gly Arg Ile Ser Ile Ala Leu Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Phe Phe Glu Leu Ala Lys Gln Leu Ala

20 25 30

Lys Arg Asn Cys Asn Val Phe Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Lys Asp Lys Asp Ser Ser Ala Ser Ile Lys Leu Val Glu Leu

50 55 60

His Leu Pro Ser Ser Pro Asp Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser His Leu Met Leu Pro Leu Arg Asn Ala Phe Glu Thr

85 90 95

Ala Gly Pro Thr Phe Ser Glu Ile Leu Lys Thr Leu Asn Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Phe Asn Pro Ser Trp Ala Pro Glu Ile Ala Ser Ser

115 120 125

His Asn Ile Pro Ala Val Tyr Phe Leu Thr Thr Ala Ala Ala Ser Ser

130 135 140

Ser Ile Gly Leu His Ala Phe Lys Asn Pro Gly Glu Lys Tyr Pro Phe

145 150 155 160

Pro Asp Phe Tyr Asp Asn Ser Asn Ile Thr Pro Glu Pro Pro Ser Ala

165 170 175

Asp Asn Met Lys Leu Leu His Asp Phe Ile Ala Cys Phe Glu Arg Ser

180 185 190

Cys Asp Ile Ile Leu Ile Lys Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gly Lys Tyr

195 200 205

Ile Asp Leu Leu Ser Thr Leu Ser Asp Lys Thr Leu Val Pro Val Gly

210 215 220

Pro Leu Val Gln Asp Pro Met Gly His Asn Glu Asp Pro Lys Thr Glu

225 230 235 240

Gln Ile Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser Thr Val Val Phe

245 250 255

Val Cys Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Asn Glu Glu Leu Glu Glu

260 265 270

Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Thr Val Asn Phe Ile Trp Ala Val

275 280 285

Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Ile Leu Pro Glu Gly Phe Val

290 295 300

Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Gly Trp Ala Pro Gln

305 310 315 320

Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe Val Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Ser Ser Ile Ala Glu Ser Met Lys Phe Gly Val Pro Val Ile

340 345 350

Ala Met Ala Arg His Leu Asp Gln Pro Leu Asn Gly Lys Leu Ala Ala

355 360 365

Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu Asn Gly Lys Tyr

370 375 380

Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val Val Val Glu Lys

385 390 395 400

Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu Ser Glu Lys Met

405 410 415

Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Ala Leu Glu Glu Leu Val

420 425 430

Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln

435 440

<210> 17

<211> 446

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 17

Met Ser Thr Thr Leu Lys Val Leu Met Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Gly

1 5 10 15

His Ile Ser Pro Tyr Leu Asn Val Ala Lys Lys Leu Ala Asp Arg Gly

20 25 30

Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Pro Ile Asn Leu Lys Ser Thr Ile

35 40 45

Asn Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile Gln Leu Ile Glu Leu

50 55 60

His Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro Asn Leu Asn His Ile Leu Arg Arg Ala Leu Lys Met

85 90 95

Ser Lys Pro Asn Phe Ser Lys Ile Met Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Ile Leu Gln Gln Trp Ala Glu Asp Val Ala Thr Glu

115 120 125

Leu Asn Ile Pro Ala Val Lys Leu Leu Thr Ser Gly Val Ala Val Phe

130 135 140

Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Thr Lys Lys Pro Glu Val Glu Phe Pro Tyr

145 150 155 160

Pro Ala Ile Tyr Leu Arg Lys Ile Glu Leu Val Arg Trp Cys Glu Thr

165 170 175

Leu Ser Lys His Asn Lys Glu Gly Glu Glu His Asp Asp Gly Leu Ala

180 185 190

Tyr Gly Asn Met Gln Ile Met Leu Met Ser Thr Ser Lys Ile Leu Glu

195 200 205

Ala Lys Tyr Ile Asp Tyr Cys Ile Glu Leu Thr Asn Trp Lys Val Val

210 215 220

Pro Val Gly Ser Leu Val Gln Asp Ser Ile Thr Asn Asp Ala Ala Asp

225 230 235 240

Asp Asp Met Glu Leu Ile Asp Trp Leu Gly Thr Lys Asp Glu Asn Ser

245 250 255

Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp

260 265 270

Val Glu Glu Val Ala Phe Gly Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile

275 280 285

Trp Val Val Arg Phe Pro Lys Gly Glu Glu Lys Asn Leu Glu Asp Val

290 295 300

Leu Pro Lys Gly Phe Phe Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu

305 310 315 320

Asp Lys Phe Ala Pro Gln Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly

325 330 335

Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp

340 345 350

Phe Gly Val Pro Ile Val Ala Met Pro Met Gln Leu Asp Gln Pro Met

355 360 365

Asn Ala Arg Leu Ile Val Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg

370 375 380

Asp Asp Asp Gly Lys Ile Tyr Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys

385 390 395 400

Gly Val Ile Thr Gly Glu Ile Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg

405 410 415

Asp Ile Ser Lys Asn Leu Lys Ala Ile Lys Asp Glu Glu Met Asp Val

420 425 430

Ala Ala Gln Glu Leu Ile Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys

435 440 445

<210> 18

<211> 470

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 18

Met Ser Pro Lys Leu His Lys Glu Leu Phe Phe His Ser Leu Tyr Lys

1 5 10 15

Lys Thr Arg Ser Asn His Thr Met Ala Thr Leu Lys Val Leu Met Phe

20 25 30

Pro Phe Leu Ala Tyr Gly His Ile Ser Pro Tyr Leu Asn Val Ala Lys

35 40 45

Lys Leu Ala Asp Arg Gly Phe Leu Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Ile

50 55 60

Asn Leu Lys Ser Thr Ile Glu Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Ile His Leu Ile Glu Leu His Leu Pro Glu Leu Pro Gln Leu Pro Pro

85 90 95

His Tyr His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro Asn Leu Asn Gln Val Leu

100 105 110

Gln Lys Ala Leu Lys Met Ser Lys Pro Asn Phe Ser Lys Ile Leu Gln

115 120 125

Asn Leu Lys Pro Asp Leu Val Ile Tyr Asp Ile Leu Gln Arg Trp Ala

130 135 140

Lys His Val Ala Asn Glu Gln Asn Ile Pro Ala Val Lys Leu Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Ala Ala Val Phe Ser Tyr Phe Phe Asn Val Leu Lys Lys Pro

165 170 175

Gly Val Glu Phe Pro Phe Pro Gly Ile Tyr Leu Arg Lys Ile Glu Gln

180 185 190

Val Arg Leu Ser Glu Met Met Ser Lys Ser Asp Lys Glu Lys Glu Leu

195 200 205

Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Leu Leu Val Asp Gly Asn Met Gln

210 215 220

Ile Met Leu Met Ser Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp

225 230 235 240

Phe Cys Thr Ala Leu Thr Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro

245 250 255

Val Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Val Asp Asp Met Glu Leu Ile Asp

260 265 270

Trp Leu Gly Thr Lys Asp Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly

275 280 285

Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe Ala

290 295 300

Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys

305 310 315 320

Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu

325 330 335

Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln Pro

340 345 350

Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly

355 360 365

Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala

370 375 380

Met Pro Met His Leu Asp Gln Pro Met Asn Ala Arg Leu Ile Val Glu

385 390 395 400

Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile His

405 410 415

Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Gly Val Ile Thr Gly Lys Thr

420 425 430

Gly Glu Lys Leu Arg Ala Lys Val Arg Asp Ile Ser Lys Asn Leu Lys

435 440 445

Thr Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Ala Ala Glu Glu Leu Ile Gln

450 455 460

Leu Cys Arg Asn Gly Asn

465 470

<210> 19

<211> 442

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 19

Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly

1 5 10 15

His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly

20 25 30

Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile

35 40 45

Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu

50 55 60

Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn

65 70 75 80

Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met

85 90 95

Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu

100 105 110

Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu

115 120 125

Gln Asn Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Thr Ser Cys Ala Ala Val Phe

130 135 140

Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe

145 150 155 160

Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile

165 170 175

Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys

180 185 190

Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile

195 200 205

Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Cys Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro

210 215 220

Pro Phe Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Trp Leu Gly Thr Lys His Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe

245 250 255

Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe

260 265 270

Ala Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro

275 280 285

Lys Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu

290 295 300

Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln

305 310 315 320

Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys

325 330 335

Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile

340 345 350

Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val

355 360 365

Glu Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile

370 375 380

His Arg Gly Glu Ile Ala Glu Thr Leu Lys Ser Val Val Thr Gly Glu

385 390 395 400

Thr Gly Glu Ile Leu Arg Ala Lys Val Arg Glu Ile Ser Lys Asn Leu

405 410 415

Lys Ser Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile

420 425 430

Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys

435 440

Claims

1.一种用于形成糖基化甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：

使用具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶在体外或在工程化细胞中由式I的化合物和(ii)活化的木糖形成式II的化合物，其中

式I是：

其中R¹包含葡萄糖残基，并且R²包含一个或多个糖残基或为氢；

所述糖基转移酶将木糖从活化的木糖转移至所述式I的化合物；并且

式II是：

其中R³包含由所述糖基转移酶添加的一个或多个木糖残基，并且R⁴与R²相同或包含一个或多个额外的糖残基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中式II的R³是包含一个或多个木糖残基的低聚糖部分。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述低聚糖部分是-β-Glu-β-Xyl或-β-Glu-β-Xyl-R⁵，其中R⁵包含一个或多个糖残基。

4.根据权利要求3所述的方法，其中式II的R³由-Glu-β-Xyl组成。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述式I的化合物选自由以下组成的组：甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G和杜尔可苷A。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述式I的化合物选自由以下组成的组：甜菊苷、莱苞迪苷A和莱苞迪苷C。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述式I的化合物是莱苞迪苷A。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述式II的化合物是：

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述活化的木糖是UDP-木糖。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有55％或更高、65％或更高、75％或更高、85％或更高、90％或更高、92.5％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高的同一性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖基转移酶包含相对于SEQ IDNO:1的以下氨基酸：

(A)W22、L23、A24、F25、G26、H27、L28、L29、P30、L57、P59、D90、V91、P92、H93、D94、R95、P96、D97、M98、V99、D128、F130、L149、L150、G151、S152、M155、R190、M191、K192、R195、T196、K197、S199、S200、G201、M202、S203、L204、A205、R221、P249、P250、L251、Y277、A279、L280、G281、S282、E283、V284、P285、A308、L309、R310、R338、W339、V340、P341、Q342、M343、L346、F354、H357、C358、G359、W360、N361、S362、T363、E365、I378、F379、G380、D381、Q382和N385；

(B)M1、H16、V18、P21、W22、L23、A24、F25、G26、H27、P30、L34、L38、A39、G42、H43、S46、S49、T50、P51、N53、R56、L57、P58、V71、P76、L81、P82、A85、E86、T88、D90、A105、D107、L109、L117、D123、D128、W133、A138、A153、P180、E187、S200、R207、R221、S222、E225、E227、P241、G246、P249、W266、L267、Q270、S274、V275、Y277、V278、A279、G281、S282、E283、E293、L294、A295、G297、L298、E299、F305、W307、R310、L321、P322、G324、F325、R328、G333、V335、W339、P341、Q342、I345、L346、H348、V351、G352、F354、L355、T356、H357、G359、S362、E365、L373、L376、P377、D381、Q382、G383、N385、A386、R387、G395、V398、R400、D404、G405、F407、V412、A413、V419和A433；或

(A)和(B)两者。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖基转移酶包含相对于SEQ IDNO:1的以下氨基酸基序中的一个或多个氨基酸基序：WLAFGHLLP(SEQ ID NO:5)；LPP；NDVPHDRPDMV(SEQID NO:6)；DVF,LLGSAHM(SEQ ID NO:7)；

RMKLIRTKGSSGMSLA(SEQ ID NO:8)；PPL；YVALGSEVP(SEQ ID NO:9)；ALR；RWVPQMSIL(SEQ ID NO:10)；

FLTHCGWNSTIE(SEQ ID NO:11)；IFGDQGPN(SEQ ID NO:12)。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法使用甜菊醇糖苷反应组合物在体外进行，所述甜菊醇糖苷反应组合物包含(i)式I的甜菊醇糖苷化合物，(ii)所述活化的木糖；和(iii)所述具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述式I的化合物构成所述反应组合物中超过50％(mol)、75％(mol)或更多、85％(mol)或更多、90％(mol)或更多、92.5％(mol)或更多、95％(mol)或更多、97％(mol)或更多、98％(mol)或更多、99％(mol)或更多、99.5％(mol)或更多、或99.9％(mol)或更多、或基本上全部的甜菊醇糖苷。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中在所述反应组合物中，超过10％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过65％、超过75％或超过80％的所述式I的甜菊醇糖苷化合物被转化为式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述式II的化合物是莱苞迪苷DG。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述反应组合物包含以下中的一者或多者：(a)镁和/或锰盐；(b)3-9、4-8、6.8-7.8或7.1-7.5范围内的pH；(c)相对于所述式I的甜菊醇糖苷化合物(SGI)摩尔过量的UDP-木糖(UDP-X)，或在1:1至1:100、1:5至1:10、1:20至1:50、1:50-1:100或1.1:1至10:1、1.2:1至5:1或1.5:1至3:1范围内的UDP-X:SGI摩尔比，其中所述活化的木糖包括UDP-木糖(UDP-X)；(d)在50μg:1μmol至10μg:1μmol范围内、在25μg:1μmol至15μg:1μmol范围内、或约20μg:1μmol的多肽(重量)与UDP-X(mol)的比率；(e)在25μg:1μmol至5μg:1μmol范围内、在15μg:1μmol至7.5μg:1μmol范围内、或约10μg:1μmol的多肽(重量)与SGI(mol)的比率。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述反应包括以下条件中的一种或多种条件：(a)1小时至10天范围内、1小时至24小时范围内、1小时至12小时范围内、12小时至7天范围内或1天至5天范围内的时间；(b)在5℃-95℃、25℃-80℃、25℃-40℃、30℃-40℃、40℃-50℃、50℃-60℃、60℃-70℃、70℃-80℃、或25℃-35℃、或28℃-32℃范围内的温度下。

20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，所述方法还包括将式II的糖基化甜菊醇糖苷化合物与所述组合物中的一种或多种其他组分分离的一个或多个步骤。

21.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法包括

其中所述形成在能够制备所述式I的甜菊醇糖苷化合物的工程化细胞中进行；

其中所述活化的木糖被供给(外部)到所述细胞，或者所述工程化细胞能够制备所述活化的木糖，并且木糖从所述活化的木糖转移至所述式I的化合物以形成所述式II的木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

22.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含：

用于形成式I的甜菊醇糖苷化合物的途径：

其中R¹包含葡萄糖残基，并且R²包含一个或多个糖残基或为氢，

其中所述途径提供的所述式I的甜菊醇糖苷化合物的量大于所述细胞中能够形成的非式I的甜菊醇糖苷的量；以及

具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶能够将木糖残基中的一个或多个木糖残基转移至所述式I的化合物以形成所述式II的糖基化甜菊醇糖苷化合物：

其中式II的R³包含一个或多个木糖残基，并且其中R⁴与R²相同或包含一个或多个额外的糖残基。

23.根据权利要求21所述的方法或根据权利要求22所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞包含用于产生UDP-木糖的途径。

24.根据权利要求23所述的方法或工程化细胞，其中在所述工程化细胞中，所述用于产生UDP-木糖的途径包括UDP-葡萄糖脱氢酶、UDP-葡糖醛酸脱羧酶、UDP-木糖合酶或它们的组合。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法或工程化细胞，其中所述工程化细胞包含在异源基因控制下的一种或多种UDP-葡萄糖再循环酶、和/或一种或多种UGT。

26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法或工程化细胞，其中所述工程化细胞是工程化的酵母、细菌或真菌。

27.根据权利要求26中任一项所述的方法或工程化细胞，其中所述工程化细胞是选自由以下的物种组成的组的工程化酵母：假丝酵母属、克勒克酵母属(有孢汉逊酵母属)、伊萨酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌属、酿酒酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属，优选选自由以下的物种组成的组：毕赤酵母属(汉逊酵母属)、酵母菌属、酿酒酵母属和耶氏酵母属。

28.根据权利要求27所述的方法或工程化细胞，其中所述工程化细胞是选自由以下的物种组成的组的工程化细菌细胞：埃希氏菌属和芽孢杆菌属。

29.根据权利要求20至28中任一项所述的方法或工程化细胞，其中所述工程化细胞表达一种或多种外源核酸，所述一种或多种外源核酸编码与所述细胞异源的以下蛋白中的一种或多种蛋白：GGPPS多肽、对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽、贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽、贝壳杉烯合酶(KS)多肽；甜菊醇合酶(KAH)多肽、细胞色素P450还原酶(CPR)多肽、UGT74G1多肽、UGT76G1多肽。

30.一种用于形成木糖基化甜菊醇糖苷的方法，所述方法包括：

由反应组合物中的甜菊醇糖苷反应物形成木糖基化甜菊醇糖苷产物，所述反应组合物包含(i)甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G或杜尔可苷A中的一者或多者；(ii)UDP-木糖；(iii)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽，(iv)非活化的糖，和(v)镁和/或锰盐；

其中所述反应组合物具有4.8-7.8范围内的pH；

其中所述甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G或杜尔可苷A中的一者或多者以全部甜菊醇糖苷的总共80％(mol)或更多存在于所述反应组合物中；

其中所述多肽(重量)与所述甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷C、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G或杜尔可苷A中的一者或多者(mol)的比率在15μg:1μmol至7.5μg:1μmol的范围内；

使所述反应组合物在25℃-95℃范围内的温度下反应至少12小时，以提供包含化合物D、E、G、H、I或J中的一者或多者的产物组合物：

31.一种组合物，所述组合物包含由前述权利要求中任一项形成的所述木糖基化甜菊醇糖苷化合物。

32.一种可摄取或含水组合物，所述可摄取或含水组合物包含含有式II的化合物的甜菊醇糖苷的混合物：

其中R³包含木糖残基，并且其中R⁴包含一个或多个糖残基或为氢，其中所述式II的化合物以大于所述组合物中任何其他单一甜菊醇糖苷的量存在。

33.一种可摄取或含水组合物，所述可摄取或含水组合物包含甜菊醇糖苷混合物，所述甜菊醇糖苷混合物任选地包含莱苞迪苷M，所述甜菊醇糖苷混合物包含式II的化合物：

其中R³包含木糖残基，并且其中R⁴包含一个或多个糖残基或为氢，其中如果存在任何莱苞迪苷M，则所述式II的化合物以大于莱苞迪苷M的量存在，并且所述式II的化合物任选地占所述可摄取或含水组合物中所有甜菊醇糖苷的1％(mol)或更多，例如，2％、3％或5％(mol)或更多。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的可摄取或含水组合物，其中存在2种或更多种式II的化合物，并且此类化合物以大于所述组合物中其他甜菊醇糖苷总量的总量存在。

35.一种糖基转移酶，所述糖基转移酶具有UDP-木糖:19-甜菊醇木糖基转移酶活性，所述糖基转移酶包含与SEQ ID NO:1具有50％或更高的同一性以及相对于SEQ ID NO:1的以下氨基酸：I152的多肽。

36.根据权利要求35所述的糖基转移酶，所述糖基转移酶与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少95％或至少98％的同一性。

37.根据权利要求35所述的糖基转移酶，所述糖基转移酶为SEQ ID NO:2。